DE69616523T2

DE69616523T2 - Verfahren zur baladung von lipidvesikeln

Info

Publication number: DE69616523T2
Application number: DE69616523T
Authority: DE
Inventors: R. Cullis; David Fenske; Michael Hope; Kim Wong
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1995-02-27
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2016-02-28
Also published as: DE69616523D1; WO1996026715A1; US5785987A; CA2213861A1; EP0812186B1; ATE207738T1; US5800833A; EP0812186A1; AU4711296A; CA2213861C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Liposomformulierungen von pharmazeutischen Verbindungen und insbesondere Liposomformulierungen, die eine Aminogruppe tragende Verbindungen enthalten. Dieses Verfahren vermeidet Bedingungen und Arbeitsweisen, die für die Lipide und/oder therapeutischen Mittel oder Substanzen, die darin einzukapseln sind, schädlich sind. Wichtiger ist, daß die vorliegende Erfindung Verfahren mit breiterer Anwendungsmöglichkeit schafft, als es für vorher bekannte Verfahren gezeigt oder beschrieben wurde.
DER ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGENDER ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Liposomen oder Lipidvesikeln sind ein anerkanntes Zuführsystem für Arzneimittel, das die therapeutsiche Aktivität verbessern und die Sicherheit einer Anzahl von unterschiedlichen pharmazeutischen Mitteln erhöhen kann. Um bei medizinischen Behandlungen brauchbar zu sein, sollten Liposomformulierungen ein wirksames Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis, eine praktische Lagerbeständigkeit haben und für eine reproduzierbare Herstellung geeignet sein. Hohe Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse erniedrigen die nicht-therapeutische "Lipidbeladung" für den Patienten und erniedrigen auch die Herstellungskosten, da weniger Pharmazeutikum beim Herstellungsverfahren verlorengeht.
Liposomale Trägersysteme (Vesikeln) sind mikroskopische Kugeln einer oder mehrerer Lipid-Doppelschichten, die konzentrisch um einen wäßrigen Kern angeordnet sind. Für die Vesikeln wurde gezeigt, daß sie als Träger für sowohl hydrophile als auch hydrophobe therapeutische Mittel geeignet sind infolge ihrer einzigartigen Kombination von lipophilen und hydrophilen Teilen. Die Struktur der Lipid-Doppelschicht ist ähnlich der von Membranen, die tierische und menschliche Zellen umhüllen, und sie sind ein Ergebnis von amphipathischen Lipiden, die so angeordnet sind, daß die hydrophoben Teile des Lipids sich zum Zentrum der Doppelschicht hin ausrichten, während die hydrophilen Kopfgruppen sich zu den inneren oder äußeren wäßrigen Phasen hin ausrichten.
Liposomformulierungen für pharmazeutische Anwendungen können gemacht werden entweder durch Zusammenbringen von Arzneimittel und Lipid vor der Bildung der Vesikeln oder durch "Beladen" der Lipidvesikeln mit dem Arzneimittel, nachdem sie gebildet sind. Bei der Verabreichung bei einem Patienten verteilen sie sich biologisch und treten in Wechselwirkung mit den Zellen in dem Körper gemäß der Verabreichungsroute, der Vesikelzusammensetzung und der Vesikelgröße. Die Ladung, die Chemie und der Einschluß von Schutzpolymeren oder auf ein Ziel gerichteten Resten auf der Vesikeloberfläche, sie alle verändern die Art und Weis, wie sich Liposomen in dem Patienten verhalten.
Trotz früher Pionierforschung in der Entwicklung von Liposomformulierungen für pharmazeutische Verwendung hat die weitere Entwicklung von Liposomen zur Verabreichung von Pharmazeutika Probleme bereitet in Hinblick auf sowohl die Einkapselung beim Herstellungsverfahren als auch die Arzneimittelfreigabe aus dem Vesikel während der Therapie.
Für die Arzneimitteleinkapselung ist es notwendig, die Einfangwirksamkeit zu erhöhen, so daß das Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis so hoch wie möglich ist, während die ursprüngliche chemische Integrität von sowohl Arzneimittel als auch Lipid erhalten bleibt. Folglich sollte das Verfahren zum Beladen mit dem Arzneimittel mild sein und die Lipide, Liposomen oder Arzneimittel nicht harten Bedingungen aussetzen, wie extremen pH, hohen Temperaturen oder beiden. Wenn einmal die Verabreichung beim Patienten erfolgt ist, ist die Arzneimittelfreigabe ein Faktor. Eine schnelle Freigabe der Arzneimittel aus den Liposomen erniedrigt die Vorteile der biologischen Verteilung, die mit der Verwendung von Lipidvesikelträgern angestrebt wird. Folglich sind Anstrengungen fortgesetzt worden, um die pharmazeutische Behandlung zu optimieren und die Freigaberate der Pharmazeitika von den Lipidvesikeln zu erniedrigen. Für klinische Anwendungen sollten die Liposomformulierungen auch in der Lage sein, beständig in einem formulierten Zustand oder in einem leicht zu mischenden Kit zu sein, um Versenden und Lagerung zu gestatten.
Was auf dem Fachgebiet benötigt wird, sind neue Verfahren zur Herstellung von beständigen Liposomformulierungen von therapeutischen Mitteln, die leicht herzustellen sind, eine geeignete Retention des therapeutischen Mittels schaffen und die hohe Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse schaffen. Ganz überraschend erfüllt die vorliegende Erfindung diese und andere Bedürfnisse.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit zur Herstellung beständiger Liposomformulierungen von protonierbaren therapeutischen Mitteln. Dieses Verfahren beinhaltet das Laden eines therapeutischen Mittels in vorgeformte Liposomen mit einem Konzentrationsgradienten des Methylamins durch die Lipid-Doppelschicht der Liposomen. Dieses Verfahren stellt Liposomformulierungen zur Verfügung, die beständiger, kostenwirksamer und leichter in einer klinischen Umgebung herzustellen sind als die vorher erhältlichen. Zusätzlich haben diese. Verfahren ein breiteres Anwendungsspektum für pharmazeutische Mittel als vorher beschriebene Verfahren. Die vorliegende Erfindung stellt auch die durch das obige Verfahren hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen, einen Kit für die Herstellung der Liposomformulierungen der therapeutischen Mittel und Verfahren für ihre Verwendung bereit.
Obwohl man nicht an irgendeine besondere Theorie gebunden sein will, wird angenommen, daß neutrale therapeutische Mittel in vorgeformte Liposomen mit einem Konzentrationsgradienten des Methylamins durch ihre Ligid-Doppelschicht durch einen in Fig. 1 gezeigten Mechanismus eingeführt werden. In dieser besonderen Ausführungsform werden Liposomen gebildet mit einem eingekapselten Medium, das ein Methylammoniumsalz enthält. Das äußere Medium, das ursprünglich die Zusammensetzung des eingekapselten Mediums hat, wird gegen ein neutrales äußeres Medium ausgetauscht. Ein therapeutisches Mittel, wie Doxorubicin oder Ciprofloxacin (die Strukturen sind in Fig. 2 gezeigt), das sowohl lipophil ist als auch protoniert werden kann, wird zum in den Liposomen eingekapselten Medium gezogen durch sowohl seine Polarität als auch den Methylammoniumiongradienten, der durch die Doppelschicht errichtet wurde. Methylamin diffundiert aus den Liposomen, wenn die therapeutischen Mittel hereingezogen und protoniert werden, wodurch das Differential aufrechterhalten wird (siehe Fig. 1).
Die erfindungsgemäßen Liposomen können mit therapeutischen Mitteln hergestellt werden, die bei pH-Bereichen gefällt werden, die in der Herstellung and dem Beladen von Lipidvesikeln mit herkömmlichen Mitteln üblich sind. Weitere Vorteile für diese liposomalen Zusammensetzungen schließen eine lange Lagerbeständigkeit ein, was ein Ergebnis davon ist, daß die Lipide nicht harten Bedingungen ausgesetzt werden, die sie hydrolysieren können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zum Erniedrigen der Freigaberate eines protonierbaren therapeutischen Mittels aus den Lipidvesikeln. In diesem Verfahren wird ein transmembranes Potential durch die Lipidvisikelmembranen erzeugt, das darauf gerichtet ist, das Mittel in den Lipidvesikeln zurückzuhalten. Wie ausführlich unten beschrieben wird, ist überraschenderweise gefunden worden, daß solch ein Methylamingradient in der Lage ist, eine über tausendfache Erniedrigung der Freigaberate der protonierbaren therapeutischen Mittel, wie Ciprofloxacin und Doxorubicin, aus den Liposomen zu erzeugen. Zusätzlich kann das Verfahren mit im wesentlichen jedem protonierbaren Material verwendet werden, das in ein Lipidvesikel eingekapselt werden kann. Der Methylamingradient kann nach der Einkapselung der protonierbaren Verbindung erzeugt werden oder kann das Ergebnis der Lipidvesikelbildung sein.
Zusätzlich zu den vorstehenden Verfahren stellt die Erfindung auch Produkte bereit, die durch Ausübung der Verfahren hergestellt werden, nämlich pharmazeutische Präparate, die ein pharmazeutisches Mittel umfassen, das in Lipidvesikeln mit Hilfe eines Methylamingradienten eingeführt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt schnelle, sichere, wirksame und preiswerte Verfahren bereit zum Laden von amphipathischen therapeutischen Mitteln in Liposomen. Die resultierenden Zusammensetzungen geben das therapeutische Mittel langsam in dem Patienten frei und erreichen daher eine maximale Wirksamkeit in vivo. Der bittere Geschmack und Geruch von Pharmazeutika, wie Ciprofloxacin, können durch Verwendung der Erfindung maskiert werden, und sie kann verwendet werden, um Arzneimittel einzuführen, die Chlorwasserstoffsalze sind und daher einen niedrigen Lösungs-pH haben. Folglich kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, die nicht in großen Mengen durch irgendeine andere Technik hergestellt werden können.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Modell eines Liposoms, das zum Laden eines protonierbaren therapeutischen Mittels verwendet wird.
Fig. 2 zeigt die Strukturen von Doxorubicin und Ciprofloxacin, zwei therapeutische Mittel, die eingeführt und in erfindungsgemäßen Liposomen zurückgehalten werden können.
Fig. 3 zeigt die temperaturabhängige Aufnahme und Retention von Doxorubicin in LUVs, die 600 mM Ethanolamin·HCl Gradienten aufweisen.
Fig. 4 zeigt die temperaturabhängige Aufnahme und Retention von Vincristin in LUVs, die Ethanolamin HCl·Gradienten aufweisen.
Fig. 5 zeigt die temperaturabhängige Aufnahme und Retention von Ciprofloxacin in LUVs, die 600 mM Ethanolamin HCl·Gradienten aufweisen.
Fig. 6 zeigt die Aufnahme und Retention von Doxorubicin, Epirubicin und Vincristin in LUVs (DPPC/Chol), die einen 600 mM EDAS Gradienten bei 60ºC aufweisen.
Fig. 7 zeigt die Aufnahme von Ciprofloxacin in POPC/Chol LUVs, die einen 300 mM EDAS Gradienten mit einem äußeren pH 5,5 Citratpuffer aufweisen.
Fig. 8 zeigt die Aufnahme von Ciprofloxacin in DPPC/Chol LUVs als Antwort auf Amingradienten bei 60ºC.
Fig. 9 zeigt die temperaturabhängige Aufnahme von Tryptophan als Antwort auf 300 mM Methylammoniumsulfat Gradienten.
Fig. 10A zeigt die Aufnahme von Doxorubicin in 100 nm große unilamellare Vesikeln (LUVs), die aus Ei-Phosphatidylcholin zusammengesetzt sind und in Anwesenheit eines Gradienten von 300 mM CH&sub3;NH&sub3;Cl (Methylammoniumchlorid oder MAC) gebildet sind bei einem Arzneimittel-zu-Lipid (molaren) Verhältnis von 0,26 und einer Temperatur von 25ºC.
Fig. 10B zeigt die verbesserte Retention von Doxorubicin in Ei-Phosphatidylcholin LUVs unter denselben Bedingungen wie in Fig. 10A mit der Ausnahme, daß die Liposomen in MAC bei einer Konzentration von 600 mM gebildet wurden.
Fig. 10C zeigt die Arzneimittelretentionseigenschaften der beladenen Formulierung von Fig. 10B während 24 Stunden nach der Beladung.
Fig. 11A stellt die Aufnahme dar, die für Doxorubicin bei einem Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,13 während etwa 30 Minuten bei 600 mM von MAC in DPPC/Cholesterin Vesikeln bei 45ºC beobachtet wurde.
Fig. 11B ist eine graphische Darstellung, die die Arzneimittelretention während eines Zeitraums von 24 Stunden für die beladene Formulierung von Fig. 11A zeigt.
Fig. 12A veranschaulicht das. Laden von Doxorubicin, die mit 200 nm DPPC/Cholesterin LUVs, hergestellt in 600 mM MAC erhalten wurde. Das Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis war anfänglich 0,25, und die Temperatur betrug 45ºC.
Fig. 12B ist eine graphische Darstellung, die die Arzneimittelretentionseigenschaften der Formulierung von Fig. 12A zeigt.
Fig. 13 zeigt die Ladungseigenschaften von Doxorubicin in Sphingomyelin/Ceramid/Cholesterin 4 : 1 : 4 (Molverhältnis von Sph/Cer/Cholesterin) LUVs von 200 nm, hergestellt in 600 mM MAC. Die Temperatur betrug 45ºC, und das Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis war 0,36.
Fig. 14 veranschaulicht, die Aufnahme von Ciprofloxacin in 200 nm DPPC/Cholesterin (55 : 45, mol : mol) LUVs als Antwort auf eine innere Konzentration von 600 mM MAC bei 45ºC bei einem anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid (molares) Verhältnis von 2,9.
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse des Ladens von Ciprofloxacin in Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin 55 : 45 mol : mol (DSPC)/Cholesterin 100 nm LUVs als Antwort auf einen 300 mM (CH&sub3;NH&sub3;)&sub2;SO&sub4; (MAS) Gradienten bei 65ºC und mit einem Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,5. Das endgültige Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis war 0,4.
Fig. 16 veranschaulicht die Aufnahme von Doxorubicin in DPPC/Cholesterin (55 : 45 mol : mol) in 100 nm LUVs, hergestellt in 300 mM MAS bei 45ºC, mit anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnissen von 0,37 (Fig. 16A) und 1,2 (Fig. 16B).
Fig. 17 ist eine graphische Darstellung, die die Aufnahme von Doxorubicin in Sph/Cer/Cholesterin 1 : 1 : 1 (Molverhältnis) 100 nm LUVs, die PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Cer-C&sub1;&sub4; enthalten, hergestellt in 300 mM MAC bei 50ºC, mit einem anfänglichen Arzneimittel-zu- Lipid Verhältnis von 0,66.
Fig. 18 zeigt die Retentionseigenschaften, die Liposomen aufweisen, die mit Doxorubicin in DSPC/Cholesterin + 2% PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;- Cer-C&sub2;&sub0; + 1% N-(4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl)phosphatidylethanolamin (MPB-PE) Lipidvesikeln beladen sind unter Verwendung eines 300 mM Methylammoniumsulfat Gradienten. Die drei Kurven zeigen Lipidvesikeln (Kreise), Lipidvesikeln vorinkubiert in 50% Mäuseserum (Quadrate) und mit Antikörper gekuppelte Lipidvesikeln inkubiert in 50% Mäuseserum (Dreiecke).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG INHALT

