DE69331330T2

DE69331330T2 - Interdigitation-fusionsliposomen und gels

Info

Publication number: DE69331330T2
Application number: DE69331330T
Authority: DE
Inventors: L. Ahl; T. Boni; S. Davis; S. Janoff; R. Minchey; R. Perkins; E. Swenson
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1992-10-14
Filing date: 1993-10-13
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2013-10-14
Also published as: JPH08502444A; AU5405194A; MX9306373A; EP0665743B1; ATE210426T1; WO1994008565A1; AU676230B2; KR100315215B1; NO951407L; CA2146115A1; FI951811A0; NZ277393A; NO951407D0; DE69331330D1; DK0665743T3; KR950703329A; PT665743E; EP0665743A1; FI951811A

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilfortführung der am 14. Oktober 1992 eingereichten Anmeldung mit Seriennr. 07/961,277, die eine Teilfortführung der am S. März 1991 eingereichten und nunmehr zurückgezogenen Anmeldung mit Seriennr. 07/664,579 ist, die eine Teilfortführung der am 12. Jänner 1990 eingereichten und nunmehr zurückgezogenen Anmeldung mit Seriennr. 07/464,528 ist.

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Interdigitations-Fusions(IF)-Liposomen und Gels. Diese Liposomen und Gels erlangen hohe Verhältnisse zwischen gelöstem Stoff und Lipid. Der Begriff "gelöster Stoff" umfasst bioaktive Mittel einschließlich Kontrastmittel. Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Entdeckung einer Interdigitation von Lipiden zur Herstellung von IF-Gels und Liposomen und die weitere Entdeckung, dass eine derartige Interdigitation zur Bildung von Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung größenabhängig ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von IF-Liposomen und Gels. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden durch Beschallung, Extrusion oder alternative Vorgänge zur Größenreduktion wie die Homogenisierung auf die passende Größe gebildete Liposomen in Anwesenheit eines geeigneten Induktors fusioniert. Dieser Vorgang liefert eine erfindungsgemäße Zusammensetzung in Gelform. Das Gel selbst kann beispielsweise zur Abgabe von bioaktiven Mitteln eingesetzt oder zur Bildung von IF- Liposomen, welche wiederum sehr große interne Volumina besitzen und große Mengen an gelöstem Stoff einkapseln, verwendet werden.
Zur Herstellung von IF-Liposomen aus den Gels werden die Gels bei einer Temperatur, die üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, oberhalb der Umwandlungstemperatur (Tm) des verwendeten Lipids liegt, inkubiert, so dass Liposomen gebildet werden. Die von den erfindungsgemäßen Verfahren erforderte Temperatur ist jene Temperatur für jede gegebene Mischung aus Lipid, gelöstem Stoff und Induktor, die eine Veränderung der Materialeigenschaften der Mischung hervorruft, wodurch die erfindungsgemäßen IF- Liposomen hergestellt werden. Die aus IF-Gels gebildeten Liposomen sind IF-Liposomen.
Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, wird während des Inkubationsschritts auch der Induktor entfernt. Das Ergebnis ist eine Zusammensetzung, die Liposomen umfasst, welche hohe Verhältnisse zwischen gelöstem Stoff und Lipid enthalten.

Hinterrund der Erfindung

Die therapeutischen Eigenschaften vieler Arzneimittel können durch Verabreichung in liposomisch eingekapselter Form dramatisch verbessert werden [siehe z.B. P.N. Shek und R.F. Barber, Mod. Med. Kanada, 41, 314-382, (1986)]. In gewissen Fällen, beispielsweise bei der Verabreichung von Amphotericin B und Doxorubicin [Lopez-Berestein, et al., J. Infect. Dis., 151, 704-710, (1985) und Rahm, et al., Cancer Res., 40, 1532 (1980)], wird die Toxizität reduziert, während die Wirksamkeit beibehalten oder sogar gesteigert wird. Der von liposomisch eingekapselten Mitteln erzielte Vorteil kann zufällig sein und resultiert wahrscheinlich aus der geänderten Pharmakokinetik und Bioverteilung des eingeschlossenen Arzneimittels. [Ostro, et al., Amer. J. Hosp. Pharm., Band 46 Aug. 1989]
Eine Anzahl an Verfahren ist zur Zeit für das "Beladen" von Liposomen mit bioaktiven Mitteln verfügbar. Beispielsweise kann in einem Liposomen-Arzneimittel-Abgabesystem ein bioaktives Mittel wie ein Arzneimittel im Liposom eingeschlossen und danach dem zu behandelnden Patienten verabreicht werden. Siehe z.B. Rahman et al., U.S. -Patent Nr. 3,993,754; Sears, U.S. -Patent Nr. 4,145,410; Papahadjopoulos, et al., U.S. -Patent Nr. 4,235,871; Lenk et al., U.S. -Patent Nr. 4,522,803; und Fountain et al., U.S. -Patent Nr. 4,588,578. Zusätzlich zu diesem grundlegenden Verfahren zum Einschließen eines bioaktiven Mittels kann sich das bioaktive Mittel mit der Lipiddoppelschicht verbinden, wenn es lipophil ist. Viele der unter Anwendung der traditionellen Verfahren hergestellten pharmazeutischen Formulierungen haben jedoch den Nachteil eines geringen Arzneimittel- Lipid-Verhältnisses, von Problemen der maßstäblichen Zunahme und der Verwendung von toxischen Lösungsmitteln.
Zusätzlich zu den obenstehend beschriebenen Verfahren wurde gezeigt, dass sich zahlreiche bioaktive Mittel als Reaktion auf einen als "Fernbeladen" bekannten, vorgeschriebenen Protonen- oder Ionengradienten in Liposomen ansammeln. [Siehe z.B. Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta, 857, 123, (1986), Mayer, et al., Biochemistry, 27, 2053, (1988) und M.B. Bally, et al., Chem. Phys. Lipids, 47, 97, (1988)]. Diese Beladungstechnik ermöglicht eine unabhängige Veränderung jedes liposomischen Parameters. Viel höhere Arnzeimittel- Lipid-Verhältnisse können im Vergleich zu herkömmlichen Techniken erzielt werden [Mayer, et al. Chem.Phys.Lipids, 40, 333 (1986)]. Die Vorgänge und Materialien zum Fernbeladen sind bei Bally at al., U.S. -Patent Nr. 5,077,056, herausgegeben am 31. Dezember 1991, und bei Mayer at al., U.S. -Seriennr. 07/636,015, eingereicht am 4. Jänner 1991, geoffenbart.
Liposomen sind vollständig geschlossene Lipiddoppelschicht-Membrane, die ein eingeschlossenes wässriges Volumen enthalten. Liposomen können unilamellar (einzelne Doppelschicht-Membran) oder multilamellar (zwiebelartige Strukturen, charakterisiert durch mehrfache Doppelschicht-Membrane, wobei jede durch eine wässrige Schicht von der nächsten getrennt ist) sein. Die Doppelschicht ist aus zwei Lipidmonoschichten mit einem hydrophoben "Schwanz"-Bereich und einem hydrophilen "Kopf"-Bereich zusammengesetzt. In der Membrandoppelschicht orientieren sich die hydrophoben (nichtpolaren) "Schwänze" der Lipidmonoschichten zum Zentrum der Doppelschicht, während sich die hydrophilen (polaren) "Köpfe" zur wässrigen Phase orientieren. Die grundlegende Struktur von Liposomen kann durch eine Vielfalt von im Stand der Technik bekannten Techniken hergestellt werden.
Eine Liposomenklasse, die in der Praxis der Erfindung verwendet werden kann, ist jene, die als eine charakterisiert ist, welche eine im Wesentlichen gleiche Verteilung von lamellarem gelöstem Mittel aufweist. Diese Liposomenklasse wird als stabile plurilamellare Bläschen (SPLV), wie im U.S. -Patent Nr. 4,522,803 von Lenk, et al., definiert, als einphasige Bläschen, wie im U.S. -Patent Nr. 4,588,578 von Fountain, et al., beschrieben, und als gefrorene und aufgetaute multilamellare Bläschen (FAT MLV), wobei die Bläschen zumindest einem Gefrier- und Auftauzyklus ausgesetzt werden, bezeichnet; dieser Vorgang ist bei Bally at al., U.S. -Patent Nr. 4,975,282, herausgegeben am 4. Dezember 1990 unter dem Titel "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies", beschrieben.
Eine liposomische Einkapselung könnte möglicherweise zahlreiche vorteilhafte Wirkungen für eine breite Vielfalt von pharmazeutischen Mitteln bringen, und ein hohes Arzneimittel- Lipid-Verhältnis könnte sich beim Verwirklichen des Potentials von liposomisch eingekapselten Mitteln als wichtig erweisen. Die Verwendung von Liposomen zur Verabreichung von Arzneimitteln warf Probleme sowohl hinsichtlich der Arzneimittel- Einkapselung als auch hinsichtlich der Arzneimittelfreisetzung während der Therapie auf. Beispielsweise besteht ein fortgesetzter Bedarf an einer Erhöhung der Arzneimittel-Lipid- Verhältnisse, um die dem Patienten zugedachte Lipidbelastung zu minimieren.
Die Interdigitation von Lipiden ist ein Phänomen, das kürzlich äußerst detailliert von James L. Slater und Ching-Hsien Huang in Progress Lipid Res., 27,325-359, 1988, erforscht wurde. Im Allgemeinen beschreibt der Stand der Technik die Interdigitation von verschiedenen Lipidarten, resultierend entweder aus der Anwesenheit von verschiedenen Induktoren und/oder aus einer Acylketten-Längenasymmetrie (siehe Fig. 1A und 1B). WO 91/10422 bezieht sich auf ein Verfahren zum Interdigitieren-Fusionieren von klassierten Liposomen. Es gibt in der Literatur jedoch keinen Bericht über die Größenabhängigkeit zum Fusionieren von Liposomen während der Interdigitation zwecks Herstellung der erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen.

Ziele der vorliegenden Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von Interdigitations- Fusionsgels und -liposomen, die zur Abgabe von gelöstem Stoff in einer Anzahl von Anwendungen, einschließlich therapeutischer Anwendungen, verwendet werden können.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Interdigitations- Fusionsgels, das ein gesättigtes Lipid enthält und zusätzlich ungesättigte Lipide und wirksame Konzentrationen von bioaktiven Mitteln enthalten kann, u.zw. für die Formulierung in Zusammensetzungen zur äußerlichen oder oralen Verabreichung an ein Säugetier einschließlich des Menschen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Interdigitations-Fusionsliposomen und -gels, die hohe Konzentrationen von bioaktiven Mitteln ansammeln.
Wiederum ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die auf den erfindungsgemäßen Interdigitations- Fusionsgels und -liposomen basieren.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Interdigitationsgels und IF-Liposomen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines neuartigen Verfahrens zum Auffangen bioaktiver Mittel.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung sind aus der detaillerten Beschreibung der Erfindung, die hierin dargelegt ist, leicht zu verstehen.

Kurzfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Interdigitations-Fusions(IF)-Liposomen und Gels, die einen gelösten Stoff enthalten können. Diese Liposomen und Gels erlangen hohe Verhältnisse zwischen gelöstem Stoff und Lipid, einschließlich eines bioaktiven Mittels. Diese IF-Gels und Liposomen finden Verwendung in einer Anzahl von Anwendungen, einschließlich kosmetischer, pharmazeutischer und landwirtschaftlicher Anwendungen. In Kombination mit bioaktiven Mitteln können diese Liposomen und Gels äußerlich oder das System betreffend an Pflanzen und Tiere, insbesondere Säugetiere einschließlich des Menschen, verabreicht werden. Zusätzlich zu den obenstehenden Anwendungen sind die erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen auch in Kombination mit einer Harztechnolgie, insbesondere einer Farbentechnologie, nützlich.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen ein klassiertes Liposom, das vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,4 um (Mikrometer) oder weniger, bevorzugter von etwa 0,05 um (Mikrometer) oder weniger, und am meisten bevorzugt von etwa 0,025 um (Mikrometer) aufweist, in Kombination mit einem gelösten Stoff, zum Beispiel einem bioaktiven Mittel und einer Menge eines Interdigitationsinduktors, die zur Fusionierung der Liposomen zwecks Herstellung eines IF-Gels wirksam ist. Die Anfangsliposomen können wahlweise FAT MLVs sein. IF-Liposomen können aus den erfindungsgemäßen IF-Gels hergestellt werden. Vorzugsweise können bei den erfindungsgemäßen IF-Liposomen und Gels ein gesättigtes Lipid, beispielsweise
Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC),
Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC),
Di-0-hexadecylphosphatidylcholin und
Distearoylphosphatidylcholin, sowie Lipide, in denen die ungesättigten Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen in den Acyl-Seitenketten des Lipids in der trans- Konfiguration vorliegen, wie Transdielaidoylphosphatidylcholin und Dipalmitelaidoylphosphatidylcholine, oder gemischte Fettsäurelipide wie Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC) oder 1-Stearoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (SOPC) sowie andere ungesättigte Lipide ebenso verwendet werden.
Bei gewissen Ausführungsformen können ungesättigte Lipide in Kombination mit den erfindungsgemäßen gesättigten Lipiden eingesetzt werden. Im Allgemeinen wird bevorzugt, dass bei Verwendung von DOPC als ungesättigtem Lipid dieses mit dem gesättigten Lipid DPPC in nicht mehr als einem Anteil von 50 Molprozent ungesättigtem Lipid verwendet wird.
Das Interdigitations-Fusionsgel, das hergestellt wird, wenn klassierte Liposomen fusioniert werden, u.zw. vorzugsweise in Anwesenheit eines Induktors, der ein bioaktives Mittel enthalten kann oder nicht, kann ohne weitere Modifikation verwendet werden, oder wahlweise kann das Gel weiter modifiziert werden, beipielsweise durch übliche, aber nicht notwendige Erhitzung auf eine Temperatur oberhalb der Lipid-Umwandlungstemperatur (Tm), in jedem Fall aber durch Inkubation der Mischung auf eine Temperatur, die eine Veränderung der Materialeigenschaften der Mischung hervorrufen und somit die Bildung von IF-Liposomen aus den erfindungsgemäßen IF-Gels auslösen wird, und weiters möglicherweise durch Entfernung des darin enthaltenen Interdigitationsinduktors, um IF- Liposomen herzustellen.
Die erfindungsgemäßen IF-Liposomen können zum Erlangen überraschend hoher Verhältnisse zwischen gelöstem Stoff und Lipid, einschließlich bioaktiver Mittel, verwendet werden. Diese IF-Liposomen können ohne weitere Modifikation verwendet werden, oder sie können weiter klassiert werden, um unter Anwendung von im Stand der Technik leicht erhältlichen Verfahren und Methodenlehren, die untenstehend besprochen sind, Liposomen von varierender und/oder homogener Größe herzustellen.
Bei der vorliegenden Erfindung ist der bevorzugte Interdigitationsinduktor ein kurzkettiger Alkohol wie jene mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Ethanol, u.zw. wegen der Leichtigkeit, mit der es zwecks Herstellung von IF-Liposomen aus den erfindungsgemäßen IF-Gels entfernt werden kann. Jeder Induktor, der ein fusioniertes IF-Gel aus klassierten Liposomen herstellt, kann jedoch bei erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet werden.
Beispielhafte Induktoren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Polyole wie Glycerin, Ethylenglycol, kurzkettige Alkohole wie Methanol, Ethanol; Isopropylalkohol, Isopropanol und n-Butanol und Anästhetika wie Chlorpromazin, Tetracain, Phenylethanol, Benzylalkohol und Phenylbutanol und andere einschließlich Polymixin, auf Myelin basierendem Protein, Cholin, Acetylcholin, Trispuffer und chaotrope Salze wie beispielsweise Thiocyanat. Ethanol wird jedoch wegen der Leichtigkeit seiner Entfernung und seiner pharmazeutischen Kompatibilität bevorzugt. Die Menge an bei der vorliegenden Erfindung verwendetem Induktor umfasst eine Menge, die zur Herstellung von Interdigitations-Fusionsgels aus klassierten Liposomen wirksam ist. Es ist festzustellen, dass das zur Herstellung von erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen verwendete gesättigte Lipid bei gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Selbstinduktor sein kann, d.h., das gesättigte Lipid stellt ohne Bedarf, einen Induktor hinzuzufügen, erfindungsgemäße IF-Gels und Liposomen her. Insbesondere wird bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Di-0-hexadecylphosphatidylcholin (DHPC) als beispielhaft festgehalten. Wahlweise oder zusätzlich, wie hierin angemerkt, kann ein gelöster Stoff, der ein bioaktives Mittel sein kann, ebenso selbst ein Induktor sein.
Bei einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann ein hydrostatischer Druck als Interdigitations-Fusionsinduktor verwendet werden. In solchen Fällen werden kleine Liposomen dazu verursacht, durch Anwendung von hydrostatischem Druck IF-Gels zu bilden. Bei bestimmten Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung können DPPC oder DSCP umfassende kleine Liposomen durch Druck zum Interdigitieren veranlasst werden, wodurch intermediäre Gels gebildet werden, die nach Erhitzung des Lipids auf über seine Phasen-Umwandlungstemperatur Liposomen bilden.
Als weiterer Aspekt dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform können hohe hydrostatische Drücke zum Abtöten von Bakterien und Sterilisieren von liposomischen Zubereitungen verwendet werden. Somit kann ein hydrostatischer Druck nicht nur zum Hervorrufen einer Interdigitationsfusion, sondern auch zur Sterilisation der resultierenden Liposomen-Zubereitungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen IF-Liposomen und Gels können Konzentrationen von faktisch jedem gelöstem Stoff einschließlich bioaktiver Mittel wie Vitamine, Hormonwirkstoffe, Antimetaboliten, bakterienwachstumshemmender Mittel, pilztötender Mittel, örtlicher Anästhetika, Bronchienerweiterungsmittel, adrenergischer Betablocker, blutdrucksenkender Mittel, Antidepressiva, krampflösender Mittel, Antihistaminen, Malariamittel, schmerzlindernder Mittel, Antibiotika, immunisierender Mittel, Immunmodulatoren, Antigenen, Nährstoffen, Proteinen, Peptiden, Nucleosiden, Oligo- und Polynucleotiden, Ribonucleinsäure (RNA) und Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Analoga von RNA und DNA, tumorwachstumshemmender Mittel, antihistaminischer Mittel, neuropharmakologischer Mittel einschließlich Sedativa und Hypnosemittel, Steroide enthaltender und steroidfreier entzündungshemmender Mittel, diuretischer Mittel, Rhytmusstörungen verhindernder Mittel und vaskulärer Erweiterungsmittel, unter anderem einschließlich röntgenographischer Kontrastmittel, Kontrastmittel zur nuklearen magnetischen Resonanz (NMR) und Antivirenmittel enthalten. Zusätzliche bioaktive Mittel zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen Nährstoffe wie Proteine, Fettsäuren und Kohlenhydrate. Bei gewissen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden bei der vorliegenden Erfindung Radiokontrastmittel, NMR- Kontrastmittel, Peptide und gewisse Antibiotika, z.B. Cephalosporine, verwendet. Beispielhafte Radiokontrastmittel zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Iohexol, Iopamidol, iotroxische Säure, Ioxoglat, Iotrolan, Ioversol, Iothalmat, Iodimid, Iodipamid, Iopentol, Iodixanol, Metrizamid, Mischungen davon und deren pharmazeutisch zulässige Salze. Bioaktive Mittel können natürlich vorkommende, synthetische oder halbsynthetische bakterienwachstumshemmende Mittel sein. Beispielhafte bakterienwachstumshemmende Mittel sind Aminoglycoside wie Gentamycin, Amikacin und Tobramycin. Bei bevorzugten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten die IF-Gels und/oder Liposomen hohe Konzentrationen des bioaktiven Mittels. Im Allgemeinen sind die Gewichtsverhältnisse zwischen bioaktivem Mittel und Lipid der erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen so hoch wie von etwa 1 : 10 bis etwa 15 : 1. Natürlich sind diese Gewichtsverhältnisse nur exemplarisch, und in gewissen Fällen kann es notwendig sein, Arzneimittel und Lipid in Gewichtsverhältnissen oberhalb oder unterhalb dieser Verhältnisse zu schaffen.
Bei gewissen erfindungsgemäßen Ausfiihmngsformen kann der gelöste Stoff oder das bioaktive Mittel auch als Induktor wirken. In solchen Fällen ist es nicht notwendig, den Induktor/das bioaktive Mittel wie in anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen zu entfernen.
Geeignete bioaktive Mittel zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Mittel, das bei äußerlicher oder das System betreffender Verabreichung in den erfindungsgemäßen Liposomen oder Gels eine biologische Aktivität aufweist. Zahlreiche bioaktive Mittel können in den erfindungsgemäßen IF-Gels beinhaltet sein, vorzugsweise zur äußerlichen oder oralen Abgabe. Dieselben Mittel können in den erfindungsgemäßen IF- Liposomen zur äußerlichen Verabreichung beinhaltet sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von IF- Liposomen und Gels, die ein bioaktives Mittel von variierender Konzentration enthalten. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden klassierte Liposomen, die vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,4 um (Mikrometer) oder weniger, bevorzugter von etwa 0,05 um (Mikrometer) oder weniger, und am meisten bevorzugt von etwa 0,025 um (Mikrometer) aufweisen und durch Beschallung, Extrusion, Homogenisierung oder einen alternativen Vorgang gebildet werden, oder wahlweise FAT MLVs in Anwesenheit von Ethanol oder einem anderen geeigneten Induktor fusioniert. In Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen dem bioaktiven Mittel und den Lipiden, die bei den erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen verwendet werden, kann das Mittel vor oder nach Zugabe des Induktors hinzugefügt werden. Die Zugabe eines Induktors führt zum IF-Gel der vorliegenden Erfindung. Das Gel einschließlich eines bioaktiven Mittels kann an einen Patienten verabreicht oder wahlweise in erfindungsgemäße IF-Liposomen umgewandelt werden.
Zwecks Herstellung von erfindungsgemäßen IF-Liposomen werden die IF-Gels einer Temperatur, die üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, oberhalb der Umwandlungstemperatur des verwendeten Lipids liegt, ausgesetzt, und zusätzlich kann der Induktor entfernt werden. Die von den erfindungsgemäßen V erfahren erforderte Temperatur ist jene Temperatur für jede gegebene Mischung aus Lipid, gelöstem Stoff oder Induktor, die eine Veränderung der Materialeigenschaften der Mischung hervorruft, wodurch die erfindungsgemäßen IF-Gels und IF-Liposomen hergestellt werden. Das Ergebnis ist eine Zusammensetzung, die IF-Liposomen umfasst, welche hohe Konzentrationen an bioaktivem Mittel enthalten.
Die durch dieses Verfahren hergestellten IF-Liposomen können größenmäßig im Allgemeinen von etwa 100 um (Mikrometer) bis etwa 0,025 um (Mikrometer), bevorzugter von etwa 20 um bis etwa 0,025 um, variieren und können hohe Konzentrationen an bioaktivem Mittel enthalten. Diese IF-Liposomen können unter Anwendung jedweder im Stand der Technik verfügbaren Techniken weiter in ihrer Größe verringert werden.
Bei einem weiteren Aspekt dieser Erfindung kann ein zweites Material durch eine Postgel- Inkorporation, wie im Detail im untenstehenden Beispiel 29 beschrieben, in Interdigitations- Fusionsbläschen eingebaut werden. Das zweite Material kann ein zweites Lipid oder irgendein anderes Material sein, das den Interdigitations-Fusionsvorgang andernfalls stören würde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A ist eine schematische Darstellung der bei Doppelschichten möglichen verschiedenen Acylkettenanordnungen. A stellt eine nicht interdigitierte Doppelschicht dar, die ein Phospholipid, enthaltend ein symmetrisches gesättigtes Phospholipid C(16) : C(16)- Phosphatidylcholin, umfasst. B stellt eine teilweise interdigitierte Doppelschicht dar, die ein asymmetrisches gesättigtes Phospholipid C(16) : C(10)-Phosphatidylcholin umfasst. C stellt eine gemischte interdigitierte Doppelschicht dar, die C(16) : C(10)-Phosphatidylcholin umfasst. D stellt eine vollständig interdigitierte Doppelschicht dar, die C(16) : C(16)- Phosphatidylcholin in Kombination mit einer wirksamen Menge eines Induktors umfasst.
Fig. 1B ist eine schematische Darstellung, die die Wirkung von Temperatur und einem Induktor (Ethanol) auf die Interdigitation einer gesättigten Art von Phospholipid zeigt.
Fig. 2 stellt eine Interdigitation von Dipalmitoylphosphatidylcholin(DPPC)-Liposomen als Funktion der Anfangsgröße der Liposomen und der Konzentration von Ethanol dar. Die Interdigitation wird durch die Diphenylhexatrien(DPH)-Fluoreszenzintensität bestimmt. Bei Einbau in die Lipiddoppelschicht fluoresziert DPH maximal. Die Interdigitation führt zur Neuorientierung von DPH bei gleichzeitiger Abnahme der Fluoreszenz. Fo = DPH- Fluoreszenz bei Fehlen von Ethanol. F = DPH-Fluoreszenz in Anwesenheit von Ethanol. Anregung = 351 nm. Eine Emission wurde zwischen 380 und 580 nm festgestellt und durch Wiegen mengenmäßig bestimmt.
Fig. 3 stellt eine Lipidmischung von DPPC-Liposomen als Funktion der Größe und Ethanolkonzentration dar, wie durch einen Resonanzenergietransfer (RET) zwischen NBD- PE und Rhodamin-PE, die zusammen in einer Markierungspopulation von Liposomen eingebaut sind, beurteilt.
Fig. 4a stellt den Prozentsatz an ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung als Funktion der Ethanolkonzentration grafisch dar. Das interne Volumen von DPPC-IF-Liposomen als Funktion einer erhöhten Ethanolkonzentration ist in Fig. 4b gezeigt, wobei volle Kreise das durch ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung bestimmte interne Volumen darstellen; offenen Kreise beziehen sich auf die CAT 1 EPR-Messung. Fig. 4c stellt den Prozentsatz an DPPC dar, der als Ergebnis des Unvermögens von IF-Liposomen, sich bei 1,0 M Ethanolkonzentrationen zu bilden, gewonnen wurde, wobei als Resultat die verbleibenden SUVs nicht erfolgreich zentrifugierten.
FigA zeigt die internen Volumina von IF-Liposomen, die unter Anwendung von ¹&sup4;C- Sucrose-, TEMPONE EPR- und CAT 1 EPR-Verfahren aus verschiedenen Lipiden gebildet wurden (einfärbige, mit Schrägstrichen versehene bzw. schattierte Balken).
Fig. 6 zeigt das interne Volumen von DPPC-IF-Liposomen als Funktion der Anfangsgröße von Liposomen vor der Zugabe von Ethanol. Die internen Volumina dieser Liposomen wurden durch ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung sowie CAT 1 EPR- und TEMPONE EPR- Verfahren berechnet (einfärbige, mit Schrägstrichen versehene bzw. schattierte Balken).
Fig. 7a und 7b stellen den Einbau von DPPG in DPPG-DPPC-IF-Liposomen grafisch dar. Die internen Volumina der IF-Liposomen sind in Fig. 7a als Funktion eines Molbruchs von DPPG gezeigt (durch ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung gemessene Volumina: offene Kreise, durch die Verbreiterungsmittel-TEMPONE EPR-Technik gemessene Volumina: volle Kreise). Fig. 7b zeigt den in Prozent angegebenen Gewinn von Pi (volle Kreise) und von ¹&sup4;C-markierter Sucrose (offene Kreise) als Funktion von DPPG.
Fig. 8a und 8b stellen das interne Volumen und die Einkapselung als Funktion der anfänglichen DPPC-Konzentration grafisch dar, wobei Fig. 8a zeigt, dass der Einkapselungsprozentsatz von Sucrose mit der anfänglichen DPPC-Lipidkonzentration ansteigt. Fig. 8b zeigt das interne Volumen der DPPC-IF-Liposomen, gemessen sowohl nach dem ¹&sup4;C-Sucrose-Verfahren (volle Kreise) als auch dem EPR-Verfahren (offene Kreise).
Fig. 9a und 9b sind Malvern-Partikelgrößenverteilungen von IF-Liposomen bei (A) 10 mg/ml und (B) 20 mg/ml Lipid.
Fig. 10a und 10b stellen die Wirkungen von Cholesterol auf die Bildung von DPPC-IF- Liposomen grafisch dar. Fig. 10a zeigt die "endgültige" Cholesterolkonzentration der IF- Liposomen (offene Kreise) und den endgültigen Prozentsatz von eingekapselter ¹&sup4;C-Sucrose (offene Quadrate) als Funktion eines anfänglichen Cholesterolprozentsatzes der Liposomen vor der Zugabe von Ethanol. Fig. 10b zeigt die Abnahme des internen Volumens der DPPC- Cholesterol-IF-Liposomen als Funktion des Cholesterolgehalts (¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung, CAT 1 EPR- und TEMPONE EPR-Verfahren; offene Kreise, offene Dreiecke bzw. volle Kreise).
Fig. 11a und 11b stellen die Wirkungen von Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) (ungesättigtem Lipid) auf die Bildung von IF-Liposomen grafisch dar. Fig. 11a zeigt das interne Volumen von IF-Liposomen, die durch ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselungs- und TEMPONE EPR-Verfahren variierende Mengen an DOPC enthalten (offene Quadrate bzw. volle Quadrate). Fig. 11b zeigt die Lipidgewinnung, die der Bildung von IF-Liposomen folgt, die variierende Mengen an DOPC enthalten.
Fig. 12 ist ein Histogramm, das die Wirkung einer Lipid-Inkubationszeit oberhalb und unterhalb der DPPC-Tm (5 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten) und eines Inkubationsvorgangs (Raumtemperatur "RT" oder 50ºC) auf das resultierende interne Volumen der IF-Liposomen zeigt. In der gesamten Beschreibung bedeutet der Begriff "RM Temp" 25ºC, falls nicht anders spezifiziert.
Fig. 13 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von Druck und Temperatur auf die Bildung von aus DPPC zusammengesetzten PIF-Bläschen zeigt. Kleine DPPC-Liposomen wurden in Teflon®-Polytetrafluorethylen-Probenhalter gegeben, und die angezeigten Drücke wurden 15 Minuten lang bei den angezeigten Temperaturen ausgeübt.
Fig. 14 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von Druck und Temperatur auf die Bildung von aus DSPC zusammengesetzten PIF-Bläschen zeigt. Kleine DSPC-Liposomen wurden in Teflon®-Probenhalter gegeben, und die angezeigten Drücke wurden 15 Minuten lang bei den angezeigten Temperaturen ausgeübt.
Fig. 15 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Drucksterilisation auf Bakterien bei 40ºC zeigt.
Fig. 16 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Drucksterilisation auf Bakterien bei 50ºC zeigt.
Fig. 17 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Drucksterilisation auf Bakterien bei 60ºC zeigt.
Fig. 18 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung des Molbruchs von DPPG auf das interne Volumen von großen DPPC/DPPG-Interdigitations-Fusionsbläschen (IFVs) zeigt.
Fig. 19 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung der Zugabe von DOPG oder Cholesterol auf das interne Volumen von großen DPPC-Interdigitations-Fusionsbläschen (IFVs) zeigt.
Fig. 20 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Postgel-Inkorporation von DMPC SUVs auf das interne Volumen von großen DPPC IFVs zeigt.
Fig. 21 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von Temperatur auf das Membranfließverhalten von verschiedenen DMPC, DPPC und DPPC/DMPC IFVs zeigt.
Fig. 22 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Postgel-Inkorporation von Cholesterol auf das interne Volumen von großen DPPC IFVs zeigt.
Fig ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung einer Postgel-Inkorporation von DOPC SUVs auf das interne Volumen von großen DPPC IFVs zeigt.
Fig. 24 zeigt Phasen-Kontrast-Mikroaufnahmen der Ethanol-induzierten DPPCinterdigitierten Lagen und DPPC IFVs. A. Mikroaufnahmen (400X) von bei 20 mg/ml (3,0 M Ethanol, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, Raumtemperatur) gebildeten Ethanol-induzierten DPPC-interdigitierten Lagen. Die Lagensuspension wurde dann durch fünffache Verdünnung mit 3,0 M Ethanol NaCl/Trispuffer gebrochen. B. Mikraufnahme (400X) von 20 mg/ml DPPC IFVs in 3,0 M Ethanol NaCl/Trispuffer bei Raumtemperatur. Die IFVs wurden durch Anheben der Probentemperatur über die Tm des DPPC aus EthanolIDPPC-interdigitierten Lagen gebildet. Die Skalenbalken zeigen in beiden Mikroaufnahmen 10 um (Mikrometer) an.
Fig. 25: Gefrierbruch-Elektronenmikroaufnahmen von Ethanol-induzierten DPPCinterdigitierten Lagen und DPPC IFVs. A. Ethanol-induzierte DPPC-interdigitierte Lagen (2,5 M Ethanol, 150 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,2, Raumtemperatur). B. Durch Inkubation der interdigitierten Lagen oberhalb der Tm von DPPC gebildete DPPC IFVs. Die Skalenbalken zeigen 1 um (Mikrometer) an.
Fig. 26 zeigen die Größenverteilung von DPPC IFVs. Die normierten Durchmesserverteilungen für drei DPPC IFV-Proben wurden unter Verwendung eines Malvern-3600ER-Laserbeugungspartikelklassieres bei Raumtemperatur gemessen. Die Verteilungen basieren auf der Partikelanzahl und wurden von diesem Instrument berechnet. Durchschnittliche Werte und Standardabweichungen für die drei Proben sind gezeigt. Der anzahlgemittelte Durchmesser für die Proben war 3,54+/-0,12 Mikrometer. Die IFVs wurden unter Verwendung von 4,0 m Ethanol aus DPPC SUVs bei 20 mg/ml gebildet.
Fig. 27 zeigt die Wirkung von Interdigitations-Fusionsparametern auf das interne Volumen von DPPC IFVs. A. Internes Volumen als Funktion der Ethanolkonzentration. Für Ethanolkonzentrationen, die größer als oder gleich 2,0 M waren, wurden die DPPC IFVs durch direkte Zugabe von Ethanol zu den DPPC SUVs bei 20 mg/ml gebildet. Bei 1,5 M oder weniger wurde das Ethanol vor der Zugabe vorverdünnt, um ein Mischen von Artefakten zu verhindern. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen an. B. Die internen Volumina von aus DPPC LUVETS von verschiedenen Durchmessern gebildeten DPPC IFVs sind gezeigt. Die LUVETS wurden durch Extrusion von zuvor gebildeten MLVs durch zwei Polycarbonatfilter hergestellt. Die Durchmesser wurden durch quasielektrische Lichtstreuung bestimmt. C. Interne Volumina von bei verschiedenen DPPC SUV- Konzentrationen gebildeten DPPC IFVs. Eine Interdigitationsfusion wurde mit 4,0 M Ethanol hervorgerufen.
Fig. 28 zeigt die internen Volumina für aus verschiedenen gesättigten Acylketten- Phosphatidylcholinen hergestellte IFVs. Durchschnittliche interne Volumina sind fiu DMPC, DPPC, DHPC, DSPC und DAPC IFVs gezeigt, die unter Verwendung von 4,0 M Ethanol aus SUVs bei 20 mg/ml hergestellt wurden, um eine Interdigitationsfusion hervorzurufen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen an.
Fig. 29: Ein Einbau von Cholesterol in DPPC IFVs wird gezeigt. Die endgültigen internen Volumina von DPPC/Cholesterol-IFVs werden für zwei Verfahren eines Cholesterol- Einbäus in IFVs verglichen. DPPC. Gefüllte Kreise zeigen DPPC/Chol IFVs an, die direkt aus DPPC/Chol SUVs von variierendem Molprozentsatz an Cholesterol gebildet sind. Bei diesem Verfahren verringerten sich die internen Volumina der Produkt-IFVs rasch mit einem erhöhten Cholesterolgehalt. Gefüllte Quadrate zeigen die internen Volumina von DPPC/Chol IFVs an, die gebildet wurden, als nach Bildung von Ethanol-induzierten DPPCinterdigitierten Lagen Cholesterol in Form von 1 : 1 DPPC/Chol SUVs in 4,0 M Ethanol zugegeben wurde. Signifikant größere interne Volumina wurden bei jedem Molprozent von verwendetem Cholesterol hergestellt. Eine Differentialscanning-Kalorimetrie wurde angewendet, um zu zeigen, dass Cholesterol direkt in Doppelschichten eingebaut wurde. Bei 35 Molprozent Cholesterol wurde der DPPC-Gel-zu-Flüssigkeit-Kristallinphasenübergang in durch eines der Verfahren gebildeten DPPC/Cholesterol-IFVs eliminiert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zu Klarheitszwecken werden in der gesamten Besprechung der vorliegenden Erfindung folgende Defmitionen verwendet:
"Interdigitation" und "interdigitiert" werden in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, eine Lipiddoppelschicht zu beschreiben, in der der Acylkettenbereich eines Lipids in einer Doppelschicht in die andere Schicht der Lipiddoppelschicht eindringt. Der Begriff "Interdigitation" soll die volle Interdigitation, die gemischte Interdigitation und die teilweise Interdigitation umfassen. Voll interdigitierte Liposomen schließen interdigitierte Liposomen ein, in denen sich die Acylketten des Lipids vollständig oder teilweise über die Breite der Lipiddoppelschicht wie in Fig. 1A(D) durchdringen. Gemischt interdigitierte Liposomen schließen interdigitierte Liposomen ein, in denen sich gewisse Acylketten von asymmetrischen Phopspholipiden, im Allgemeinen die längeren Acylketten, vollständig über die Spanne der Doppelschicht erstrecken, während sich die kürzeren Ketten Ende an Ende in der Mittelebene der Doppelschicht wie in Fig. 1A(C) treffen. Ein weiteres Beispiel von Liposomen einer gemischten Interdigitation schließt Liposomen ein, in denen Bereiche des Liposoms entweder vollständig oder teilweise interdigitiert sind und mit Bereichen, die nicht interdigitiert sind, koexistieren können. Teilweise interdigitierte Liposomen schließen interdigitierte Liposomen ein, in denen sich die Acylketten von asymmetrischen Phosholipiden derart paaren, dass sich die längere Acylkette einer Doppelschicht mit der kürzeren Acylkette der anderen Doppelschicht wie in Fig. 1A(B) paart.
"Induktor" wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, Moleküle einschließlich amphipathischer Moleküle von eingeschränkter Größe zu beschreiben, die sich am Grenzflächenbereich der wässrigen Phase der Lipiddoppelschicht eines Liposoms lokalisieren und ein erfindungsgemäßes Interdigitations-Fusionsgel, das auch eine Flüssigkeit sein kann, produzieren. Der Begriff betrachtet auch Lipide und/oder gelöste Stoffe wie bioaktive Mittel, die als "Selbsinduktoren" agieren können. Hydrostatischer Druck kann auch ein Induktor sein.
"Druckinduzierte Fusion" ("PIF") ist eine Interdigitation, die durch eine ausreichende Anwendung von hydrostatischem Druck, der zwecks Bildung eines Interdigitations- Fusionsgels auf klässierte Liposomen ausgeübt wird, hervorgerufen wird. Aus diesem Gel gebildete Liposomen werden hierin als PIF-Liposomen oder einfach PIFs bezeichnet.
"Interdigitations-Fusionsgel" (IF-Gel) wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, das Produkt zu beschreiben, das sich ergibt, wenn ein Induktor in ausreichender Menge kombiniert wird, um klassierte Liposomen zu fusionieren. Die resultierenden Lipidlagen sind fusionierte Gels für die Zwecke der vorliegenden Erfindung und können Produkte von variierender Viskosität einschließlich Flüssigkeiten, Gels und in gewissen Fällen sogar sehr zähflüssiger, sich dem festen Zustand nähernder Produkte umfassen.
"Interdigitations-Fusionsliposom" (IF-Liposom) wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, das Liposom zu beschreiben, das aus IF-Gels resultiert, die im Allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, über die Lipidumwandlungstemperatur ("Tm") gehoben werden, in jedem Fall jedoch bei einer Temperatur zur Herstellung von IF-Liposomen inkubiert werden. Der Induktor kann zusätzlich, aber nicht notwendigerweise, vom Interdigitations-Fusionsgel entfernt werden. In gewissen Ausführungsformen, in denen das Liposom ein selbstinduzierendes Lipid enthält oder der gelöste Stoff ein Induktor ist, wird der Induktor nicht entfernt. Die IF-Liposomen können hohe Konzentrationen an gelöstem Stoff wie bioaktiven Mitteln in Verhältnissen von bioaktivem Mittel zu Lipid von etwa 1 : 10 bis 15 : 1 enthalten.
"Gelöster Stoff" wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, jede Chemikalie einschließlich Puffer und Lösungsmittel zu beschreiben, die von den erfindungsgemäßen IF- Gels und Liposomen eingeschlossen werden kann. Gelöste Stoffe können Puffer, Salze, Toxine, Mikroben und Bakterien, Pestizide, Insektizide, Herbizide, Fungizide, Emulgierungsmittel, Kosmetika, einzellige Organismen und eine große Anzahl an chemischen Mitteln, insbesondere einschließlich bioaktiver Mittel, umfassen.
"Bioaktives Mittel" wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, jedwedes Mittel wie chemische Mittel zu beschreiben, das bei Verabreichung an lebende Organismen einschließlich Pflanzen, Tieren wie Säuetieren und insbesondere einschließlich des Menchen eine biologische Aktivität aufweist. Bioaktive Mittel schließen Arzneimittel und Nährstoffe ein, unter anderem wie hierin obenstehend und im Folgenden beschrieben.
"Gesättigtes Lipid" wird in der gesamten Beschreibung dazu verwendet, ein Lipid zu beschreiben, das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Interdigitations-Fusionsgels und - liposomen verwendet werden kann. Der Begriff "gesättigtes Lipid" umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Lipide, die symmetrische und/oder asymmetrische Acylseitenketten haben, welche gesättigt sind, d.h. keine Doppelbindungen enthalten, Lipide, die ungesättigte Seitenketten haben, in denen die ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in der trans-Konfiguration ausgerichtet sind, und gewisse Lipide, die ungesättigte Seitenketten haben, in denen die ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in der cis- Konfiguration ausgerichtet sind, oder gemischte Fettsäurelipide wie beispielsweise SOPC und POPC.
"Interdigitationsfusioniertes Lipid enthaltende Zusammensetzung" wird zur Beschreibung der erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen verwendet.
Die vorlegende Erfindung bezieht sich auf Lipid-hältige Zusammensetzungen, umfassend ein klassiertes Liposom, das vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,4 um (Mikrometer) oder weniger bis etwa 0,05 um (Mikrometer) oder weniger und bevorzugter von etwa 0,025 um (Mikrometer) oder weniger aufweist, und eine Menge eines Induktors, die zur Fusionierung der Liposomen in Kombination mit einem gelösten Stoff wirksam ist. Die Anfangsliposomen können wahlweise FAT MLVs sein. Bei gewissen Ausführungsformen ist der gelöste Stoff ein bioaktives Mittel. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können vorteilhafterweise ein bioaktives Mittel in hohen Konzentrationen, beispielsweise in Verhältnissen von bioaktivem Mittel zu Lipid von etwa 1 : 10 bis 15 : 1, einschließen.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die klassierten Liposomen, die erfindungsgemäße IF- Gels und Liposomen bewirken, vorzugsweise aus zwitterionischen, kationischen und anionischen Lipiden und Phospholipiden, die Fettacylketten mit 12 bis 35 Kohlenstoffatomen umfassen, gebildet, wobei hierin auch gesättigte (entsättigte und teilweise gesättigte) und ungesättigte und polare oder apolare Lipide und Phospholipide beinhaltet sind.
Die erfindungsgemäßen gesättigten Lipide umfassen beispielsweise unter anderem:
Dimyristoylphosphatidylcholin,
Distearoylphosphatidylcholin,
Dipalmitoylphosphatidylcholin,
Dimyristoylphosphatidylserin,
Dipalmitoylphosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserin,
Dimyristoylphosphatidylethanolamin,
Dipalmitoylphosphatidylethanolamin,
Distearoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatsäure, Distearoylphosphatsäure,
Dipalmitoylphosphatsäure, Dimyristoylphosphatidylinosit,
Distearoylphosphatidylinosit,
Dipalmitoylphosphatidylinosit, hydriertes Sojaphosphatidylcholin, hydriertes Sojalecithin,
Dipalmitoylphosphatidylglycerin,
Di-0-hexadecylphosphatidylcholin,
Dipalmitoylphosphatidylglycerin,
Distearoylphosphatidylglycerin,
Dimyristoylphosphatidylglycerin,
ohne darauf beschränkt zu sein.
Andere gesättigte Lipide umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die gesättigten Lipide, die symmetrische und/oder asymmetrische Acylseitenketten haben, welche gesättigt sind, d.h. keine Doppelbindungen enthalten, Lipide, die ungesättigte Seitenketten haben, in denen die ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in der trans-Konfiguration ausgerichtet sind, und gewisse Lipide, die ungesättigte Seitenketten haben, in denen die ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in der cis-Konfiguration ausgerichtet sind, oder gemischte Fettsäurelipide wie beispielsweise SOPC und POPC.
Andere Lipide zum Einschluss mit dem gesättigten symmetrischen Lipid umfassen andere Lipide bildende Liposomen, einschließlich z.B. synthetischer oder natürlicher Phospholipide einschließlich gemischter Kettenzusammensetzungen, unter anderem zum Beispiel Phosphatidylcholine (PC), Phosphatidylethanolamine (PE), Phosphatidylserine (PS), Phosphatidylglycerine (PG), Phosphatsäuren (PA), Phosphatidylinosite (PI), Sphingomyeline (SPM) und Cardiolipine, entweder allein oder in Kombination.
