DE60122304T2

DE60122304T2 - Auf lipiden basierendes system zur zielgerichteten verabreichung diagnostischer wirkstoffe

Info

Publication number: DE60122304T2
Application number: DE60122304T
Authority: DE
Inventors: Kent Jorgensen; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven Frokjaer; G. Ole MOURITSEN
Original assignee: LiPlasome Pharma ApS
Current assignee: LiPlasome Pharma ApS
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: CY1105792T1; US20030170297A1; US20070134153A1; WO2001076556A2; PT1272160E; WO2001076644A2; WO2001076555A3; JP2003530338A; ES2280355T3; AU2001248301A1; ATE336267T1; DK1272225T3; EP1272160A2; US20030162748A1; ATE382333T1; US7166297B2; DE60126072D1; EP1272225B1; PT1272161E; DE60132184D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die zielgerichtete Verabreichung diagnostischer Wirkstoffe (hier im Allgemeinen als „Macker" bezeichnet) durch Verwendung von auf Lipiden basierenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft die Verwendung von auf Lipiden basierenden Verbindungen zur Herstellung einer diagnostischen Verbindung, die nützlich ist bei der Diagnose von verschiedenen Störungen, welche mit erhöhten Niveaus extrazellulärer PLA₂-Aktivität im erkrankten Gewebe verknüpft sind oder daraus resultieren, z. B. Krebs, infektiöse und entzündliche Erkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die diagnostische Bildgebung ist in der modernen Medizin weit verbreitet. Sie erfordert, dass in einem zu untersuchenden Bereich eine geeignete Signalintensität erreicht wird, um unabhängig von dem angewandten Verfahren bestimmte Strukturen vom umliegenden Gewebe unterscheiden zu können. Wie von Torchilin (1998) angemerkt, umfasst Bildgebung das Verhältnis zwischen den drei räumlichen Dimensionen des zu untersuchenden Bereichs und einer vierten Dimension, der Zeit, die sich sowohl auf die Pharmakokinetik des Wirkstoffs als auch auf den Zeitraum bezieht, der zum Erhalten des Bildes benötigt wird. Die physikalischen Eigenschaften, die zur Erzeugung eines Bildes genutzt werden können, umfassen die Emission oder Absorption von Strahlung, nukleare magnetische Momente und Relaxation sowie die Übertragung oder Reflexion von Ultraschall. Gemäß den angewandten physikalischen Prinzipien umfassen die derzeit verwendeten bildgebenden Verfahren γ-Szintigraphie (umfassend die Anwendung von γ-emittierenden radioaktiven Materialien), Magnetresonanz (MR, ein Vorgang, der auf dem Übergang zwischen unterschiedlichen Energieniveaus von Atomkernen unter Einwirkung eines Hochfrequenzsignals beruht), Computertomographie (CT, das Verfahren, das ionisierende Strahlung mit Hilfe von Computern nutzt, um Schnittbilder des Körpers und dreidimensionale Bilder von zu untersuchenden Bereichen zu erhalten) und Ultraschalldiagnostik (US, das Verfahren, das Bestrahlung mit Ultraschall verwendet und auf der unterschiedlichen Rate beruht, mit welcher der Ultraschall verschiedene Gewebe durchdringt). Alle vier bildgebenden Verfahren unterscheiden sich in ihren physikalischen Prinzipien, ihrer Empfindlichkeit, ihrer Auflösung (sowohl räumlich als auch zeitlich), ihrer Fähigkeit, Bilder ohne durch Kontrastmittel vermittelte Verbesserung bereitzustellen, und in einigen anderen Parametern wie Kosten und Sicherheit. Üblicherweise kann die Bildgebung von unterschiedlichen Organen und Geweben zur Früherkennung und Lokalisierung von zahlreichen Krankheitserscheinungen ohne geeignete Kontrastmittel (siehe unten) in unterschiedlichen Bildgebungsvorgängen nicht erfolgreich durchgeführt werden.
Zur Verbesserung der Bildgebung werden Kontrastmittel verwendet. Dabei handelt es sich um Substanzen, die in der Lage sind, bestimmte Arten von Signalen (Bestrahlung) viel stärker zu absorbieren als umliegende Gewebe. Die Kontrastmittel sind für jedes bildgebende Verfahren spezifisch (siehe Tabelle 1), und aufgrund ihrer Akkumulation an bestimmten zu untersuchenden Stellen können diese Stellen bei Anwendung des geeigneten bildgebenden Verfahrens leicht visualisiert werden.
Tabelle 1 Bildgebende Verfahren und erforderliche Konzentration von diagnostischen Anteilen
Die Gewebekonzentration, die für eine erfolgreiche Bildgebung erreicht werden muss, variiert je nach Verfahren und diagnostischem Anteil, siehe Tabelle 1. In vielen Fällen basiert eine durch Kontrastmittel vermittelte Bildgebung auf der Fähigkeit einiger Gewebe (d. h. von makrophagenreichen Geweben), die bestimmten Substanzen zu absorbieren. Dieser Prozess ist partikelgrößenabhängig und beruht auf einem genau abgestimmten Gleichgewicht zwischen Partikeln, die einerseits klein genug sind, um in die Blut- oder Lymphkapillaren einzudringen, andererseits jedoch groß genug, um im Gewebe zurückgehalten zu werden. Bei jedem der bildgebenden Verfahren werden zwei Hauptverabreichungswege für das Kontrastmittel verwendet: systemisch und über den lokalen Kreislauf. Jeder Weg hat seine Vor- und Nachteile. Durch Variieren der physikochemischen Eigenschaften eines Kontrasts oder Kontrastträgers kann die Rate seines Abbaus an der Injektionsstelle bei lokaler Verabreichung moduliert werden. Ein Nachteil der systemischen Verabreichung ist, dass dadurch nicht als Ziel vorgesehene Organe vermehrt einem potenziell toxischen Kontrastmittel ausgesetzt sind.
Liposomen
Um die Kontrastakkumulation in der erforderlichen Zone zu erleichtern, wurden verschiedene Mikropartikel als Träger für Kontrastmittel vorgeschlagen. Unter diesen Trägern sind Liposomen, mikroskopische künstliche Phospholipidvesikel, aufgrund ihrer leicht zu steuernden Eigenschaften und guten pharmakologischen Charakteristika besonders auffällig. Viele einzelne Lipide und deren Gemische bilden bei Suspension in einer wässrigen Phase spontan doppelschichtige Strukturen (Liposomen), bei denen die hydrophoben Molekülteile nach innen weisen und die hydrophilen Teile der sie umgebenden wässrigen Phase ausgesetzt sind. Es existieren mehrere unterschiedliche Arten von Liposomen; jede Art weist spezifische Charakteristika auf und kann durch spezifische Verfahren hergestellt werden. Die übliche Klassifikation von Liposomen beruht auf deren Größe und Anzahl konzentrischer Doppelschichten, die eine einzelne Vesikel bilden (wie beispielsweise multilamellare Vesikel (MLV), unilamellare Vesikel, LUV, und kleine unilamellare Vesikel (SUV)). Die Verfahren zur Herstellung von LUVs können leicht übertragen und zur industriellen Herstellung von großen Chargen von Liposomen mit einer vorhersehbaren Größe und einer engen Größenverteilung verwendet werden.
Seit nahezu zwei Jahrzehnten sind Liposomen als vielversprechende Träger für Drogen und diagnostische Wirkstoffe anerkannt, und zwar aus folgenden Gründen: (1) Liposomen sind vollständig biokompatibel, (2) sie können praktisch jede Droge oder jeden diagnostischen Wirkstoff entweder in ihrer internen Wasserkammer oder in der Membran selbst einschließen, je nach den physikochemischen Eigenschaften der Droge, (3) in Liposomen eingebundene Pharmazeutika sind gegen die inaktivierende Wirkung durch äußere Bedingungen geschützt, verursachen jedoch gleichzeitig keine unerwünschten Nebenreaktionen, (4) Liposomen bieten auch die einzigartige Möglichkeit, Pharmazeutika in Zellen oder sogar in das Innere von einzelnen Zellkompartimenten abzugeben. Werden unterschiedliche In-vivo-Verabreichungszwecke verfolgt, können die Größe, Ladung und Oberflächeneigenschaften leicht verändert werden, indem vor der Liposomherstellung dem Lipidgemisch einfach neue Bestandteile hinzugefügt und/oder die Herstellungsverfahren verändert werden.
Leider werden Phospholipidliposomen bei Einbringung in den Kreislauf sehr schnell (die übliche Halbclearancezeit beträgt höchstens 30 min) von den Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) sequestriert. Primär dafür verantwortlich sind Leberzellen, und die Sequestrierung hängt relativ von der Größe, Ladung und Zusammensetzung der Liposomen ab. Zirkulierende Peripherblutmonozyten können Liposomen ebenfalls einschließen und später Gewebe infiltrieren und eingeschlossene Liposomen an bestimmte pathologische Bereiche im Körper abgeben.
Bis vor kurzem war das Potenzial von Liposomen als Drogenträger durch die schnelle Clearance von Liposomen aus der Blutbahn begrenzt. Herkömmliche Liposomen können zum Beispiel innerhalb von 1 bis 2 Stunden nach intravenöser Verabreichung größtenteils aus der Blutbahn verschwunden sein.
Es wurden verschiedene Ansätze zur Verlängerung der Zirkulationszeit von Liposomen vorgeschlagen. Zwei dieser Ansätze haben die Halbwertszeit von Liposomen in der Blutbahn erfolgreich um Zeiträume von bis zu 40 bis 50 Stunden verlängert. Bei einem Ansatz, beschrieben in dem US-Patent Nr. 4,837,028, werden Liposomen mit dem Gangliosid G_M1 und vorwiegend starren Lipiden formuliert. In einem anderen allgemeinen Ansatz, offenbart in dem US-Patent Nr. 5,013,556, werden Liposomen mit einer Schicht von Polyethylenglykol(PEG)ketten beschichtet.