I. Glossar
II. Allgemeines
III. Verfahren zum Laden von therapeutischen Mitteln in Liposomen
IV. Verfahren zum Zurückhalten von therapeutischen Mitteln in Liposomen
V. Pharmazeutische Formulierungen
VI. Verabreichung von Liposomformulierungen
VII. Beispiele
VIII. Schlußfolgerung

I. Glossar

Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet: DOX, Doxorubicin; Cer, Ceramid; Chol, Cholesterin; CIP, Ciprofloxacin; DPPC, Dipalmitoylphosphatidylcholin; DSPC, Distearoylphosphatidylcholin; DTT, Dithiothreit; EDAS, Ethylendiammoniumsulfat; HBS, mit Hepes gepufferte Salzlösung; LUV, große unilamellare Vesikeln; MAC, Methylammoniumchlorid; MAS, Methylammoniumsulfat; MLV, multilamellare Vesikeln; MPB,4-(Maleinimidophenyl)- butyryl; PE, Phosphatidylethanolamin; PEG, Polyethylenglycol; PEG-Cer-C&sub2;&sub0;, 1-0-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)- 2-N-arachidoyl-sphingosin; PEG-Cer-C&sub1;&sub4;, 1-0-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)-2-N-myristoyl-sphingosin; POPC, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin; und Sph, Sphingomyelin.
Die Begriffe "pharmazeutisches Präparat" und "protonierbares Mittel", wie sie hier verwendet werden, haben die folgenden Bedeutungen: Pharmazeutisches Präparat bedeutet eine Stoffverbindung, die zur Verabreichung an Menschen oder Tiere geeignet ist und ein biologisch aktives Material und geeignete Puffer, Verdünner, Träger und ähnliches enthält; und protonierbares Mittel bedeutet ein Mittel, das in einem geladenen Zustand existieren kann, wenn es in einem wäßrigen Medium gelöst ist. Beispiele für protonierbare Mittel umfassen Verbindungen mit einer Aminogruppe, die in sauren Medien protoniert werden kann, und Verbindungen, die in neutralen Medien zwitterionisch sind (d. h. Aminosäuren und Mittel wie Ciprofloxacin) und die auch in sauren Umgebungen protoniert werden können.
Der Begriff "Lipid" bezieht sich auf jedes geeignete Material, das in der Weise zu einer Doppelschicht führt, daß ein hydrophober Teil des Lipidmaterials sich zur Doppelschicht hin ausrichtet, während ein hydrophiler Teil sich zur wäßrigen Phase hin ausrichtet. Amphipathische Lipide sind als primäres Strukturelement des Lipidvesikels notwendig. Hydrophile Eigenschaften stammen von der Anwesenheit von Phosphat-, Carboxy-, Sulfat-, Amino-, Sulfhydryl-, Nitrogruppen und anderen ähnlichen Gruppen.
Die Hydrophobie könnte durch den Einschluß von Gruppen verliehen werden, die, ohne darauf eingeschränkt zu sein, langkettige gesättigte und ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen und solche Gruppen umfassen, die mit einer oder mehreren aromatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Gruppen substituiert sind. Die bevorzugten amphipathischen Verbindungen sind Phosphoglyceride und Sphingolipide, repräsentative Beispiele, die Phosphalidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidsäure, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin oder Dilinoleoylphosphatidylcholin umfassen, könnten verwendet werden. Andere Verbindungen ohne Phosphor, wie Sphingolipid- und Glycosphingolipidfamilien sind auch innerhalb der als Lipid bezeichneten Gruppe. Zusätzlich können die oben beschriebenen amphipathischen Lipide mit anden Lipiden einschließlich Triglyceriden und Sterinen gemischt werden.
Der Begriff "Gewebe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede pathologische Zelle oder Gruppe von Zellen, die eine ähnliche pathologische Eigenschaft zeigen. Zum Beispiel kann die Eigenschaft eine maligne Umwandlung sein. Alternativ kann die Eigenschaft eine intrazellulare Infektion sein. Im allgemeinen wird das Gewebe Zellen umfassen, die vom selben Zellentyp stammen.