Zusätzlich zu den obenstehenden Lipiden können in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch zusätzliche Lipide einschließlich verschiedener Lysolipide, z.B. n-Octadecyl-2-methylphosphatidylcholin, n-Octadecylphosphatidylcholin, 1- Laurylpropanediol-3-phosphocholin, Erythro-N-lignoceroylsphingophosphatidylcholin, Cholesterol und wasserlösliche Derivate davon wie beispielsweise Cholesterolhemisuccinat und Alphatocopherole und wasserlösliche Derivate davon wie Tocopherolhemisuccinat und Ganglioside, Glycolipide und Glycosphingolipide, eingeschlossen sein. Der durchschnittliche Fachmann erkennt, dass die Menge und der Typ des Lipids, das in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingeschlossen sein kann, innerhalb der Lehren der vorliegenden Anwendung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen variiert werden können.
Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden die klassierten Liposomen, die beträchtliche Mengen von zumindest einem gesättigten Lipid enthalten, unter Zugabe eines Induktors interdigitiert-fusioniert. Die erfindungsgemäßen klassierten Liposomen, die im Allgemeinen ein gesättigtes Phospholipid enthalten, werden einer vollständigen, teilweisen oder gemischten Interdigitation in Kombination mit einer wirksamen Menge des Interdigitationsinduktors unterzogen. Ohne Einschränkung durch die Theorie wird geglaubt, dass der Induktor dahingehend wirken kann, einige der mit der Kopfgruppe verbundenen Wassermoleküle zu verschieben, und im Allgemeinen einen Anstieg bei der Kopfgruppen- Oberfläche bewirkt. Es wird bevorzugt, dass die ausgewählten Lipide in Anwesenheit des Induktors einer vollständigen Interdigitation unterzogen werden; es muss jedoch erkannt werden, dass Lipide, die weniger als eine vollständige Interdigitation, d.h. entweder eine gemischte oder eine teilweise Interdigitation, liefern, ebenso in Betracht gezogen werden und sich im Gebiet der vorliegenden Erfindung befinden. Beispielhafte Interdigitationsinduktoren zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen unter anderem zum Beispiel kurzkettige Alkohole einschließlich Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Isopropanol und n-Butanol, Polyole wie Glycerin und Ethylenglycol, Anästhetika wie Chlorpromazin, Tetracain, Phenylethanol, Benzylalkohol und Phenylbutanol, Puffer wie Tris und chaotrope Salze wie Thiocyanat SCH- sowie andere Stoffe, auf die obenstehend Bezug genommen wird.
In gewissen Fällen sind die zur Bildung der erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen verwendeten gesättigten Lipide Selbstinduktoren, d.h., diese Lipide interdigitieren und bilden IF-Gels und Liposomen durch Mischen des Lipids in Anwesenheit eines gelösten Stoffes bei variierenden Temperaturen und ohne Bedarf, einen chemischen Induktor (zum Beispiel DHPC) hinzuzufügen. Zusätzlich kann in gewissen Fällen ein extrem hoher Druck verwendet werden, um ohne Bedarf, einen Induktor einzuschließen, eine Interdigitation herzustellen.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt kann eine Interdigitation durch Ausübung eines hydrostatischen Drucks auf eine Population von klassierten Liposomen hervorgerufen werden. Die Zeitdauer und der Grad, in der bzw. mit dem der Druck auf die Liposomen ausgeübt wird, müssen wirksam sein, um das Auftreten der Interdigitationsfusion zu bewirken. Obwohl kein spezifischer Minimaldruck erforderlich ist, beträgt ein bevorzugter Druckgrad für aus gesättigten Lipiden zusammengesetzte Liposomen zumindest etwa 1.378,8 · 10&sup5; Pa (20.000 psi), vorzugsweise zumindest etwa 2.757,6 · 10&sup5; Pa (40.000 psi). Der Druck sollte für eine zur Bewirkung einer Interdigitationsfusion ausreichende Zeitdauer ausgeübt werden, vorzugsweise von etwa einer Minute bis zu etwa einer Stunde.
Gute Ergebnisse wurden durch Verwendung von Liposomen, die entweder aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) oder aus Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) zusammengesetzt waren, erzielt. In einem Beispiel wurden kleine, DPPC oder DSPC umfassende, unilamellare Bläschen (SUVs) fusioniert, um durch Ausübung von Druck von zumindest 1.378,8 · 10&sup5; Pa (20.000 psi) und vorzugsweise zumindest 2.757,6 · 10&sup5; Pa (40.000 psi) für eine Periode von zumindest 15 Minuten größere Liposomen zu bilden. Während dieser Tests wurde zumindest eine teilweise Fusion der kleinen Liposomen bei der ersten Beobachtung nach 5 Minuten festgestellt. Dieser Vorgang ist detaillierter im untenstehenden Beispiel 27 besprochen. Obwohl DPPC und DSPC durch druckinduzierte Fusion (PIF) erfolgreich interdigitiert wurden, wurde festgestellt, dass der PIF-Vorgang bei kleinen Liposomen aus asymmetrische Acylseitenketten aufweisendem Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC) keine Interdigitation hervorruft.
Als weiterer Aspekt dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform können hohe hydrostatische Drücke zum Abtöten von Bakterien und Sterilisieren von liposomischen Zubereitungen angewendet werden. Somit kann ein hydrostatischer Druck nicht nur zum Hervorrufen einer Interdigitationsfusion, sondern auch zur Sterilisation von liposomischen Zubereitungen angewendet werden. Dieser Sterilisationsvorgang kann als Teil eines Interdigitations-Fusionsvorgangs oder zur Sterilisation von Liposomen ange wendet werden, die durch andere Vorgänge wie z.B. den in den U.S. -Patenten Nr. 4,522,803, 4,588,578 und 4,975,282 beschriebenen Verfahren, die obenstehend besprochen sind, gebildet werden.
Es ist seit langem bekannt, dass hydrostatische Drücke Auswirkungen auf zelluläre Vorgänge haben. Derzeit werden ein hoher Druck und eine mäßige Temperatur zur Pasteurisation und Sterilisation von bestimmten Nahrungsmittelprodukten angewendet. Solche Verfahren setzen im Allgemeinen die Anwendung von Drücken, die so hoch wie 5.170,5 · 10&sup5; Pa (75.000 psi) sind, und von mäßigen Temperaturen ein. Bakterien, Hefepilze und Viren können alle durch Anwendung eines hohen Drucks inaktiviert werden. Es ist bekannt, dass der Inaktivierungsvorgang bei feststehendem Druck als Funktion der Temperatur, der chemischen Zusammensetzung des Mediums und der Zeit variiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden hohe hydrostatische Drücke und mäßige Temperaturen zum Abtöten von Mikroben einschließlich Bakterien wie dem Bacillus subtilis im untenstehenden Beispiel 28 und dadurch zum Sterilisieren von liposomischen Zubereitungen angewendet. Das Bacillus subtilis wurde zur Verwendung in diesem Beispiel ausgewählt, da es als eines jener Mikroben betrachtet wird, die in Sterilisationsvorgängen am schwierigsten abzutöten sind. Im Beispiel 26 wird die Inaktivierungsgeschwindigkeit für mehrere Temperaturen bei einer Anzahl von Drücken beschrieben. Wie aus den in den Fig. 1 S. 16 und 17 dargelegten Ergebnissen ersichtlich, ist die Sterilisationsgeschwindigkeit eine Funktion der Temperatur und des Drucks, bei der bzw. bei dem die Sterilisation durchgeführt wird.
Im Allgemeinen wären bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Sterilisationsvorgangs bei einer ausgewählten liposomischen Zusammensetzung in kürzester Zeit eine geeignete Temperatur und ein geeigneter Druck, die für die Zusammensetzung wirksam sind, zu bestimmen. Für die schnellste Sterilisation wäre eine Kombination der höchsten Temperatur und des höchsten Drucks, die bzw. der von der liposomischen Zusammensetzung zu tolerieren ist, anzuwenden. Die in den Fig. 15, 16 und 17 für das Beispiel 28 dargelegten Daten schaffen ein Beispiel des Verhältnisses zwischen der Temperatur und dem Druck für derartige Sterilisationsvorgänge.
Ein Druck von etwa 689,4 · 10&sup5; Pa (10.000 psi) wird als minimaler Grad zum Bewirken einer erfindungsgemäßen Sterilisation betrachtet. Vorzugsweise wird ein Minimum von etwa 2.757,6 · 10&sup5; Pa (40.000 psi) Druck zur schnelleren Durchführung der Sterilisation verwendet, wobei die eigentliche erforderte Zeit von der Temperatur, bei der der Vorgang durchgeführt wird, abhängt. Der Druck sollte unter einem Grad gehalten werden, der eine gesundheitsschädliche Wirkung auf die bestimmte Liposomenzusammensetzung, die sterilisiert wird, haben kann, entweder durch Schädigung der Liposomenstrukturen oder durch Beeinflussung irgendeines Bestandteils der Zusammensetzung. In gleicher Weise sollte die maximale Temperatur auch unter jener liegen, die gesundheitsschädliche Wirkungen auf die Liposomenzusammensetzung, wie strukturelle oder chemische Veränderungen der Liposomen oder irgendeines Bestandteils der Zusammensetzung, auslöst.
Im Allgemeinen schließen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine Menge eines Induktors ein, die zum Fusionieren der klassierten Liposomen wirksam ist. Die Menge und der Typ des zur Herstellung einer Liposomenfusion verwendeten Induktors variieren als Funktion des Typs von verwendetem Liposom. Im Allgemeinen umfasst die Menge an verwendetem Induktor jedoch etwa 1,0% bis etwa 50% des Gesamtgewichts der Lösung, was eine Kombination der klassierten Liposomen, von Induktor und von gelöstem Stoff umfasst. Der durchschnittliche Fachmann erkennt, dass die Konzentration des Induktors innerhalb der Lehren des Stands der Technik und der vorliegenden Anwendung leicht zu variieren ist, um erfindungsgemäße Interdigitationsgels und -liposomen herzustellen.
Ohne Einschränkung durch die Theorie wird geglaubt, dass klassierte Liposomen bei gewissen Induktorkonzentrationen in Lipidlagen (Gels) fusionieren, um die durch einen kleinen Krümmungsradius auferlegte Doppelschichtbelastung zu entlasten (Siehe z.B. Fig. 3). Das resultierende Interdigitations-Fusionsgel, welches hergestellt wird, kann eine hohe Konzentration an gelöstem Stoff erlangen. Dies schließt einkapselnde Substanzen ein, die ansonsten nicht in hohen Verhältnissen zwischen gelöstem Stoff und Lipid in Liposomen eingeschlossen werden können. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ergeben sich Liposomen von hohem erlangtem Volumen, wenn die IF-Gels Temperaturen ausgesetzt werden, -die üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, oberhalb ihrer L Beta I-L Alpha- Umwandlungstemperatur ("Tm") liegen, in jedem Fall aber bei einer Temperatur, die die Materialeigenschaften der Mischung ändert, so dass IF-Liposomen gebildet werden, und der Induktor vorzugsweise (aber nicht notwendigerweise) entfernt wird. Diese Liposomen können größenmäßig als Funktion des gelösten Stoffs, des Liposoms und des Induktors, die verwendet werden, variieren, reichen im Allgemeinen aber größenmäßig von etwa 100 um und mehr, bevorzugter etwa 20 um (Mikrometer), bis etwa 0,025 um (Mikrometer).
Ohne Einschränkung durch die Theorie wird geglaubt, dass eine Interdigitation, die die Lipiddoppelschicht während der Liposomenbildung weniger anfällig für eine Störung macht, zum Einfangen von Substanzen verwendet werden kann, die normalerweise mit Membranen interagieren und schwer einzuschließen sind. Beispielsweise wurden erfindungsgemäße Interdigitations-Fusionsliposomen zum Einschließen von hohen Konzentrationen an Aminoglykosiden verwendet, die wegen ihrer Tendenz, mit Membranen zu interagieren, sehr schwer in hohen Konzentrationen einzuschließen sind. Es wurde gezeigt, dass IF-Liposomen Gentamycin in einem Arzneimittel/Lipid-Verhältnis von etwa 1 : 2 (w : w) einschließen, während modifizierte kleine plurilamellare Liposomen (SPLVs) typischerweise Gentamycin in einem Arzneimittel/Lipid-Verhältnis von etwa 1 : 10 (w : w) einschließen.
Die Herstellung von erfindungsgemäßen Interdigitations-Fusionsgels und -liposomen involviert die anfängliche Bildung von klassierten Liposomen, die einen Durchmesser von etwa 0,4 um (Mikrometer) oder weniger, bevorzugter von etwa 0,05 um (Mikrometer) oder weniger, und am meisten bevorzugt von nicht mehr als etwa 0,025 um (Mikrometer) aufweisen. Wahlweise können FAT MLVs verwendet werden, und in einigen Fällen können größere Liposomen angewendet werden. Jedes der im Stand der Technik zur Herstellung von klassierten Liposomen verfügbaren Verfahren kann einschließlich der untenstehend detaillierter beschriebenen Verfahren verwendet werden. Typischerweise können Liposomen anfänglich hergestellt werden, indem eine Lipidlösung in einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Chloroform, in einem runden Behälterboden oder in einem anderen geeigneten Kolben oder Gefäß bis zu einem dünnen Film vakuumgetrocknet wird, gefolgt von einer Hydratisierung des Lipidfilms mit einem wässrigen Lösungsmittel wie beispielsweise einem wässrigen Puffer oder einer Salzlösung. Wahlweise können Liposomen durch Zusatz eines trockenen Lipidpulvers und eines wässrigen Lösungsmittels, vorzugsweise z.B. einer Salzlösung oder eines wässrigen Puffers, gebildet werden.
Die Liposomen werden dann gemäß irgendeinem im Stand der Technik bekannten Verfahren wie Beschallung, Extrusion oder Homogenisierung klassiert und untenstehend weiters beschrieben. Nach der Bildung von klassierten Liposomen wird der gelöste Stoff, vorzugsweise ein einzukapselndes bioaktives Mittel, im Allgemeinen in das wässrige Lösungsmittel gemischt. Zwei Ansätze werden im Allgemeinen zum Einschließen von gelöstem Stoff angewendet, u.zw. abhängig davon, ob der gelöste Stoff mit Liposomen interagiert oder nicht. In dem Fall, in dem der gelöste Stoff nicht mit den Liposomen interagiert, kann der gelöste Stoffnach Bildung der klassierten Liposomen, die einer Interdigitation unterzogen werden sollen, mit dem wässrigen oder wässrigen/Puffer- Lösungsmittel eingemischt werden. Im Fall eines gelösten Stoffs, der mit den Liposomen interagiert, wird der gelöste Stoff im Allgemeinen nach Bildung von Interdigitations- Fusionsgels mit dem wässrigen Lösungsmittel eingemischt.
Natürlich erkennt der durchschnittliche Fachmann, dass die Reihenfolge, in der die einzelnen Bestandteile der erfindungsgemäßen IF-Gels und Liposomen zugegeben werden, variieren kann und vom Typ des einzuschließenden gelösten Stoffs und vom Typ des verwendeten gesättigten Lipids abhängt.
Die endgültige Konzentration des zur Einkapselung von erfindungsgemäßem gelöstem Stoff verwendeten Lipids variiert als Funktion der Konzentration und des Typs des erwünschten gelösten Stoffs sowie des Typs von verwendetem Lipid, im Allgemeinen reicht das Gewichtsverhältnis von Arzneimittel und Lipid in dem wässrigen Lösungsmittel aber von etwa 50 : 1 bis etwa 1 : 100, wobei die endgültige Lipidkonzentration in den Bereich von etwa 5 bis 100 mM fällt. Das endgültige Gewichtsverhältnis von Arzneimittel und Lipid bei den erfindungsgemäßen Interdigitations-Fusionsgels und -liposomen reicht von etwa 1 : 10 bis etwa 15 : 1.
Nach Bildung der klassierten Liposomen wird dem wässrigen Lösungsmittel ein Induktor beigegeben. Die Menge an zugegebenem Induktor reicht im Allgemeinen von etwa 1,0 Gew.-% (des kombinierten Gewichts von Lipid, gelöstem Stoff und Induktor) bis zu etwa 50 Gew.-%. Bei Verwendung von Ethanol als Induktor beträgt die Menge an inkludiertem Ethanol im Allgemeinen etwa 5 Gew.-% (1,0 M) bis etwa 20 Gew.-% (4,0 M), und im Fall von Glycerin kann die Menge an verwendetem Induktor soviel wie etwa 90-100 Gew.-% betragen. Die Menge anderer zu inkludierender Induktoren variiert. Im Fall von Ethanol fällt die endgültige Ethanolkonzentration in den Bereich von etwa 0,50 bis etwa 10,0 Mol und vorzugsweise in den Bereich von etwa 1,75 bis etwa 4,0 Mol.
Die Anwesenheit eines Induktors in einer wirksamen Menge bewirkt die Fusionierung der klassierten Liposomen, was zu fusionierten Lipidlagen führt. Das durch dieses Verfahren hergestellte IF-Gel kann äußerlich oder für die orale Verabreichung, zum Beispiel als in weiches Galert eingekapselte Formulierungen oder in anderen oralen Dosierungsformen, verwendet werden. Wahlweise kann das Gel zur Herstellung der erfindungsgemäßen IF- Liposomen weiter modifiziert werden.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen IF-Liposomen wird die Mischung bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer, die zur Bildung eines Gels ausreichen, inkubiert. Typischerweise reicht diese Periode von etwa 1 Minute zu etwa 1 Stunde. Danach wird die Temperatur im Allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, für eine Periode von etwa 1 Minute bis etwa 1,0 Stunde über die Tm des Lipids angehoben. Die erforderliche Inkubationstemperatur kann die Tm der Mischung sein, ist aber jene Temperatur für jede gegebene Mischung aus Lipid, gelöstem Stoff oder Induktor, die eine Veränderung der Materialeigenschaften der Mischung erzeugt, wodurch die erfindungsgemäßen IF- Liposomen hergestellt werden. Während diese Inkubationstemperatur beibehalten wird, kann der Induktor durch Evaporisation (insbesondere im Fall von Alkoholinduktoren), positiven Druckstickstoff (z.B. N&sub2;-Zerstäubung, die im Allgemeinen aus dem Hindurchsprudeln von N&sub2; durch die Mischung besteht) oder Verdünnung entfernt werden. Dies erzeugt IF- Liposomen, die größenmäßig im Allgemeinen zwischen etwa 0,025 und etwa 100 um, bevorzugter von etwa 0,025 bis etwa 20 Mikrometer, variieren. Falls erwünscht kann nicht eingekapseltes Arzneimittel aus dem Lösungsmittel entfernt werden. Die durch das obenstehende Verfahren hergestellten IF-Liposomen können weiters zwecks Herstellung von Liposomen, die größenmäßig variieren oder homogen sind, in ihrer Größe weiter verringert werden.
Zusätzlich zur Extrusion können Anfangsliposomen (vor der Zugabe eines Induktors) für das IF-Gel- oder Liposomenverfahren und resultierende IF-Liposomen durch Beschallung oder Homogenisierung in ihrer Größe verringert werden. Die Beschallung verwendet Schallenergie zur Brechung oder Scherung der größeren Liposomen, die sich spontan in kleine Liposomen zurückbilden. Siehe z.B. Chapman, et al., BBA, 163, 255 (1968). Eine Beschallung wird durch Eintauchen einer die Liposomensuspension enthaltenden Glasröhre in das in einem Wannentyp-Beschaller hergestellte Schallepizentrum erzielt. Wahlweise kann ein Sondentyp-Beschaller verwendet werden, in dem die Schallenergie durch Vibration einer Titansonde, die in direktem Kontakt mit der Liposomensuspension steht, erzeugt wird.
Bei der Homogenisierung werden die Scherkräfte, die größere Liposomen in kleinere zerlegen, beispielsweise durch Geräte vom Rotorstator-Typ wie den Polytron (Brinkman Instruments Co., Westbury, New York, USA), ein Gerät vom Rotorstator-Typ wie den Mikroverflüssiger (Microfluidics Corp., Newton, MA, USA) oder irgendeine Anzahl ariderer derartiger Geräte, die üblicherweise zum Brechen von Zellen verwendet werden, erzeugt. Wegen der Tatsache, dass alle obenstehenden Verfahren ein Brechen der IF-Liposomen involvieren, geht eingeschlossener gelöster Stoff verloren, wenn IF-Liposomen irgendeinem dieser Vorgänge unterworfen werden. Der Verlust kann jedoch minimiert werden, wenn der nicht eingeschlossene gelöste Stoff nicht vor der Größenreduktion der Liposomen aus der Liposomensuspension entfernt wird.
Eine Anzahl anderer Techniken kann zur Herstellung von klassierten Liposomen, die einer Interdigitationsfusion zu unterziehen sind, und zur Herstellung von klassierten IF-Liposomen nach Beendigung des Vorgangs angewendet werden. Diese Verfahren umfassen eine umgekehrte Phasenevaporisation, Infusionsvorgänge, eine Homogenisierung, eine Beschallung, eine Mikroverflüssigung und eine Detergensverdünnung oder eine Kombination dieser Verfahren. Eine Betrachtung bestimmter von diesen und anderen Verfahren zur Herstellung von Liposomen ist im Text Liposomes, Marc J. Ostro, Hgb., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1, zu finden. Klassierte Liposomen können auch durch einen Extrusionsvorgang hergestellt werden.
In dem Extrusionsvorgang werden die Liposomen zur Herstellung von klassierten Liposomen durch Filter mit Porengrößen, die im Allgemeinen von etwa 30 nm bis etwa 1 um (Mikrometer) reichen, geleitet, um Liposomen, die größenmäßig von etwa 30 nm bis etwa 1 um (Mikrometer) Durchmesser reichen, herzustellen. Vorzugsweise reicht die Porengröße der Filter, durch die die Liposomen extrudiert werden können, von etwa 100 nm bis etwa 1 um (Mikrometer). Die Filter bestehen im Allgemeinen aus Polycarbonat, die Filter können aber aus jeglichem haltbarem Material bestehen, das nicht mit den Liposomen interagiert und genügend stark ist, um bei ausreichendem Druck eine Extrusion zu ermöglichen. Bevorzugte Filter umfassen "Gerade-durch"-Filter, da sie im Allgemeinen dem höheren Druck der erfindungsgemäßen bevorzugten Extrusionsvorgänge widerstehen können. "Kurvenpfad"-Filter können ebenso verwendet werden. Bei den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden zwecks Erzeugung von Liposomen mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 100 nm Vor-IF-Fusionsliposomen durch Polycarbonatfilter von 50 bis 100 nm extrudiert.
Jeglicher im Stand der Technik verfügbare Extrusionsvorgang kann zur Herstellung von klassierten Liposomen, die einer Interdigitationsfusion unterzogen werden, angewendet werden. Der Extrusionsvorgang kann regelmäßig oder einmal unter hohem Druck ausgeführt werden. Besonders bevorzugte Extrusionsvorgänge zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen jene, die bei Cullis, et al., PCT-Anmeldung PCT/US85/01151, Veröffentlichungsnummer WO 86/00238, unter dem Titel "Extrusion Techniques for Producing Liposomes, veröffentlicht am 16. Jänner 1986, geoffenbart sind.
Andere Verfahren zur Klassierung der erfindungsgemäßen Liposomen entweder vor oder nach der Fusion sind Filtrationsverfahren, die asymmetrische Filter wie beispielsweise AnotecR-Filter gemäß der gemeinsam übertragenen, gleichzeitig anhängigen U.S. - Patentanmeldung mit dem Titel "Liposome Extrusion Process", U.S. -Seriennr. 593,200, eingereicht am 5. Oktober 1990, einsetzen, welche das Extrudieren von Liposomen durch einen porösen Aluminiumoxidfilter vom verzweigten Porentyp beinhaltet.
Wahlweise können die Liposomen unter Anwendung eines Homogenisierungs- oder Mahlvorgangs wie einer Kolloidmühle, zum Beispiel der Gifford Wood-Kolloidmühle, klassiert werden. Die Liposomen können einmal oder mehrere Male durch die Mühle geleitet werden, bis die geeignete Größe und Homogenität erzielt sind, und zur Größenverteilung unter Verwendung entweder des Nicomp-Partikelklassieres oder des Malvern- Partikelklassieres analysiert werden. Die Liposomen können wahlweise durch ein obenstehend besprochenes Mikroverflüssigungsgerät, das die Liposomen ebenso homogenisiert, geleitet werden.
Falls erwünscht können die resultierenden Liposomen in Populationen getrennt werden, indem irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren zum derartigen Trennen angewendet wird; ein solcher Vorgang ist beispielsweise die Tangentialflussfiltration. Dieser Vorgang, wie er für die größenmäßige Trennung von Liposomen angewendet wird, ist in der gemeinsam übertragenen und gleichzeitig anhängigen U.S. -Patentanmeldung mit dem Titel "Method for Size Separation of Particles", Seriennr. 225,327, eingereicht am 28. Juli 1988, geoffenbart.
Bei diesem Vorgang wird eine heterogen klassierte Liposomenpopulation durch einen oder mehr Tangentialflussfilter geleitet, was zu einer Größenverteilung mit einem oberen und/oder unteren Größenlimit führt. Wenn beispielsweise zwei Filter unterschiedlicher Größe verwendet werden, z.B. ein erster Filter mit einer Porengröße von 5 um, gehen Liposomen von weniger als 5,0 um durch den Filter und in das Filtrat, das dann durch einen zweiten Filter von geringerer Porengröße, z.B. einer Porengröße von 2,0 um, geleitet wird. In diesem Fall enthält der Rückstand Liposomen einer homogenen Größenverteilung mit diskreten Größenlimits von 5,0 und 2,0 um. Filter einer alternativen Porengröße können eingesetzt werden, um zu diskreten Populationen mit oberen und unteren Größenlimits zu führen.
Die Liposomen, die in Anwesenheit eines Induktors einer Interdigitationsfusion unterzogen werden, weisen vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,4 um (Mikrometer) oder weniger, bevorzugter von etwa 0,05 um (Mikrometer) oder weniger, und am meisten bevorzugt von etwa 0,025 um (Mikrometer) oder weniger auf. Wahlweise können die klassierten Anfangsliposomen der Erfindung FAT MLVs sein. Die IF-Liposomen, die durch das allgemeine erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, reichen größenmäßig im Allgemeinen von etwa 100 um, aber bevorzugter von etwa 20 um (Mikrometer), bis etwa 0,025 um (Mikrometer) und liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 2 bis 20 um (Mikrometer). Diese resultierenden IF-Liposomen können iri ihrer Größe weiter verringert werden, um durch obenstehend beschriebene Beschallungs-, Homogenisierungs- und Extrusionstechniken Liposomen von variierender Größe herzustellen. Es ist jedoch festzustellen, dass, obwohl diese erfindungsgemäßen IF-Liposomen verkleinert werden können, die Verkleinerung oft zum Verlust von bioaktivem Mittel aus den Liposomen führt. Somit können IF-Liposomen, die einer weiteren Verkleinerung unterzogen werden, z.B. durch den zuvor besprochenen Extrusionsvorgang oder durch andere Vorgänge wie Beschallung und Homogenisierung zur Variierung der Größe der hergestellten Liposomen, vernngerte Konzentrationen an bioaktiven Mitteln einkapseln.
Bioaktive Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter anderem Vitamine, Hormonwirkstoffe, Antimetaboliten, bakterienwachstumshemmende Mittel, pilztötende Mittel, Antibiotika, Proteine, Peptide, Ribo- und Desoxyribonucleinsäuren, Nucleotide, Nucleoside, Oligonucleotide, antihistaminische Mittel, neuropharmakologische Mittel einschließlich Sedativa und Hypnosemittel, Steroide enthaltende und steroidfreie entzündungshemmende Mittel, diuretische Mittel, blutdrucksenkende Mittel, Rhytmusstörungen verhindernde Mittel, immunisierende Mittel, Immunmodulatoren, empfängnisverhütende Mittel, röntgenographische Kontrastmittel, NMR-Kontrastmittel, Antivirenmittel und vaskuläre Erweiterungsmittel umfassen. Bei gewissen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden bei der vorliegenden Erfindung Radiokontrastmittel, NMR-Kontrastmittel, Peptide und natürlich vorkommende, synthetische und halbsynthetische bakterienwachstumshemmende Mittel, z.B. Cephalosporine und Aminoglycoside, verwendet. Beispielhafte Radiokontrastmittel zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Iohexol, Iopamidol, Ioxoglat, Iotrolan, Ioversol, Iothalmat, Iodimid, Iodipamid, Iopromid, Iopentol, Iodixanol, Metrizamid, Mischungen davon und deren pharmazeutisch zulässige Salze. Beispielhafte Aminoglycoside umfassen Gentamycin, Tobramycin und Amikacin.
Geeignete biologische Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen alle Mittel, die bei äußerlicher oder das System betreffender Verabreichung eine günstige biologische Aktivität aufweisen und für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stabil sind. Mittel, die wegen ihrer Einwirkung auf die Haut äußerlich verabreicht werden können, umfassen Salicylsäure, Resorcinol, Phenol, Retinsäure und deren Äquivalente. Andere Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen unter anderem gewisse Desensibilisierungsmittel, zum Beispiel Antigene und Impfstoffe, Vitamine, Nährstoffe wie Aminosäuren, etherische Fette und Mineralien, Retinoide, tumorwachstumshemmende Mittel und Antitumormittel einschließlich gewisser alkylierender Mittel.
Zusätzliche bioaktive Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Benzodiazepine, fiebersenkende Mittel, krampflösende Mittel, juckreizlindernde Mittel, sympathikomimetische Mittel, Dekongestionsmittel, Beruhigungsmittel, krampflösende Mittel, auf der Herz wirkende Mittel, andere Herzmittel, Mittel gegen Erbrechen, Sedativa und Hypnosemittel, Steroide enthaltende Mittel, prämenstruelle Mittel, Mittel zur örtlichen Betäubung und Antibiotika. Andere bakterienwachstumshemmende Mittel, unter anderem einschließlich pilztötender Mittel, können ebenso in der erfindungsgemäßen Erfindung verwendet werden.
Die obenstehend aufgelistete Gruppe von bioaktiven Mitteln, unter anderem einschließlich ihrer pharmazeutisch zulässigen Salze, wird zur erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht gezogen. Eine Bestimmung der Kompatibilitäten der obenstehend aufgelisteten Mittel und der bei erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu verwendenden Mengen liegt im durchschnittlichen Stand der Technik bei Formulierungen. Die Stabilität und Anwendbarkeit von einzelnen pharmazeutischen Mitteln liegen durchaus in den durchschnittlichen Fähigkeiten eines diesen Stand der Technik ausführenden Fachmanns.
Es ist zu erkennen, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen an in einem spezifischen Fall verwendetem bioaktivem Mittel gemäß der Schwere eines pharmakologischen Zustands oder Erkrankungszustands und der erwarteten Pharmakokinetik eines bioaktiven Mittels bei dem einzelnen Patienten variieren können. Die Dosierungen für einen gegebenen Wirt können unter Anwendung herkömmlicher Betrachtungen, z.B. durch einen gewöhnlichen Vergleich der Differentialaktivitäten des abhängigen bioaktiven Mittels mittels eines geeigneten herkömmlichen pharmakologischen Protokolls, bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen IF-Liposomen und Gels können irgendeinem Tier einschließlich Säugetieren wie dem Menschen verabreicht werden. Zur Verabreichung an Menschen bei der Behandlung von Leiden bestimmt der verordnende Arzt schließlich die geeignete Dosierung für eine gegebene Person, und diese kann erwartungsweise gemäß dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des Individuums sowie der Natur und Schwere der Symptome des Patienten variieren. Die vorliegende Erfindung schafft ein leicht verfügbares Verfahren, um breite Variationen bei liposomischen Arzneimittelkonzentrationen zu ermöglichen.
Die Art der Verabreichung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die Stellen im Organismus, an die die Zusammensetzungen abgegeben werden, bestimmen. Beispielsweise kann eine Abgabe an eine spezifische Infektionsstelle am leichtesten durch äußerliche Anwendung (wenn die Infektion extern ist, z.B. auf Bereiche wie die Augen, die Haut, in die Ohren oder auf Leiden wie Wunden oder Verbrennungen) oder durch Aufnahme durch epitheliale oder die Haut und Schleimhaut betreffende Überzüge (z.B. nasal, oral, vaginal, rektal, gastrointestinal, die Schleimhaut betreffend etc.) bewerkstelligt werden. Eine derartige äußerliche Anwendung kann in Form von Cremen oder Salben erfolgen. Die erfindungsgemäßen Interdigitations-Fusionsgels werden vorzugsweise äußerlich angewendet. Allerdings können die erfindungsgemäßen IF-Gels in Formulierungen, in denen das Lipid nach Berührung der Flüssigkeiten des Mundes oder des Magendarmtrakts ein Liposom in situ bildet, oral angewendet werden.
Die ein bioaktives Mittel enthaltenden IF-Liposomen können allein verabreicht werden, werden jedoch im Allgemeinen in Beimischung mit einem pharmazeutischen Träger, ausgewählt in Bezug auf den vorgesehenen Verabreichungsweg und die pharmazeutische Standardpraxis, verabreicht, wodurch pharmazeutische Zusammensetzungen gebildet werden. Die erfindungsgemäßen IF-Liposomen können parenteral, zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Zur parenteralen Verabreichung sind diese Liposomen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung zu verwenden, die andere gelöste Stoffe, zum Beispiel genügend Salze, Glukose oder Dextrose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthalten können.
Zur oralen Art der Verabreichung können die erfindungsgemäßen Liposomen in Form von Tabletten, Kapseln, Pastillen, Pillen, Pulvern, Sirupen; Elixieren, wässrigen Lösungen und Suspensionen und dergleichen verwendet werden. Im Fall von Tabletten umfassen Träger, die verwendet werden können, Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure. Verschiedene Abbaumittel wie Stärke und Gleitmittel können verwendet werden. Zur oralen Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und Polyethylenglycole von hohem Molekulargewicht. Sind wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung gefordert, können gewisse Süßungs- und/oder Geschmacksmittel beigegeben werden.
Bioaktive Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können die obenstehend aufgelisteten umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, und umfassen deren pharmazeutisch zulässigen Salze. Eine Bestimmung der Kompatibilitäten der obenstehend aufgelisteten Mittel und der bei erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu verwendenden Mengen liegen im durchschnittlichen Stand der Technik bei Formulierungen. Die Stabilität und Anwendbarkeit von einzelnen pharmazeutischen Mitteln liegen durchaus in den durchschnittlichen Fähigkeiten eines diesen Stand der Technik ausführenden Fachmanns. Es ist zu erkennen, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen an in einem spezifischen Fall verwendetem bioaktivem Mittel gemäß der Schwere eines pharmakologischen Zustands oder Erkrankungszustands und der erwarteten Pharmakokinetik eines bioaktiven Mittels bei dem einzelnen Patienten variieren können. Die Dosierungen für einen gegebenen Wirt können unter Anwendung herkömmlicher Betrachtungen, z.B. durch einen gewöhnlichen Vergleich der Differentialaktivitäten des abhängigen bioaktiven Mittels mittels eines geeigneten herkömmlichen pharmakologischen Protokolls, bestimmt werden.
IF-Liposomen können fernbeladen werden, zum Beispiel um bioaktive Mittel einzubauen. Falls erwünscht können IF-Liposomen beispielsweise unter Anwendung der Vorgänge von Janoff et al., U.S. -Patent Nr. 4,880,635, oder Schneider et al., U.S. -Patent Nr. 4,229,360, hydratisiert werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung geschaffen und sollten in keiner Weise zur Einschränkung des Gebiets der Erfindung der vorliegenden Anwendung ausgelegt werden.