Kontrastbeladene Liposomen wurden erstmals bei der Bildgebung der makrophagenreichsten RES-Organe, der Leber und der Milz, eingesetzt, da RES-Organe für Liposomen die natürlichen Ziele darstellen und diese bei intravenöser Verabreichung gut akkumulieren. Die diagnostische Bildgebung von Leber und Milz zielt üblicherweise auf die Entdeckung von Tumoren und Metastasen in diesen Organen sowie von bestimmten Blutflussunregelmäßigkeiten und Entzündungsprozessen ab. Die Verwendung von mindestens drei unterschiedlichen bildgebenden Verfahren zu diesem Zweck, nämlich γ-, MR- und CT-Bildgebung, wurde bereits beschrieben.
Tumorbildgebung mit Kontrastliposomen
Ein Gebiet einer wichtigen potenziellen Anwendung von kontrastbeladenen Liposomen ist die Tumorbildgebung. Die Liposomakkumulation in Tumoren erfolgt hauptsächlich über die Extravasation aus undichten Tumorkapillaren in den interstitiellen Raum. Wie in vielen anderen Fällen auch, kann die Wirksamkeit einer derartigen Akkumulation durch Verwendung von lange zirkulierenden PEG-beschichteten Liposomen stark erhöht werden. Auf Liposomen basierende Bildgebungswirkstoffe wurden bereits erfolgreich bei der γ-, MR-, CT-Bildgebung und Ultraschalldiagnostik von Tumoren eingesetzt. Indium-111-markierte Liposomen für die Tumorbildgebung (VesCan^®, Vestar, Inc.) befinden sich bereits in Phase II-III von klinischen Studien.
Liposomformulierungen können auch zur Visualisierung von entzündeten oder infizierten Stellen verwendet werden. Die Verwendung von mikropartikulären Bildgebungswirkstoffen zur Visualisierung von infizierten und entzündeten Stellen beruht auf der Fähigkeit von Mikropartikeln, aus dem Kreislauf zu extravasieren und sich an diesen Stellen zu akkumulieren, ähnlich, wie bereits für Tumore und infarktierte Gewebe beschrieben.
Die beiden hauptsächlichen Probleme im Zusammenhang mit der Verwendung von Liposomen zu Zwecken der diagnostischen Bildgebung, nämlich die geringe Wirksamkeit von Kontrastliposomen in der Tumorbildgebung, wurden oft mit einer schnellen Clearance der Liposomen aus dem Blut und deren Unfähigkeit, sich im erkrankten Gewebe zu akkumulieren, erklärt. Beide Hindernisse werden in der vorliegenden Erfindung behandelt.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Bildverbesserungssysteme, die besonders nützlich sind bei der Diagnose von Erkrankungen, die durch eine örtliche Aktivität der extrazellulären PLA₂-Aktivität gekennzeichnet sind.
Wie von Kaiser (1999) berichtet, scheint PLA₂ von bösartigen Zellen produziert zu werden. Die immunhistochemische Färbung von verschiedenen Krebsgeweben, einschließlich Bauchspeicheldrüsen-, Brust- und Magenkrebs, war im Hinblick auf PLA₂ positiv. In mit IL-6 stimulierten Magenkrebszellen wurde eine erhöhte Expression und Sekretion von PLA₂ festgestellt, und bei sechs von 16 humanen Karzinomzelllinien erfolgte eine spontane Sekretion von PLA₂ in den Kulturüberstand (Kaiser, 1999). Somit scheint also hinreichend erwiesen zu sein, dass erhöhte Niveaus der extrazellulären PLA₂-Aktivität im Zusammenhang mit Krebsgewebe stehen.
Der Anstieg der PLA₂-Aktivität in Tumorgewebe bildet zusammen mit der Beobachtung, dass sich Liposomen in Tumoren über Extravasation durch undichte Tumorkapillaren in den interstitiellen Raum akkumulieren, die Basis für die hier offenbarte Verwendung von Liposomen zur verbesserten Bildgebung von Tumoren.
Darüber hinaus ist die extrazelluläre PLA₂-Aktivität auch in bestimmten erkrankten Regionen, wie zum Beispiel entzündetem oder infiziertem Gewebe, erhöht. Ähnlich wie auch in Bezug auf Krebsgewebestellen zu bemerken, wurde beobachtet, dass Mikropartikel aus dem Kreislauf extravasieren und sich in infiziertem, entzündeten und infarktiertem Gewebe akkumulieren (Torchilin, 1998). Es ist jedoch wichtig, anzumerken, dass es unter Verwendung von z. B. positiv geladenen ⁶⁷Ga-Liposomen, die sich in Tumoren, jedoch nicht in infizierten Stellen anlagern, möglich ist, zwischen Infektion und Tumor zu unterscheiden (Ogihara (1986) J Nucl Med 27, 1300-7).
Diese Erfindung stellt ein derartiges Markerzuführungssystem in Form von auf Lipiden basierenden Trägern, z. B. Liposomen oder Mizellen, bereit, das aus einer Lipid-Doppelschicht besteht, die Etherlipide bildet, wie beispielsweise Glycerophospholipde, die eine Alkylbindung in der 1-Stellung und eine Acylbindung in der sn-2-Stellung an der Glycerolhauptkette enthalten und die darauf aufgepfropfte Poylmer- oder Polysaccharidketten aufweisen. Darüber hinaus kann das Trägersystem die Lipid-Doppelschicht stabilisierende Komponenten umfassen, z. B. Lipopolymere, Glykolipide und Sterole, die zu einer erhöhten Gefäßzirkulationszeit und infolgedessen zu einer Akkumulation im erkrankten Target-Gewebe führen. Wenn die Träger die Target-Stelle für den Marker, z. B. Krebszellen, erreichen, setzt eine durch PLA₂ katalysierte Hydrolyse der Acylbindung den Marker, typischerweise Lysoetherlipide und estergebundene Derivate, frei. Im Gegensatz zu Alkylabspaltungsenzymen, die in Krebszellen fast nicht vorhanden sind, ist die extrazelluläre PLA₂-Aktivität in Krebsgewebe erhöht. Darüber hinaus ist die extrazelluläre PLA₂-Aktivität in erkrankten Regionen, wie zum Beispiel entzündetem Gewebe, erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines auf Lipiden basierenden Systems bereit, das ein Lipidderivat und einen Marker umfasst, wobei das Lipidderivat (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7 Kohlenstoffatomen und ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen sowie (b) einen hydrophilen Anteil hat, wobei das Lipidderivat außerdem in dem Maße ein Substrat für extrazelluläre PLA₂ ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abspaltbar ist, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt, wodurch ein Lipidderivat, von dem das organische Radikal abgespaltet worden ist, in Form eines Lysolipidderivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei in dem System Lipopolymere oder Glykolipide eingeschlossen sind, so dass auf der Oberfläche des Systems hydrophile Ketten dargestellt sind, zur Darstellung einer diagnostischen Verbindung zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einem örtlichen Anstieg der extrazellulären PLA₂-Aktivität in Säugetiergewebe verknüpft sind.
Somit zieht die vorliegende Erfindung einen Vorteil aus der überraschenden Feststellung, dass Liposomen (und Mizellen), die Lipidderivate einschließen, welche speziell und nur teilweise von extrazellulären Phospholipasen abgespaltet werden können, was gleichzeitig Lipopolymere oder Glykolipide einschließt, die Eigenschaften aufweisen, ausreichend lange in der Blutbahn zu zirkulieren, um Target-Gewebe zu erreichen, in welchem die extrazelluläre PLA₂-Aktivität erhöht ist, ohne dabei von den retikuloendothelialen Systemen des Säugetiers erkannt zu werden und ohne Zellwände zu durchdringen, wobei die Lipidderivate der Liposomen speziell von extrazellulärer PLA₂ abgespaltet werden, um bildverbessernde Bestandteile an der gewünschten Stelle freizusetzen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Wärmekapazitätskurven, die mittels Differenzialscanning-Kalorimetrie erhalten wurden. (a) Multilamellare, MLV, (die obere Kurve) und unilamellare, LUV, (die untere Kurve) Liposomen, bestehend aus 1 mM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC). (b) MLV- (die obere Kurve) und LUV- (die untere Kurve) Liposomen, bestehend aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC).
2. Charakterstisches Reaktionszeitprofil bei 41 °C für Phospholipase-A₂-, PLA₂, (A. piscivorus piscivorus) Hydrolyse von unilamellaren 1-O-DPPC-Liposomen, zusammengesetzt aus 90 % 1-O-DPPC und 10 % 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). Die PLA₂-Hydrolyse-Reaktion wird durch die intrinsische Fluoreszenz (durchgehende Linie) des Enzyms und 90° statische Lichtstreuung (gestrichelte Linien) der Lipidsuspension überwacht. Nach Hinzugabe von PLA₂ bei 800 s zu der äquilibrierten Liposomsuspension folgt eine charakteristische Verzögerungszeit, bevor ein plötzlicher Anstieg der katalytischen Aktivität erfolgt. Vor Hinzugabe des Enzyms und 20 Minuten nach der beobachteten Verzögerungszeit wurden Proben für eine HPLC entnommen.
3. HPLC-Chromatogramme, welche die Wirkung der Phospholipase-A₂-Hydrolyse von Liposomen zeigen, die aus 90 % 1-O-DPPC und 10 % 1-O-DPPE-PEG350 zusammengesetzt sind. Die Chromatogramme zeigen die Menge an 1-O-DPPC (100 %, durchgehende Linie), bevor Phospholipase-A₂ (A. piscivorus piscivorus) zu der Liposomsuspension hinzugegeben wurde, und die Menge an 1-O-DPPC (75 %, gestrichelte Linie) nach dem Lag-Burst.