II. Allgemeines

Die Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden aus üblichen vesikelbildenden Lipiden gebildet, die im allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterin, wie Cholesterin, umfassen. Die Auswahl der Lipide wird im allgemeinen unter Berücksichtigung z. B. der Liposomgröße und der Beständigkeit der Liposomen in dem Blutstrom getroffen.
Typischerweise ist die Hauptlipidkomponente in den Liposomen Phosphatidylcholin. Phosphatidylcholine, die eine Vielzahl von Acylkettengruppen mit unterschiedlicher Kettenlänge und unterschiedlichem Sättigungsgrad haben, sind erhältlich oder können durch wohlbekannte Techniken isoliert oder synthetisiert werden. Im allgemeinen können weniger gesättigte Phosphatidylcholine leichter auf geeignete. Größen gebracht werden, insbesondere wenn die Liposomen auf unter etwa 0,3 Mikron für die Zwecke der Filtersterilisation gebracht werden müssen. Phosphatidylcholine, die gesättigte Fettsäuren mit Kohlenstoffkettenlängen im Bereiche von C&sub1;&sub4; bis C&sub2;&sub2; enthalten, sind bevorzugt. Phosphatidylcholine mit einfach oder zweifach ungesättigten Fettsäuren und Mischungen von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren können auch verwendet werden. Andere geeignete Lipide schließen Phosphonolipide ein, in denen die Fettsäuren an Glycerin eher über Etherbindungen als über Esterbindungen gebunden sind. In der vorliegenden Erfindung brauchbare Liposomen können auch aus Sphingomyelin oder Phospholipide mit anderen Kopfgruppen als Cholin, wie Ethanolamin, Serin, Glycerin und Inosit, zusammengesetzt sein. Bevorzugte Liposomen umfassen ein Sterin, vorzugsweise Cholesterin, bei Molverhältnissen von 0,1 bis 1,0 (Cholesterin : Phospholipid). Am meisten bevorzugte Liposomzusammensetzungen sind Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin, Dipalmitoylphosphatidylcholin/Cholesterin und Sphingomyelin/Cholesterin. Verfahren, die verwendet werden, um die Liposomen auf geeignete Größen zu bringen und durch Filtration zu sterilisieren, werden unten erörtert.
Die Liposomen können mit irgendeiner der jetzt bekannten oder später entwickelten Techniken zur Herstellung von Liposomen hergestellt werden. Zum Beispiel können die Liposomen durchdie herkömmliche Technik zur Herstellung von multilamellaren Lipidvesikeln (MLVs) gebildet werden, d. h. durch Abscheiden eines oder mehrerer ausgewählter Lipide auf den Innenwänden eines geeigneten Gefäßes, indem die Lipide in Chloroform aufgelöst werden und dann das Chloroform verdampft wird und dann durch Zugabe der einzukapselnden wäßrigen Lösung zum Gefäß und dadurch, daß man die wäßrige Lösung das Lipid hydratisieren läßt sowie durch Wirbeln oder starkes Wirbeln der resultierenden Lipidsuspension. Dieses Verfahren erzeugt eine Mischung, die die gewünschten Liposomen enthält.
Alternativ können Techniken, die zur Herstellung von großen unilamellaren Lipidvesikeln (LUVs) verwendet werden, wie Umkehrphasen-Verdampfung, Infusionsverfahren und Detergensverdünnung, verwendet werden, um die Liposomen herzustellen. Ein Überblick über diese und andere Verfahren zur Herstellung von Lipidvesikeln kann in dem Text Liposome Technology, Volume I, Gregory Gregoriadis Ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, (1984) gefunden werden, der durch Nennung Teil der Beschreibung wird. Zum Beispiel können die lipidhaltigen Teilchen vorliegen in Form von steroidalen Lipidvesikeln, beständigen plurilamellaren Lipidvesikeln (SPLVs), einphasigen Vesikeln (MPVs) oder Lipidmatrixträgern (LMCs) der Typen, die in Lenk et al. US-Patent Nr. 4 522 803 und Tountain et al. US-Patente Nr. 4 588 578 und Nr. 4 610 868 offenbart werden, deren Offenbarungen durch Nennung Teil der Beschreibung werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von LUVs wird in dem US-Patent Nr. 5 008 050 beschrieben.
Zusätzlich können im Fall von MLVs, falls gewünscht, die Liposomen mehrfach (fünf oder mehr) Frier-Tau-Zyklen unterworfen werden, um die eingeschlossenen Volumen und die Einfangwirkungsgrade zu erhöhen und um eine einheitlichere interlamellare Verteilung des gelösten Stoffs zu schaffen (Mayer et al., J. Biol. Chem. 260: 802-808 (1985)).
Anschließend an die Liposomherstellung können die Liposomen auf eine bestimmte Größe gebracht werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung der Liposomengrößen zu erreichen. Ein Größenbereich von etwa 0,2-0,4 Mikron gestattet es, die Liposomsuspension mittels Filtration durch ein herkömmliches Filter, typischerweise ein 0,22 Mikron Filter, zu sterilisieren. Das Verfahren der Filtersterilisation kann auf einer hohen Durchsatzbasis durchgeführt werden, wenn die Liposomen auf Größen von etwa 0,2-0,4 Mikron verkleinert wurden.
Einige Techniken stehen zur Verfügung, um Liposomen auf eine gewünschte Größe zu bringen. Ein solches Verfahren wird in dem US-Patent Nr. 4 737 323 beschrieben, das durch Nennung Teil der Beschreibung wird. Schallbehandlung einer Liposomsuspension durch Bad- oder Prüfkopf-Schallbehandlung erzeugt eine zunehmende Größenverringerung bis herunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln mit einer Größe unterhalb etwa 0,05 Mikron. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf Scherenergie beruht, um große Liposomen in kleinere zu zerteilen. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Vesikeln durch einen üblichen Emulsionshomogenisierapparat rezirkuliert, bis die ausgewählten Liposomgrößen, typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 Mikron, beobachtet werden. In beiden Verfahren kann die Teilchengrößeverteilung mit herkömmlicher Teilchengrößebestimmung durch Laserstrahl überwacht werden.
Die Liposomextrusion durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine asymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren, um Liposomgrößen auf eine relativ wohl definierte Größenverteilung zu verringern (siehe US-Patent Nr. 5 008 050 und Hope et al. in: Liposome Technology, Vol. 1, 2d ed. (G. Gregoriadis, Ed.) CRC Press, Seiten 123-139 (1992), dessen Offenbarung durch Nennung Teil der Beschreibung ist). Typischerweise durchläuft die Suspension ein oder mehrere Male die Membran, bis die gewünschte Größenverteilung der Liposomen erreicht ist. Die Liposomen können durch zunehmend kleinerporige Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Verringerung der Liposomgröße zu erreichen. Zur Anwendung in den vorliegenden Erfindungen sind Liposomen mit einer Größe von etwa 0,05 Mikron bis etwa 0,15 Mikron bevorzugt. Andere geeignete Verfahren zur Größeneinstellung wie Schallbehandlung, Lösemittelverdampfung oder Umkehrphasen-Verdampfung sind den Fachleuten bekannt.
Dia nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Liposomen können für längere Lagerung dehydratisiert werden. Zu diesem Zweck sind zwei grundlegende Wege vorgesehen. Bei einem Weg werden die Lipidvesikeln gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem therapeutischen Mittel beladen, für Lagerungszwecke dehydratisiert, verschickt und ähnliches und dann zur Verwendungszeit rehydratisiert. Alternativ können die Lipidvesikeln ohne das protonierbare therapeutische Mittel gebildet, zur Lagerung dehydratisiert werden wie oben und dann zur oder nahe der Verwendungszeit unter Verwendung einer Lösung des protonierbaren therapeutischen Mittels so rehydratisiert werden, daß der Methylamingradient entsteht und das pharmazeutische Mittel eingeführt wird.
In beiden Fällen werden die Liposomen vorzugsweise unter vermindertem Druck dehydratisiert, indem eine übliche Gefriertrocknungseinrichtung oder eine äquivalente Apparatur verwendet wird. Die Lipidvesikeln und ihr umgebendes Medium können auch in flüssigem Stickstoff gefroren werden, bevor sie dehydratisiert werden oder nicht, und unter verminderten Druck gebracht werden. Die Dehydratisierung ohne vorheriges Frieren dauert länger als die Dehydratisierung mit vorherigem Frieren, aber das Gesamtverfahren ist schonender ohne den Gefrierschritt, und daher tritt anschließend geringere Schädigung der Lipidvesikeln und ein geringerer Verlust der inneren Gehalte auf, Die Dehydratisierung ohne vorheriges Frieren bei Raumtemperatur und einem verminderten Druck durch eine Vakuumpumpe geschaffen, die einen Druck von etwa 1 mmHg schaffen kann, dauert zwischen etwa 24 und 36 Stunden, während die Dehydratisierung mit vorherigem Frieren unter denselben Bedingungen im allgemeinen zwischen etwa 12 und 24 Stunden dauert.
Um sicherzustellen, daß die Liposomen das Dehydratisierungsverfahren ohne Verlust eines wesentlichen Teils ihrer inneren Gehalte übersteht, ist es wichtig, daß eine oder mehrere schützende Zucker zur Verfügung stehen, um mit den Membranen der Lipidvesikeln in Wechselwirkung zu stehen und sie intakt zu halten, wenn das Wasser in dem System entfernt wird. Eine Vielzahl von Zuckern kann verwendet werden einschließlich solcher Zucker, wie Trehalose, Maltose, Sucrose, Glucose, Lactose und Dextran. Im allgemeinen ist gefunden worden, daß Disaccharidzucker besser arbeiten als Monosaccharidzucker, wobei die Disaccharidzucker Trehalose und Sucrose am wirksamsten sind. Andere kompliziertere Zucker können auch verwendet werden. Zum Beispiel wurde gefunden, daß Aminoglycoside einschließlich Streptomycin und Dihydrostreptomycin Lipidvesikeln während der Dehydratisierung schützen.
Typischerweise sind ein oder mehrere Zucker als Teil entweder des inneren oder äußeren Mediums der Lipidvesikeln enthalten. Am meisten bevorzugt sind die Zucker sowohl in dem inneren Medium als auch in dem äußeren Medium enthalten, so daß sie mit beiden, der inneren und äußeren Oberfläche der Liposommembranen in Wechselwirkung treten können. Der Einschluß in dem inneren Medium wird erreicht, indem der Zucker oder die Zucker zu dem Puffer gegeben werden, der in die Lipidversikeln während des Bildungsverfahrens der Lipidvesikeln eingekapselt wird. Da in den meisten Fällen dieser Puffer auch das Badmedium für die fertigen Lipidvesikeln bildet, läßt der Gehalt der Zucker in dem Puffer diese auch Teil des äußeren Mediums werden. Wenn natürlich ein anderes äußeres Medium als der ursprüngliche Puffer verwendet wird, um z. B. ein Transmembranpotential (siehe oben) zu erzeugen, sollte das neue äußere Medium auch einen oder mehrere der schützenden Zucker enthalten.
Die zu verwendende Zuckermenge hängt von dem verwendeten Zuckertyp und den Eigenschaften der zu schützenden Lipidvesikeln ab. Siehe US-Patent Nr. 4 880 635 und Harrigan et al., Chem. Phys. Lipids 52: 139-149 (1990), deren Offenbarungen durch Nennung Teil der Beschreibung sind. Fachleute können leicht verschiedene Zuckertypen und -konzentrationen testen, um zu bestimmen, welche Kombination für ein spezielles Lipidvesikelpräparat am besten arbeitet. Im allgemeinen ist gefunden worden, daß Zuckerkonzentrationen in der Größenordnung von 100 mM und darüber notwendig sind, um die höchsten Schutzniveaus zu erreichen. Ausgedrückt in Molen des Membranphospholipids, entsprechen Niveaus in der Größenordnung von 100 mM etwa 5 Mol Zucker je Mol des Phospholipids.
Im Fall der Dehydratisierung ohne vorheriges Frieren, wenn die zu dehydratisierenden Lipidvesikeln vom Typ mit mehreren Lipidschichten sind und wenn die Dehydratisierung bis zu einem Endpunkt durchgeführt wird, bei dem zwischen etwa 2% und etwa 5% des ursprünglichen Wassers in dem Präparat darin gelassen wird, kann auf die Verwendung eines oder mehrerer schützender Zucker verzichtet werden.
Wenn die Lipidvesikeln einmal dehydratisiert sind, können sie über eine lange Zeit gelagert werden, bis sie verwendet werden. Die geeignete Temperatur für die Lagerung wird von der Aufmachungsart der Lipidvesikeln und der Temperaturempfindlichkeit von den jeweiligen Materialien, die in die Lipidvesikeln eingekapselt wurden, abhängen. Zum Beispiel, wie auf dem Gebiet bekannt ist, sind verschiedene pharmazeutische Mittel hitzelabil, und daher sollten dehydratisierte Lipidvesikeln, die solche Mittel enthalten, unter gekühlten Bedingungen gelagert werden, so daß die Wirksamkeit des Mittels nicht verloren geht. Auch wird für solche Mittel das Dehydratisierungsverfahren vorzugsweise eher bei verminderten Temperaturen als bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen ist es wünschenswert, die erfindungsgemäßen Liposomen auf ein Ziel auszurichten unter Verwendung von auf ein Ziel richtenden Resten, die für einen speziellen Zelltyp, Gewebe und ähnliches spezifisch sind. Das auf ein Ziel Ausrichten von Liposomen unter Verwendung einer Vielzahl von auf ein Ziel richtenden Resten (z. B. Liganden, Rezeptoren und monoklonalen Antikörpern) sind früher beschrieben worden (siehe z. B. US-Patente Nr. 4 957 773 und Nr. 4 603 044, die beide durch Nennung Teil der Beschreibung sind).
Beispiele von auf ein Ziel richtenden Resten umfassen monoklonale Antikörper, die spezifisch für mit Neoplasmen verbundene Antigene sind, wie Prostatakrebs spezifisches Antigen. Tumore können auch diagnostiziert werden, indem Genprodukte, die von der Aktivierung oder Überexpression von Onkogenen stammen, wie ras oder c-erB2, nachgewiesen werden. Außerdem exprimieren viele Tumore Antigene, die normalerweise von Fetalgewebe exprimiert werden, wie Alphafetoprotein (AFP) und carcinoembryonales Antigen (CEA). Stellen einer Virusinfektion können diagnostiziert werden unter Verwendung verschiedener Virusantigene, wie Hepatitis B Kern- und Oberflächenantigen (HBVc, HBVs), Hepatitis C Antigen, Epstein-Barr Virusantigen, menschliches Immunschwäche Typ-1 Virus (HIV1) und Papillom Virusantigen. Entzündung kann nachgewiesen werden unter Verwendung von Molekülen, die spezifisch durch Oberflächenmoleküle erkannt werden, die an Entzündungsstellen expremiert werden, wie Integrine (z. B. VCAM-1), Seletinrezeptoren (z. B. ELAM-1) und ähnliche.
Übliche Verfahren zur Kupplung von auf ein Ziel richtenden Mitteln an Liposomen können verwendet werden. Diese Verfahren betreffen im allgemeinen die Einarbeitung von Lipidkomponenten, in Liposomen, wie Phosphalidylethanolamin, die für die Anheftung von auf ein Ziel richtenden Mitteln aktiviert werden können, oder derivatisierte lipophile Komponenten, wie lipidderivatisiertes Bleomycin. Durch Antikörper auf ein Ziel gerichtete Liposomen können gebildet werden unter Verwendung von Liposomen zum Beispiel, die Protein A einbauen (siehe Renneisen et al., J. Biol. Chem., 265: 16337-16342 (1990) und Leonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2448-2451 (1990), die beide durch Nennung Teil der Beschreibung sind).
Auf ein Ziel richtende Mechanismen erfordern im allgemeinen, daß die auf ein Ziel richtenden Mittel auf der Oberfläche des Liposoms in solcher Weise angeordnet sind, daß die auf ein Ziel richtenden Reste zur Wechselwirkung mit dem Ziel, zum Beispiel einem Zelloberflächenrezeptor, erreichbar sind. Das Liposom ist typischerweise in solcher Weise geformt, daß ein Verbindungsteil zuerst in die Membran zur Zeit der Membranbildung eingearbeitet wird. Das Verbindungsteil muß ein lipophiles Teil haben, das fest in die Membran eingebettet und verankert ist. Es muß auch ein hydrophiles Teil haben, das chemisch auf der wäßrigen Oberfläche des Liposoms erreichbar ist. Das hydrophile Teil ist so ausgewählt, daß es chemisch geeignet ist, eine beständige chemische Bindung mit dem auf ein Ziel richtenden Mittel, das später zugegeben wird, bilden zu können. Daher muß das Verbindungsmolekül beides haben, einen lipophilen Anker und eine hydrophile reaktive Gruppe, die geeignet ist zur Reaktion mit dem auf ein Ziel richtenden Mittel und zum Halten des auf ein Ziel richtenden Mittels in der richtigen Stellung, das sich von der Liposomoberfläche nach außen erstreckt. In einigen Fällen ist es möglich, das auf ein Ziel richtende Mittel an das Verbindungsmolekül direkt zu heften, aber in den meisten Fällen ist es geeigneter, ein drittes Molekül zu verwenden, um als eine chemische Brücke zu wirken, wodurch das Verbindungsmolekül, das in der Membran ist, mit dem auf ein Ziel richtenden Mittel verbunden wird, das sich dreidimensional von der Vesikeloberfläche weg erstreckt.