BEISPIEL 1

Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, erhalten von Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA) umfassende Liposomen wurden in 1 ml wässriger Pufferlösung zu einer Konzentration von 20 mM DPPC gebildet, zusätzlich 0,04 mM Diphenylhexatrien (DPH, erworben von Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) enthaltend. Nach Bildung der Liposomen wurde zu einer endgültigen Konzentration von 0,3 M bis 2,5 M wässriger Lösung Ethanol zugegeben.
DHP fluoresziert maximal beim Einbau in die Liposomendoppelschicht. Eine Interdigitation führt zur Neuorientierung von DPH aus der Doppelschichtmembran bei gleichzeitiger Abnahme der Fluoreszenz. Wie in Fig. 2 gezeigt, ist die Interdigitation größer, wo höhere Ethanolkonzentrationen vorliegen, u.zw. für alle Liposomen. Die Wirkung einer Interdigitation durch dieselbe Ethanolmenge ist bei den Liposomen mit einem größeren Durchmesser größer. In Fig. 2, Fo = DHP-Fluoreszenz bei Fehlen von Ethanol; F = DPH- Fluoreszenz in Anwesenheit von Ethanol. Anregung = 351 nm. Eine Emission wurde zwischen 380 und 580 nm festgestellt und durch Wiegen mengenmäßig bestimmt.

BEISPIEL 2

Lipidmischung von Liposomen

Eine Lipidmischung von klassierten DPPC-Liposomen wurde als Funktion der Größe der Liposomen und der Induktorkonzentration bestimmt. DPPC umfassende Liposomen wurden in einer wässrigen Pufferlösung, enthaltend 20 mM DPPC, gebildet. Eine Markierungspopulation von Liposomen, enthaltend 99 Gew.-% DPPC, 0,35 Gew.-% N- Benzyldiphosphatidylethanolamin (NBD-PE) und 0,65 Gew.-% Rhodamin- Phosphatidylethanolamin, wurde in 1 ml wässriger Pufferlösung gebildet. Diese Sonden bilden ein Donor-Acceptor-Paar. Der NBD-Anteil wird bei 465 nm angeregt und über einen Resonanzenergietransfer (RET) vom Rhodamin-Acceptor gequericht, der selbst in einem distanzabhängigen Phänomen angeregt wird. Diese Liposomen wurden mit leeren Liposomen in einem 1 : 10-Verhältnis vermischt. Emissionsspektren wurden zwischen 480 und 680 nm aufgezeichnet. Eine Lipidmischung in DPPC-Liposomen von variierender Größe als Funktion einer Ethanolkonzentration kann durch den Verlust von RET aus dem NBD-Anteil an den Rhodamin-Anteil bestimmt werden. Eine Standardkurve wurde durch Herstellung von Liposomen aus 0,35 Molprozent NBD-PE und 0,65 Molprozent Rhodamin- PE erzeugt, wobei diese Molprozentsätze fortschreitend auf 0,035 bzw. 0,065 abgesenkt wurden. Ein direkter Vergleich aus den 1/10-Mischungsexperimenten mit dieser Standardkurve zeigt den Grad der Lipidmischung, einen Hinweis auf eine Membranfusion, an.

BEISPIEL 3

Vergleich von aufgefangenem gelöstem Stoff in unterschiedlichen Bläschentypen

Eine Anzahl an liposomischen Formulierungen wurde hergestellt. Die Menge an aufgefangener wässriger Phase wurde bestimmt und für jeden "Typ" von hergestelltem Liposom verglichen. Die Ergebnisse scheinen in der untenstehenden Tabelle 1 auf
Zur Herstellung von IF-Liposomen wurden MLVs, wie untenstehend beschrieben, zu einer endgültigen Konzentration von 20 uMol DPPC pro ml wässrigem Puffer hergestellt. Die MLVs wurden dann in einem Wannentyp-Beschaller bei 50ºC beschallt, bis sie durchsichtig waren (SUVs). Nach Abkühlung der SUVs auf Raumtemperatur wurde Ethanol einer endgültigen Konzentration von 2,0 M in der endgültigen wässrigen Suspension beigegeben. Für die Beispiele A1 und A2 (siehe untenstehende Tabelle 1) wurde Ethanol durch Verdünnung, gefolgt von Waschen, entfernt. Für B1 und B2 wurde Ethanol mittels einer positive Druckverschiebung unter Verwendung von N&sub2; entfernt, wonach die Proben verdünnt und gewaschen wurden. Die Probe C hatte eine Hälfte der anfänglichen Lipidkonzentration von A und B, und die Ethanolentfernung wurde wie für die Probe A erzielt.
Zur Herstellung von MLVs wurden 100 mg DPPC in 5 ml Chloroform in einem Kolben mit rundem Boden zu einem dünnen trockenen Film rotationsverdampft, zu welchem 1 ml wässrige Pufferlösung, enthaltend 0,04 mM Diphenylhexatrien, hinzugefügt wurde. Danach wurde die Lipidmischung kräftig gewirbelt, bis das gesamte Lipid von der Wand entfernt war.
FATMLVs wurden gebildet, indem ungewaschene MLVs, wie obenstehend beschrieben, 5 Gefrier- und Auftauzyklen, wie von Bally et al., U.S. -Patent Nr. 4,975,282, herausgegeben am 4. Dezember 1990, beschrieben, unterzogen wurden.
SPLVs wurden hergestellt, indem der dünne trockene DPPC-Film, wie obenstehend für MLVs beschrieben, gebildet und danach der Lipidfilm in 5 ml Ethylether, dem auch 0,5 ml wässriger Puffer beigefügt wurde, aufgelöst wurde. Diese Mischung wurde danach in einem Wannentyp-Beschaller emulgiert, ein N&sub2;-Strahl wurde zum Rühren der Emulsion verwendet, während der Ether entfernt wurde, wie von Lenk, et al., U.S. -Patent Nr. 4,522,803 beschrieben. Die Etherentfernung wurde fortgesetzt, bis kein zurückbleibender Geruch festgestellt wurde (ungefähr fünf Minuten lang). Die resultierende Lipidmischung wurde in 1 ml wässrigem Puffer resuspendiert.
MPVs wurden, wie im U.S. -Patent Nr. 4,588,578, beschrieben, gebildet, indem eine Monophase aus 100 mg DPPC und 5 ml Chloroform, 5 ml Ethanol und 0,5 ml wässrigem Puffer hergestellt und bis zur Trockenheit rotationsverdampft wurde und der suspendierte Film durch kräftiges Wirbeln in 1 ml wässrigem Puffer resuspendiert wurde.
Zur Bestimmung des erlangten wässrigen Volumens wurden 20 ul von 10 mM 4- Trimethylammonium TEMPO (4-TMAT)-Lösung zu 0,98 ml der liposomischen Suspensionen beigefügt. Die Proben wurden dann gewirbelt, und die äußere wässrige Phase wurde durch Zentrifugation von den Liposomen getrennt. Da 4-TMAT sich weder an die in dieser Studie verwendeten Liposomen bindet, noch diese durchdringt, ist es in der äußeren wässrigen Phase konzentriert. Eine Messung der 4-TMAT-Konzentration ermöglicht die Berechnung der internen wässrigen Phase oder des erlangten Volumens, wie bei Perkins, et al., BBA, 943, 103 (1988), im Detail beschrieben. Die Ergebnisse dieser Analyse scheinen in der untenstehenden Tabelle 1 auf. Wie ersichtlich, kapseln die IF-Liposomen beträchtlich größere Volumina ab, in einigen Fällen soviel wie 10mal jenes, das mit den anderen Liposomentypen erreicht wurde. Tabelle 1 Vergleich von aufgefangenem; gelöstem Stoff
* Die erlangten Volumina wurden unter Anwendung der EPR-Technik (Perkins, et al. (1988) Biochim. Biophys. Acta 943, 103) gemessen, wobei die Proben nach der Bildung überprüft werden.