4. PLA₂-gesteuerte Freisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des fluoreszierenden Kontrastmittels Calcein aus Liposomen, zusammengesetzt aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in einem 10-mM-HEPES-Puffer (pH = 7,5), als eine Funktion der Zeit. Bei 900 s wurden 25 nM Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) hinzugegeben, die Temperatur betrug 37 °C. Der Prozentanteil an freigesetztem Calcein wird als Freisetzung = 100 (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B) bestimmt, wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach Hinzugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz und I_T die Gesamtfluoreszenz, gemessen nach Hinzugabe von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der Liposomen führt.
5. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Calceins über die Target-Membran von nicht hydrolysierbaren Membranen hinweg (siehe 11b) als eine Funktion der Zeit, für Liposomen bestehend aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in einem 10-mM-HEPES-Puffer (pH = 7,5). Bei 0 s wurden 25 nM Phospholipase A₂ hinzugegeben, und die Temperatur betrug 37 °C. Der Prozentanteil des freigesetzten Calceins wird ermittelt wie in 4 beschrieben.
6. Hämolyseprofil von normalen roten Blutzellen unter Anwesenheit von Liposomen, zusammengesetzt aus 100 % 1-O-DPPC (Quadrate), 90 % 1-O-DPPC und 10 % 1-O-DPPE-PEG350 (Dreiecke), 90 % 1-O-DPPC und 10 % 1-O-DPPE-PEG2000 (Kreise) und ET-18-OCH₃ (Rauten). Die Konzentrationen, die 5 % Hämolyse (H₅) ergeben, lagen für aus 100 % 1-O-DPPC zusammengesetzte Liposomen und für aus 90 % 1-O-DPPC mit 10 % DPPE-PEG350 zusammengesetzte Liposomen weit über 2 mM. Eine Hämolysebestimmung erfolgte nach Perkins et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1327, 61-68. Jede Probe wurde kurz seriell mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, und 0,5 ml jeder verdünnten Suspension wurden mit 0,5 ml gewaschenen humanen roten Blutzellen (RBC) [4 % in PBS (v/v)] gemischt. Probe und Standard wurden in einen 37-°C-Inkubator eingebracht und 20 Stunden bewegt. Die Röhrchen wurden bei geringer Geschwindigkeit (2000 × G) 10 Minuten zentrifugiert, und 200 μl des Überstands wurden durch Extinktion bei 550 nm quantitativ bestimmt. 100 Prozent Hämolyse wurden als maximale Hämolysemenge definiert, die mit dem Detergens Triton X-100 erreicht wurde. Das Hämolyseprofil in 6 zeigt für 2 mM 1-O-DPPC-Liposomen und für 1-O-DPPC-Liposomen mit 10 % 1-O-DPPE-PEG350 einen niedrigen Hämolysewert (unter 5 %).
7. Charakteristische Reaktionszeitprofile bei 41 °C für die PLA₂-(A. piscivorus piscivorus) Hydrolyse von unilamellaren Liposomen, die 0,5 und 10 % 1-O-DPPE-PEG350-Lipopolymere einschließen. Die PLA₂-Hydrolyse-Reaktion wird durch intrinsische Fluoreszenz (durchgehende Linie) der Enzyme und 90° statische Lichtstreuung (gestrichelte Linien) der Suspension überwacht. Nach Hinzugabe von PLA₂ zu der äquilibrierten Liposomsuspension folgt eine charakteristische Verzögerungszeit, bevor ein plötzlicher Anstieg der katalytischen Aktivität erfolgt.
8. PLA₂-gesteuerte Freisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des fluoreszierenden Kontrastmittels Calcein über die Target-Membran von nicht hydrolysierbaren D-O-SPC-Membranen hinweg, als eine Funktion der Zeit, für Mizellen, die zusammengesetzt sind aus 25 μM 1-O-DPPE-PEG350 (gepunktete Linie), DSPE-PEG750 (gestrichelte Linie), 1-O-DPPE-PEG2000 (durchgehende Linie), suspendiert in einem 10-mM-HEPES-Puffer (pH = 7,5). Bei 1200 s wurde Phospholipase A₂ (25 nM) hinzugegeben; die Temperatur betrug 41 °C. Der Prozentanteil an freigesetztem Calcein wird ermittelt, wie in 4 beschrieben. Die durch PLA₂ katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 induzierte die schnellste und höchste Feisetzung.
9. HPLC-Chromatogramme, welche die Wirkung der Phospholipase-A₂-Hydrolyse von Mizellen zeigen, die aus DSPE-PEG750 (0,150 mM) zusammengesetzt sind. Die Chromatogramme zeigen die Menge an erzeugter Stearinsäure bevor (durchgehende Linie) Phospholipase-A₂ (A. piscivorus piscivorus) zu der Mizellensuspension hinzugegeben wurde, und die Menge (gestrichelte Linie) an DSPE-PEG750 nach dem Lag-Burst. Die gepunktete Linie zeigt reine Stearinsäure (0,4 mM). Der Prozentanteil der Hydrolyse wurde auf der Basis des integrierten Bereichs des Stearinsäurestandards (115850 Einheiten) und des integrierten Bereichs der Probe (45630 Einheiten) berechnet. Die Konzentration der Stearinsäure in der Probe wurde auf 0,157 mM (45630/115850 × 0,4 mM) berechnet, was bedeutet, dass 100 % des DSPE-PEG750 zu Lyso-SPE-PEG750 und Stearinsäure hydrolysiert wurden.
10. Beschreibt das Prinzip des liposomalen Drogen- und/oder Kontrastmittel-Targetings, der Freisetzung und der Absorption durch extrazelluläre Enzyme.

(I) Pathologisches Gewebe mit undichten Kapillaren
(II) Liposomaler Drogen- und/oder Kontrastmittelträger
(III) Target-Zelle und Zellmembran
(IV) Örtliche Drogen- und/oder Kontrastmittelfreisetzung und Absorption durch extrazelluläre Phospholipase A₂.

11(a) Schematische Veranschaulichung des Prinzip des liposomalen Drogen- und/oder Kontrastmittel-Targetings, umfassend die Akkumulation der liposomalen Drogen- und/oder Kontrastmittelträger in porösem erkranktem Gewebe und die anschließende Freisetzung der Droge und/oder des Kontrastmittels und den Transport über die Target-Membran hinweg durch extrazelluläre PLA₂-Aktivität.

(I) Pathologisches Gewebe mit undichten Kapillaren
(II) Polymerstabilisiertes lipidkonjugiertes Kontrastmittelträgerliposom
(III) Target-Zelle und Zellmembran
(IV) Lipidkonjugierte Kontrastmittel (Monoetherlipid), Proenhancer (Lipid), Proaktivator (Lipid)
(V) Drogen (Etherlysolipid- und Fettsäurederivate), Enhancer (Lysolipid + Fettsäure), PLA₂-Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure)

11(b) Schematische Veranschaulichung des Systems eines molekularbasierten biophysikalischen Modells, bei dem die Phospholipide der Drogen- und/oder Kontrastmittelträgerliposomen über die durch PLA₂ katalysierte Hydrolyse als Prodestabilisatoren an der Drogen- und/oder Kontrastmittelträgerstelle und als Proenhancer an der Target-Stelle wirken. Die Möglichkeit der Ausdehnung des Prinzips auf die Einbeziehung eines lipidbasierten lipidkonjugierten Kontrastmittels ist ebenfalls eingeschlossen.

(I) Polymerstabilisiertes Drogen- und/oder Kontrastmittelträgerliposom
(II) Nicht abbaubare liposomale Target-Membran
(III) Nicht hydrolysierbare Etherlipide
(IV) Proenhancer (Lipid), lipidkonjugierte Kontrastmittel (Monoetherlipid), Proaktivator (Lipid)
(V) Enhancer (Lysolipid + Fettsäure), Drogen (Etherlysolipid- und Fettsäurederivate), PLA₂-Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure)

12(a) PLA₂-gesteuerte Freisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des Calceins über die Target-Membran hinweg, als eine Funktion der Zeit, für unterschiedliche Verbindungen der Trägerliposomen. Die Temperatur beträgt 37 °C. Im Vergleich zu unbeschichteten DPPC-Trägern ist die Freisetzungsrate der Modelldroge und/oder des Kontrastmittels bei den polymerbeschichteten Trägern drastisch erhöht, DPPC +2,5 mol% DPPE-PEG2000. Eine weitere Erhöhung der Freisetzungsrate wird erreicht, wenn der Träger auch ein kurzkettiges Phospholipid, DCPC, enthält, das als ein örtlicher Aktivator für das Enzym wirkt. Der Prozentanteil an freigesetztem Calcein wird als % Freisetzung = 100 (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B) bestimmt, wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach Hinzugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz und I_T die Gesamtfluoreszenz, gemessen nach Hinzugabe von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der Liposomen führt. (b) PLA₂-gesteuerte Freisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des Kontrastmittels Calcein über die Target-Membran hinweg, als eine Funktion der Zeit, für unterschiedliche Temperaturen. Mit Erhöhung der Temperatur wird aufgrund einer verstärkten Aktivität der Enzyme, ausgelöst durch strukturelle Veränderungen des Lipid-Doppelschichtsubstrats des Trägerliposoms, auch die Freisetzungsrate erhöht. Bei der vorliegenden Bestimmung wird in allen Fällen eine maximale Freisetzung von etwa 70 % erreicht. Die eingeschobene Grafik zeigt den Zeitpunkt von 50 % Calcein-Freisetzung, t_50%, als eine Funktion der Temperatur. Die Konzentration der Target- und Trägerliposomen beträgt 25 μM, und PLA₂ wird in einer Konzentration von 25 nM in einem HEPES-Puffer mit pH = 7,5 hinzugegeben.