III. Verfahren zum Laden therapeutischer Mittel in Liposomen

Traditionelle Verfahren zum Laden herkömmlicher Arzneimittel in Liposomen umfassen eine Einkapselungstechnik und ein Einführungsverfahren durch Transmembranpotential. Bei dem Einkapselungsverfahren werden das Arzneimittel und die Liposomkomponenten in einem organischen Lösemittel oder einer Lösemittelmischung gelöst, in dem bzw. in der alle Spezien mischbar sind, und zu einem trockenen Film konzentriert. Ein Puffer wird dann zu dem getrockneten Filmgegeben und Liposomen werden gebildet, die das Arzneimittel in den Vesikelwänden enthalten. In einer Modifikation dieser Einkapselungstechnik kann das Arzneimittel in einen Puffer gegeben werden und zu einem getrockneten Film aus nur Lipidkomponenten gegeben werden. Auf diese Weise wird das Arzneimittel in dem wäßrigen Inneren des Liposoms eingekapselt. Der Puffer, der bei der Bildung der Liposomen verwendet wird, kann jede biologische verträgliche Pufferlösung sein von zum Beispiel isotonischer Salzlösung, mit Phospat gepufferter Salzlösung oder anderen Puffern mit niedriger Ionenstärke.
Einkapselungsverfahren, oft als ein "passives Beladen" bezeichnet, leiden unter mehreren Einschränkungen. Eine solche Einschränkung ist das niedrige Arzneimittel-zu-Lipid (D/L) Verhältnis, das erreicht wird. Mit niedrigen D/L Verhältnissen müssen größere Mengen Lipide verabreicht werden, um eine geeignete Arzneimittelkonzentration in vivo zu erreichen. Verbunden mit diesem niedrigen D/L Verhältnis ist die Ineffizienz der Arzneimittelaufnahme in die Liposomen, die zu einem wesentlichen Verlust der teuren pharmazeutischen Mittel führt. Alternativ führt die Rückführung und erneute Isolierung der nicht eingekapselten pharmazeutischen Mittel zu zusätzlichen Kosten für die Herstellung.
Alternative Beladungsverfahren, als "aktives Beladen" bezeichnet, umfaßt die Verwendung der Transmembranpotentiale. Das Beladen durch Transmembranpotential ist ausführlich in US-Patent Nr. 4 885 172, US-Patent Nr. 5 059 421, US-Patent Nr. 5 171 578, US-Patent Nr. 5 316 771 und US-Patent Nr. 5 380 531 beschrieben worden. Kurz, das Beladungsverfahren durch Transmembranpotential wird für eine Anzahl herkömmlicher Arzneimittel verwendet, die in einem geladenen Zustand vorliegen können, wenn sie in einem geeigneten wäßrigen Medium gelöst sind. Vorzugsweise wird das Arzneimittel relativ lipophil sein, so daß es sich in die Liposommembranen verteilen wird. Das Beladungsverfahren wird ausgeführt durch Schaffung eines Transmembranpotentials durch die Doppelschichten der Liposomen. Das Transmembranpotential wird erzeugt durch Schaffung eines Konzentrationsgradienten für eine oder mehrere geladene Arten (z. B. Na&spplus;, K&spplus;, H&spplus; und/oder NH&sub4;&spplus;) durch die Membranen. Dieser Konzentrationsgradient wird erzeugt durch Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichem inneren und äußeren Medium. Daher wird für ein Arzneimittel, das, wenn ionisiert, negativ geladen ist, ein Transmembranpotential durch die Membranen geschaffen, das ein inneres Potential hat, das relativ zum äußeren Potential positiv ist. Für ein Arzneimittel, das positiv geladen ist, würde das umgekehrte Transmembranpotential verwendet.
Trotz dieser mehr "aktiven" Beladungsverfahren leiden einige dieser Verfahren noch an einer ineffizienten Arzneimittelbeladung oder Beschränkungen infolge der besonderen verwendeten Medien. Zum Beispiel beschreiben Mayer et al., J. Biol. Chem. 260: 802-808 (1985) das Laden des Lokalanästhetikums Dicubain in Liposomen unter Verwendung von Na&spplus;- und K&spplus;-Gradienten. Es wurde jedoch nur eine 52%-ige Beladung erreicht. Verfahren, die H&spplus;-Ionengradienten (oder pil-Gradienten) betreffen, haben sich für eine Anzahl von Anwendungen zur Liposombeladung als nützlich erwiesen. Dennoch haben auch diese Verfahren ihre Beschränkungen. Zum Beispiel beinhaltet ein Verfahren, das einen pH-Gradienten verwendet, die Herstellung von Liposomen mit einem sauren inneren Medium und einem neutralen äußeren Medium. Die Verwendung eines unphysioligischen sauren pH kann einige Arzneimittel abbauen und auch Lipidhydrolyse beschleunigen und anschließende Leckage irgendeines eingekapselten Arzneimittels. Zusätzlich scheint das Verfahren nicht geeignet zu sein für solche Arzneimittel, die sowohl eine basische Aminfunktionalität als auch eine Carbonsäurefunktionalität besitzen (z. B. Aminosäuren, kleine Peptide und zwitterionische Arzneimittel). Zum Beispiel beschreiben Chakrabarti et al. US-Patent Nr. 5 380 531 pH-Beladungsverfahren für Aminosäuren und Peptide, bei denen die Aminosäuren und Peptide zuerst in ihre Ester- oder Amidformen derivatisiert werden. Chakrabarti et al. geben auch an, daß das Verfahren nicht bei basischeren Aminosäureestern und Peptidestern, wie Histidinmethylester, (LYS)&sub5;methylester und Lys-(Ala)&sub4;methylester, funktioniert. Andere Probleme, die bei pH-Beladungsverfahren bestehen, betreffen die begrenzte Löslichkeit einiger Arzneimittel in einem neutralen äußeren Medium. Zum Beispiel ist das Chinolon antibakterielle Mittel Ciprofloxacin im wesentlichen in Wasser bei dem pH-Bereich 6 bis 8 unlöslich. Wenn der äußere pH auf etwa 5 erniedrigt wird (ein Punkt, bei dem Ciprofloxacin angemessen löslich ist), ist der Gradient für ein schnelles und wirksames Laden des Arzneimittels unzureichend.
Vor kürzerem haben Barenholz et al. US-Patent Nr. 5 316 771 und 5 192 549 ein aktives Beladungsverfahren beschrieben, das einen NH&sub4;&spplus;-Ionengradienten verwendet. Barenholz et al. geben an, daß Liposombeladung unter Verwendung eines NH&sub4;&spplus;- Ionengradienten für schwach amphipathische Verbindungen nützlich ist, die entweder schwach basische oder saure Reste haben. Zusätzlich geben Barenholz et al. an, daß innerhalb einer Gruppe von schwachen Basen die hydrophobere Gruppe leichter geladen wird. Während dieses Verfahren eine alternative Strategie zum Laden bestimmter Verbindungen schafft, besteht weiter ein Bedürfnis auf dem Gebiet für Verfahren mit breiterer Anwendung, zum Beispiel Verfähren, die für Verbindungen geeignet sind, die sowohl basische als auch saure Funktionalität besitzen und die relativ unlöslich in Wasser bei neutralem pH sind.
Überraschenderweise haben wir gefunden, daß die Verwendung von Methylammoniumionen-Gradienten rasches Laden und Retention von Arzneimitteln, wie Ciprofloxacin, in Liposomen ermöglicht. Darüberhinaus schaffen Verfahren, die Methylammoniumionen-Gradienten verwenden, einen breiteren Bereich für Beladungsmöglichkeiten als sie mit Gradienten, die andere Amine, wie Ethanolamin oder Glucosamin, verwenden, erreichbar sind.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren bereit zur Herstellung einer beständigen Liposomformulierung eines protonierbaren therapeutischen Mittels. In diesem Verfahren werden die Liposomen zuerst hergestellt, die eine wäßrige Lösung eines Methylammoniumsalzes einkapseln. Nach der Herstellung der Liposomen wird ein Konzentrationsgradient von Methylamin durch die Liposemmembranen hergestellt, und die resultierende Liposommischung wird mit einer neutralen Form eines protonierbaren therapeutischen Mittels inkubiert. Das therapeutische Mittel wird in das Liposom gezogen infolge des Konzentrationsgradienten des Methylamins, und einmal eingekapselt, wird es protoniert und gefangen.
Liposomen, die eine wäßrige Lösung eines Methylaminsalzes einkapseln, können durch jedes der oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das anschließende Laden des protonierbaren therapeutischen Mittels in die Liposomen wird von dem Konzentrationsgradienten des Methylamins (oder Gradienten des Methylammoniumions) und des pH-Gradienten abhängen, der auch von einer Änderung in den Methylaminkonzentrationen zwischen den Lipiddoppelschichten herrührt. Die Gradienten werden geschaffen durch Bildung der Liposomen in einer Methylammoniumsalzlösung, gefolgt von einem Entfernen oder Verdünnen des Salzes von bzw. in der äußeren wäßrigen Phase der Liposomen. Eine Anzahl von Methylammoniumsalzen ist in der vorliegenden Erfindung nützlich einschließlich Methylammoniumchlorid, Methylammoniumsulfat, Methylammoniumcitrat und Methylammoniumacetat. Andere Salze, die in pharmazeutischen Formulierungen geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Die Konzentration der Methylammoniumsalzlösung, die eingekapselt wird, kann von etwa 50 mM bis etwa 1 M variieren, jedoch sind Konzentrationen von 200 mM bis 800 mM bevorzugt, wobei 300 mM bis 600 mM besonders bevorzugt sind. Im allgemeinen ist eine anfängliche Methylammoniumionkonzentration von etwa 600 mM die am meisten bevorzugte. Um den Konzentrationsgradienten zu schaffen, wird das ursprüngliche äußere Medium durch ein neues äußeres Medium ersetzt mit einer verschiedenen Konzentration der geladenen Art oder einer völlig verschiedenen geladenen Art. Der Ersatz des äußeren Mediums kann durch verschiedene Techniken ausgeführt werden, wie durch Passage des Lipidvesikelpräparates durch eine Gelfiltrationssäule, z. B. eine Sephadex Säule, die mit dem neuen Medium äquilibriert wurde, oder durch Zentrifugieren, Dialyse oder verwandte Techniken.
In Abhängigkeit von der Permeabilität der Lipidvesikelmembranen wird sich das volle Transmembranpotential, das dem Konzentrationsgradienten entspricht, entweder spontan bilden oder es kann notwendig sein, ein Mittel zur Erhöhung der Permeabilität, z. B. ein Proton- Ionophor, zu dem Badmedium zu geben. Falls erwünscht, kann das Mittel zur Erhöhung der Permeabilität unter Verwendung von Chromatographie oder anderen Techniken aus dem Präparat entfernt werden, nachdem das Laden vervollständigt worden ist. In jedem Fall wird sich ein Transmembranpotential mit einer durch die Nernstsche Gleichung definierten Größenordnung durch die Lipidvesikelmembranen einstellen. Die Veränderung in der Zusammensetzung der äußeren Phase verursacht einen Ausfluß von neutralem Methylamin aus dem inneren eingekapselten Medium zum äußeren Medium. Dieser Ausfluß ergibt auch einen umgekehrten pH-Gradienten durch Anhäufung von in der inneren wäßrigen Phase zurückgebliebenen Wasserstoffionen. Ein Zufluß einer neutralen Form eines protonierbaren therapeutischen Mittels in die Liposomen ersetzt das Methylamin.
Erfindungsgemäß ist auch gefunden worden, daß der Methylamingradient auch verwendet werden kann, um protonierbare therapeutische Mittel in Lipidvesikeln zu laden ungeachtet des pH der äußeren Lösung. Das ist sehr überraschend angesichts der früheren Beladungsverfahren. Weiterhin, wenn einmal die Lipidvesikeln mit einem Konzentrationsgradienten und daher einem Methylamingradienten mit geeigneter Orientierung hergestellt worden sind, reduziert sich das Verfahren zum Laden pharmazeutischer Mittel in die Lipidvesikeln auf den sehr einfachen Schritt der Zugabe des Mittels zu dem äußeren Medium. Einmal zugegeben, wird der Methylamingradient das Mittel automatisch in die Lipidvesikeln laden. Wie in den Beispielen unten ausführlich beschrieben, ist das Beladen nicht nur einfach, sondern auch äußerst wirksam. Wie auch in den Beispielen unten beschrieben, ist gefunden worden, daß Einfangwirkungsgrade für pharmazeutische Mittel von 90% und höher leicht mit der Methylamin/Methylammoniumiongradient-Beladungstechnik erreicht werden können.
Das Methylamingradient Beladungsverfahren kann mit im wesentlichen jedem therapeutischen Mittel verwendet werden, das in einem geladenen Zustand bestehen kann, wenn es in einem geeigneten wäßrigen Medium gelöst ist (z. B. organische Verbindungen, die eine Aminogruppe enthalten, die protoniert werden kann, und einige zwitterionische Verbindungen, wie die Chinolon antibakteriellen Mittel). Vorzugsweise sollte das Mittel oder Arzneimittel relativ lipophil sein, so daß es sich in den Lipidvesikelmembranen verteilen kann. Beispiele für einige pharmazeutische Mittel, die durch dieses Verfahren in Lipidvesikeln geladen werden können, umfassen Doxorubicin, Mitomycin, Bleomycin, Daunorubicin, Streptozocin, Vinblastin, Vincristin, Mechlorethaminhydrochlorid, Melphalan, Cyclophosphamid, Triethylenthiophosphoramid, Carmustin, Lomustin, Semustin, Fluorouracil, Hydroxyharnstoff, Thioguanin, Cytarabin, Floxuridin, Decarbazin, Procarbazin und Ciprofloxacin. Vorzugsweise werden Arzneimittel, die unter Verwendung der vorliegenden Verfahren in Liposomen geladen werden, Anthrachinon Arzneimittel aus der Gruppe Doxorubicin, Daunomycin, Carcinomycin, N-Acetyladriamycin, N-Acetyldaunomycin, Rubidazon, 5-Imidodaunomycin, Musettamycin, Rudolfomycin, Aclacinomycin, Marcellomycin, Descarbomethoxymarcellomycin, Descarbomethoxyrudolfomycin und Mitoxanthron; Vincristin und dessen Analoge; Displatin; und Chinolon antibakterielle Mittel sein.
Das vorliegende Verfahren hat sich insbesondere als geeignet erwiesen zum Laden von Arzneimitteln, wie Ciprofloxacin. Wie oben angegeben, ist Ciprofloxacin ein antibakterielles Mittel, das in dem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 11,5 zwitterionisch ist. Zusätzlich hat Ciprofloxacin eine begrenzte Löslichkeit in Wasser im neutralen, in dem pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 9,5. Wenn es in Wasser gegeben wird, erzeugt Ciprofloxacin eine wäßrige Mischung mit einem pH von etwa 3,5 bis 4,0. Alle Versuche, diese Ciprofloxacinlösung zu puffern oder den pH einzustellen, führen zur Fällung des Arzneimittels. Trotz dieser problematischen Eigenschaften kann das vorliegende Verfahren zum Beladen von Liposomen mit Ciprofloxacin und verwandten Chinolon antibakteriellen Mitteln, angewandt werden, wie Norfloxacin, Ofloxacin und Enoxacin (siehe Fernandes et al., ANNUAL REPORTS IN MEDICINAL CHEMISTRY Vol. 23, Academic Press, San Diego, CA, Chapter 14, Seiten 133-140 (1988), durch Nennung Teil der Beschreibung).
Zusätzlich zum Laden eines einzigen therapeutischen Mittels kann das Verfahren zum Laden mehrerer therapeutischer Mittel entweder gleichzeitig oder hintereinander, verwendet werden. Auch die Lipidvesikeln, in die die protonierbaren therapeutischen Mittel geladen werden, können selbst mit anderen pharmazeutischen Mitteln oder anderen Arzneimitteln unter Verwendung herkömmlicher Einkapselungstechniken (z. B. durch Einbringen des Arzneimittels in den Puffer, aus dem die Lipidvesikeln gemacht werden) vorher beladen sein. Da die herkömmlichen geladenen Materialien nicht protonierbar zu sein brauchen, schafft dieser Lösungsweg große Flexibilität bei der Herstellung von in Lipidvesikeln eingekapselten "Arzneimittelcocktails" zur Verwendung in Krebstherapien. Tatsächlich können im wesentlichen alle Arten von Antikrebsarzneimitteln wenigstens bis zu einem gewissen Grad in entweder das Lipid oder den wäßrigen Teil der Lipidvesikeln vorher geladen werden. Natürlich können, falls erwünscht, eine oder mehrere der oben aufgelisteten protonierbaren Arzneimittel vorher geladen werden und dann dasselbe oder ein unterschiedliches Arzneimittel zu den Lipidvesikeln unter Verwendung des Transmembranpotentialwegs gegeben werden.
Die Liposomformulierungen der therapeutischen Mittel können zur längeren Lagerung dehydratisiert und genau vor der Verwendung rehydratisiert werden. Techniken zum Gefriertrocknen sind oben im allgemeinen Abschnitt beschrieben.