BEISPIEL 4

Vorgang zur Bildung von IF-Liposomen

Liposomen (LUVs, MLVs, SPLVs etc., wie obenstehend hergestellt), umfassend ein gesättigtes Lipid wie
Dimyristoylphosphatidylcholin,
Dipalmitoylphosphatidylcholin oder
Distearoylphosphatidylcholin, werden hergestellt und durch Extrusion, Beschallung oder Homogenisierung auf 0,4 um (Mikrometer) oder weniger (vorzugsweise 0,025 um (Mikrometer)) klassiert. Ein bioaktives Mittel, das nicht mit dem Lipid interagiert, wird dann mit dem wässrigen Lösungsmittel, das zur Bildung der Liposomen verwendet wird, eingemischt. (Die endgültige Lipidkonzentration sollte etwa 5 bis 100 mM, vorzugsweise etwa 10 bis 35 mM, betragen.) Die Temperatur der Liposomen liegt unterhalb der Hauptphasen-Umwandlungstemperatur des Lipids. Danach wird Ethanol zu einer endgültigen Konzentration von etwa 1,75 bis etwa 2,5 M in dem wässrigen Lösungsmittel hinzugefügt im Fall von mit dem Lipid interagierenden bioaktiven Mitteln werden die Mittel im Allgemeinen nach der Zugabe von Ethanol und der Bildung des IF-Gels dem Lösungsmittel beigefügt. In diesem Stadium kann der Vorgang angehalten und das resultierende Gel bei äußerlichen und oralen Formulierungen verwendet werden. Wahlweise kann das Gel zur Bildung von erfindungsgemäßen IF-Liposomen verwendet werden.
Zur Bildung von IF-Liposomen wird das Gel bei einer unterhalb der Tm des Lipids liegenden Temperatur inkubiert, u.zw. für eine von etwa 1 Minute bis etwa 1 Stunde reichende Periode, gefolgt von einer Inkubationsperiode von etwa 1 Minute bis etwa 1,0 Stunde bei einer oberhalb der Tm des Lipids liegenden Temperatur. Der Induktor wird dann durch Evaporisation, positiven Stickstoffdruck oder Verdünnung entfernt. Im Fall von Ethanol kann das Ethanol auf eine untenstehende Konzentration von etwa 0,2 M verdünnt werden. Bei Entfernung des Induktors bilden sich Liposomen, die größenmäßig im Allgemeinen von etwa 0,25 um (Mikrometer) bis etwa 20 um (Mikrometer) variieren.

BEISPIEL 5

Maßstäbliche Vergrößerung von Diatrizoat-DPPC-IF-Liposomen

600 mg DPPC wurden durch Rotationsverdampfung aus Chloroform zu einem Film getrocknet und danach unter Vakuum 16 Stunden lang weiter getrocknet. Das Lipid wurde durch Inkubation in einem 51ºC-Bad ungefähr 15 Minuten lang in 6 ml 0,9%iger Salzlösung resuspendiert. Die resultierenden multilamellaren Liposomen (MLVs) wurden in eine 30 ml-Corex-Röhre übertragen und zwei Stunden lang bei 51ºC im Bad beschallt, bis die Lösung durchsichtig war. Zu diesem Zeitpunkt konnten nur 4,1 ml Liposomensuspension zurückgewonnen werden. 12 ml Diatrizoat (Renografin-76TM, erhältlich von Bristol-Myers Squibb), 12 ml deuteriertes Wasser ("dH&sub2;O) und 2 ml Ethanol wurden in einer 50 ml- Zentrifugenflasche gemischt, in welche die 4,1 ml Lipid (noch bei 51ºC) hinzugefügt wurden, und wurden danach kurz gewirbelt. Innerhalb von 10 Minuten wurde die Mischung ein loses, gießbares Gel, welches bei Raumtemperatur 2 Stunden lang sich setzen gelassen wurde. Als nächstes wurde die Suspension in einem 51ºC-Bad 1 Stunde lang inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Probe zwecks Erleichterung einer Ethanolevaporisation in die Hälfte geteilt. Während sie noch immer in das Bad getaucht war, wurde N&sub2; für eine Periode von 12 Minuten durch jede Aliquote gesprudelt. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, gefolgt von einer Verdünnung mit 20 ml 0,9%iger Salzlösung pro Aliquote. Das Präparat wurde mittels wiederholter 10-minütiger Zentrifugation bei 10.000 · g und bei 20ºC für 3 Zyklen gewaschen. Die Probe wurde untersucht, wie untenstehend für das Beispiel 6 beschrieben. Die Ergebnisse scheinen in der untenstehenden Tabelle 2 auf. Tabelle 2
1 bezogen auf 12 ml anfänglich hinzugefügtem Diatrizoat

BEISPIEL 6

Diatrizoat-HSPC-IF-Liposomen

400 mg HSPC (Natterman-Phospholipide) wurden bei 70ºC in 10 ml dH&sub2;O etwa 1 Stunde lang hydratisiert und sondenbeschallt, bis sie durchsichtig waren (30 Minuten). 14 ml Diatrizoat (Squibb), enthaltend ungefähr 1 uCi/ml 125I-Diatrizoat, wurden mit 2,1 ml dH&sub2;O und 4,9 ml Ethanol in einer 50 ml-CorexTM-Röhre mit Schraubdeckel vermischt. 7 ml der kleinen unilamellaren HSPC-Liposomen (SUV) wurden während des Mischens beigegeben; dies wurde getan, während die SUVs noch oberhalb ihrer Tm waren. Ein festes Gel bildete sich sofort und wurde bei Raumtemperatur sich setzen gelassen, wobei es ungefähr 1 Stunde lang bedeckt war. Das Präparat wurde dann unbedeckt 2 Stunden lang in einem 70ºC- Wasserbad inkubiert, wonach N&sub2; 23 Minuten lang durch das nunmehr flüssige Präparat hindurchgesprudelt wurde. Die N&sub2;-Durchflussgeschwindigkeit lag beim ManostatTM- Durchflussmesser bei 10. Eine 4 ml-Aliquote wurde in eine 30 ml-CorexTM-Röhre dispensiert und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. 10 ml eines 900 mOsm- Megluminpuffers (hergestellt aus Meglumin, NaCl, Citrat, EDTA) wurden hinzugefügt, und das Präparat wurde kurz gewirbelt. Das nicht eingeschlossene Diatrizoat wurde mittels wiederholter 15-minütiger Zentrifugation bei 10.000 · g und bei 18ºC für 3 Zyklen entfernt. Die endgültige Jodkonzentration wurde durch Extrapolation aus einer UVspektralphotometrischen Probe von Diatrizoat (A256) als 106,3 mg/ml bestimmt. Die endgültige Lipidkonzentration war 12,1 mg/ml, wie durch die von Chen, et al., Analytical Chem., 28, 11, 1756 (1956) beschriebenen Standardmethodenlehren bestimmt. Das endgültige I : L-Verhältnis war 8.8 (w/w). Die resultierende liposomische Suspension wurde bei Umgebungsbedingungen gelagert.

BEISPIEL 7

Iotrolan-HSPC-IF-Liposomen

1 g HSPC (Natterman-Phospholipide) wurde bei 70ºC in 25 ml dH&sub2;0 etwa 1 Stunde lang hydratisiert und sondenbeschallt, bis es durchsichtig war (etwa 30 Minuten). Die hergestellten SUVs wurden in eine 50 ml-CorexTM-Röhre mit Schraubdeckel übertragen und bei 5000 · g etwa fünf Minuten lang gesponnen, um jegliches vorhandenes Titan zu Pellets zu formen. Die SUVs wurden vom Titanpellet dekantiert und etwa 5 Minuten lang in einem 70ºC-Wasserbad inkubiert, bevor sie folgender Lösung beigefügt wurden: 44 ml ¹²&sup5;I markiertes Iotrolan wurden mit 15,6 ml Ethanol und 6,4 ml dH&sub2;O vermischt. Diese Lösung wurde danach in 50 ml-CorexTM-Röhren mit Schraubdeckel in 4 · 16,5 ml Aliquote geteilt. 5,5 ml SUVs wurden während des Mischens in jede Röhre hinzugefügt, was zur Bildung von losen Gels führte. Die Gels setzten sich 1 Stunde lang bedeckt bei Raumtemperatur, danach wurde jedes unbedeckt 1 Stunde lang in ein 70ºC-Wasserbad übertragen, wonach N&sub2; bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 40 am Gasdurchflussmesser 13 Minuten lang durch die Flüssigkeit in jeder Röhre hindurchgesprudelt wurde. Jede Röhre wurde in einen 250 ml- Erlenmeyer-Kolben entleert, wo es auf Raumtemperatur abkühlte. Etwa 150 ml sterile PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne Ca und Mg, pH-Wert 7) wurden beigegeben, während der Kolben gewirbelt wurde. Das nicht eingeschlossene Iotrolan wurde mittels wiederholter 10-minütiger Zentrifugation bei 10.000 · g und bei 18ºC für 3 Zyklen entfernt. Die endgültige Jodkonzentration basierte auf der anfänglichen spezifischen Aktivität der Iotrolan-Lösung bei 300 mg/ml Jod und wurde als 152,7 mg/ml festgestellt. Die endgültige Phospholipidkonzentration wurde durch das Verfahren von Chen, et al., Analytical Chem., 28, 11, 1756(1956); als 32,7 mg/ml bestimmt und auf die Anwesenheit von Phosphat im Puffer korrigiert. Diese Werte resultierten in einem endgültigen I : L-Verhältnis von 4,7 (w/w). Die resultierende Liposomensuspension wurde bei Umgebungsbedingungen gelagert.

Beispiel 8

Lagerstabilität von bei Umgebungsbedingungen gelagerten Radiokontrastmittel-IF- Liposomen

50 ul von entweder Diatrizoat oder von Iotrolan-HSPC-IF-Liposomenpräparaten (radiomarkiert) wurden mit 1 ml ihres ursprünglichen Suspensionspuffers verdünnt und bei 16.000 X g in einem Mikrofugierer bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt, und sowohl die Pellets als auch die Überstände wurden für 125I gezählt. Nach 62 Tagen bei 25ºC waren 4% der Radiomarkierung in dem Überstand der Diatrizoatliposomen, und nach 54 Tagen waren 3% in dem Überstand der Iotrolanliposomen. Basierend auf diesen Ergebnissen weisen die Präparate bei Lagerung bei Umgebungsbedingungen eine Lagerdauer von zumindest etwa 1 Jahr auf

BEISPIEL 9

Wirkung einer anfänglichen Lipidkonzentration auf den Einschluss von Diatrizoat in DPPC- IF-Liposomen

Die in der untenstehenden Tabelle 3 aufscheinenden Ergebnisse stellen IF- Liposomenpräparate dar, die, wie zuvor im Beispiel 5 beschrieben, mit einer Variation bei der anfänglichen Lipidkonzentration hergestellt wurden. In 15 ml-Corex-Röhren wurde 1 ml Diatrizoat kurz mit dH&sub2;O- und DPPC-klassierten unilamellaren Liposomen (SUVs) bei 50 mg/ml vermischt, um das untenstehend gezeigte endgültige Volumen zu erhalten. Vor der Lipidzugabe wurden 87,5 ul Ethanol pro ml (endgültiges Volumen 2 M) der Diatrizoatlösung beigefügt. Die Präparate setzten sich abgedeckelt 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer nicht abgedeckelten Inkubation in einem 51º C-Bad. Nach 1 Stunde wurde N&sub2; durch jede Probe 2 Minuten lang hindurchgesprudelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde jede Probe mit 10 ml 0,9%iger Salzlösung verdünnt und mittels wiederholter 15-minütiger Zentrifugation bei 10.000 g und bei 20ºC für 3 Zyklen gewaschen. Die Proben wurden, wie zuvor beschrieben (Beispiel 3), untersucht. Die Ergebnisse scheinen in der untenstehenden Tabelle 3 auf Tabelle 3
1 bezogen auf 1 ml anfänglich hinzugefügtem Diatrizoat

Beispiel 10

Einschluss von Gentamycin über IF-Liposomen
Eine Lösung aus Gentamycin-Sulfat (Sigma Chemicals, St.Louis, Missouri, USA) wurde in einer 0,9%igen Salzlösung zu einer endgültigen Konzentration von 500 mg/ml hergestellt. Getrennt wurden 100 mg DPPC (Avanti Polar Lipids) bis zur Trockenheit verdampft und in 2,5 ml Salzlösung zu einer endgültigen Konzentration von 40 mg/ml hydratisiert. Die DPPC- Mischung wurde auf einem Wannenbeschaller bis zur Klarheit beschallt.
Danach wurden die folgenden Mischungen hergestellt. Es ist zu beachten, dass der ethanolische Induktor vor den Gentamycin-Sulfat enthaltenden Lösungen beigegeben wurde.
A - 0,5 ml DPPC-Lösung plus Ethanol ("EtOH") (zu einer endgültigen Konzentration von 2 M) und 0,5 ml Gentamycin-Lösung;
B- 0,25 ml DPPC-Lösung plus 0,25 ml 0,9%ige NaCl-Salzlösung, EtOH (zu einer endgültigen Konzentration von 2 M) und 0,5 ml Gentamycin-Lösung;
C - 0,25 ml DPPC-Lösung plus 0,75 ml Salzlösung, EtOH (zu einer endgültigen Konzentration von 2 M) und 1,0 ml Gentamycin-Lösung.
Jedes der obenstehenden Präparate wurde danach durch die biologische Agarquelldiffusionsprüfung hinsichtlich der Gentamycin-Aktivität untersucht; um die Lipid : Gentamycin-Konzentration zu bestimmen. Kurz gesagt, die Liposomen in jedem der obenstehenden Präparate wurden dann mit 0,2% Triton-X 100 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) gebrochen und unter Anwendung einer biologischen Agarquelldiffusionsprüfung hinsichtlich der Gentamycin-Aktivität untersucht, wobei Bacillus subtilis (ATCC #6633) der Anzeigeorganismus war. Eine Lipidkonzentration wurde durch die von Ames, et al., Journal of Biological Chem. 235, 236, 769 (1960), beschriebenen Standardverfahren bestimmt.
Die Ergebnisse der Bestimmungen aus der biologischen Prüfung scheinen in der untenstehenden Tabelle 4 auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sehr niedrige Lipid/Gentamycin-Gewichtsverhältnisse erhalten werden können. Tabelle 4 Einschluss von Gentamycin in IF-Liposomen
1 hinsichtlich der Wirksamkeit korrigiert (616 ug/mg)

Beispiel 11

Maßstäbliche Vergrößerung von DSPC-Iotrolan-IF-Liposomen

Acht (8) Gramm DSPC wurden in 200 ml Wasser zum Einspritzen ("WFI") bei 70ºC 30 Minuten lang gemischt. Die resultierende Suspension wurde 25 Mal bei einem Druck von 758,34 · 10&sup5; Pa (11.000 psi) durch einen MicrofluidizerTM-Homogenisator geleitet, wodurch SUVs gebildet wurden. Die resultierenden SUVs wurden durch einen Milliporet Kurvenpfad-Polymerfilter mit einer Porengröße von 0,22 um gefiltert.
Iotrolan (92 ml, bei 300 mg/ml), 13,4 ml WFI und 32,6 ml Ethanol wurden in einen Kolben mit rundem Boden und einem Fassungsvermögen von 2.000 ml zugemischt. Die SUVs (44 ml) wurden bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) in den Kolben zugemischt und unter Verwendung eines Bananenschaufelmischers 10 Sekunden lang gemischt. Das sich nach dem Mischen gebildete Gel wurde ungestört 1,25 Stunden lang sich setzen gelassen.
Der Kolben mit rundem Boden wurde in ein 70ºC-Wasserbad gesetzt und unter Verwendung der Bananenschaufel bei 66 rpm eine (1) Stunde lang gemischt. Danach wurde Ethanol durch eine ein(1)stündige Stickstoffbesprengung über die wässrige Oberfläche bei einer Geschwindigkeit von 4,7 L N&sub2;/Minute entfernt, wobei das Ethanol in einem Auffanggefäß gesammelt wurde, wobei sich das Mischen auf etwa 135 rpm steigerte. Das endgültige Volumen wurde mit einem Karbonatpuffer (0,4 mg/ml NaHCO&sub3;, 0,1 mg/ml Dinatrium EDTA, in 0,9%iger Salzlösung) auf etwa 400 ml eingestellt. Die resultierenden IF- Liposomen wurden gewaschen, wodurch Liposomen mittels Diafiltration durch ein 0,2 um- Microgon-Filtrationsgerät von nicht eingeschlossenem Iotrolan getrennt wurden. Sieben Waschungen von 100 ml wurden mit Entfernung der letzten 300 ml als Konzentrationsschritt eingesetzt. Dieser Waschschritt dauerte 25 Minuten lang an.
Eine Analyse der resultierenden Iotrolan DSPC-Liposomen ergab die folgenden, in der untenstehenden Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse:

Tabelle 5

Lipidkonzentration 23,0 mM, 18,2 mg/ml
Lyso-PC-Anteil 0,9%
eingeschlossenes Iotrolan 264,8 mg/ml
freies Iotrolan 1,4%
Iotrolan/DSPC 14,5
erlangtes Volumen 13,7 ul/umol
Größenverteilung 90% weniger als 3,6 um 50% weniger als 2,8 um 10% weniger als 1,2 um

BEISPIEL 12

Einkapselungswirksamkeit von DPPC-IF-Bläschen als Funktion einer Ethanolkonzentration

DPPC (Pulver) wurde bei einem pH-Wert von 7,4 mit 10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, auch enthaltend einen Spurenanteil von ¹&sup4;C-Sucrose, zu einer Konzentration von 20 mg/ml DPPC gemischt, u.zw. für eine Gesamtmenge von 2,0 ml. Dieses Mischen erfolgte bei einer oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur von DPPC liegenden Temperatur, bei 50º-53º C, und führte zu MLVs. Die MLVs wurden eine Stunde lang bei 50-53ºC beschallt und auf Raumtemperatur abgekühlt, was zu SUVs mit einem Durchmesser von etwa 30-50 nm führte. Den 2,0 ml SUVs wurde genügend Ethanol (100%) beigefügt, um zu einer Ethanolkonzentration von 3,0 M (0,43 ml Ethanol; 20% Ethanol nach Gesamtgewicht) zu führen; die Mischung wurde bis zur Homogenität gewirbelt. Die Suspension wurde abgedeckelt und ungestört eine Stunde lang bei Raumtemperatur sich setzen gelassen und wurde dann eine Stunde lang bei einer oberhalb der Umwandlungstemperatur von DPPC liegenden Temperatur, d.h. bei 50º-55ºC, inkubiert, wobei die Kappe gelockert wurde. Während sie noch oberhalb der Lipid-Tm inkubierte, wurde ein sanfter N&sub2;-Strahl 3 Minuten lang durch die Mischung hindurchsprudeln gelassen. Eine Probe (100 uL) wurde für eine ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselungsstudie entfernt, und eine 4 uL- und eine 8 uL-Aliquote wurden zur Bestimmung von Pi gemäß der Bartlett-Phosphoruntersuchung von Chen et al. ebenso entfernt. 10 ml Tris/NaCl-Puffer wurden den resultierenden IF-Liposomen beigegeben, und die Mischung wurde bei 9.000 · g 15 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Pellet in einem Tris/NaCl-Puffer resuspendiert und zwei zusätzliche Male für im Gesamten 3 Waschungen zentrifugiert. Das Pellet wurde schließlich in 2,0 ml Puffer resuspendiert. Eine weitere 200 uL-Probe wurde für die Einkapselungsstudie entfernt, sowie eine 4,0 uL- und eine 8,0 uL-Aliquote für die Pi-Untersuchung.
Das obenstehende Verfahren wurde unter Verwendung einer gesamten Ethanolkonzentration von 1,0, 2,0, 2,5, 3,5 und 4,0 M in Lösung wiederholt.
Das interne Volumen der IF-Liposomen ist als uL pro uM des Phosphor-Pi ausgedrückt und wurde mittels ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung und CAT 1 EPR-Verfahren gemessen.
Die ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung wurde wie folgt durchgeführt: Nach dem Schritt des N&sub2;- Sprudelns wurde die für die ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselungsstudie entfernte 100 uL-Probe in einem Szintillationszähler vom Beckman-Modell Ls 6800 gezählt. Gleichermaßen wurde die entfernte 200 uL-Probe nach dem Zentrifugationsschritt unter Verwendung einer Tischplattenzentrifuge bei 3.000 · g zentrifugiert, und sowohl das Pellet als auch der Überstand wurden in dem Szintillationszähler gezählt. Zusätzlich wurde Pi wie zuvor bestimmt. Die ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung wurde dadurch bestimmt, und die Ergebnisse sind in Fig. 4a grafisch dargestellt.
Die CAT 1 EPR-Studie wurde wie im untenstehenden Beispiel 13 durchgeführt.
Wie in Fig. 4c gezeigt, erhöhte sich das interne Volumen der DPPC-IF-Liposomen als Funktion einer gesteigerten Ethanolkonzentration, was mit einer höheren Einkapselungswirksamkeit von Liposomen bei höheren Ethanolkonzentrationen übereinstimmte. Der Prozentsatz an DPPC, der nach den drei Zentrifugationswaschungen gewonnen wurde, ist in Fig. 4c gezeigt.

BEISPIEL 13

Einkapselungswirksamkeit von DSPC-, DHPC-, DOPC- und EPC-IF-Bläschen, wie mittels Sucrose- und EPR-Verfahren gemessen

Die Verfahren des Beispiels 12 wurden unter Verwendung der Lipide DSPC, DHPC, DOPC und EPC wiederholt, wobei eine endgültige Konzentration von 3,0 M Ethanol eingesetzt wurde. Die der Ethanolzugabe folgenden Inkubatiorien bei niedriger Temperatur wurden für DOPC und EPC bei 50ºC durchgeführt. Die Inkubation bei hoher Temperatur wurde für alle Proben bei 70ºC durchgeführt.
Eine Inkubationen von DSPC fand bei 70ºC, von DHPC bei 50ºC und von DOPC und EPC bei Sº C statt.
Die DOPC- und EPC-Proben wurden nicht mittels Zentrifugation gewaschen, sondern durch die Filter eines AmiconTM-30K-Mikrokonzentrationsgeräts (Grace Co.) gefiltert. 100 uL- Aliquote wurden für eine Einschlusswirksamkeitsanalyse vor und nach der Filtration aus dem Filtrat und aus der Probe entfernt.
Die Einschlusswirksamkeit wurde durch die Sucrose-Einkapselung, die CAT 1 EPR- und TEMPONE EPR-Verfahren und Verfahren zur Durchführung, die alle untenstehend angeführt sind, berechnet.
Wie in Fig. 5 gezeigt, stellte jedes der drei Phosphatidylcholine, von denen bekannt ist, dass sie interdigitieren (DPPC, DSPC und DHPC), IF-Liposomen mit großen internen Volumina her. EPC und DOPC hatten relativ geringe interne Volumina, waren relativ klein und konnten nicht unter Verwendung einer Tischplattenzentrifuge (9.000 · g) zu Pellets geformt werden. Daher war es nicht möglich, die internen Volumina dieser Liposomen unter Anwendung des CAT 1 EPR-Verfahrens zu messen.