13 Gesamtfreisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des Kontrastmittels Calcein nach 20 min über die Target-Membran hinweg, als eine Funktion der getrennt voneinander erfolgenden Hinzugabe von zunehmenden Mengen Lysolpalmitoylphospholipid und Palmitinsäure in einem 1:1-Gemisch. Die Konzentration der Target-Membranen beträgt 25 μM in einem NPES-Puffer mit pH = 7,5 bei einer Temperatur von 39 °C.
14 PLA₂-gesteuerte Freisetzung der fluoreszierenden Modelldroge und/oder des Kontrastmittels Calcein aus Liposomen, zusammengesetzt aus 25 μM 90 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und 10 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N[methoxy(polyethylenglykoλ)-350) (1-O-DPPE-PEG350), suspendiert in einem 10-mM-HEPES-Puffer (pH = 7,5), als eine Funktion der Zeit. Bei 300 s wurden 50 nM (gerade Linie), 1 nM (durchgehende Linie) und 0,02 nM (gepunktete Linie) Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) hinzugegeben, die Temperatur betrug 35,5 °C. Der Prozentanteil an freigesetztem Calcein wird ermittelt, wie in 4 beschrieben.
15 Emissionsspektrum von 1 mol% Bis-py-DPC, eingeschlossen in negativ geladenen Liposomen (0,100 mM), vor (durchgehende Linie) und nach (gestrichelte Linie) Hinzugabe von 100 nM PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) zu einer Liposomsuspension, äquilibriert bei 41 °C.
16 Charakteristisches Reaktionszeitprofil bei 41 °C für die durch Rattenphospholipase katalysierte Hydrolyse negativ geladener Liposomen. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Hinzugabe zellfreier Peritonealflüssigkeit zu 2,5 ml der thermostatisierten Liposomsuspension, die vor Hinzugabe der Peritonealflüssigkeit 60 s äquilibriert wurde. Die Hydrolyse-Reaktion wird überwacht durch die Monomerfluoreszenz (durchgehende Linie) und Eximerfluoreszenz (gestrichelte Linie) des Bis-py-DPC. Nach Hinzugabe der unverdünnten Peritonealflüssigkeit zu der äquilibrierten Liposomsuspension bei 60 s wird während der Hydrolyse des Bis-py-DPC-Substrats eine plötzliche Zunahme der Monomerfluoreszenz und eine gleichzeitige Abnahme der Eximerfluoreszenz beobachtet. Die eingeschobene Grafik zeigt das Reaktionszeitprofil für die ersten 120 s.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eines der wichtigen Merkmale der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, dass bestimmte Lipidderivate von extrazellulärer PLA₂ auf wohldefinierte Art an bestimmten extrazellulären Orten von Säugetiergewebe abgespaltet werden. Es wurde festgestellt, dass extrazelluläre PLA₂ in der Lage ist, Monoether-/Monoesterlipidderivate abzuspalten, um den Marker in dem entsprechenden erkrankten Gewebe zielgerichtet freizusetzen.
Lipidderivate
Das bildverbessernde System (Liposomen oder Mizellen) zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung beruht somit auf einem Lipidderivat, das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7 Kohlenstoffatomen und ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen sowie (b) einen hydrophilen Anteil hat, wobei das lipidkonjugierte Kontrastmittel außerdem in dem Maße ein Substrat für extrazelluläre Phospholipase A₂ ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abspaltbar ist, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt, wodurch das lipidkonjugierte Kontrastmittel in Form eines Lysolipidderivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei in dem System Lipopolymere oder Glykolipide eingeschlossen sind, so dass auf der Oberfläche des Systems hydrophile Ketten dargestellt sind.
Obwohl die Begriffe „Lipid" und „Lysolipid" (im Zusammenhang mit Phospholipiden) dem Fachmann hinreichend bekannt sein werden, sollte betont werden, dass im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche der Begriff „Lipid" die Triester folgender Formel bezeichnen soll:
wobei R^A und R^B Fettsäure-Anteile (C_9-30-Alkyl-/Alkylen-/Alkyldien-/Alkyltrien-/Alkyltetraen-C(=O)-) sind und R^C eine Phosphatidsäure (PO₂-OH) oder ein Phosphatidsäurederivat ist. Die Gruppen R^A und R^B sind somit über Esterbindungen an die Glycerolhauptkette gebunden.
Der Begriff „Lysolipid" soll ein Lipid bezeichnen, bei dem die R^B-Fettsäuregruppe nicht vorhanden (z. B. hydrolytisch abgespaltet) ist, d. h. ein Glycerolderivat der oben stehenden Formel, bei dem R^B Wasserstoff ist, die übrigen Substituenten jedoch im Wesentlichen unbeeinflusst bleiben. Die Umwandlung eines Lipids in ein Lysolipid kann unter Einwirkung eines Enzyms erfolgen, insbesondere unter der Einwirkung von zellulärer sowie extrazellulärer PLA₂.
Die Begriffe „Lipidderivate" und „Lysolipidderivate" sollen mögliche Derivate der oben stehenden möglichen Verbindungen innerhalb der Gruppen „Lipid" bzw. „Lysolipid" abdecken. Beispiele für biologisch aktive Lipidderivate und Lysolipidderivate sind angegeben in Houlihan, et al., Med. Res. Rev., 15, 3, 157-223. Der Zusatz „Derivat" sollte also im weitesten Sinne verstanden werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anwendung sollten Lipidderivate und Lysolipide jedoch bestimmte funktionelle Kriterien (siehe oben) und/oder strukturelle Anforderungen erfüllen. Insbesondere ist zu beachten, dass die geeigneten Lipidderivate diejenigen sind, die (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7, vorzugsweise mindestens 9 Kohlenstoffatomen, und ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen sowie (b) einen hydrophilen Anteil haben. Es ist ersichtlich, dass die aliphatische Gruppe und das organische Radikal den beiden Fettsäure-Anteilen in einem normalen Lipid entsprechen und dass der hydrophile Anteil dem Phosphat-Teil eines (Phospho-)Lipids oder eines Bioisosters davon entspricht.
Da also der allgemeine Gedanke der vorliegenden Erfindung darin besteht, das angestiegene Niveau der extrazellulären PLA₂-Aktivität in örtlichen Bereichen des Körpers eines Säugetiers auszunutzen, insbesondere in erkranktem Gewebe, sollten die Lipidderivate, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, Substrate für extrazelluläre PLA₂ sein, d. h. die Lipidderivate sollten zu einer hydrolytischen, enzymatischen Abspaltung des organischen Radikals, das der Fettsäure in der 2-Stellung in einem Lipid entspricht, in der Lage sein. Es ist bekannt, dass extrazelluläre PLA₂ zu der Enzymklasse (EC) 3.1.1.4 gehört. Somit sollten bei der Bezugnahme auf (extrazelluläre) PLA₂ darunter alle extrazellulären Enzyme dieser Klasse, z. B. Lipasen, verstanden werden, die eine hydrolytische Abspaltung des organischen Radikals induzieren können, das der Fettsäure in der 2-Stellung in einem Lipid entspricht. Ein besonderer Vorteil des auf Lipiden basierenden bildverbessernden Systems (wie Liposomen und Mizellen) besteht darin, dass die extrazelluläre PLA₂-Aktivität zu organisierten Substraten hin im Vergleich zu monomeren Substraten wesentlich erhöht ist.
In Anbetracht der Anforderung der Hydrolysierbarkeit durch extrazelluläre PLA₂ ist offensichtlich, dass das organische Radikal (z. B. aliphatische Gruppe) vorzugsweise über eine Esterfunktionalität gebunden ist, die durch extrazelluläre PLA₂ abgespaltet werden kann, vorzugsweise so, dass die abgespaltete Gruppe eine Carbonsäure ist.
Weiterhin ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die aliphatische Gruppe (die Gruppe, die der Fettsäure in der 1-Stellung in einem Lipid entspricht) des Lipidderivats, d. h. das Lysolipidderivat nach Abspaltung durch extrazelluläre PLA₂, von der Wirkung der extrazellulären PLA₂ im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt. Mit „im Wesentlichen unbeeinflusst" ist gemeint, dass die Integrität der aliphatischen Gruppe erhalten bleibt und dass weniger als 1 mol%, vorzugsweise weniger als 0,1 mol%, der aliphatischen Gruppe (der aliphatischen Gruppe in der 1-Stellung) unter Einwirkung der extrazellulären PLA₂ abgespaltet wird.
Außerdem sollte das aus der hydrolytischen Abspaltung des organischen Radikals resultierende Lysolipidderivat selbst kein Substrat für Lysophospholipase sein. Es ist bekannt, dass Lysophospholipase zu der Enzymklasse (EC) 3.1.1.5 gehört. Somit sollten bei der Bezugnahme auf Lysophospholipase darunter alle Enzyme dieser Klasse verstanden werden, welche die Reaktion von Lyso(phospho)lipid + Wasser zu Phosphoglycerol + Fettsäure beschleunigen. Der Ausdruck „kein Substrat für Lysophospholipase" soll bedeuten, dass Lysophospholipase eine Aktivität von weniger als 1 % zum Substrat hin im Vergleich zu dem entsprechenden Esterlipid, d. h. nahezu keine enzymatische Aktivität, aufweist.
Geeignete Beispiele für derartige Lysolipidderivate sind diejenigen, bei denen unter Einwirkung von Lysophospholipasen keine hydrolytische Abspaltung erfolgt. Die Lysolipidderivate sind also insbesondere keine Lysolypide und Lysolipidderivate, die eine Esterbindung in der 1-Stellung des Lysolipids oder der der 1-Stellung eines Lysolipids entsprechenden Stellung eines Lysolipidderivats aufweisen.