IV. Verfahren zum Zurückhalten von therapeutischen Mitteln in Liposomen

Wendet man sich den Aspekten der Erfindung zu, die die Verringerung der Freigaberate eines protonierbaren pharmazeutischen Mittels aus den Lipidvesikeln betrifft, so ist überraschenderweise gefunden worden, daß die Freigaberate merklich erniedrigt werden kann, indem ein Transmembranpotential durch die Lipidvesikelmembranen geschaffen wird, das ausgerichtet ist, um das Mittel in den Lipidvesikeln zurückzuhalten.
Wenn die Lipidvesikeln mittels eines Transmembranpotentials, das durch solch einen Konzentrationsgradienten hergestellt wurde, geladen worden sind, wird ein einfaches Halten der Lipidvesikeln in einem äußeren Medium, das den ursprünglichen Konzentrationsgradienten aufrechterhalten wird, die gewünschte Erniedrigung der Freigaberate ergeben. Alternativ, wenn ein Methylamingradient nicht schon durch die Lipidvesikelmembranen geschaffen wurde, z. B. wenn die Lipidvesikeln unter Verwendung einer herkömmlichen Technik geladen wurden, kann der gewünschte Methylamingradient leicht durch Wechsel der Zusammensetzung des äußeren Mediums unter Verwendung der oben beschriebenen Austauschtechniken geschaffen werden.
Der erfindungsgemäße Aspekt der verringerten Freigaberate kann mit im wesentlichen jedem protonierbaren biologisch aktiven Mittel verwendet werden, das in ein Lipidvesikel eingekapselt werden kann. Insbesondere kann die Technik mit den oben aufgeführten protonierbaren pharmazeutischen Mitteln und mit einer Vielzahl anderer protonierbarer Arzneimittel verwendet werden einschließlich solcher Arzneimittel, wie Lokalanaesthetika, z. B. Dibucain und Chlorpromazin; Betaadrenerge-Blocker, z. B. Propranolol, Timolol und Labetolol; antihypertonische Mittel, z. B. Clonidin und Hydrazalin; Antidepressiva, z. B. Imipramin, Amitriptylin und Doxepim; Anti-, krampfmittel, z. B. Phenytoin; Antiemetika, z. B. Procainamid und Prochlorperazin; Antihistamine, z. B. Diphenhydramin, Chlorpheniramin und Promethazin; antiarrhythmische Mittel, z. B. Chinidin und Disopyramid; Antimalariamittel, z. B. Chloroquin; Antibiotika, z. B. Ciprofloxacin; und Analgetika, z. B. Cocain. Im allgemeinen, wenn das Arzneimittel sich in den Lipidvesikeln ansammelt, steigt der innere pH an, was einige Arzneimittel ausfällt, wodurch es weniger wahrscheinlich wird, daß sie aus dem Lipidvesikel austreten.

V. Pharmazeutische Formulierungen

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Liposomen enthalten, werden gemäß üblicher Techniken hergestellt und enthalten außerdem einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Im allgemeinen wird normale Salzlösung als pharmazeutisch akzeptabler Träger verwendet. Andere geeignete Träger umfassen z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Salzlösung, 0,3%iges Glycin und ähnliches einschließlich Glycoproteine für erhöhte Stabilität, wie Albumin, Lipoprotein, Globulin u. s. w. Diese Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher, wohlbekannter Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können für die Verwendung verpackt werden oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wäßrigen Lösung zusammengebracht wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, falls erforderlich, enthalten, um sie physiologischen Bedingungen anzunähern, wie Mittel zum Einstellen des pH und Puffermittel, Mittel zum Einstellen der Tonizität und ähnliche, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid u. s. w. Zusätzlich kann die Liposomsuspension lipidschützende Mittel enthalten, die die Lipide gegen Schädigungen durch freie Radikale und gegen lipid-peroxidative Schädigungen bei der Lagerung schützen. Lipophile Radikalfänger, wie Alphatocopherol, und wasserlösliche eisenspezifische Chelatbildner wie Ferrioxamin, sind geeignet.
Die Konzentration der Liposomen in den pharmazeutischen Formulierungen kann weit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,05 Gew.-%, üblicherweise bei oder wenigstens etwa 2-5 Gew.-% bis so viel wie 10 bis 30 Gew.-%, und sie wird in erster Linie auf Grund der Flüssigvolumen, Viskositäten u. s. w. entsprechend der besonderen gewählten Verabreichung ausgewählt. Zum Beispiel kann die Konzentration erhöht werden, um die mit der Behandlung verbundene Flüssigkeitsbelastung zu erniedrigen. Dies kann insbesondere bei Patienten wünschenswert sein, die mit Atherosklerose verbundene kongestive Herzschwäche oder schweren Bluthochdruck haben. Alternativ können aus irritativen Lipiden zusammengesetzte Liposomen auf niedrige Konzentration verdünnt werden, um die Entzündung an der Verabreichungsstelle zu vermindern. Für die Diagnose wird die verabreichte Liposommenge von dem besonderen verwendeten Label, dem zu diagnostizierenden Krankheitszustand und der Beurteilung des Klinikers abhängen, aber sie wird im allgemeinen zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht liegen, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 5 mg/kg Körpergewicht.
Wie oben angegeben, ist es oft wünschenswert polyethylenglykol (PEG)- oder gangliosid GM1-modifizierte Lipide den Liposomen einzufügen. Die Zugabe solcher Komponenten verhindert die Liposomaggregation während der Kupplung des Antiliganden an das Liposom. Dies liefert auch ein Mittel zur Erhöhung der Zirkulationslebensdauer und Erhöhung der Zuführung der Liposomen an die Zielgewebe. Typischerweise wird die Konzentration der PEG- oder GM1-modifizierten Lipide in der Liposommembran etwa 1-5% betragen.
Die Liposomladung ist eine wichtige Determinante für die Clearance der Liposomen aus dem Blut, wobei negativ geladene Liposomen schneller durch das retikuloendotheliale System aufgenommen werden (Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 651 (1975)) und daher kürzere Halbwertszeiten im Blutstrom haben. Liposomen mit verlängerten Zirkulationshalbwertszeiten sind typischerweise für therapeutische und diagnostische Verwendungen wünschenswert (siehe US-Anmeldung Ser. No. 08/316 429). Zum Beispiel sind Liposomen, die von 8, 12 oder bis zu 24 Stunden im Blutstrom gehalten werden können, besonders bevorzugt.
In einem anderen Beispiel ihrer Verwendung können Lipidvesikelformulierungen in einen breiten Bereich von topischen Dosierungsformen eingebracht werden einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, in Gele, Öle, Emulsionen und ähnliche. Zum Beispiel kann die Suspension, die die Lipidvesikelformulierung enthält, zu der wäßrigen Phase als ein Bestandteil in dem Lipidvesikelpräparat gegeben werden und als solches als topische Cremes, Pasten, Salben, Gele, Lotionen und ähnliches für die direkte Anwendung verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Liposomen und protonierbare therapeutische Mittel in Kitform bereit. Das Kit wird typischerweise in einem Behältnis enthalten sein, das in Abteilungen aufgeteilt ist, die die verschiedenen Elemente des Kits enthalten. Die in dem Kit verwendeten therapeutischen Mittel sind diejenigen Mittel, die oben beschrieben wurden. In einer Ausführungsform wird die eine Abteilung ein zweites Kit zum Laden eines protonierbaren therapeutischen Mittels in ein Liposom genau vor der Verwendung enthalten sein. Daher wird die erste Abteilung ein geeignetes Mittel in einem neutralen Puffer enthalten, der zur Schaffung eines äußeren Mediums für die Liposomen verwendet wird, typischerweise in dehydratisierter Form in einer ersten Abteilung. Die Liposomen sind Vesikeln, die ein eingekapseltes Methylammoniumsalz haben. In anderen Ausführungsformen wird das Kit die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten, vorzugsweise in dehydratisierter Form mit Instruktionen für ihre Rehydratisierung und Verabreichung. In noch einer anderen Ausführungsform werden die Liposomen und/oder die Liposomen enthaltenden Zusammensetzungen einen auf ein Ziel gerichteten Rest aufweisen, der an die Oberfläche des Liposoms gefügt ist. Wie in obigen Abschnitten angegeben, ist ein bestechender Vorteil der beschriebenen Kits ihre breitere Anwendbarkeit für die Aufnahme und Retention von Arzneimitteln, wie zum Beispiel Ciprofloxacm.