CAT 1 EPR-VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES EINSCHLUSSES

Dieses Verfahren ist alternativ als das bei Perkins et al., 1988, Biochim. Biophys. Acta, 943 : 103-107, beschriebene externe Lösungsmittelvolumenverfahren bekannt. Das interne Volumen von Liposomen wurde durch Abziehen des externen Lösungsmittelsvolumens bestimmt und durch Messen der Konzentration einer Membranen-undurchdringlichen Spinsonde aus dem Gesamtvolumen der Liposomensuspension berechnet. Das externe Lösungsmittelvolumen wurde durch Zugabe einer bekannten Menge eines Spinsonden-4- Trimethylammonium-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyliods ("CAT 1") zu einer Liposomensuspension berechnet. Die Liposomensuspension wurde zur Pelletformung der Liposomen zentrifugiert. Die Konzentration von CAT 1 in dem Lösungsmittel wurde durch Vergleich der Magnitude des CAT 1 EPR-Signals aus dem Überstand mit einem EPR-Signal gegenüber einer CAT 1-Konzentrationskalibrierungskurve bestimmt. Die CAT 1- Konzentration in dem Überstand war höher als jene, die auf Basis der Menge an zugegebenem CAT 1 zu erwarten wäre, da das für die Spinsonde verfügbare Volumen verringert wurde, als die Sonde vom inneren Volumen der Liposomen ausgeschlossen wurde. Eine Korrektur wurde wegen der Lipide selbst auch für das Probenvolumen durchgeführt.
Vorgan: Eine Stammlösung, enthaltend 10 mM CAT 1, 10 mM Tris HCl (pH-Wert 7,4), 150 mM NaCl, wurde für die Kalibrierungspufferlösungen, enthaltend 100, 200, 300 und 400 uM CAT 1, verwendet. Das EPR-Spektrum jeder Stammlösung wurde mit einem Brucker ER 100D-Spektrometer aufgezeichnet. Die Spitzenwert-zu-Spitzenwert-Höhe der MI = +1-Resonanzlinie jedes für jede Konzentration gemessenen Spektrums und eine Spitzenwerthöhe-versus-CAT I -Konzentrationskurve wurden erstellt.
CAT 1-Ausgangsmaterial (0,20 uM) wurde 1,00 ml der Liposomensuspension (Vt) beigegeben und durch Wirbeln gemischt. Die Liposomen wurden durch Zentrifugation auf einer Tischplattenzentrifuge bei 9.000 · g zu Pellets geformt, und ein kleiner Anteil des Überstands wurde in ein EPR-Kapillarröhrchen gezogen und abgeschlossen. Die Spitzenwert-zu-Spitzenwert-Höhe der MI = 1-Resonanzlinie wurde gemessen. Die Lösungsmittelkonzentration von CAT 1 wurde aus der Magnitude des Proben-EPR-Signals und der Kalibrierungskurve gemessen.
Das externe Lösungsmittelvolumen Vo wurde durch die Kalibrierungskurve erhalten. Das externe Lösungsmittelvolumen Vo ist gleich M/C, wobei M die Mole von hinzugefligtem CAT 1 und C die CAT 1-Konzentration im Überstand ist. V1 ist das vom Lipid eingenommene Volumen und ist als Vi = 1.00-Vt-V 1 ausgedrückt, wobei V 1 das Volumen des Lipids ist. Das interne Volumen, Vi, geteilt durch den Phosphatgehalt der Probe, ergibt das interne Volumen pro uM Pi, was die Standardmethode zum Ausdrücken des internen Volumens von Liposomen ist.

TEMPONE-EPR-VERFAHREN ZUR EINSCHLUSSBESTIMMUNG

Dieses Verfahren ist alternativ als das bei Anzai et al., Biochim. Biophys. Acta 1988, 937 : 73-80, beschriebene Verbreiterungsmittelverfahren bekannt. Das interne Volumen von Liposomen wird durch Messung der Menge an Membran-durchdringlichem EPR- Spinsonden-Verbreiterungsmittel bestimmt. Normalerweise haben schnell fallende wässrige EPR-Spinsonden relativ schmale Spektrallinienformen, eine Zugabe von paramagnetischen Ionen verringert allerdings die Spin-Spin-Abklingzeit (T&sub2;). Liegt das Verbreiterungsmittel in einer ausreichend hohen Konzentration vor, kann es die Spektrallinienform drastisch erweitern und die Spitzenwert-zu-Spitzenwert-Höhe von EPR-Signalen dramatisch absenken. Hat das EPR-Verbreiterungsmittel Zugang zur Spinsonde, so wird das Sondensignal tatsächtlich eliminiert.
Die Messungen werden durch Zugabe des Membran-durchdringlichen EPR-Spimsonden-4- Oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyls ("TEMPONE") zu Liposomensuspensionen durchgeführt. Die zwei 200 ul-Aliquote wurden von jeder Liposomensuspension entfernt. Eine der Aliquote wurde mit 200 ul Puffer verdünnt, während die andere mit 200 ul Puffer plus dem Membran-undurchdringlichen Verbreiterungsmittel Kaliumtris(oxalat)chromat (III) verdünnt wurde. Das EPR-Signal aus der mit einem Puffer verdünnten Aliquote ist proportional zum gesamten Probenvolumen, während das EPR-Signal aus der mit dem Kaliumtris(oxalat)chromat (III) verdünnten Aliquote zum Probenvolumen in den Liposomen proportional ist.
Vorgang: Eine Stammlösung aus 50 mM TEMPONE, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 150 mM NaCl-Stammlösung wurde hergestellt. Ein TEMPONE-Ausgangsmaterial (10 ul) wurde 0,5 ml Liposomensuspension beigegeben und durch Wirbeln gemischt. Eine 200 ul-Aliquote wurde aus jeder Probe genommen und mit 200 ul Puffer verdünnt. Eine weitere 200 ul- Aliquote wurde genommen und mit einer 100 mM-Kaliumtris(oxalat)chromat (III)-, 50 mM- NaCl-Lösung verdünnt. Die osmotische Stärke des Puffers und der Chromlösungen wurde zuvor mit einem Dampfdruckosmometer geprüft, um sicherzustellen, dass sie gleich 1-2% waren. Die Proben wurden durch Wirbeln gemischt.
Die EPR-Spektren wurden mit einem Brucker-ER 100D-Spektrometer aufgezeichnet. Proben wurden in EPR-Kapillarröhrchen gezogen und abgeschlossen. Das EPR-Spektrum der Pufferprobe wurde zuerst aufgezeichnet, die Chromlösungsprobe wurde danach hergestellt, und das EPR-Spektrum dieser Probe wurde unmittelbar danach aufgezeichnet. Die Spitzenwert-zu-Spitzenwert-Höhe der MI = -1-Resonanzlinie wurde zur Messung der relativen Konzentrationen der unbeeinflussten Spinsonde in beiden Proben verwendet. Das gesamte Probenvolumen war zur EPR-Signalgröße einer Puffer verdünnten Aliquote, geteilt durch das Spektrometer-Verstärkungssetzen (ST), proportional, während das interne Volumen der Liposomen zum EPR-Signal der mit einer Chromlösung verdünnten Aliquote, geteilt durch das Verstärkungssetzen (SI), proportional war. Das interne Probenvolumen (Vi) ergab sich durch die SI/ST-Zeiten des Probenvolumens V. Das interne Volumen, Vi, der Probe wurde durch den Phosphatgehalt der Probe geteilt, um das interne Volumen pro uM Pi anzugeben, was die Standardmethode zum Ausdrücken des internen Volumens von Liposomen ist.

BEISPIEL 14

Einkapselungswirksamkeit von DPPC LUVET-IF-Bläschen als Funktion einer Anfangsgröße von Liposomen

DPPC (422 mg Pulver) wurde mit 21 ml Tris/NaCl mit einem Spurenanteil von ¹&sup4;C-Sucrose gemäß der Verfahren des Beispiels 12 hydratisiert, u.zw. für eine Gesamtkonzentration von DPPC von 20 mg/ml. Ein Mischen durch Wirbeln der Probe bei 50-55ºC führte zu DPPC MLVs. FAT MLVs wurden gemäß der Verfahren von Cullis et al., U.S. -Patent Nr. 4,975,282, herausgegeben am 4. Dezember, 1990, für eine Gesamtheit von 10 Gefrier- und Auftauzyklen hergestellt. Die resultierenden DPPC FATMLVs wurden zehnmalt extrudiert, wobei der LUVET-Apparat gemäß der Verfahren von Cullis et al., PCT-Anmeldung PCT/US85/01161, Veröffentlichungsnummer WO 86/00238 mit dem Titel "Extrusion Techniques for Producing Liposomes", veröffentlicht am 16. Jänner 1986, bei 60º-65ºC verwendet und ein einzelner 1,0 um-Nuclepore-Polycarbonatfilter eingesetzt wurde. 2 ml der LUVET-verarbeiteten Liposomen wurden beiseitegestellt.
Das obenstehende Verfahren wurden unter Einsatz von 0,4, 0,2 und 0,1 um- Polycarbonatfiltern wiederholt, bis 2,0 ml LUVET-Proben mit den folgenden Durchmessern hergestellt waren: 0,1, 0,2, 0,4 und 1,0 um.
Bei Einsatz von FAT MLVs für die Zwecke dieses Beispiels wurden diese wie gehabt ohne Extrusion verwendet. SUVs wurden gemäß der Verfahren des Beispiels 12 durch Beschallung der verbliebenen 0,1 um gefilterten LUVETs hergestellt.
Die internen Volumina dieser Liposomen wurden mittels ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung sowie CAT 1 EPR- und TEMPONE EPR-Verfahren, wie obenstehend beschrieben, berechnet.
Wie in Fig. 6 außer für die FATMLVs gezeigt, erhöhte sich das interne Volumen der IF- Liposomen mit einer verringerten Größe von "Ausgangs"-Liposomen, z.B. Liposomen vor der Ethanolzugabe; wobei diese Ergebnisse darauf hinwiesen, dass der Durchmesser des Ausgangsliposoms ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung des endgültigen Volumens des IF-Liposoms war.

BEISPIEL 15

Bildung von Interdigitations-Fusionsbläschen

Interdigitations-Fusionsbläschen (IFVs) können aus Phospholipiden oder Kombinationen von Phospholipiden, die einer Interdigitation unterzogen werden, wie DPPC oder DSPC, z.B. durch Hervorrufen einer Interdigitationsfusion von solche Phospholipide umfassenden, kleinen unilamellaren Bläschen (SUVs) gebildet werden. Die Koaleszenz von IrIPPC SUVs in interdigitierte Lagen und die Umwandlung dieser Lagen in IFVs sind in den Fig. 24 und 25 durch eine optische Phasen-Kontrastmikroskopie bzw. eine Gefrierbruch- Elektronenmikroskopie gezeigt. Die optische Phasen-Kontrastmikroskopie wurde unter Verwendung eines Leitz Laborlux D-Mikroskops in Kombination mit einem Wild MP545- Belichtungsmesser durchgeführt. Ein Kodak GC 135-24-Farbdruckfilm wurde zur Aufnahme der Bilder verwendet. Die Proben wurden bei Raumtemperatur beobachtet. Die Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie wurde durchgeführt, indem eine 0,1 bis 0,3 Mikroliteraliquote von Probe zwischen einem Paar Balzer-Kupferstütztafeln (Nashua, NH) aufgeschichtet wurde und die Probe danach rasch von der Raumtemperatur in flüssiges Propangas eingetaucht wurde. Die Proben wurden gebrochen und auf einer Balzers BAF 400-Gefrierbrucheinheit bei minus 115 Grad Celsius und bei einem Vakuum von 4 · 10&supmin;&sup7; mbar repliziert. Die Reproduktionen wurden in 3 N Salpetersäure abgeschwemmt und in einer Reihe von Clorox-Lösungen gewaschen. Die Reproduktionen wurden betrachtet und in einem Philips 300-Elektronenmikroskop in Vergrößerungen von zwischen 6.000X und 27.000X fotografiert.
Die Bildung von interdigitierten Lagen aus den DPPC SUVs erfolgte unmittelbar nach der Zugabe von Ethanol. Die optisch klare SUV-Suspension wurde schnell in eine undurchsichtige hochviskose Flüssigkeit umgewandelt. Die interdigitierten Lagen, die diese undurchsichtige Suspension umfassten, hatten Abmessungen in der Größe von Hunderten von Mikrometern, wie in Fig. 24a angezeigt. Ein Erhöhen der Temperatur auf über die Tm von DPPC wandelte die interdigitierten Lagen schnell in relativ große unilamellare Bläschen um. Die anzahlgemittelte Größenverteilung von bei 20 mgiml mit 4,0 M Ethanol gebildeten DPPC IFVs ist in Fig. 26 gezeigt. Die Verteilung war relativ homogen, wobei die meisten Liposomen im Bereich von 2 bis 6 Mikrometer lagen. Das interne Volumen der DPPC IFV- Präparate, das zum Erhalten der in Fig. 26 gezeigten Daten im Durchschnitt ermittelt wurde, betrug 20,2+/-0,2 u1/uM, während die mit 44,3+1-12,5 M angezeigten Messungen der NMR-Lamellarität des DPPC in der äußeren Monoschicht der Liposomen waren, Dies stimmt mit einer statistischen Lamellarität von 1,13+/-0,32 überein. Somit waren die DPPC IFVs überwiegend unilamellar.
Die Wirkungen einer variierenden Ethanolkonzentration, eines Vorläuferbläschendurchmessers und einer Lipidkonzentration auf das interne Volumen von DPPC IFVs sind in Fig. 27 gezeigt. Fig. 27a zeigt die Wirkung eines Variierens der Ethanolkonzentration, die zur Herstellung der interdigitierten Lagen aus den DPPC SUVs verwendet wurde. Das interne Volumen wurde unter Verwendung der ESR-Spinsonde CAT- 1, wie zuvor beschrieben, gemessen. Für Ethanolkonzentrationen von 3,0 M und darüber wurden die DPPC IFVs durch Zentrifugation vom Lösungsmittel abgetrennt. Bei Ethanolkonzentrationen von 2,0 M und darunter wurden die Liposomen durch Filtration durch einen Whatman-0,02 Mikrometer-Anotop-25-Filter (Whatman, Inc., Clifton, NJ) vom Lösungsmittel abgetrennt. Dieser Filter wurde ausgewählt, da sich die kationische Spinsonde CAT-1 nicht an ihn bindet.
Das interne Volumen von DPPC IFVs stieg von Ethanolkonzentrationen von 2,0 M bis 4,0 M linear an. Es gab weder beim durchschnittlichen Partikeldurchmesser, noch bei der Lamellarität von bei 2,0 M Ethanol gebildeten DPPC IFVs einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu jenen, die bei 4,0 M gebildet wurden. Dies weist darauf hin, dass der beobachtete Anstieg des internen Volumens an Unterschieden bei den Liposomenformen lag. IFVs wurden bei Ethanolkonzentrationen, die höher als 5,0 M waren, nicht effizient gebildet.
Fig. 27b zeigt, wie der Interdigitations-Fusionsvorgang von den Durchmessern dler Vorläufer-DPPC-Liposomen abhängt. Die Ethanolkonzentrationen bei den Experimenten, deren Ergebnisse in der Figur zusammengefasst sind, wurden bei 4,0 M gehalten, was nahe bei der optimalen Konzentration zum Erhalten großer interner Volumina bei DPPC SUVs zu sein schien. Der Durchmesser von Vorläufer-DPPC LUVETs wurde durch quasielektrische Lichtstreuung unter Verwendung eines Malvern-3600 E-Laserbeugungspartikelldassieres (Malvern Instruments, Malvern, England) bestimmt. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur mit stark verdünnten Proben durchgeführt. Die anzahlgewogene Partikeldurchmesserverteilung wurde durch das Instrument mit dem Laserbeugungsmuster berechnet. Vorläuferbläschen unter 100 nm ergaben DPPC IFVs mit den größten internen Volumina. Große IFVs wurden nicht beobachtet, außer wenn der Durchmesser dler Vorläuferbläschen 150 nm oder weniger betrug. Bläschen mit einer Größe von 200 nm oder mehr waren als Vorläuferliposomen relativ ineffizient.
Die Wirkung von anfänglichen DPPC SUV-Konzentrationen auf die internen Volumina der bei 0,4 M Ethanol gebildeten IFVs ist in Fig. 27c gezeigt. Wie angezeigt verringerte sich das interne Volumen bei Anhebung der Lipidkonzentration in der interdigitierten Lagensuspension auf über 10 mg/ml. Bei höheren Lipidkonzentrationen ist zu erwarten, dass die Bläschen dicht gepackt sind, wenn das Verhältnis zwischen internem und externem wässrigem Volumen begrenzend wird. Das Packproblem führte zu einem signifikanten Anstieg der Lamellarität für die bei hohen Lipidkonzentrationen gebildeten DPPC IFVs. Die statistische Lamellarität für bei 100 mg/ml gebildete DPPC IFVs betrug 2,9, im Vergleich zu einem Wert von 1, 1 für bei 20 mg/ml gebildete DPPC IFVs.
Unter Anwendung von für DPPC optimierten Parametern wurden IFVs hergestellt, wobei eine Vielfalt von gesättigten Phospholipiden (DMPC, DHPC, DSPC und DAPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)) verwendet wurde. IFVs wurden typischweise in 4 ml-Chargen unter Verwendung einer Lipidkonzentration von 20 mg/ml hergestellt. Zwei Lipide enthaltende Proben wurden bei 30 mM Gesamtlipid hergestellt. Die Bläschen wurden in Behältern wie Szintillationsampullen oder -röhren mit Deckeln hergestellt. Eine SUV- Suspension aus dem erwünschten Phospholipid wurde in den Behälter übertragen. DPPC-, DSPC-, DHPC- und DAPC-Proben wurden bei Raumtemperatur abgeglichen, während DMPC-, DOPC- und EPC-Proben auf zwischen 4 und 6 Grad Celsius abgekühlt wurden. Ein isothermisches Volumen von absolutem Ethanol wurde hinzugegeben, um die endgültige Ethanolkonzentration in der Probe auf 4,0 M zu bringen. Die Proben wurden unmittelbar danach gewirbelt. Dieser Vorgang wandelte die durchsichtige SUV-Suspension rasch in eine extrem zähflüssige, undurchsichtige weiße Suspension aus Phospholipid-Lagen um. Der Schritt der Ethanolzugabe wurde modifiziert, als die zum Hervorrufen einer Interdigitation verwendete endgültige Ethanolkonzentration 1,5 M oder weniger betrug. Für solche Proben wurden gleiche Volumina der SUV-Proben bei 40 mg/ml und einer Puffer/Ethanol-Lösung bei zweimal der erwünschten endgültigen Ethanolkonzentration vermischt. Dieser Vorgang war erforderlich, um ein Auftreten von örtlich hohen Ethanolkonzentrationen in der SUV- Probe vor deren vollständigen Vermischung zu verhindern. Diese Wirkung produzierte ein Mischungsartefakt von großem internem Volumen bei den niedrigen Ethanolkonzentrationen. Es wurde kein Unterschied im internen Volumen der bei den 2,0 M- Ethanolkonzentrationen gebildeten DPPC IFVs zwischen der dirketen Zugabe des Ethanols gegenüber der Zugabe von vorverdünntem Ethanol beobachtet.
Nach der Ethanolzugabe wurden die Proben abgeschlossen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, abgesehen von den DMPC-, DOPC- und EPC-Proben, die bei 4- 6ºC inkubiert wurden. Die Deckeln auf den Proben wurden gelockert, und die Proben wurden danach weitere 30 Minuten lang bei derselben, oberhalb der Tm liegenden Temperatur inkubiert. DMPC-, DOPC- und EPC-Proben wurden bei 40-45ºC inkubiert.
DPPC- und DHPC-Proben wurden bei 50-55ºC inkubiert, während DSPC- und DAPC- Proben bei 70-75ºC inkubiert wurden. Das Ethanol wurde typischerweise in einem zweistufigen Vorgang entfernt, der zuerst ein Besprengen der Proben durch Hindurchsprudeln eines sanften Stickstoffstrahls durch die Probe oberhalb der Liipid-Tm beinhaltete. Die Proben wurden dann dreimal bei Raumtemperatur durch 15-minütige Zentrifugation bei 12.000 g unter Verwendung einer Sorvall RESB-Zentrifuge (DuPont Instruments, Wilmington, DE) gewaschen, wobei ein Sorvall SA-600-Rotor verwendet wurde. Dies reichte aus, um die IFVs rasch zu Pellets zu formen. Typischerweise wurden 901 100% des Anfangsphospholipids im IFV-Pellet gewonnen, wenn 3,0-4,0 M Ethanol zur Herstellung der Interdigitations-Fusionslagen verwendet wurde. Das IFV-Pellet wurde in der Folge in NaCl/Tris-Puffer bei einer nahe 20 mg/ml liegenden Konzentration resuspendiert und bei Raumtemperatur gelagert. IFV-Phospholipidkonzentrationen wurden durch eine modifizierte Bartlett-Untersuchung bestimmt (Bartlett, J. Biol. Chem. 234 : 466 (1959).
Dieselben allgemeinen Vorgänge wurden zur Herstellung von IFVs aus zwei Phospholipiden angewendet. Ethanol wurde unterhalb der Tm der Mischung hinzugegeben; die Hochtemperaturinkubation wurde ebenfalls oberhalb der Tm der Mischung durchgeführt.
Ein Einbau von Cholesterol in DPPC IFVs wurde durch Zugabe von DPPC/Chol SUVs mit einem 1 : 1 Molverhältnis in 4,0 M Ethanol zu DPPC-interdigitierten Lagen, ebenso bei 4,0 M Ethanol, durchgeführt. Die interdigitierten DPPC-Lagen wurden gemäß der zuvor beschriebenen Vorgänge aus DPPC SUVs bei einer Konzentration von 30 mM unter Verwendung von 4,0 M Ethanol hergestellt. DPPC/Chol SUVs in 4,0 M Ethanol wurden bei Raumtemperatur auf eine Weise in die interdigitierten Lagen gemischt, um das erwünschte Chol : DPPC-Molverhältnis mit einer endgültigen Lipidkonzentration von 30 mM zu ergeben. Die Mischungen wurden danach bei 50-55ºC 45 Minuten lang inkubiert und 5 Minuten lang mit Stickstoff oberhalb der Lipid-Tm besprengt, um das Ethanol zu entfernen. Da die Größe der Produkt-DPPC/Chol-IFVs mit ansteigender Cholesterolkonzentration abnahm, wurde der Zentrifugations/Waschschritt ausgelassen. Kontrollexperimente zeigten, dass das Auslassen dieses Schritts das endgültige interne Bläschenvolumen nicht beeinflusste.
Fig. 28 zeigt die internen Volumina von aus DMPC, DPPC, DHPC, DSPC und DAPC SUVs hergestellten IFVs. Die internen Volumina von aus Phospholipiden gebildeten Bläschen, die keiner Ethanol-induzierten Interdigitationsfusion unterzogen werden, z.B. EPC und DOPC, betrugen weniger als 1 Mikroliter/uM Pi.
Die Interdigitations-Fusionstechnik war sehr wirksam bei Anwendung auf SUVs, die zwei oder mehr Phospholipide umfassten, die einer Ethanol-induzierten Interdigitationsfusion unterzogen werden können. Beispielsweise betrug das interne Volumen von aus DSPC/DPPC oder DPPC/DPPG SUVs unter Verwendung von 3,0 M Ethanol gebildeten IFVs 13,7+/-0,7 bzw. 16,7+/-1,7. Die DSPC-Molbrüche für die DSPC/DPPC SIJVs waren 0, 0,20, 0,50, 0,67, 0,80 und 1,00, während die DPPG-Molbrüche 0, 0,17, 0,50, 0,67, 0,83 und 1,00 waren. Eine Zugabe von keine Interdigitation eingehenden Lipiden zu den Vorläufer- SUVs (z.B. Cholesterol oder DOPC) hemmte die Bildung von interdigitierten Lagen. Dies stimmt mit Komatsu und Rowe (Biochem. 30 : 2463 (1991) überein, die herausfanden, dass Cholesterol eine Doppelschicht-Interdigitation hemmte. Wenn jedoch SUVs zugegeben wurden, die keine Interdigitation eingehende Lipide enthielten, nachdem dem Ethanol ermöglicht wurde, eine Interdigitation einzuleiten, so fusionierten beide Bestandteile in einem gemischten Lipid-IFV bei Anhebung der Temperatur über die Tm (siehe Fig. 29).
Das interne Volumen der aus DPPC/Chol SUVs gebildeten IFVs verringerte sich rasch bei Anstieg des Choleterolgehalts. Das interne Volumen der Produkt-IFVs betrug weniger als 4 ul/uM Pi bei 20 Molprozent Cholesterol. Im Gegensatz dazu vergrößerte eine Zugabe des Cholesterols nach der Bildung von DPPC-interdigitierten Lagen das interne Volumen der IFVs für ein gegebenes Molprozent Cholesterol signifikant. Das Cholesterol wurde in Form von DPPC/Chol SUVs mit einem 1 : 1 Molverhältnis in 4,0 M Ethanol zugegeben. Eine Differentialscanning-Kalorimetrie von 35 Molprozent DPPC/Chol IFVs, hergestellt durch eines der Verfahren, zeigte, dass der DPPC-Gel-zu-Flüssigkeit-Kristallinphasenübergang bei 41ºC in beiden Proben eliminiert wurde. Dies zeigte, dass Cholesterol, das nach der Bildung der DPPC-interdigitierten Lagen zugegeben wurde, in die Produkt-DPPC/Chol IFVs eingebaut wurde.