Eine bevorzugte Klasse von Lipidderivaten zum Einschluss in die erfindungsgemäßen bildverbessernden Systeme kann durch folgende Formel dargestellt werden:
wobei
X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂ ausgewählt werden, vorzugsweise aus O, NH, NMe und CH₂, insbesondere O;
Y -OC(O)- ist und Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom mit R² verbunden ist, vorzugsweise über das Carbonylkohlenstoffatom;
R¹ eine aliphatische Gruppe mit der Formel Y¹Y² ist;
R² ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen ist, wie zum Beispiel eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7, vorzugsweise mindestens 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Gruppe mit der Formel Y¹Y²;
worin Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r(CH₂)_n9 ist und die Summe aus n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; und n2, n4, n6 und n8 unabhängig jeweils Null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist, worin jedes Y¹-Y² unabhängig durch Halogen oder C_1-4akyl substituierbar ist, vorzugsweise jedoch bleibt Y¹-Y² unsubstituiert bleibt,
R³ aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten der Phosphatidsäure und Bioisosteren der Phosphatsäure und Derivaten davon ausgewählt wird (unter anderem Phosphatidsäurederivate, an die ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid kovalent gebunden ist).
Wie oben erwähnt, bedeuten bevorzugte Ausführungsformen, dass Y -OC(O)- ist, wobei Y über das Carboxylatom mit R² verbunden ist. Die bevorzugtesten Ausführungsformen bedeuten, dass X und Z O sind und dass Y -OC(O)- ist, wobei Y mit R² über das Carboxylatom verbunden ist. Das bedeutet, dass das Lipidderivat eine 1-Monoether-2-monoester-phospholipid-artige Verbindung ist.
Eine weitere Gruppe bevorzugter Lipidderivate ist diejenige, in der die Gruppe X S ist.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² aliphatische Gruppen mit der Formel Y¹Y² sind, worin Y² CH₃ oder CO₂H ist, vorzugsweise jedoch CH₃, und worin Y¹ – (CH₂)_n1(CH=CH)_n2(CH₂)_n3(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5(CH=CH)_n6(CH₂)_n7(CH=CH)_n8(CH₂)_n9 ist; die Summe aus n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 ist eine ganze Zahl von 9 bis 23, das heißt, dass die aliphatische Gruppe, Y¹Y², eine Länge von 10 bis 24 Kohlenstoffatome aufweist. n1 ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 23; n3 ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20; n5 ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17; n7 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14; n9 ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11; und n2, n4, n6 und 8 sind jeweils unabhängig Null oder 1.
In einer Ausführungsform umfasst/umfassen eine oder mehr der aliphatischen Gruppen R¹/R² oder der R³-Gruppen einen Marker, z. B. Halogene (Brom, Iod) oder Bariumatome, die insbesondere geeignet sind für das bildgebende Verfahren der Computertomographie (CT), oder sind mit instabilen Isotopen angereichert, z. B. ¹¹C, das insbesondere zum Zweck des PET-Scannings nützlich ist.
Die aliphatische Gruppen wie R¹ und R² sind in einer Ausführungsform vorzugsweise gesättigt sowie unverzweigt, das heißt, sie haben vorzugsweise keine Doppelbindungen zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen, wobei n2, n4, n6 und n8 dann jeweils Null sind. Dementsprechend ist Y¹ vorzugsweise (CH₂)_n1. Noch bevorzugter sind (in dieser Ausführungsform) R¹ und R² jeweils unabhängig (CH₂)_n1CH₃ sind und am bevorzugtesten (CH₂)₁₇CH₃ oder (CH₂)₁₅CH₃. In alternativen Ausführungsformen können die Gruppen eine oder mehr Doppelbindungen aufweisen, das heißt, sie können ungesättigt sein, und ein oder mehr der n2, n4, n6 und n8 können 1 sein. Zum Beispiel ist, wenn das ungesättigte Kohlenwasserstoffatom eine Doppelbindung hat, n2 1, n4, n6 und n8 sind jeweils Null und Y¹ ist (CH₂)_n1 CH=CH(CH₂)_n3. n1 ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 21, und n3 ist ebenfalls Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20, wobei mindestens eines der n1 oder n3 nicht Null ist.
In einer bestimmten Ausführungsform sind die Lipidderivate diejenigen, die Monoetherlipide sind, wobei X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig aus Alkylgruppen, (CH₂)_nCH₃, ausgewählt werden, worin n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29 ist, vorzugsweise 14, 15 oder 16, insbesondere 14; Y -OC(O)- ist, Y dann über das Carbonylkohlenstoffatom mit R² verbunden ist.
Im Hinblick auf den hydrophilen Anteil (oft bekannt als die „Kopfgruppe"), der R³ entspricht, wird davon ausgegangen, dass eine große Vielfalt an Gruppen, die der Phosphatidsäure (PO₂-OH) entsprechen, Derivate der Phosphatidsäure und Bioisostere der Phosphatsäure und Derivate davon verwendet werden können. Wie ersichtlich sein wird, besteht die wesentliche Anforderung an R³ darin, dass die Gruppen eine enzymatische Abspaltung der R²-Gruppe (tatsächlich R²-C(=O) oder R²-OH) durch extrazelluläre PLA₂ zulassen sollten. „Bioisostere der Phosphatidsäure und Derivate davon" bedeutet tatsächlich, dass derartige Gruppen – wie Phosphatidsäure – eine enzymatische Abspaltung durch extrazelluläre PLA₂ zulassen sollten.
R³ wird typischerweise ausgewählt aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Phosphatidylcholin (PO₂-O-CH₂CH₂N(CH₃)₃), Phosphatidylethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂NH₂), N-Methylphosphatidylethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂NCH₂), Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerol (PO₂-O-CH₂CHOHCH₂OH). Weitere mögliche Derivate der Phosphatidsäure sind diejenigen, in denen Dicarbonsäuren, wie zum Beispiel Aldar-, Sebacin-, Bernstein- und Weinsäure, an den Endstickstoff von Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol usw. gekoppelt sind.
In der besonderen Ausführung, in der eine Fraktion des Lipidderivats auch ein Lipopolymer oder Glykolipid ist, ist ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid typischerweise kovalent an den Phosphatidyl-Teil des Lipidderivats gebunden.
Hydrophile Polymere, die geeigneterweise in die erfindungsgemäßen Lipidderivate eingeschlossen werden können, um Lipopolymere zu bilden, sind diejenigen, die leicht wasserlöslich sind, kovalent an ein vesikelbildendes Lipid gebunden werden können, und die in vivo ohne toxische Wirkungen toleriert werden (d. h. biokompatibel sind). Geeignete Polymere umfassen Polyethylenglykol (PEG), Polymilchsäure (auch als Polylactid bezeichnet), Polyglykolsäure (auch als Polyglykolid bezeichnet), ein Polymilchsäure-Polyglykolsäure-Copolymer, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierten Cellulosen wie Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose.
Bevorzugte Polymere sind diejenigen mit einem Molekulargewicht von etwa 100 Dalton bis zu etwa 10.000 Dalton und bevorzugter von etwa 300 Daltons bis etwa 5.000 Dalton. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 5.000 Dalton und bevorzugter mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 5.000 Dalton. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglykol mit 750 Dalton (PEG(750)). Polymere können auch durch die Anzahl ihrer Monomere definiert sein; eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt Polymere mit mindestens etwa drei Monomeren, wie PEG-Polymere, bestehend aus drei Monomeren (zirka 150 Dalton).
Wenn das Glykolipid oder Lipopolymer durch eine Fraktion des Lipidderivats dargestellt wird, stellt ein derartiges Lipidderivat (Lipidderivate mit einer Polymer- oder Polysaccharidkette) typischerweise 1 bis 80 mol%, beispielsweise 2 bis 50 mol% oder 3 bis 25 mol%, des gesamten dehydratisierten lipidbasierten Systems dar. Bei mizellulären Verbindungen jedoch kann die Fraktion sogar noch größer sein, wie zum Beispiel 1 bis 100 mol%, beispielsweise 10 bis 100 mol%, des gesamten dehydratisierten lipidbasierten Systems.
Bevorzugte Polymere, die kovalent an den Phosphatidyl-Teil gebunden werden sollen (z. B. über den Endstickstoff von Phosphatidylethanolamin), sind Polyethylenglykol (PEG), Polyactid, Polyglykolsäure, Polyactid-Polyglykolsäure-Copolymer und Polyvinylalkohol.
Es sollte deutlich werden, dass R² ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen sein sollte, (wie eine aliphatische Gruppe mit einer bestimmten Länge (mindestens 7, vorzugsweise 9, Kohlenstoffatome)), ein hoher Grad an Variabilität ist möglich, z. B. braucht R² nicht notwendigerweise ein langer Kettenrest zu sein, sondern kann komplexere Strukturen darstellen.
Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass R² entweder in der Umgebung, in der es durch extrazelluläre PLA₂ freigesetzt werden kann, relativ inert sein oder dass R² einen zur diagnostischen Anwendung geeigneten Marker darstellen kann. Alternativ kann R² eine aktive pharmazeutische Rolle spielen, typischerweise als Zusatzdrogensubstanz oder als ein Wirksamkeitsmodifikator für das Lysolipidderivat und/oder jede weitere (zweite) Drogensubstanz, die in der Umgebung vorhanden sein kann. Ist Letzteres der Fall, kann das auf Lipiden basierende System ebenso eine therapeutische Wirkung aufweisen wie auch die nützlichen Eigenschaften im Hinblick auf das diagnostische Verfahren. In dieser Ausführungsform kann die Gruppe R² ein langer Kettenrest sein, z. B. ein Fettsäurerest (die Fettsäure umfasst dabei ein Carbonyl der Gruppe Y). Dies wurde oben bereits detailliert beschrieben. Interessante Beispiele für Zusatzdrogensubstanzen wie R² innerhalb dieser Untergruppen sind mehrfach ungesättigte Säuren, z. B. Oleat, Linol-, Linolensäure, sowie Derivate von Arachidonoyl (einschließlich des Carbonyls von Y), z. B. Prostaglandine wie Prostaglandin E₁, da Arachidonsäurederivate als Regler der Hormonwirkung bekannt sind, einschließlich der Wirkung von Prostaglandinen, Thromboxanen und Leukotrinen. Beispiele für Wirksamkeitsmodifikatoren wie R² sind jene, welche die Durchlässigkeit der Target-Zellmembran sowie die Aktivität extrazellulärer PLA₂ oder der lipidkonjugierten Kontrastmittel oder jeglicher zweiten Drogensubstanz erhöhen. Beispiele hierfür sind kurzkettige (C_8-12) Fettsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die gleichzeitige Verwendung des auf Lipiden basierenden Systems für diagnostische und für therapeutische Zwecke.
Es sollte deutlich werden, dass die verschiedenen Beispiele möglicher R²-Gruppen mit dem Namen einer diskreten Spezies bezeichnet werden und nicht mit dem Namen des Radikals. Weiterhin sollte deutlich werden, dass die möglichen Beispiele die Carbonylgruppe oder Oxygruppe der Bindung, über die das organische Radikal mit der Lipidhauptkette verbunden ist (entspricht „Y" in der oben stehenden Formel) einschließen. Dies ist für den Fachmann natürlich ersichtlich.
Obgleich in der allgemeinen Formel für die geeigneten Beispiele von im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Lipidderivaten nicht speziell angegeben, sollte deutlich werden, dass der Glykolanteil der Lipidderivate substituiert werden kann, z. B. um die Abspaltungsrate durch extrazelluläre PLA₂ zu modifizieren oder einfach um die Eigenschaften der Liposomen zu modifizieren, welche die Lipidderivate umfassen.
Eine besondere Gruppe nützlicher Verbindungen für das auf Lipiden beruhende System sind Lipidderivate mit der folgenden Formel:
wobei
X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂ ausgewählt werden, vorzugsweise aus O, NH, NMe und CH₂, insbesondere O;
Y -OC(O)- ist und Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom mit R² verbunden ist, vorzugsweise über das Carbonylkohlenstoffatom;
R¹ eine aliphatische Gruppe mit der Formel Y¹Y² ist;
R² ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen ist,
worin Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8r(CH₂)_n9 ist und die Summe aus n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; und n2, n4, n6 und n8 unabhängig jeweils Null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist, worin jedes Y¹-Y² unabhängig durch Halogen oder C_1-4akyl substituierbar ist, vorzugsweise jedoch bleibt Y¹-Y² unsubstituiert bleibt,
R³ ausgewählt wird aus Derivaten der Phosphatidsäure, an die ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid gebunden ist. Das hydrophile Polymer oder Polysaccharid wird typischer- und bevorzugterweise ausgewählt aus Polyethylenglykol, Poly(milchsäure), Poly(glykolsäure), Poly(milchsäure)-Poly(glykolsäure)copolymere, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierter Cellulose, insbesondere aus Polyethylenglykol, Poly(milchsäure), Poly(glykolsäure), Poly(milchsäure)-Poly(glykolsäure)copolymere und Polyvinylalkohol.
Besondere Untergruppen sind diejenigen, in denen X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig aus Alkylgruppen, (CH₂)_nCH₃, ausgewählt werden, worin n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29 ist, vorzugsweise 14, oder 16, insbesondere 14; Y -OC(O)- ist, Y dann über das Carbonylkohlenstoffatom mit R² verbunden ist.
Eine spezifische Gruppe von Verbindungen sind Polyethylenoxid-1-O-palmityl-sn-2-palmitoyl-phosphatidylethanolamin, DPPE-PEG und Polyethylenoxid-1-O-stearyl-sn-2-stearoyl-phosphatidylethanolamin, DSPE-PEG, mit einem PEG-Molekulargewicht von 100 bis 10000 Dalton, insbesondere von 300 bis 5000 Dalton.
Als Liposomen und Mizellen formulierte Lipidderivate
Der Begriff „auf Lipiden basierendes bildverbesserndes System" umfasst makromolekulare Strukturen, die als Hauptkonstituente Lipid oder Lipidderivate umfassen. Geeignete Beispiele dafür sind Liposomen und Mizellen. Derzeit wird davon ausgegangen, dass Liposomen die vielfältigsten Anwendungsmöglichkeiten bieten, wobei diese Anwendungen im Folgenden detailliert beschrieben werden. Obwohl derzeit davon ausgegangen wird, dass Liposomen das bevorzugte auf Lipiden basierende System sind, wird auch bei mizellulären Systemen davon ausgegangen, dass sie interessante Ausführungsformen im Rahmen der vorliegenden Erfindung bereitstellen.
In einer wichtigen Variante, die vorteilhaft mit den hier beschriebenen Ausführungsformen kombiniert werden kann, ist das Lipidderivat in Liposomen entweder als einzige Konstituente oder – was häufiger der Fall ist – in Kombination mit anderen Konstituenten (anderen Lipiden, Sterolen usw.) enthalten. Die hier beschriebenen auf Lipiden basierenden Systeme haben also vorzugsweise die Form von Liposomen, wobei die Liposomen aus Schichten aufgebaut sind, die das Lipidderivat und den Marker umfassen.
Wenn hier verwendet, soll der Begriff „Marker" eine Spezies bedeuten, die in der Lage ist, sowohl dem Säugetierkörper verabreicht als auch durch extrakorporale Mittel zur Bildgebung von lebendem Gewebe nachgewiesen zu werden. Der Marker kann ausgewählt werden aus Radiomarkern wie Radioisotopen und radioisotopmarkierten Verbindungen, radiopaken Verbindungen; fluoreszierenden Verbindungen usw. Spezifische Marker sind ¹¹¹In, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ''C; Gd, Mn, Eisenoxid, Argon, Stickstoff, Iod, Brom und Barium.
Geeignete Marker für die Gamma-Szintigraphie sind diagnostische Radionuklide, wie ¹¹¹In, ^99mTc, ⁵⁷Ga. Aus praktischen Gründen werden die Radionukleotide z. B. mit Chelatoren wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Hexamethylpropylenaminoxim (HMPAO), Diisopropyliminodiessigsäure (DISIDA) oder sogar mit Proteinen wie Humanserumalbumin (HSA) komplexiert. Alternativ können DTPA oder ähnliche chelatisierende Verbindungen durch Einbindung einer hydrophoben Gruppe, die während oder nach der Liposomherstellung den chelatisierenden Anteil an die Liposomoberfläche binden können, derivatisiert werden.
Geeignete Marker für das Röntgen sind Verografin, Ioxagiat, Iohexol, Iopromid, Iomeprol, Iopamidol, Iopentol, Iodixanol, Ioversol, verschiedene nicht ionogene Kontrastmittel usw., die in Liposomen eingebunden werden können und sowohl für die Bildgebung der Leber und Milz durch planares Röntgen als auch für das bildgebende Verfahren der CT verwendet werden können.
Geeignete Marker für das bildgebende Verfahren der Magnetresonanz (MR) sind paramagnetische Ionen wie Gd und Mn sowie an verschiedene Trägermoleküle gekoppeltes Eisenoxid. So wurde z. B. nachgewiesen, dass der Gadolinium-Diethylentriaminpentaessigsäure(Gd-DTPA)-Komplex ein wirksames Kontrastmittel für die MR-Bildgebung von Leber, Milz und Lebermetastasen ist.
Geeignete Marker für das bildgebende Verfahren der Computertomographie (CT) sind Iod, Brom, Barium usw.
Weitere Beispiele für geeignete Marker sind häufig gegeben durch das gewählte Bildgebungs- oder Nachweisverfahren, wobei entsprechende Beispiele ausführlich beschrieben sind in: Handbook of medical imaging, Bd. 1, 2, 3, SPIE Press, Washington USA, 2000, Beutel, Konden und van Metier (Hrsg). „Liposomen" sind bekannt als sich selbst organisierende Strukturen, die eine oder mehr Lipid-Doppelschichten umfassen, von denen jede ein wässriges Kompartiment umschließt und zwei einander gegenüberliegende monomolekulare Schichten aus amphipathischen Lipidmolekülen umfasst. Amphipathische Lipide (hier u. a. Lipidderivate) umfassen eine polare (hydrophile) Kopfgruppenregion (entspricht dem Substituenten R³ in den Lipidderivaten), die kovalent an eine oder zwei nicht polare (hydrophobe) aliphatische Gruppen (entsprechen R¹ und R² in den Lipidderivaten) gebunden ist. Allgemein wird davon ausgegangne, dass energetisch ungünstige Kontakte zwischen den hydrophoben Gruppen und dem wässrigen Medium Lipidmoleküle dazu veranlassen, sich neu anzuordnen, so dass die polaren Kopfgruppen zum wässrigen Mittel hin ausgerichtet sind, während die hydrophoben Gruppen sich zum Inneren der Doppelschicht hin ausrichten. Es wird eine energetisch stabile Struktur gebildet, in der die hydrophoben Gruppen wirksam gegen den Kontakt mit dem wässrigen Medium abgeschirmt sind.
Wie aus oben Stehendem ersichtlich wird, sind die auf Lipiden basierenden Systeme, z. B. Liposomen, insbesondere nützlich zur Einbindung von Markern.