VI. Verabreichung von Liposomformulierungen

Wenn das therapeutische Mittel einmal in die Liposomen "geladen" ist, kann die Kombination einem Patienten mittels einer Vielzahl von Techniken verabreicht werden.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, d. h. intraartikulär, intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär verabreicht. Bevorzugter werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös oder intraperitoneal durch eine Bolusinjektion verabreicht. Siehe zum Beispiel Rahman et al. US-Patent Nr. 3 993 754; Sears US-Patent Nr. 4 145 410; Papahadjopoulos et al. US-Patent Nr. 4 235 871; Schneider US-Patent Nr. 4 224 179; Lenk et al. US-Patent Nr. 4 522 803; und Fountain et al. US-Patent Nr. 4 588 578. Besondere Formulierungen, die für diese Verwendung geeignet sind, sind in Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17 th. ed. (1985) zu finden. Typischerweise werden die Formulierungen eine in einem akzeptablen Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger suspendierte Liposomlösung enthalten. Eine Vielzahl von wäßrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9%ige isotonische Salzlösung und ähnliches. Diese Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher, wohlbekannter Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können sterilgefiltert sein. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können zur Verwendung so, wie sie sind oder lyophilisiert verpackt werden, wobei die lyophilisierten Präparate vor der Verabreichung mit einer sterilen wäßrigen Lösung zusammengebracht werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, falls erforderlich, enthalten, um sie physiologischen Bedingungen anzunähern, wie Mittel zum Einstellen des pH und Puffermittel, Mittel zum Einstellender Tonizität, Netzmittel und ähnliche, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat Triethanolaminoleat u. s. w.
Die Dosierung für die Liposomformulierungen wird vom Verhältnis von Arzneimittel zu Lipid und der auf Alter, Gewicht und Kondition des Patienten basierenden Beurteilung des verabreichenden Arztes abhängen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können an einer Vielzahl von Wirten praktiziert werden. Bevorzugte Wirte sind Säugerspezien, wie Menschen, nicht menschliche Primaten, Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe und ähnliche.
In anderen Verfahren können die pharmazeutischen Präparate mit den Zielgeweben durch direkte Verabreichung des Präparats an das Gewebe in Kontakt gebracht werden. Die Anwendung kann durch topische, "offene" oder "geschlossene" Behandlungsmethoden durchgeführt werden. Mit "topisch" ist die direkte Verabreichung des pharmazeutischen Präparats an das der Umgebung ausgesetzte Gewebe gemeint, wie die Haut, Mundrachenhöhle, äußerer Gehörgang und ähnliche. "Offene" Behandlungsmethoden sind solche Behandlungsmethoden, die das Einschneiden der Haut eines Patienten umfassen und das direkte Sichtbarmachen des darunterliegenden Gewebes, auf das die pharmazeutischen Präparate aufgebracht werden. Dies wird im allgemeinen durch ein chirurgisches Verfahren durchgeführt, wie eine Brustwandöffnung, um Zugang zu den Lungen zu bekommen, Bauchhöhlenöffnung, um Zugang zu den Bauchhöhlenorganen zu bekommen, oder einen anderen direkten chirurgischen Weg zu dem Zielgewebe. "Geschlossene" Behandlungsmethoden sind invasive Behandlungsmethoden, bei denen die inneren Zielgewebe nicht direkt sichtbar gemacht werden, sondern der Zugang durch Einführen von Instrumenten durch kleine Wunden in der Haut erfolgt. Zum Beispiel können die Präparate dem Bauchfell durch Nadelspülung verabreicht werden. Ähnlich können die pharmazeutischen Präparate den Hirnhäuten oder dem Rückenmark durch Infusion während einer Lumbalpunktion verabreicht werden, gefolgt von einer geeigneten Lagerung des Patienten, wie es üblicherweise bei spinaler Anaesthesie oder der Metrazamidabbildung des Rückenmarks praktiziert wird. Alternativ können die Präparate durch endoskopische Vorrichtungen verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die außerdem einen auf ein Ziel gerichteten Antikörper auf der Liposomoberfläche enthalten, sind besonders zur Behandlung von bestimmten bösartigen Tumorkrankheiten nützlich, wie Eierstock-Drüsenkrebs, der durch die gesamte Bauchfellhöhle metastasiert hat, und metastasische Schädigungen am subarachnoidalen Raum, die üblicherweise an der arachnoidalen oder weichen Hirnhaut hängen und das Rückenmark zu komprimieren drohen. Drüsenkrebs der Brust zeigt üblicherweise metastasische Muster.
Die folgenden Beispiele werden allein zu Zwecken der Erläuterungen unterbreitet.

BEISPIELE

In den Beispielen unten zeigt Beispiel 1 die Schwierigkeiten, die mit der Liposomaufnahme von Ciprofloxacin verbunden sind unter Verwendung der pH-Gradientenverfahren. Beispiel 2 zeigt Unterschiede in der Arzneimittelbeladung unter Verwendung eines substituierten Ammoniumionengradienten für die Aufnahme von Doxorubicin, Vincristin und Ciprofloxacin. Beispiel 3 zeigt die Verwendung eines Diamins zur Herstellung von Ionengradienten, um die Arzneimittelaufnahme zu erleichtern, und die mit verschiedenen Arzneimitteln beobachteten Unterschiede. Beispiel 4 zeigt die Verwendung von Methylammoniumsulfat, um ein zwitterionisches Arzneimittel (Ciprofloxacin) in Liposomen zu laden. Beispiel 5 zeigt Versuche, um Tryptophan (zwitterionisch) in Liposomen zu laden unter Verwendung von Methylammoniumsulfat. Beispiel 6 liefert zusätzliche Ergebnisse für das Laden von Arzneimitteln in Liposomen unter Verwendung von Methylammoniumionengradienten und zeigt auch die Wirkung der Vesikelzusammensetzung, des Gegenions, der Arzneimittel-zu- Lipid Verhältnisse und der Liposomoberflächenkonjugate. Beispiele 7 und 8 zeigen die Retention der Arzneimittel in Liposomen, die unter Verwendung eines Methylammoniumionengradienten geladen wurden.

Materialien

Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Dipalmitoylphosphatidylcholin wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA) erhalten und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionsäure (SPDP) war von Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Doxorubicin, Epirubicin und Vincristin wurden von Pharmacia, Inc., Mississauga, Ontario, Canada erhalten. Cholesterin, Dithiothreit (DTT), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), Sephadex G-50, Sepharose CL-4B, Tryptophan und alle Salze, ausgenommen diejenigen, für die Herstellungsverfahren geliefert werden, wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA erhalten. Gereinigtes N-(4-(Maleinimidophenyl)butyryl)distearoylphosphatidylethanolamin (MPB- DSPE) wurde von Northern Lipids Inc., Vancouver, British Columbia, Canada gekauft. Ciprofloxacin wurde von Bayer, Inc. Healthcare Division, Etobicoke, Ontario, Canada erhalten. PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Cer-C&sub2;&sub0; und PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Cer-C&sub1;&sub4; sind in der anhängigen USSN 08/316 429 beschrieben.
Methylamin (40 Gew.-%/Vol. in Wasser) und Methylammoniumchlorid (CH&sub3;NH&sub3;Cl oder MAC) wurde von BDH gekauft. Methylammoniumsulfat ((CH&sub3;NH&sub3;)&sub2;SO&sub4; oder MAS) wurde durch sorgfältiges Titrieren von Methylamin (40 Gew.-%/Volumen in Wasser) mit konzentrierter Schwefelsäure hergestellt, bis die Lösung leicht basisch war (pH 7,9). Etwas Wasser wurde durch Verwendung eines Brinkmann Rotavapor-R Rotationsverdampfer entfernt. Das restliche Waser wurde azeotrop mit absolutem Ethanol (5-6 Zugaben) unter Verwendung des Rotationsverdampfers entfernt. Das resultierende Salz wurde mit wasserfreiem Ether gewaschen und das Lösemittel durch Filtration entfernt. Restliches Lösemittel wurde entfernt, indem das Methylammoniumsulfat unter hohem Vakuum über Nacht gestellt wurde.

Verfahren

Lipidvesikeln

Ei-Phosphatidylcholin wurde in einer geeigneten Puffer- oder Salzlösung (zum Beispiel 300 oder 600 mM MAC) bei 25ºC hydratisiert und fünf Frier-Tau-Zyklen unterworfen (flüssiger Stickstoff bei etwa -195ºC, gefolgt von Wasser bei 30ºC).
Distearoyl- oder Dipalmitoylphosphatidylcholin/Cholesterin (55 : 45 mol : mol) (DSPC oder DPPC/Chol) wurde zuerst in t-Butanol oder 10%igem Ethanol/Cyclohexan gelöst, dann lyophilisiert. Die Lipidmischung wurde dann in einer geeigneten Puffer- oder Salzlösung hydratisiert (z. B. 600 mM MAC oder 300 mM MAS) und einem Frier-Tau-Wechsel in derselben Weise wie das Ei-Phosphatidylcholinlipid unterworfen mit der Ausnahme, daß die Temperatur des Wassers zum Tauen auf 45ºC (für DPPC/Chol) und auf 65ºC (für DSPC/Chol) erhöht wurde.
Sphingomyelin/Ceramid/Cholesterin (1 : 1 : 1 Molverhälnis Sph/Cer/Chol) Mischungen wurden wie oben für DPPC/Cholesterin beschrieben hergestellt mit der Ausnahme, daß die Lipide anfangs aus Benzol : Methanol (7 : 3 Vol : Vol) lyophilisiert wurden.
LUVs wurden aus obigen hydratisierten Lipiden hergestellt durch Extrusion durch entweder 0,1 Mikron oder 0,2 Mikron Polycarbonatfilter (Costar oder Poretics, Inc.) bei 25ºC oder 45ºC. Die LUVs ließ man dann Spin-Kolonnen nach unten passieren, die mit Sephadex G-50 (Sigma) in 150 mM NaCl (Salzlösung) hergestellt waren.

Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse (D/L)

Die Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse wurden folgendermaßen bestimmt. Aliquote Teile von beladenen Lipidvesikeln wurden zu festgesetzten Zeitintervallen, die von Minuten bis 24 Stunden nach der Arzneimittelzugabe (z. B. Doxorubicin oder Ciprofloxacin) reichten, genommen und bei 2500 U/min 3 Minuten gedreht. Die Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse wurden aus Spin-Kolonnen Proben bestimmt, die genommen wurden, bevor und nachdem die Lipidvesikeln beladen waren. Die Lipidkonzentrationen wurden unter Verwendung von Phosphatassays bestimmt und Arzneimittelkonzentrationen (Doxorubicin) durch spektrophotometrisches Assay basierend auf der dekadischen Extinktion des Arzneimittels bei 480 nm. Für Ciprofloxacin wurden die geladenen Vesikeln einem Bligh und Dyer Extraktionsverfahren unter Verwendung von 200 mM NaOH unterworfen, und die obere (wäßrige Phase) wurde entfernt und spektrophotometrisch bei 274 nm untersucht gegen eine obere Blindphase, um die Arzneimittelkonzentrationen zu bestimmen.

BEISPIEL I

Dieses Beispiel zeigt die Versuche, um Liposomen wirksam mit Ciprofloxacin unter Verwendung eines pH-Gradienten zu beladen.
Liposomen wurden aus Ei-Phosphatidylcholin hergestellt, wie oben beschrieben. Citratpuffer (300 mM, pH 4,0) wurde als Hydratationspuffer verwendet, um dadurch das innere Medium bereitzustellen. Nachdem die LUVs auf eine Größe von 200 nm gebracht waren, ließ man sie durch Spin-Kolonnen laufen, um Liposomen mit einem äußeren Medium von 150 mM NaCl bereitzustellen. Ciprofloxacin wurde zu dem äußeren Medium gegeben, um ein D/L von 2,0 zu erreichen. Diese Menge führte jedoch zu einer Erniedrigung des pH des äußeren Mediums auf etwa 4. Entsprechend wurde das Ciprofloxacin in einer Menge in die Liposomen geladen, die nur ein D/L Verhältnis von 0,18 (10% Beladung) lieferte. Wenn der pH des inneren Mediums auf etwa 2 erniedrigt wurde, wurde nur eine Beladung von etwa 13% erreicht. Daher, obwohl es möglich ist etwas Beladung von Ciprofloxacin unter Verwendung innerer Citratpuffer zu erreichen, sind die D/L Verhältnisse sehr niedrig und stark saure Bedingungen sind erforderlich. Solche Bedingungen können zu Lipidhydrolyse und anschließender Leckage des geladenen Arzneimittels führen.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines Ethanolamingradienten (Ethanolammoniumchlorid), um mit Doxorubicin, Vincristin oder Ciprofloxacin beladene Liposomen bereitzustellen.
Große unilamellare Vesikeln (LUVs) wurden aus DPPC und Cholesterin, wie oben beschrieben, hergestellt durch Hydratisieren der Lipidmischung in 600 mM Ethanolaminhydrochlorid. Die resultierende Mischung wurde auf passende Größe gebracht, um LUVs von etwa 100 nm herzustellen. Die Vesikeln ließ man durch eine Spin-Kolonne laufen, um ein äußeres Medium von 150 mM NaCl zu liefern.
Für Doxorubicin wurde die Aufnahme bei 60ºC 15 min mit einem anfänglichen D/L Verhältnis von 0,25 durchgeführt. Nach der anfänglichen Aufnahmezeit wurde die Probe in zwei Aliquote geteilt. Ein Aliquot wurde bei 60ºC inkubiert, und das andere Aliquot wurde bei 37ºC inkubiert. Innerhalb 5 min waren im wesentlichen 100% des Arzneimittels eingekapselt. Wenn die Temperatur auf 60ºC gehalten wurde, lief annähernd die Hälfte des Doxorubicins während 2,5 h aus. Wenn die Temperatur jedoch auf 37ºC erniedrigt wurde, wurde nach der Aufnahme eine vollständige Retention während 2,5 h beobachtet und auch nach 94 h bei 4ºC (siehe Fig. 3).
Für Vincristin wurden die Experimente in derselben Weise, wie für Doxorubicin beschrieben, durchgeführt. Die Aufnahme des Vincristins war auch ausgezeichnet (siehe Fig. 4, unter Verwendung eines anfänglichen D/L Verhältnisses von 0,3), es trat jedoch etwas Leckage auf.
Die Aufnahme von Ciprofloxacin wurde bei 45ºC und 60ºC für anfängliche D/L Verhältnisse von 0,38 bzw. 0,91 durchgeführt. Wie Fig. 5 zeigt, war das erreichte maximale D/L Verhältnis in der Größenordnung von 0,20-0,25, was eine Aufnahme von nur etwa 27-40% zeigt.
Wie die Fig. 3-5 zeigen, kann die Beladung mit einem Ethanolammoniumiongradienten für Doxorubicin und Vincristin unter geeigneten Bedingungen nützlich sein, aber sie ist nicht nützlich zum Laden von Ciprofloxacin.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt das Beladen von Lipidvesikeln mit Doxorubicin, Epirubicin, Vincristin und Ciprofloxacin unter Verwendung eines Ethylendiammoniumsulfatgradienten (&spplus;H&sub4;N-CH&sub2;CH&sub2;- NH&sub4;&spplus;SO&sub4;&supmin;², EDAS).
Ethylendiammoniumsulfat wurde in ähnlicher Weise, wie oben für Methylammoniumsulfat beschrieben, hergestellt. LUVs (100 nm, DPPC/Chol 55 : 45, 600 mM EDAS enthaltend) wurden ebenso hergestellt, wie für Ethanolammoniumchlorid Vesikeln beschrieben. Die LUVs wurden, nachdem sie auf passende Größe gebracht waren, durch eine Spin-Kolonne laufen gelassen, um ein 150 mM NaCl äußeres Medium zu liefern.
Die Aufnahme von Doxorubicin, Epirubicin und Vincristin wurde jeweils bei 60ºC ausgeführt. Wie Fig. 6 zeigt, erfolgte die Aufnahme von Doxorubicin und Epirubicin schnell (etwa 20 mm) und lieferte über 90% Einkapselung der Arzneimittel. Für Vincristin verlief die Aufnahme signifikant langsamer mit nur 80% Aufnahme, die in annähernd 2 Stunden erreicht wurde.
Die Aufnahme von Ciprofloxacin war signifikant niedriger. Experimente mit 200 nm LUVs und 300 mM EDAS als inneres Medium ergaben weniger als 40% Aufnahme während etwa 3 Stunden. Eine leichte Verbesserung der prozentualen Aufnahme von Ciprofloxacin wurde mit EDAS beobachtet, wenn das äußere Medium auf etwa pH 5,5 gepuffert wurde unter Verwendung von 25 mM Citratpuffer. Für 200 nm LUVs, die aus POPC/Chol, das 300 mM EDAS enthielt, zusammengesetzt waren, betrug die Aufnahme bei 60ºC nahezu 60% (siehe Fig. 7).
Eine andere Diaminoverbindung, Lysinmethylesterhydrochlorid, wurde auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die Aufnahme von Epirubicin zu fördern. Nur 70% Aufnahme wurde nach 1,3 Stunden bei 60ºC erhalten, was sogar eine niedrigere Wirksamkeit lieferte, als sie mit EDAS erhalten wurde.
Wie die obigen Ergebnisse zeigen, ist EDAS geeignet, die Aufnahme einiger Arzneimittel (z. B. Doxorubicin und Epirubicin) zu fördern, aber ist weniger geeignet für andere (Vincristin) und ist ganz wenig geeignet zur Förderung der Aufnahme von Arzneimitteln, wie Ciprofloxacin.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines Methylammoniumsulfationengradienten, um die Aufnahme von Ciprofloxacin in Liposomen zu fördern, und liefert einen Vergleich mit dem obigen Verfahren, das EDAS oder einen pil-Gradienten verwendet.
LUVs (200 nm, DPPC/Chol) wurden hergestellt mit dem gezeigten inneren Medium (siehe Fig. 8) und einem äußeren Medium von 150 mM NaCl. Die Einkapselung von Ciprofloxacin wurde bei 60ºC während der angegebenen Zeit durchgeführt mit einem anfänglichen D/L Verhältnis von 0,3. Wie Fig. 8 zeigt, lieferten sowohl 150 mM Methylammoniumsulfat als auch 300 mM Methylammoniumsulfat etwa 90% Einkapselung von Ciprofloxacin innerhalb 10 Minuten. Wenn das Vesikelinnere 300 mM Citrat (pH 4,0) enthält, werden nur 25% Aufnahme des Ciprofloxacins beobachtet, und eine Leckage beginnt nach etwa 1 Stunde. Die Aufnahme unter Verwendung von EDAS ergibt nur 40% Aufnahme nach etwa 3 Stunden.
Nachfolgende Experimente untersuchten die Fähigkeit von Liposomen, die Methylammoniumsulfatlösungen einkapselten, aktiv andere Arzneimittel zu laden. Eine ausgezeichnete Beladung wurde für Ciprofloxacin, Doxorubicin, Epirubicin und Vincristin gefunden.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel zeigt die Versuche, Tryptophan in Liposomen zu laden. Wie oben angegeben, ist Ciprofloxacin zwitterionisch bei neutralem pH und zeigt Eigenschaften, die ein aktives Laden in Liposomen mit solchen Verfahren, wie pH-Gradienten, sehr schwierig machen. Überraschenderweise wurde für Ciprofloxacin gefunden, daß es in Liposomen geladen wird, wenn ein Methylamin/Methylammoniumionengradient verwendet wird (siehe Beispiel 4). Um zu sehen, ob sich dieses Verhalten auf andere übliche zwitterionische Verbindungen erstreckt, wurde die temperaturabhängige Aufnahme der Aminosäure Tryptophan untersucht. Die Ergebnisse werden in Fig. 9 wiedergegeben. Das anfängliche Tryptophan/Lipid Verhältnis betrug 1,0 unter Verwendung von 100 nm LUVs, die aus DPPC/Chol (55 : 45) zusammengesetzt waren. Wie in Fig. 9 gesehen werden kann, wurde im wesentlichen keine Aufnahme bei 45ºC beobachtet und eine sehr geringe (~5%) wurde bei 60ºC beobachtet. Daher erstreckt sich die Fähigkeit, Ciprofloxacin einzukapseln, nicht auf Zwitterionen wie Tryptophan.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel liefert weitere Experimente, um die Wirksamkeit von Methylamin/Methylammoniumsalzen beim Laden verschiedener Arzneimittel zu bestimmen. Zusätzlich wurden auch Lipidvesikelzusammensetzung, Gegenionen und Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisse untersucht.

6.1 Vesikelzusammensetzung

In Salzlösung gelöstes Doxorubicin wurde zu vorher hergestellten Ei-Phosphatidylcholin, DPPC/Chol oder Sph/Cer/Chol Vesikeln gegeben, und auf die Aufnahme folgte die Entfernung und spätere Analyse von Aliquoten für Spin-Kolonnen Extraktion. Die Aufnahme wurde bei 25ºC für Ei-Phosphatidylcholin LUVs (siehe Fig. 10A) und bei 45ºC für die DPPC/Cholesterin (siehe Fig. 11A) und Sph/Cer/Cholesterin LUVs (siehe Fig. 13 und 16) durchgeführt. In Wasser gelöstes Ciprofloxacin wurde zu vorher hergestellten DPPC/Chol oder DSPC/Chol Vesikeln gegeben, und die Aufnahme wurde bei 45ºC (siehe Fig. 14) bzw. 65ºC (siehe Fig. 15) durchgeführt.