BEISPIEL 16

Einbau von DPPG in DPPC-IF-Liposomen

IF-Liposomen wurden gemäß der Verfahren des Beispiels 12 mit den folgenden Modifikationen aus DPPC/Dipalmitoylphosphatidylglycerin(DPPG)-SUV s hergestellt. Eine Gesamtheit von 30 mM Phospholipid (DPPC und DPPG) wurde eingesetzt, 0,17 Molbruch (17 Molprozent) DPPG. Jeweils in Chloroform befindliches DPPC und DPPG wurden in einen Kolben mit rundem Boden (50 ml Fassungsvermögen) hinzugegeben und gut vermischt. Die Lipide wurden im Kolben durch negativen Druck (Rotationsverdampfung) zu einem dünnen Film getrocknet, und der resultierende Film wurde mit 2,0 ml Tris/NaCl- Puffer hydratisiert und auf eine Temperatur von 50-55ºC erhitzt. Eine Gesamtkonzentration von 3,0 M Ethanol wurde eingesetzt. Eine Spurenmenge von ¹&sup4;C-Sucrose wurde der Probe beigegeben, und die Suspension wurde bis zur Klarheit beschallt. Nach Entfernung des Ethanols und Inkubation der Mischung auf 50º-55ºC wurden IF-Liposomen gebildet.
Das interne Volumen der Liposomen wurde mittels ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung und TEMPONE EPR-Verfahren gemäß der Verfahren des Beispiels 13 berechnet.
Die obenstehenden Verfahren wurden mit 1,0, 0,83, 0,66, 0,50 und 0,00 Molbruch (100, 83, 66, 50 und 0 Molprozent) DPPG wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 7a und b grafisch in Tabellenform dargestellt.
Bei höheren DPPG-Brüchen wurden IF-Liposomen nur in niedrigen Prozentsätzen gewonnen, da sich die Liposomen während des Waschschritts nicht gut zu Pellets formten, ein für negativ geladene Liposomen typisches Problem. Die internen Volumina der in den Pellets gewonnenen IF-Liposomen sind in Fig. 7a gezeigt. Die offenen Kreise sind die durch ¹&sup4;C-Einkapselung gemessenen Volumina, während die vollen Kreise die durch die Verbreiterungsmittel-(TEMPONE) EPR-Technik gemessenen Volumina sind. Fig. 7b zeigt den Gewinn in Prozent von Pi (volle Kreise) und ¹&sup4;C-markierter Sucrose (offene Kreise) als Funktion von DPPG.

BEISPIEL 17

Erlangtes Volumen und Einkapselung als Funktion einer anfänglichen DPPC-Konzentration

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 12 wurden befolgt, um 2,00 ml DPPC-IF- Liposomen bei 20 mg/ml zu bilden.
Die obenstehenden Vefahren wurden unter Einsatz von 2,0, 10,0, 20,0, 80,0 und 160,0 mg DPPC wiederholt, was zu fünf Proben von 2,00 ml DPPC-IF-Liposomen bei folgenden DPPC-Konzentrationen führte: 2,5, 5,0, 10,0, 40,0 und 80,0 mg/ml DPPC.
Der Prozentsatz der ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung und die internen Volumina jeder Probe wurden gemäß der Verfahren des Beispiels 13 berechnet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 8a und b grafisch dargestellt. Fig. 8a zeigte, dass die Einkapselung von Sucrose mit der anfänglichen DPPC-Lipidkonzentration ansteigt. Fig. 8b zeigt das interne Volumen der DPPC-IF-Liposomen, welches sowohl durch das ¹&sup4;C-Sucrose- Verfahren (offene Quadrate) als auch das EPR-Verfahren (volle Rhomben) gemessen wurde.
Das interne Volumen der IF-Liposomen betrug etwa 15 bis 20 ul/uM Pi, wenn die anfängliche DPPC-Konzentration 1 bis 20 mg/ml betrug. Eine mit dem Malvern- Partikelklassierer durchgeführte Messung wies darauf hin, dass der durchschnittliche Durchmesser dieser Liposomen (enthaltend 10 mg/ml und 20 mg/ml Lipid) etwa 7,0-7,5 um beträgt (siehe Fig. 9a und b). Dies zeigt, dass das interne Volumen von durch das IF- Verfahren gebildeten DPPC-Liposomen viel größer als herkömmliche MLVs war.

BEISPIEL 18

Wirkung von Cholesterol auf die Bildung von DPPC-IF-Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 12 wurden befolgt, um in einer Gesamtheit von 30 mM Lipid unter Verwendung einer Gesamtkonzentration von 3,0 M Ethanol IF- Liposomen herzustellen, wobei DPPC und Cholesterol verwendet wurden. Das Cholesterol und das DPPC, die in Choloformstammlösungen in Konzentrationen von 20 mg/ml vorlagen, wurden bei 95% DPPC und 5% Cholesterol in einen Kolben mit rundem Boden und einem Fassungsvermögen von 50 ml zugemischt. Die Lipide wurden auf der Oberfläche des Kolbens zu einem dünnen Film getrocknet und mit Tris/NaCl wie zuvor hydratisiert. Die Inkubationstemperatur betrug 50º-55ºC.
Zur Cholesteroluntersuchung wurden vor und nach dem IF-Vorgang Aliquote entfernt, um sicherzustellen, dass die Liposomen Cholesterol enthielten und die Einkapselung von ¹&sup4;C- Sucrose zu prüfen.
Die obenstehenden Verfahren wurden unter Einsatz von 0,00, 0,02, 0,10, 0,15 und 30,0 Molbruch (0,2,0,10,15 und 30 Molprozent) Cholesterol wiederholt.
Die internen Volumina der Liposomen wurden mittels ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung und sowohl des CAT 1 EPR- als auch des TEMPONE EPR-Verfahrens bestimmt. IDer Cholesterolgehalt der IF-Liposomen wurde unter Verwendung von o-Phthalaldehyd gemäß der Verfahren von Rudel und Morris, 1973, J. Lipid Res., 14 : 14, gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 10a und b grafisch dargestellt. Fig. 10a zeigt die "endgültige" Cholesterolkonzentration der IF-Liposomen (offene Kreise) und den endgültigen Prozentsatz an eingeschlossener ¹&sup4;C-Sucrose (offene Quadrate). Bei Anstieg des Cholesterolgehalts verringerte sich die Menge an eingekapselter Sucrose.
Fig. 10b zeigt die Verringerung des internen Volumens der DPPC-Cholesterol-Liposomen als Funktion des Cholesterolgehalts. Obwohl die Daten aus dem Cat 1 EPR- und dem TEMPONE EPR-Verfahren (offene Dreiecke bzw. volle Kreise) stark übereinstimmen, zeigen die Daten aus der ¹&sup4;C-Sucrose-Untersuchung beträchtlich größere interne Volumina. Ohne Anbindung an die Theorie scheint die ¹&sup4;C-Sucrose an den Liposomen zu "kleben" und somit Anzeigen für ein größeres internes Volumen zu liefern.
Diese Studien und die Fig. 10a und b weisen darauf hin, dass die Größe der IF-Liposomen mit Anstieg des Cholesterolgehalts stark abnimmt, ein Schluss, der durch die Ergebnisse einer Malvern-Partikelklassierung unterstützt wurde; 0% Cholesterol enthaltende IF- Liposomen hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von 7,66 um, während IF- Liposomen mit 30% Cholesterol bei 3,99 um lagen.

Beispiel 19

Wirkung von Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) auf die Bildung von DPPC-IF- Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 12 wurden befolgt, um in einer Gesamtheit von 30 mM Lipid unter Verwendung einer Gesamtkonzentration von 3,0 M Ethanol IF- Liposomen herzustellen, wobei DPPC und Dioleoylphosphatidylcholin ("DOPC") verwendet wurden, ein ungesättigtes Lipid. Die Anfangsliposomen wurden aus DPPC und DOPC gebildet, die in Choloformstammlösungen in Konzentrationen von 20 mg/ml vorlagen, welche mit 0,20 Molbruch (20 Molprozent) DOPC in einen Kolben mit rundem Boden zugemischt wurden. Die Lipide wurden auf der Oberfläche des Kolbens durch Rotationsverdampfung zu einem dünnen Film getrocknet und mit Tris/NaCl wie zuvor hydratisiert. Die Inkubationstemperatur betrug 50º-55º C.
Die obenstehenden Verfahren wurden unter Einsatz von 0,00, 0,11, 0,55, 0,72 und 1,00 Molbruch (0, 11, 55, 72 und 100 Molprozent) DOPC wiederholt.
Das interne Volumen der IF-Liposomen wurde mittels des ¹&sup4;C-Sucrose- Einkapselungsverfahrens und des TEMPONE EPR-Verfahrens gemessen, und die Ergebnisse sind in Fig. 11 A grafisch dargestellt.
Wie aus der grafischen Darstellung ersichtlich, verringerte ein Anstieg der DOPC-Menge die Größe der IF-Liposomen. Sogar so wenig wie 10% DOPC schien das Liposornenvolumen um mehr als 50 % zu reduzieren. Über 0,4 Molbruch (40 Molprozent) DOPC bildete sich kein Ethanol-Lipidgel und die SUVs schienen nicht zu fusionieren. Die internen Volumina der Liposomen bei 0,6 und 0,8 Molbruch DOPC betrugen 0,2 bzw. 0,24 ul/uM Pi, was im SUV-Bereich liegt. Zusätzlich nahm der Prozentsatz an durch Zentrifugation gewinnbaren Lipiden über 0,4 Molbruch DOPC ab (siehe Fig. 11 B).

BEISPIEL 20

Einschluss des Radiokontrastmittels Ioversol in DSPC-IF-Liposomen

DSPC (200 mg gefriergetrocknetes Pulver) wurde in 5,0 ml destilliertem Wasser suspendiert und zu einer durchsichtigen SUV-Suspension beschallt (Beschallungsdauer war etwa 20 Minuten). Die SUV-Suspension wurde 10 Minuten lang bei 10.000 · g zentrifugiert, um den Titanrückstand zu Pellets zu formen; SUVs wurden aus dem Titanpellet dekantiert. Ioversol (Optiray 320R, Mallinekrodt) (11,5 mg), 4,1 ml Ethanol und 1,7 ml destilliertes Wasser wurden zugemischt, und 3,3 ml Aliquote dieser Mischung wurden in drei CorexR-Röhren mit einem Fassungsvermögen von 15 ml pipettiert. Aliquote (1,1 ml) der SUV-Suspension wurden jeder Röhre hinzugegeben. Die Röhren wurden abgedeckelt und stark gewirbelt, was zu einem durchsichtigen Gel führte.
Die Röhren wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur sich setzen gelassen, danach wurden sie entdeckelt und eine Stunde lang bei 70ºC in einem Tauchbad inkubiert, wobei intermittierend durch Wirbeln gemischt wurde. Nach der Inkubation wurden die Röhren durch Hindurchsprudelneines sanften N&sub2;-Strahls durch die Mischung etwa 8 Minuten lang mit N&sub2; besprengt. Nach Abkühlung des Inhalts auf Raumtemperatur wurde jeder Röhre ein Puffer (30 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.6 mM Na&sub2;EDTA, pH-Wert 6, 7) zugegeben und durch Inversion vermischt. Das nicht eingeschlossene Ioversol wurde durch Zentrifugationswaschungen (3 Minuten bei 5.000 · g), welche dreimal wiederholt wurden, entfernt.
Das in-den IF-Liposomen eingeschlossene resultierende Ioversol wurde durch Absorption bei 245 nm und Regression auf eine Standardkurve von Ioversol in Ethanol spektralphotometrisch untersucht. Durch das Verfahren von Chen et al. wurde eine Lipidkonzentration bestimmt. Die Einschlussergebnisse sind untenstehend in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Die IF-Liposomen hatten einen mittleren Durchmesser von 4,0-5,0 um, bestimmt durch eine Malvern-Partikelgrößenanalyse.

BEISPIEL 21

Einschluss des Radiokontrastmittels Ioxoglat in DSPC-IF-Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 20 wurden befolgt, wodurch das Radiokontrastmittel Ioxoglat (HexabrixR, Mallinckrodt) in IF-Liposomen eingeschlossen wurde. Der Einschluss wurde gemäß der Verfahren des Beispiels 20 untersucht, und die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 7 in Tabellenform dargestellt. Tabelle 7

BEISPIEL 22

Einschluss des Radiokontrastmittels Iopamidol in DSPC-IF-Liposonnen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 20 wurden befolgt, wodurch das Radiokontrastmittel Iopamidol (IsovueR, Bristol-Myers Squibb) in IF-Liposomen eingeschlossen wurde. Der Einschluss wurde gemäß der Verfahren des Beispiels 20 untersucht, und die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 8 in Tabellenform dargestellt. Tabelle 8

BEISPIEL 23

Wirkung der Inkubationszeit auf das interne Volumen von IF-Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 12 wurden befolgt, wobei 20 mg/ml DPPC verwendet wurde und die Ethanolkonzentration 3,0 M betrug, wobei die Inkubationsperiode des Gels bei einer Temperatur oberhalb und unterhalb der Tm variiert wurde. Die Inkubationsperiode wurde auf 5 Minuten eingestellt, und das interne Volumen der resultierenden IF-Liposomen wurde mittels des ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselungsverfahrens (einfärbiger Balken) und sowohl des CAT 1 EPR- (schattierter Balken) als auch des TEMPONE EPR-Verfahrens (mit Schrägstrichen versehener Balken) gemessen. Die Ergebnisse der Messungen sind am Histogramm der Fig. 12 gezeigt.
Die obenstehenden Verfahren wurden wiederholt, wobei die Inkubationsperiodem 30 Minuten, eine Stunde und zwei Stunden betrugen. Gleichermaßen wurden interne Volumensmessungen durchgeführt und verglichen.
Wie durch Fig. 12 gezeigt, scheint es keinen signifikanten Unterschied beim internen Volumen des IF-Liposoms als Funktion der Inkubationszeit zwischen 5 Minuten und 2 Stunden zu geben.

BEISPIEL 24

Wirkung einer Veränderung des Inkubationsvorgangs auf das interne Volumen von IF- Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 12 wurden wiederholt, wobei die Inkubationsbedingungen variiert wurden, indem z.B. die DPPC SUVs nur bei Raumtemperatur ohne Inkubation oberhalb der DPPC-Tm (z.B. bei 50-55ºC) inkubiert wurden. Das interne Volumen der resultierenden IF-Liposomen wurde mittels des ¹&sup4;C- Sucrose-Einkapselungsverfahrens (einfärbige Balken) und sowohl des CAT 1 EPR- (schattierte Balken) als auch des TEMPONE EPR-Verfahrens (mit Schrägstrichen versehener Balken) bestimmt, und die Ergebnisse sind am Histogramm der Fig. 12 als "RT" gezeigt.
Der obenstehende Vorgang wurde ohne Raumtemperaturinkubation wiederholt, wobei das Ethanol hinzugefügt und die Inkubation bei einer Temperatur oberhalb der DPPC-Tm (50- 55ºC) durchgeführt wurde. Da sich die aus diesem Inkubationsverfahren resultierenden Liposomen nicht zu Pellets formten, wurden die Liposomen eher als in Zentrifugationswaschungen durch sechsfache Verdünnung der DPPC-Probe mit 10 ml Tris/NaCl-Puffer gewaschen, wobei eine 4,0 ml-Probe entnommen und diese Probe mit einem AmiconTM-30K-Mikrokonzentrator (Grace Co.) konzentriert wurde, welche Probe 1 Stunde lang bei 30.000 · g in einer Beckman J-2-Zentrifuge gesponnen wurde. JDas zurückbehaltene Probenvolumen wurde unter Anwendung desselben Vorgangs abermals konzentriert. Die Ergebnisse dieser Probe sind mit "50ºC" markiert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 12 ist ersichtlich, dass beide Inkubationsperioden für die Bildung von großen IF-Liposomen erforderlich sind.

BEISPIEL 25

Vergleich des internen Volumens von IF-Liposomen und MLVs

I

DPPC (80 mg, pulvrige Form) (Avanti Polar Lipids) wurde gemäß der Verfahren des Beispiels 12 zu 2,00 ml Tris/NaCl-Puffer hinzugefügt. Die DPPC-Suspension wurde, wie im Beispiel 12 beschrieben, bis zur Klarheit beschallt. Eine endgültige Konzentration von 3,0 M Ethanol (Zugabe von 0,43 ml Ethanol) wurde eingesetzt, wodurch sich IF-Liposomen bildeten. Die Probe wurde: wie im Beispiel 12 inkubiert und durch Zentrifugation gewaschen, und das interne Volumen wurde durch die im Beispiel 13 beschriebenen CAT 1 EPR- Verfahren zweimal bestimmt, die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 9 in Tabellenform dargestellt.

II

Die obenstehenden Verfahren des Abschnitts I wurden unter Einsatz von 80 mg DPPC in 2,00 ml Tris/NaCl-Puffer wiederholt, wobei bei 50-55ºC gewirbelt wurde, wodurch MLVs hergestellt wurden. Diese MLVs wurden allerdings nicht beschallt, und kein Ethanol wurde hinzugegeben.
Die identischen Verfahren wurden wiederholt, wobei 40 mg DPPC eingesetzt wurde. Die Probe wurde wie im Beispiel 12 inkubiert und durch Zentrifugation gewaschen, und das interne Volumen wurde durch die im Beispiel 13 beschriebenen CAT 1 EPR-Verfahren zweimal bestimmt, die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 9 in Tabellenform dargestellt.

III

Die Verfahren des Abschnitts II wurden wiederholt, wobei 0,43 ml Ethanol für eine endgültige Konzentration von 3,0 M Ethanol in der endgültigen Lösung hinzugefügt wurde. Die Probe wurde wie im Beispiel 12 inkubiert und durch Zentrifugation gewaschen, und das interne Volumen wurde durch die im Beispiel 13 beschriebenen CAT 1 EPR-Verfahren zweimal bestimmt, die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 9 in Tabellenform dargestellt.
Die untenstehende Tabelle 9 veranschaulicht das relativ große interne Volumen von IF- Liposomen im Vergleich zu herkömmlichen MLVs oder MLVs, die relativ hohen Ethanolkonzentrationen ausgesetzt sind. Tabelle 9

BEISPIEL 26

Iotrolan-DSPC-IF-Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 7 wurden wiederholt, wodurch eine Iotrolan enthaltende IF-Liposomenpopulation hergestellt wurde.

BEISPIEL 27

Einschluss des Radiokontrastmittels Iopromid in DSPC-IF-Liposomen

Die Materialien und Vorgänge des Beispiels 22 werden wiederholt, wodurch Iopromid enthaltende IF-Liposomen hergestellt werden.