Liposomen können eine einzelne Lipid-Doppelschicht (unilamellare Liposomen, „ULVs") oder mehrere Lipid-Doppelschichten (multilamellare Liposomen, „MLVs") aufweisen und durch verschiedene Verfahren hergestellt werden (siehe hierzu z. B. Deamer und Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27-52). Zu diesen Verfahren gehören die Verfahren nach Bangham zur Herstellung von multilamellaren Liposomen (MLVs), die Verfahren nach Lenk, Fountain und Cullis zur Herstellung von MLVs mit im Wesentlichen gleicher interlamellarer Verteilung gelöster Stoffe (siehe z. B. die US 4,522,803 , US 4,588,578 , US 5,030,453 , US 5,169,637 und US 4,975,282 ) sowie das Verfahren der Umkehrphasenverdampfung nach Papahadjopoulos et al. ( US 4,235,871 ) zur Herstellung von oligolamellaren Liposomen. ULVs können zum Beispiel durch Verfahren wie Beschallung (siehe Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) oder Extrudieren ( US 5,008,050 und US 5,059,421 ) aus MLVs hergestellt werden. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung können durch die Verfahren einer jeden dieser Offenbarungen hergestellt werden.
Zur Herstellung von Liposomen kleinerer Größe aus größeren Liposomen können verschiedene Methodologien, wie beispielsweise Beschallung, Homogenisierung, Anwendung der French Press und Mahlen genutzt werden. Extrudieren (siehe die US 5,008,050 ) kann angewendet werden, um Liposomen in ihrer Größe zu reduzieren, das heißt, um Liposomen mit einer vorbestimmten mittleren Größe herzustellen, indem diese unter Druck durch Filterporen mit einer definierten gewählten Größe gezwungen werden. Tangentialflussfiltration (siehe die WO 89/08846) kann ebenfalls angewendet werden, um die Größe von Liposomen zu regulieren, das heißt, um Liposomen herzustellen, die eine Liposompopulation mit einer geringeren Größenheterogenität und einer homogeneren definierten Größenverteilung aufweisen. Liposomgrößen können auch durch eine Anzahl von Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch quasielektrische Lichtstreuung, sowie mit Geräten, z. B. mit Nicomp^®-Particle-Sizern, über die Fachleute natürlich verfügen.
Es ist interessant, festzustellen, dass die Lipidderivate der vorliegenden Erfindung den Hauptteil eines auf Lipiden basierenden Systems darstellen können, selbst wenn das System ein Liposomsystem ist. Diese Tatsache ist zurückzuführen auf die strukturelle (jedoch nicht funktionelle) Ähnlichkeit zwischen den Lipidderivaten der vorliegenden Erfindung und Lipiden. Daher wird davon ausgegangen, dass die Lipidderivate für die vorliegende Erfindung die einzigen Konstituenten von Liposomen sein können, d. h. bis zu 100 mol% der gesamten dehydratisierten Liposomen können sich aus den Lipidderivaten zusammensetzen. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten Monoetherlysolipiden, die nur einen geringen Teil der Liposomen ausmachen können.
Typischerweise schließen Liposomen vorteilhafterweise, wie unten ausführlicher beschrieben, weitere Konstituenten ein, die eine pharmazeutische Wirkung haben können oder auch nicht, die jedoch die Liposomstruktur stabiler (oder alternativ instabiler) machen oder die Liposomen gegen Clearance schützen und dadurch die Zirkulationszeit erhöhen und somit die Gesamtwirksamkeit eines die Liposomen enthaltenden Pharmazeutikums verbessern.
Es wird davon ausgegangen, dass die bestimmten Lipidderivate typischerweise 15 bis 100 mol%, beispielsweise 50 bis 100 mol%, vorzugsweise 75 bis 100 mol%, insbesondere 90 bis 100 mol%, ausmachen, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Die Liposomen können unilamellar oder multilamellar sein. Einige bevorzugte Liposomen sind unilamellar und haben Durchmesser von unter zirka 200 nm, bevorzugter von über zirka 50 nm bis unter zirka 200 nm.
Wie in Fachkreisen bekannt ist, werden die Liposomen typischerweise durch ein Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Auflösen des Lipidderivats in einem organischen Lösungsmittel, (b) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Lipidderivatlösung aus Schritt (a) und (c) Hydratisieren des Produkts aus Schritt (b) mit einem wässrigen Lösungsmittel, um Liposomen zu bilden.
Das Verfahren umfasst weiterhin den Schritt der Hinzugabe eines Markers zu dem organischen Lösungsmittel aus Schritt (a) oder der wässrigen Phase aus Schritt (c). Alternativ können Liposomen mit ionisierbaren Markern beladen werden, indem zuerst die Liposomen gebildet werden, über die äußerste liposomale Doppelschicht hinweg ein elektrochemisches Potenzial erzeugt wird, z. B. mittels eines pH-Gradienten, und der ionisierbare Marker dann der wässrigen Medium außerhalb des Liposoms hinzugegeben wird (siehe z. B. die US 5,077,056 und WO 86/01102).
Anschließend kann das Verfahren den Schritt des Extrudierens der in Schritt (c) hergestellten Liposomen durch einen Filter umfassen, um Liposomen einer bestimmten Größe, z. B. 100 nm, herzustellen.
Auf Lipiden basierende Partikelsysteme, d. h. Liposomen sowie Mizellen, mit Größen, die einen großen Bereich abdecken, können nach den oben genannten Verfahren hergestellt werden. Je nach Verabreichungsweg liegen geeignete Größen für pharmazeutische Anwendungen normalerweise im Bereich von 20 bis 10.000 nm, insbesondere im Bereich von 30 bis 1000 nm. Größen im Bereich von 50 bis 200 nm werden normalerweise bevorzugt, da bei Liposomen in diesem Größenbereich im Allgemeinen davon ausgegangen wird, dass sie länger im Gefäßsystem von Säugetieren zirkulieren als größere Liposomen, die schneller von den retikuloendothelialen Systemen („RES") des Säugetiers erkannt werden und somit schneller aus dem Kreislauf entfernt werden. Eine längere Gefäßzirkulation erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass das auf Lipiden basierende System die vorgesehene Stelle, z. B. Tumore oder Entzündungen, erreicht.
Es wird davon ausgegangen, dass die Liposomen für ein bildverbesserndes System gemäß der Definition in den hier beschriebenen Ausführungsformen, das angepasst ist, um durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht zu werden, vorzugsweise eine mittlere Partikelgröße von etwa 100 nm aufweisen sollten. Die Partikelgröße sollte somit im Allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 nm liegen.
Weiterhin sollten die Liposomen für ein bildverbesserndes System, das dazu angepasst ist, um durch subkutane Injektion verabreicht zu werden, vorzugsweise eine mittlere Partikelgröße von 100 bis 5000 nm aufweisen; die Liposomen können dann eine Einzelschicht oder mehrere Schichten aufweisen.
Einer der Vorteile der Einbindung der Lipidderviate in Liposomen besteht darin, dass die Liposomstruktur, insbesondere wenn diese wie im Folgenden beschrieben stabilisiert wurde, eine viel längere Gefäßzirkulationszeit aufweist als die Lipidderivate und der Marker als diskrete Verbindungen. Weiterhin werden die Lipidderivate und der Marker mehr oder weniger inert oder sogar „unsichtbar", wenn sie in Liposomen „gepackt" sind, die Lipopolymere oder Glykolipide einschließen. Das bedeutet auch, dass jegliche potenziell nachteilige Wirkung, z. B. eine hämolytische Wirkung, unterdrückt werden kann.
Die Liposomen sollten vorzugsweise als inerte Konstituenten wirken, bis sie im vorgesehenen Bereich reagieren, z. B. in kanzerösen, infizierten oder entzündeten Bereichen oder Geweben. Wie im Folgenden beschrieben, können Liposomen eine Anzahl weiterer Konstituenten einschließen. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes bildverbesserndes System weiterhin eine Komponente umfassen, welche die Freisetzung des Markers steuert, Wirkstoffe, die die extrazelluläre PLA₂-Aktivität steuern oder Durchlässigkeits-Enhancer, z. B. kurzkettige Lipide und Lipopolymere/Glykolipide.
Zwei sehr wichtige Gruppen von als Modifikatoren in Liposomen aufzunehmende Verbindungen sind die stabilisierenden Verbindungslipopolymere und -glylolipide, wie Lipopolymere (z. B. Polyethylenoxiddipalmitoylphosphatidylethanolamin, DPPE-PEG, Polyethylenoxiddistearoylphosphatidylethanolamin, DSPE-PEG) mit einem PEG-Molekulargewicht von 100 bis 10000 Dalton. Es wurde nachgewiesen, dass Lipopolymere als Stabilisatoren für die Liposomen, d. h. das Lipopolymer erhöht die Zirkulationszeit, und – was im vorliegenden Kontext von großem Interesse ist – als Aktivatoren für extrazelluläre PLA₂ dienen. Die stabilisierende Wirkung wird im Folgenden beschrieben.
Es wird davon ausgegangen, dass im Kreislauf von Säugetieren die äußeren Oberflächen von Liposomen mit Serumproteinen, wie beispielsweise Opsoninen, beschichtet werden. Es wird davon ausgegangen, dass die Liposom-Clearance durch Modifizierung der äußeren Oberfläche der Liposomen gehemmt werden kann, so dass eine Bindung des Serumproteins an diese im Allgemeinen gehemmt wird. Es wird davon ausgegangen, dass eine wirksame Oberflächenmodifizierung, das heißt Veränderungen der äußeren Oberfläche von Liposomen, die zu einer Hemmung der Opsonisierung und der RES-Aufnahme führen, erreicht wird durch Einbindung von Lipiden in liposomale Doppelschichten, wobei die polaren Kopfgruppen dieser Lipide durch Bindung eines chemischen Anteils an dieselben derivatisiert wurden, wobei dieser Anteil die Bindung von Serumproteinen an Liposomen hemmen kann, so dass das pharmakokinetische Verhalten der Liposomen im Kreislaufsystem von Säugetieren verändert wird und die Aktivität von extrazellulärer PLA₂ wie oben für Lipopolymere beschrieben erhöht wird.