6.2 Wirkung des Gegenions (Sulfat gegen Chlorid)

Die Doxorubicinaufnahme wurde auch in aus Sph/Cer/Chol zusammengesetzten LUVs unter Verwendung von sowohl MAC als auch MAS (Fig. 13 und 17) untersucht. Das Laden von Doxorubicin bei 45ºC in 200 nm Sph/Cer/Chol (4 : 1 : 4 Molverhältnis) LUVs, hergestellt in 600 mM MAC dauerte 2 Stunden mit einem anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,36. Kein Arzneimittel war aus den Lipidvesikeln verloren worden, wenn Messungen 24 Stunden später gemacht wurden.
Ciprofloxacin, das bei 45ºC in 200 nm DPPC/Chol LUVs geladen wurde, die in 600 mM MAC hergestellt waren, wobei mit einem Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 2,5 begonnen und 15 Minuten inkubiert wurde, führte zu einem geladenen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,35 (siehe Fig. 14).
Für DSPC/Chol 100 nm LUVs, hergestellt in 300 mM MAS und mit einem anfänglichen molaren Ciprofloxacin-zu-Lipid Verhältnis von 0,5 und bei einer Temperatur von 65ºC inkubiert, wurde am Ende ein Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,4 erreicht (siehe Fig. 15).

6.3 Wirkung von D/L

Bei einem anfänglichen Doxorubicin-zu-Lipid Verhältnis von 0,13 wurde im wesentlichen 100% Aufnahme in 100 nm DPPC/Chol (55 : 45 Mol : Mol) LUVs nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten beobachtet. Das Arzneimittel blieb stabil mit dem Lipid während eines Zeitraums von 24 Stunden verbunden, nach denen keine weiteren Messungen durchgeführt wurden (siehe Fig. 11A und 11B).
Bei einem anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,25 in 200 nm DPPC/Chol (55 : 45) LUVs dauerte die Aufnahme bei 45ºC 60 Minuten, und nach 24 Stunden betrug die Retention annähernd 90%. Nach fünf Tagen betrug die Retention 75% (siehe Fig. 12A und 12B).
Bei einem anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,37 in 100 nm DPPC/Chol (55 : 45) LUVs fand im wesentlichen die vollständige Aufnahme bei 45ºC in 2 Stunden statt, und nach 24 Stunden betrug die Retention 100% (siehe Fig. 16A). Diese Ladezeit konnte auf etwa 30 min erniedrigt werden durch Erhöhung der Ladetemperatur auf etwa 55 bis 60ºC. Ein Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,4 scheint das Maximum zu sein, das mit einer MAS Konzentration von 300 mM erreicht werden kann (siehe Fig. 13, 15, 16A und 17). Eine Erhöhung des anfänglichen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnisses auf 1,2 verbesserte nicht das Beladen, sondern scheint eher die Aufnahme des Arzneimittels zu erniedrigen mit einem maximalen nach 30 min erreichten Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,25, gefolgt von einer Abnahme auf annähernd 0,2 während eines Zeitraums von 2 Stunden (siehe Fig. 16B). Sehr hohe äußere Konzentrationen von DOX können die Permeabilität der Membran beeinflussen, indem sie das Präparat undichter machen.

6.4 Wirkung der Lipidvesikeln mit PEG Konjugaten

Die Aufnahme von Doxorubicin in 100 nm LUVs, die aus Sph/Cer/Chol (1 : 1 : 1 Molverhältnis) zusammengesetzt waren und 5 mol% PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Cer-C&sub1;&sub4; enthielten (von Polyethylenglycol abgeleitetes Ceramid mit einer 14 Kohlenstoffatom Fettsäurekette, wie es in der am 30. September 1994 mitübertragenen Anmeldung 08/316 429 beschrieben ist), um die Aggregation der LUVs nach der Extrusion zu hemmen, wurde studiert. Die Bildung eines MAS-Gradienten und die Aufnahme des Arzneimittels wurden gemessen unter Verwendung von Aliquoten, die, wie in BEISPIEL 2 oben beschrieben, genommen und analysiert wurden mit der Ausnahme, daß das anfängliche Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis 0,66 betrug und die Aufnahme bei 50ºC eine Stunde lang durchgeführt wurde (Fig. 17). Es ist zu beachten, daß ein Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis von 0,4 in beiden Fig. 13 und 17 erhalten wurde ähnlich dem in DPPC/Chol LUVs erhaltenen maximalen Arzneimittel-zu-Lipid Verhältnis.
Die Wirkung der Änderungen im Puffer und in der Lipidzusammensetzung wurden auch bei der Ciprofloxacinbeladung untersucht.
Alle Ergebnisse der obigen Experimente sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1
*Verhältnisse sind für 24 h bzw. 5 Tage.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel zeigt die Erniedrigung der Freigaberate von geladenen Arzneimitteln aus Lipidvesikeln unter Verwendung von Methylamin- und pil-Gradienten.
Lipidfilme von DSPC : Chol : PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;-Cer-C&sub2;&sub0; und (N-(4-p-Maleinimidophenyl)butyryl)distearoylphosphatidylethanolamin (MPB- DSPE) (MPB erhältlich von Northern Lipids, Vancouver, Canada) (52 : 45 : 2 : 1) wurden in 300 mM MAS hydratisiert und fünf Frier- Tau-Zyklen unterworfen vor der Extrusion (zehnmal) bei 65ºC durch 100 nm Filter. Die Lipidvesikeln wurden dann durch eine PD-10 Gelfiltrationskolonne (vorgepackte Sepharose Kolonne, erhältlich von Pharmacia) laufen gelassen, die mit Salzlösung äquilibriert war. Die verbleibenden Lipidvesikeln wurden mit ¹&sup4;C-markiertem Doxorubicin in einem Molverhältnis von 0,2 Teile Arzneimittel zu 1 Teil Lipid inkubiert. Sowohl Lipid als auch ¹&sup4;C-Doxorubicin waren getrennt auf 60ºC 5 Minuten lang erhitzt worden, bevor sie zusammengemischt wurden. Nach dem Mischen wurde die Kombination bei 60ºC weitere 10 Minuten gehalten, um eine völlige Arzneimittelaufnahme, zu ermöglichen.
Die beladenen Lipidvesikeln wurden getrennt und dann 24 Stunden inkubiert entweder in Hepes Buffered Saline (HBS) bei pH 7,5 oder einem gleichen Volumen von 50%igem Mäuseserum. Nach 1, 4 und 24 Stunden wurden Aliquote genommen und durch eine Spin-Kolonne laufen gelassen, um die LUVs von dem freien ¹&sup4;C- Doxorubicin zu trennen. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 dargestellt.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel zeigt die Erniedrigung der Freigaberate von geladenen Arzneimitteln aus mit Antikörper gekuppelten Lipidvesikeln unter Verwendung eines Methylamingradienten.
Die beladenen Lipidvesikeln, die wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt waren, wurden mit NRLU-10 Antikörper gekuppelt. Der Antikörper war mit dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiopropionat) (SPDP, erhältlich von Pierce, Rockford, 11, USA) modifiziert und dann mit Dithiothreit (DTT) aktiviert. Der resultierende aktivierte Antikörper wurde mit den Liposomen in einem Verhältnis von 75 ug Antikörper zu jedem uM Lipid gemischt. Nach einer 16 stündigen Kupplungsreaktion wurden die Lipidvesikeln durch eine CL-4B Kolonne laufen gelassen, um nicht umgesetzten Antikörper zu entfernen. Das Endpräparat von Iimmunoliposom enthielt 38,7 ug Antikörper/umol Lipid.
Die gekuppelten Lipidvesikeln wurden 24 Stunden in 50%igem Mäuseserum inkubiert. Nach 1, 4 und 24 Stunden wurden Aliquote genommen und durch eine Spin-Kolonne laufen gelassen, um die beladenen Liposomen von ¹&sup4;C-Doxorubicin zu trennen, das ausgelaufen war. Volle 98,6% des markierten Doxorubicins waren in den Lipidvesikeln zurückgehalten worden (siehe Fig. 18).
Alle in dieser Beschreibung genannten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen werden durch Nennung Teil der Beschreibung in demselben Maß, als wenn für jede einzelne Publikation, Patent oder Patentanmeldung speziell und einzeln angegeben wäre, daß sie durch Nennung Teil der Beschreibung wird.
Obwohl die vorstehende Erfindung mit gewissem Detail mittels Illustration und Beispiel zum klaren Verständnis beschrieben wurde, ist es naheliegend, daß Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Bereichs der angefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Liposomformulierung eines protonierbaren therapeutischen Mittels mit folgenden Schritten;

(i) Herstellen einer Mischung von Liposomen in einer wäßrigen Lösung, wobei die Liposomen ein eingekapseltes Medium und ein äußeres Medium haben und das eingekapselte Medium und das äußere Medium jeweils ein Methylammoniumsalz enthalten;

(ii) Herstellen eines Konzentrationsgradienten von Methylamin durch die Liposommenbranen, indem die Methylammoniumsalze in dem äußeren Medium entfernt oder verdünnt werden; und

(iii) Inkubieren der Liposomen von Schritt (ii) mit dem protonierbaren therapeutischen Mittel, das in neutraler Form vorliegt, die zum eingekapselten Medium der Liposomen durch den Konzentrationsgradienten des Methylamins gezogen wird, während einer ausreichenden Zeitspanne, um eine Adhäsion des therapeutischen Mittels zu den Liposomen zu verursachen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das protonierbare therapeutische Mittel ein antineoplastisches Mittel ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem vielfache therapeutische Mittel in das Liposom geladen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das protonierbare therapeutische Mittel Doxorubicin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das protonierbare therapeutische Mittel ein antibakterielles Mittel ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das protonierbare therapeutische Mittel ein Chinolon antibakterielles Mittel ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das protonierbare therapeutische Mittel Ciprofloxacin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Liposomformulierung Liposomen enthält, die aus Mischungen hergestellt sind, die aus der Gruppe Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin/Cholesterin und Sphingomyelin/Ceramid/Cholesterin ausgewählt sind.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Liposomformulierung Liposomen enthält, die aus Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin hergestellt ist, wobei das protonierbare therapeutische Mittel Ciprofloxacin ist und ein Arzneimittel- zu-Lipid Verhältnis von 0,4 erreicht wird.

10. Verwendung einer Liposomformulierung eines protonierbaren antineoplastischen Mittels, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Neoplasmen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der das antineoplastische Mittel Doxorubicin ist.

12. Verwendung einer Liposomformulierung eines protonierbaren antibakteriellen Mittels, das nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mycobakterieller Infektion.

13. Verwendung nach Anspruch 12, bei der das antibakterielle Mittel Ciprofloxacin ist.

14. Liposomale Formulierung eines protonierbaren therapeutischen Mittels, das nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt ist.

15. Liposomale Formulierung eines nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellten protonierbaren therapeutischen Mittels, worin das protonierbare therapeutische Mittel ein antineoplastisches Mittel ist.

16. Liposomale Formulierung eines protonierbaren therapeutischen Mittels nach Anspruch 15, worin das antineoplastische Mittel ein Glied aus der Gruppe Doxorubicin, Daunorubicin, Vinblastin und deren pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Derivaten ist.

17. Liposomale Formulierung eines nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellten protonierbaren therapeutischen Mittels, worin das protonierbare therapeutische Mittel ein antibakterielles Mittel ist.

18. Liposomale Formulierung eines protonierbaren therapeutischen Mittels nach Anspruch 17, worin das antibakterielle Mittel Ciprofloxacin ist.

19. Verfahren zum Zurückhalten eines protonierbaren therapeutischen Mittels in einer Liposomformulierung mit folgenden Schritten;

(i) Herstellen einer Mischung von Liposomen in einer wäßrigen Lösung, wobei die Liposomen ein eingekapseltes Medium und ein äußeres Medium haben und das eingekapselte Medium ein Methylammoniumsalz und das therapeutische Mittel enthält; und

(ii) Herstellen eines Konzentrationsgradienten des Methylamins durch die Liposommembranen, wobei der Gradient zur Folge hat, daß die eingekapselten therapeutischen Mittel protoniert werden und dadurch in der Liposomformulierung zurückgehalten werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Methylammoniumsalz aus der Gruppe Methylammoniumchlorid und Methylammoniumsulfat ausgewählt ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin das protonierbare therapeutische Mittel ein Glied aus der Gruppe eines antineoplastischen Mittels und eines antibakteriellen Mittels ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, worin das protonierbare therapeutische Mittel ein Glied aus der Gruppe Doxorubicin, Daunorubicin, Vinblastin und deren pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Derivaten ist.

23. Verfahren nach Anspruch 19, worin das protonierbare therapeutische Mittel Ciprofloxacin ist.