BEISPIEL 28

Druckinduzierte Interdigitations-Fusionsliposomen

Interdigitations-Fusionsliposomen wurden unter Anwendung von hydrostatischem Druck zum Hervorrufen der FusiLon hergestellt. Diese werden hierin als druckinduzierte Fusionsliposomen oder "PIFs" bezeichnet. Kleine Liposomen wurden durch Sondenbeschallung bis zur Klarheit von entweder 20 mg/ml DPPC MLVs oder IDSPC MLVs hergestellt. Die resultierenden kleinen unilamellaren Bläschen (SUVs) wurden bei 3.000g 5 Minuten lang zentrifugiert, um vom Sondenbeschaller eingebrachten Titanstaub zu entfernen. 2 bis 3 ml der SUVs wurden in einen Teflon®-Polytetrafluorethylen-Probenhalter gegeben, der danach in die hydraulische Flüssigkeit in der Hochdruckreaktionskammer eingetaucht wurde. Die Temperatur der Reaktionskammer wurde auf den erwünschten Wert gebracht, bevor die Probe in sie gegeben wurde. Zur Temperaturvariation wurde die Reaktionskammer mit einer flexiblen Verrohrung verkleidet, durch welche Wasser aus einem Wasserbad zirkulierte. Sobald die Probe beladen war, wurde die Kammer geschlossen und Hydraulikflüssigkeit eingepumpt, um die Probe unter Druck zu setzen. Die Proben wurden 15 Minuten lang unter Druck gehalten, wonach der Druck reduziert und die Probe entfernt wurde. Die Probe wurde dann aus dem Teflon®-Halter in eine Glasampulle übertragen und auf 50ºC (für DPPC) oder 70ºC (für DSPC) erhitzt, um eine erneute Bildung einer Bläschenstruktur zu gewährleisten. Die Liposomen (nunmehr PIFs) wurden abkühlen gelassen, und die erlangten Volumina wurden unter Anwendung einer um Detail bei Perkins, et al., (1988) Biochim. Biophys, Acta 943 : 103-107, beschriebenen Technik gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 13 für die DPPC-Tests und in Fig. 14 für die DSPC-Tests grafisch dargestellt. Für DPPC waren die unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids (41ºC für DPPC) unter Druck gesetzten Proben, wie in Fig. 13 gezeigt, im Erscheinen gelartig - genau wie die Gels, die aus einer Ethanolzugabe unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur resultierten. Die zähflüssige Natur dieser Proben veschwand, nachdem sie auf über 41ºC erhitzt wurden. Für DSPC waren die unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids (54ºC für DSPC) unter Druck gesetzten Proben, wie in Fig. 14 gezeigt, im Erscheinen gelartig. Die zähflüssige Natur dieser Proben veschwand, nachdem sie auf 70ºC erhitzt wurden. In beiden Fällen führte ein Eihitzen zur Umwandlung von interdigitierten Lagen zu Liposomen.

Beispiel 29

Hochdrucksterilisation

Es ist bekannt, dass vegetative Bakterien, besonders jene der Gattung Bacillus, extrem widerstandsfähig gegenüber einer Vielfalt von Umweltbelastungen einschließlich hoher Temperaturen und Drücke sind. Es ist in der Tat seit langem bekannt, dass Drüclce über 1000 MPa notwendig sind, um Bakteriensporen zu inaktivieren (Larson, et al. The Effect of High Pressure on Bacteria, J. Infectious Diseases, 22, 271-279 (1918). Daher wurden Sporensuspensionen des Bacillus subtilis ATCC-Stammes 6633 auf Blutagar (Remel) gestrichen und als Keimkultur für alle Sterilisationsstudien verwendet. Kolonien von dem Agar wurden in einer Tryptikase-Sojanährlösung (Remel) bis zur frühen stationären Phase gezogen. Diese Kulturen enthielten 7,7 · 10&sup7; lebensfähige Bakterien pro Millimeter, wie durch das Wachstum auf dem Blutagar gemessen.
Kulturen, die hohen Drücken ausgesetzt waren, wurden in Teflon®-Polytetrafluorethylen- Röhren mit Schraubdeckel (Swage Lok) und in die Hochdruckreaktionskammer gegeben. Der Druck auf den Reaktor wurde danach bis auf den erwünschten Punkt (High Pressure Equip. Co., PS 150-Pumpsystem) erhöht, und die Zeit bei diesem Druck wurde danach überwacht. Bei Beendigung der Inkubation wurde die Probe auf Blutagar gestrichen, und lebensfähige Kolonien wurden nach 15 Stunden Wachstum gezählt.
Fig. 15, 16 und 17 zeigen die Wirkungen von hohen Drücken auf B. subtilis bei 40, 50 bzw. 60ºC. Jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt von zumindest 3 bis 9 getrennten Bestimmungen. Fehlerbalken sind nicht gezeigt, da sie üblicherweise kleiner als das zum Bezeichnen des Punkts verwendete Symbol sind. Die Sterilität wird durch das Fehlen von Wachstum auf dem Blutagar bestimmt. In den grafischen Darstellungen zeigen zwei aufeinanderfolgende Punkte mit einem Wert von 0 die zum sicheren Erreichen der Sterilität erforderliche Zeitdauer. Bei 40ºC konnte eine Sterilität nur nach 90 Minuten bei 80.000 psi erzielt werden. Diese Zeit wird bei 50ºC auf 30 Minuten reduziert. Obwohl der Logarithmus von 0 streng gesprochen undefiniert ist, wurde der Logarithmus von 0 zum Zweck des Darstellens der vorliegenden Daten als 0 grafisch dargestellt.
Um sicherzugehen, dass die Anwesenheit von Lipid keine schützende Wirkung auf die Bakterien hat und dass die Anwesenheit von Bakterien die Bildung der interdigitierten Phase nicht beeinflusst, wurden Proben von DPPC SUVs mit 100.000 lebensfähigen Bakterien vermischt. Die Mischung wurde danach sterilisierenden Drücken unterzogen. Die Sterilisation erwies sich als wirksam, und das erlangte Volumen der resultierendem PIF- Liposomen wurde durch die Anwesenheit von Bakterien nicht beeinflusst. Daher weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass hohe hydrostatische Drücke beim Sterilisieren von liposomischen Präparaten von Nutzen sein können.
Weitere Test wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass ein hoher Druck zum Sterilisieren von liposomischen Produkten verwendet werden kann, die nicht jene sind, die druckinduzierte Fusionsbläschen beinhalten. Gentamycin enthaltende multilamellare Eier- Phosphatidylcholin(EPC)-Liposomen wurden gemäß den bei Lenk et al., U.S. -Patent Nr. 4; 522,803, dargelegten Verfahren gebildet. Eine Probe dieses Materials wurde bei einer Temperatur von 50ºC 60 Minuten lang einem Druck von 6.204,6 · 10&sup5; Pa (80.000 psi) unterzogen. Diese Probe sowie eine unbehandelte Kontrollprobe wurden danach zentrifugiert, um freies von gebundenem Gentamycin zu trennen. Die Überstände wurden zur Bestimmung von freien Gentamycin untersucht, und die Liposomen wurden resuspendiert und auf liposomisch verbundenes Gentamycin untersucht. Es zeigte sich, dass die nicht unter Druck gesetzte Kontrollprobe 0,723 mg/ml nicht liposomisch verbundenes Gentamycin und 6,687 mg/ml liposomisch verbundenes Gentamycin hatte. Die unter Druck gesetzte Testprobe hatte übereinstimmende Werte von 0,744 mg/ml nicht liposonnisch verbundenem Gentamycin und 7,234 mg/ml liposomisch verbundenem Gentamycin. Die Daten weisen darauf hin, dass diese Druck- und Temperaturbedingungen die Verlbindung von Gentamycin mit EPC-Liposomen nicht negativ beeinflussen.

Beispiel 30

Postgel-Inkorporation von Lipid-löslichen Molekülen in Interdigitations-Fusionsliposomen

Die Interdigitations-Fusions(IF)-Technik kann auch eher für aus zwei oder mehr. Lipidbestandteilen zusammengesetzte SUVs als für die Einzellipidbestandteil-Systeme angewendet werden. Die IF-Technik ist sehr effektiv beim Herstellen großer Liposomen, wenn beide Lipide in den SUVs einer Ethanol-induzierten Interdigitation unterzogen werden können. Beispielsweise wurden entweder aus DPPC/DMPC SUVs oder aus DPPC/DPPG SUVs große Interdigitations-Fusionsbläschen (IFVs) hergestellt, wenn die Temperatur so war, dass beide Lipidbestandteile einer Ethanol-induzierten Interdigitation unterzogen wurden.
Das interne Volumen resultiert aus der in Fig. 18 gezeigten DPPC/DPPG SUV-Mischung. Wie in der Figur gezeigt, änderte sich das aus DPPC/DPPG SUVs gebildete interne Volumen von IFVs bei Anhebung des Molbruchs DPPG nicht signifikant. Die wie im Beispiel 1 beschriebene IF-Technik wurde zur Bildung dieser IFVs verwendet, und die gesamte Lipidkonzentration flhrjedes Experiment war 30 mM. Der Ethanol-induzierte DPPC/DPPG- Gelzustand entstand bei Raumtemperatur. Das interne Volumen der Produkt-IFVs wurde sowohl mit der ¹&sup4;C-Sucrose-Einkapselung als auch der EPR-Sonde TEMPONE gemessen, wie zuvor beschrieben.
Im Gegensatz zum DPPC/DPPG SUV-Experiment hemmte die Zugabe eines keine Interdigitation eingehenden Lipids wie DOPC oder Cholesterol zu den DPPC SLIVs die Bildung von großen IFVs beträchtlich. Das interne Volumen von aus DPPC/DOJPC- und DPPC/Cholesterol-SUVs gebildeten IFVs ist als Funktion oder Molbruch DOPC oder Cholesterol in Fig. 20 gezeigt. Die internen Volumina der Produktliposomen wurden unter Verwendung der EPR-Sonde TEMPONE gemessen. Das interne Volumen der Produktliposomen wurde um 50% reduziert, als der DOPC-Gehalt in den DPPC/DOPC SUVs 10 Molprozent erreichte. SUVs, die über 50 Molprozent DOPC lagen, fusionierten nicht zwecks Bildung der Für die IFV-Bildung erforderlichen interdigitierten Membranlagen. Cholesterol war beim Unterbrechen der IF-Technik besonders effektiv. Das interne IFV- Volumen wurde sogar für DPPC/Cholesterol SUVs, die so wenig wie 2 bis 5 Molprozent Cholesterol enthielten, signifikant reduziert.
Daher wurde die Wirksamkeit der IF-Technik zur Herstellung von Liposomen mit großem internem Volumen signifikant reduziert, wenn vor der Interdigitationsfusion Lipide, die keine Interdigitation eingehen, in die SUVs eingeschlossen wurden Keine Interdigitation eingehende Lipide wie DOPC und Cholesterol hemmten die Ethanol-induzierte Doppelschicht-Interdigitation, die zum Hervorrufen einer SUV-Fusion und einer Bildung der interdigitierten Membranllagen erforderlich ist. Diese Wirkung stellt ein Problem bei der Herstellung von großen IFV s dar, welche Lipide haben, die nicht interdigitieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jedoch eine Modifikation der grundlegenden IF- Technik entwickelt, um keine Interdigitation eingehende Lipide effizienter in IFVs einzubringen. Diese Modifikation der IF-Technik umfasst die Zugabe des keine Interdigitation eingehenden Lipids nach Bildung der Ethanol-induzierten interdigitierten Membranlagen oder des "GeI"-Zustands: Typischerweise werden SUVs, welche die keine Interdigitation eingehenden Lipide enthalten, vor dem Anheben der Temperatur auf über Tm in das Ethanol/Phospholipid-Gel gemischt. Die SUVs, welche die keine Interdigitation eingehenden Lipide enthalten, fusionieren mit den Phospholipid-Lagen, wenn die Temperatur über die Tm der Phospholipid-Membranlagen angehoben wird. Diese Modifikation der IF-Technik wird hierin als "Postgel"-lnkorporation bezeichnet, da die zusätzlichen Lipide nach Bildung des Ethanol/Phospholipid-"Gel"-Zustands hinzugegeben wurden.
Zusätzlich kann diese Postgel-Inkorporationstechnik zum Einbau jeglichen Materials, das normalerweise den IF-Vorgang stören würde, in IF-Bläschen verwendet werden. Das heißt, gewisse Materialien, die wünschenswerterweise in IF-Bläschen einzubauen wären, wie bioaktive Materialien, können den IF-Vorgang stören und daher ansonsten nicht verwendbar sein. Der vorliegende Postgel-Inkorporationsvorgang ermöglicht den Einbau dieser die Interdigitationsftision störenden Materialien in IF-Bläschen. Dieser Vorgang ist insbesondere für hydrophobe oder amphipathische Materialien, die Lipid-löslich sind, geeignet. Bioaktive Materialien, die wünschenswerterweise in IF-Bläschen einzubauen wären, sind an anderer Stelle in dieser Beschreibung beschrieben.
Obwohl DMPC ein gesättigtes Phospholipid ist, ist der Einbau von DMPC SUVs in DPPC IFVs bei Raumtemperatur ein gutes Beispiel der Postgel-Lipidinkorporation. Da die Tm für DMPC bei 23ºC liegt, ruft Ethanol keine Interdigitation in den DMPC-Doppelschichten bei Raumtemperatur hervor. DMPC verhinderte bei Zugabe des Ethanols zu DPPC/DMPC SUVs bei Raumtemperatur die Bildung großer IFVs. Große IFVs wurden jedoch bei Zugabe von Ethanol zu DPPC/DMPC SUVs bei 5ºC gebildet. Somit behinderte das Eimnischen von DMPC in DPPC SUVs die IF-Technik bei Raumtemperatur, jedoch nicht bei 5ºC. Es bildeten sich jedoch relativ große DPPC/DMPC IFVs bei Raumtemperatur, sogar in einem DPPC/DMPC-Molverhältnis von 1 : 1, wenn das DMPC nach Bildung des Ethanol/DPPC- Gelzustands zur Probe hinzugegeben wurde.
Ein Nachweis des Postgel- Zustand-Mischens von DMPC SUVs in DPPC IFVs ist in Fig. 20 und 21 gezeigt. Fig. 20 zeigt das durchschnittliche interne Volumen für reine DPPC IFVs, welche gemäß der in den früheren Beispielen beschriebenen Vorgänge gebildet wurden. Zusätzlich wurden in Befolgung der drei verschiedenen modifizierten Versionen der Standard-IF-Technik IFVs mit einem DPPC/DMPC-Molverhältnis von 1 : 1 gebildet. Die mit "5ºC" und "RT" markierten Balken zeigen das interne Volumen von IFVs an, welche aus SUVs mit einem DPPCIDMPC-Molverhältnis von 1 : 1 gebildet wurden, in denen der Ethanol/Lipid-Gelzustand bei 5ºC bzw. bei Raumtemperatur gebildet wurde. Der mit "Post" markierte Balken zeigt das interne Volumen von IFVs mit einem DPPC/DMPC- Molverhältnis von 1 : 1 an, welche unter Anwendung der Postgel-Inkorporationsmodifikation bei Raumtemperatur gebildet wurden.
Wie von den in Fig. 20 dargestellten Ergebnissen gezeigt, hemmte die Zugabe von DMPC SUVs zum Ethanol-induzierten DPPC-Gelzustand nicht die Bildung großer IFVs. Um zu zeigen, dass das DMPC in die IFVs eingebaut wurde, wurde das Phasenumwandlungsverhaten der DPPC/DMPC IFVs untersucht. Fig. 21 zeigt das Membranfließverhalten von DPPC, DMPC und DPPC/DMPC IFVs als Funktion der Temperatur. Das Membranfließverhalten wurde gemäß dem Verfahren von Wu und McConnell mit der EPR-Sonde TEMPO gemessen. Die Temperaturen zur Bildung des Gelzustands lagen für die DPPC und DMPC IFVs bei Raumtemperatur bzw. bei 5ºC. Die mit "5ºC" markierte DPPC/DMPC-Kurve wurde bei 5ºC aus SUVs mit einem DPPCIDMPC-Molverhältnis von 1 : 1 gebildet. Das DMPC für die mit "Post" markierte DPPCIDMPC-Kurve wurde nach Bildung des Ethanol-induzierten DPPC-Gelzustands bei Raumtemperatur als DMPC SUVs hinzugefügt. Die Hauptphasenumwandlungstemperaturen für die DMPC und DPPC IFVs lagen bei 23 bzw. 39ºC. Die Tm für DPPC IFVs betrug 39º C, was leicht unter der für DPPC aufgestellten Tm liegt. DPPC und DMPC sind sowohl im Gel als auch in den flüssig-kristallinen Phasen vollständig mischbar, wobei sie eine ideale Mischung bilden. Die Phasenumwandlungstemperatur für IFVs mit einem DPPC/DMPC- Molverhältnis von 1 : 1, für die das Gel aus SUVs mit einem DPPC/DMPC-Molverhältnis von 1 : 1 bei 5ºC gebildet wurde, betrug 30ºC, was mit den für DPPCIDMPC MLVs mit einem Molverhältnis von 1 : 1 aufgestellten Werten übereinstimmt. Die Tm für die DPPC/DMPC IFVs, die durch Postgel-IF-Modifikation gebildet wurden, lag ebenfalls bei 30ºC, was darauf hinweist, dass das Molverhältnis dieser DPPC/DMPC IFVs ebenso 1 : 1 war. Dies zeigt, dass die meisten DMPC SUVs während der Inkubation bei 50-55ºC in die DPPC IFVs eingebaut wurden.
Keine Interdigitation eingehende Lipide, die sich nicht in idealer Weise mischen, können auch in DPPC IFVs gemischt werden. Fig. 22 zeigt das interne Volumen von DPPC- Cholesterol-IFVs, die durch Mischen des Cholesterols in die Probe nach Bildung des Ethanol-induzierten DPPC-Gelzustands gebildet wurden. Das interne Volumen als Funktion von Molbruch-Cholesterol, das in den Produkt-DPPClCholesterol-IFVs gewonnen wurde, ist in dieser Figur gezeigt. Der Cholesterolgehalt in den IFVs wurde unter Verwendung von radiomarktiertem Cholesterol bestimmt. Zum Vergleich sind die internen Volumina von aus DPPC/Cholesterol-SUVs gebildeten DPPC/Cholesterol-IFVs auch in Fig. 22 gezeigt. Fig. 23 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Experiments, wobei das keine Interdigitation eingehende Lipid DOPC unter Anwendung von entweder der Postgel-IF-Modifikation oder der Standard-IF-Technik in DPPC IFVs gemischt wurde, wobei DPPC/DOPC SUVs verwendet wurden. Der DOPC-Gehalt wurde unter Verwendung von radiomarkiertem DOPC bestimmt. Diese Figur zeigt, dass der Einbau von keine Interdigitation eingehenden Lipiden in die Probe nach Bildung der interdigitierten Membranlage das interne Volumen von gemischten Lipid-IFVs signifikant vergrößerte.
Typische zweite Lipide, die in Interdigitations-Fusionsliposomen eingebaut werden können, welche durch dieses Postgel-Inkorporationsverfahren aus einem ersten Lipid gebildet sind, umfassen Cholesterole, Tocopherole, Ei-PC, POPC, DOPC, DMPC, DPPE, Ei-PE und Fettsäuren, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein. Diese sind alles Lipide, die entweder keine Interdigitation eingehen oder eine Umwandlungstemperatur (Tm) unterhahb von Raumtemperatur haben. Durch dieses Verfahren können soviel wie 90% dieser lLipide in IFVs eingebaut werden, die aus einem eine Interdigitation eingehenden Lipid gebildet sind. Daher kann das Gewichtsverhältnis des ersten Lipids zum zweiten Lipid so nieduig wie 10 : 90 sein. Auf der anderen Seite kann die Menge des zweiten Lipids, das den Interdigitations-Fusionsvorgang stören kann, so gering wie 0,1% des ersten Lipids sein. Daher kann das Verhältnis des ersten Lipids zum zweiten Lipid so hoch wie 99,9 : 0,1 sein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Interdigitations-Fusionsliposomen, welches die Schritte umfasst:

(a) Interdigitationsfusionieren klassierter Liposomen, die ein symmetrisches Phospholipid mit gesättigten Acylketten umfassen, mit einer Menge an Induktor, die wirksam ist, um die Liposomen zu fusionieren;

(b) Inkubieren der Zusammensetzung von Schritt (a) bei einer Temperatur, die unterhalb der Umwandlungstemperatur der Zusammensetzung liegt, über eine Zeitspanne, die wirksam ist, um aus der Zusammensetzung ein Interdigiiations-Fusionsgel zu bilden, wobei die Zeitspanne 1 Minute bis 1 Stunde beträgt;

(c) Zugabe eines Materials, das den Interdigitations-Fusionsschritt (a) stören würde, zu dem Gel von Schritt (b), um eine Mischung zu bilden; und

(d) Inkubieren der Mischung von Schritt (c) bei einer Temperatur, die größer ist als die Umwandlungstemperatur des Phospholipids in dem Gel, um Interdigitations-Fusionsliposomen, die das Material umfassen, aus dem Gel zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das symmetrische Phospholipid mit gesättigten Acylketten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

Dimyristoylplhosphatidylcholin,

Distearoylphosphatidylcholin,

Dipalmitoylpinosphatidylcholin,

Dimyristoylphosphatidyiserin,

Dipalmitoylphosphatidylserin,

Distearoylphosphatidylserin,

Dimyristoylphosphatidylethanolamin,

Dipaimitoylphosphatidylethanolamin,

Distearoylphosphatidylethanolamin,

Dimyristoylphosphatidsäure,

Distearyolyphosphatidsäure,

Dipalmitoylphosphatidsäure,

Dimyristoyiphosphatidylinosit,

Distearoylphosphatidylinosit,

Dipalmitoylphosphatidylinosit,

hydriertes Sojaphosphatidylcholin,

hydriertes Sojalecithin,

Dipalmitoylphosphatidylglycerin,

Di-O-hexadecylphosphatidylcholin,

Distearoylphosphatidylglycerin und

Dimyristoylphosphatidylglycerin.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Liposomen von Schritt (a) eine Größe von weniger als 0,050 um (Mikrometer) aufweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem die Liposomen von Schritt (a) eine Größe von 0,025 um (Mikrometer) aufweisen.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das Material von Schritt (c) ein bioaktives Mittel ist.

6. Verfahren zur Herstellung von Interdigitations-Fusionsiposomen, umfassend:

(a) Interdigitationsfusionieren klassierter Liposomen, die mindestens ein symmetrisches Phospholipid mit gesättigten Acylketten umfassen, in Anwesenheit einer Menge eines Induktors, die wirksam ist, um die Liposomen zu fusionieren,

b) Inkubieren der Zusammensetzung von Schritt (a) bei einer Temperarur unterhalb der Umwandlungstemperatur der Zusammensetzung über eine Zeitspanne im Bereich von 1 Minute bis 1 Stunde, um die Liposomen zu einem Interdigitations-Fusionsgel zu fusionieren, das Phospholipid-Membranlagen umfasst,

(c) Zugabe eines zusätzlichen Lipids zu dem Gel, um eine Mischung zu bilden, wobei das zusätzliche Lipid keine Interdigitation eingeht oder eine Umwandlungstemperatur unterhalb von Raumtemperatur aufweist,

(d) Inkubieren der Mischung bei einer Temperatur, die größer ist als die Umwandlungstemperatur der Phospholipid-Membranlagen in dem Gel, um Interdigitations-Fusionsliposomen zu bilden, die beide Lipide umfassen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem das zusätzliche Lipid ein Lipid ist, das keine Interdigitation eingeht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das Lipid ausgewählt ist aus cler Gruppe bestehend aus:

Cholesterolen,

Tocopherolen,

Ei-Phosphatidylcholin,

Palmitoyloleoylphosphatidylcholin und

Dioleoylphosphatidylcholin.