Es wurden Liposomzubereitungen entwickelt, die eine schnelle RES-Aufnahme vermeiden und die somit eine erhöhte Halbwertszeit in der Blutbahn aufweisen. STEALTH^®-Liposomen (Liposome Technology Inc., Menlo Park, Kalifornien) umfassen Polyethytenglykol(PEG)-gepfropfte Lipide mit etwa 5 mol% der gesamten dehydratisierten Liposomen. Das Vorhandensein von Polymeren an der äußeren Liposomoberfläche setzt die Aufnahme von Liposomen durch die Organe des RES herab. Die Liposommembranen können so aufgebaut sein, dass sie der aufspaltenden Wirkung des darin enthaltenen oberflächenwirksamen Stoffes widerstehen. Zum Beispiel weist eine Liposommembran, die als Konstituenten Lipide enthält, die mit einem hydrophilen wasserlöslichen Polymer derivatisiert wurden, normalerweise eine erhöhte Stabilität auf. Die Polymerkomponente der Lipid-Doppelschicht schützt das Liposom gegen die Aufnahme durch das RES, und somit wird die Zirkulationszeit der Liposomen in der Blutbahn ausgedehnt.
Für die Verwendung in Lipopolymeren geeignete hydrophile Polymere sind diejenigen, die kovalent an ein Vesikel bildendes Lipid gebunden werden können und die in vivo ohne toxische Wirkungen toleriert werden (d. h. biokompatibel sind). Geeignete Polymere schließen Polyethylenglykol (PEG), Polymilchsäure (auch bezeichnet als Polylactid), Polyglykolsäure (auch bezeichnet als Polyglykolid), ein Polymilchsäure-Polyglykolsäure-Copolymer sowie Polyvenylalkohol ein. Bevorzugte Polymere sind diejenigen mit einem Molekulargewicht von etwa 100 oder 120 Dalton bis zu etwa 5.000 oder 10.000 Dalton und bevorzugter von etwa 300 Daltons bis etwa 5.000 Dalton. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 5.000 Dalton und bevorzugter mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 5.000 Dalton. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglykol mit 750 Dalton (PEG(750)). Polymere können auch durch die Anzahl ihrer Monomere definiert sein; eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt Polymere mit mindestens drei Monomeren, wie PEG-Polymere, bestehend aus drei Monomeren (zirka 150 Dalton). Weitere hydrophile Polymere, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierte Cellulosen wie Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulos.
Glykolipide sind Lipide, an die eine hydrophile Polysaccharidkette kovalent gebunden ist. Es wird ersichtlich sein, dass Glykolipide wie Lipopolymere genutzt werden können, obwohl die Lipopolymere derzeit die vielversprechendsten Ergebnisse liefern.
Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass der Lipopolymergehalt vorteilhafterweise im Bereich von 1 bis 50 mol%, beispielsweise 2 bis 25 mol%, insbesondere 2 bis 15 mol% liegt, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Die Doppelschicht oder die mehreren Schichten des Liposoms können auch andere Konstituenten, beispielsweise andere Lipide, Sterolverbindungen, Polymerceramide, als Stabilisatoren und zielgebende Verbindungen usw. enthalten.
Die Lipidderivate umfassenden Liposomen können (prinzipiell) ausschließlich aus den Lipidderivaten bestehen. Um jedoch die Liposomen zu modifizieren, können außerdem auch „andere Lipide" enthalten sein. Andere Lipide werden nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, mit den Lipidderviatkomponenten der Doppelschicht kompatible Packkonformationen anzunehmen, so dass alle Lipidkonstituenten dicht gepackt sind und eine Freisetzung der Lipidderivate aus der Doppelschicht gehemmt wird. Auf Lipiden basierende Faktoren, die zu kompatiblen Packkonformationen beitragen, sind dem Fachmann hinreichend bekannt und umfassen ohne Einschränkung, Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit sowie die Kopfgruppengröße und Ladung. Dementsprechend können geeignete andere Lipide, einschließlich verschiedener Phosphatidylethanolamine („PEs"), beispielsweise Phosphatidylethanolamin („EPE") oder Dioleoylphosphatidylethanolamin („DOPE"), von Fachleuten ohne größeren Experimentieraufwand ausgewählt werden. Lipide können auf verschiedene Arten modifiziert werden, z. B. durch Kopfgruppenderivatisierung mit Dicarbonsäuren, beispielsweise Glutar-, Sebacin-, Bernstein- und Weinsäure; vorzugsweise ist die Dicarbonsäure Glutarsäure („GA"). Dementsprechend schließen geeignete kopfgruppenderivatisierte Lipide Phosphatidylethanolaminedicarbonsäuren wie Dipalmitoylphosphatidylethanolaminglutarsäure („DPPE-GA"), Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamineglutarsäure („POPE-GA") und Dioleoylphosphatidylethanolamineglutarsäure („DOPE-GA") ein. Am meisten bevorzugt wird das derivatisierte Lipid DOPE-GA.
Der Gesamtgehalt an „anderen Lipiden" liegt typischerweise im Bereich von 0 bis 30 mol%, insbesondere 1 bis 10 mol%, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Eine in dem Liposom enthaltene Sterolverbindung kann im Allgemeinen die Fluidität von Lidpid-Doppelschichten beeinflussen. Dementsprechend hemmen Sterolinteraktionen mit den umliegenden Kohlenwasserstoffgruppen die Emigration dieser Gruppen aus der Doppelschicht. Ein Beispiel für eine in das Liposom aufzunehmende Sterolverbindung (Sterol) ist Cholesterol, es sind jedoch verschiedene andere Sterolverbindungen möglich. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass der Gehalt der Sterolverbindung, sofern diese vorhanden ist, im Bereich von 0 bis 25 mol%, insbesondere 0 bis 10 mol%, beispielsweise 0 bis 5 mol%, liegt, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Polymerceramide sind Stabilisatoren, welche die Gefäßzirkulationszeit verbessern. Beispiele sind Polyethylenglykolderivate von Ceramiden (PEG-Ceramide), insbesondere diejenigen, bei denen das Molekulargewicht des Polyethylenglykols zwischen 100 und 5000 liegt. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass der Gehalt der Polymerceramide im Bereich von 0 bis 30 mol%, insbesondere 0 bis 10 mol%, liegt, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Weitere Bestandteile können 0 bis 2 mol%, insbesondere 0 bis 1 mol%, ausmachen, basierend auf dem gesamten dehydratisierten Liposom.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Lipid-Doppelsicht eines Liposoms mit Polyethylenglykol (PEG) derivatisierte Lipide, so dass sich die PEG-Ketten von der inneren Oberfläche der Lipid-Doppelschicht in den durch das Liposom umschlossenen Innenraum und vom Äußeren der Lipid-Doppelschicht in die Umgebung erstrecken (siehe z. B. die US 5,882,679 und 10 und 11).
In Fachkreisen sind verschiedene Kopplungsverfahren bekannt, um eine Vesikel bildendes, mit einem biokompatiblen, hydrophilen Polymer, wie beispielsweise Polyethylenglykol, derivatisiertes Lipid herzustellen (siehe z. B. die US 5,213,804 , US 5,013,556 ).
Die derivatisierten Lipidkomponenten der erfindungsgemäßen Liposomen können zusätzlich eine labile Lipid-Polymer-Bindung einschließen, wie beispielsweise eine Peptid-, Ester- oder Disulfidbindung, die unter selektiven physiologischen Bedingungen, wie beispielsweise bei Vorhandensein von Peptidase oder Esterase-Enzymen oder Reduktionsmitteln, abgespaltet werden kann. Die Verwendung derartiger Bindungen, um Polymere an Phospholipide zu koppeln, ermöglicht das Erreichen hoher Blutkonzentrationen derartiger Liposomen für mehrere Stunden nach der Verabreichung, gefolgt von der Abspaltung der reversiblen Bindungen und dem Entfernen des Polymers aus der äußeren Liposom-Doppelschicht. Die polymerlosen Liposomen werden dann einer schnellen Aufnahme durch das RES-System unterzogen (siehe z. B. die US 5,356,633 ).
Zusätzlich können erfindungsgemäße Liposomen Nichtpolymermoleküle enthalten, die an das Äußere des Liposomen gebunden sind, beispielsweise Haptene, Enzyme, Antikörper oder Antikörperfragmente, Cytokine und Hormone (siehe z. B. die US 5,527,528), sowie andere kleine Proteine, Polypeptide, Einfachzucker-Polysaccharidanteile oder Nichtproteinmoleküle, die ein bestimmtes enzymatisches oder Oberflächenerkennungsmerkmal auf das Liposom übertragen. Siehe die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/21235. Oberflächenmoleküle, die vorzugsweise die Liposomen zielgerichtet bestimmten Organen oder Zelltypen zuführen, werden hier als „zielgebende Moleküle" bezeichnet und umfassen zum Beispiel Antikörper und Zuckeranteile, z. B. Ganglioside oder auf Mannose und Galactose basierende Anteile, die das Liposom zielgerichtet bestimmten Zellen zuführen, die bestimmte Antigene tragen (Rezeptoren für Zuckeranteile). Verfahren zur Kopplung von Oberflächenmolekülen an Liposomen sind in Fachkreisen bekannt (siehe z. B. die US 4,762,915 ).
Die Liposomen können dehydratisiert, gelagert und anschließend rekonstituiert werden, so dass ein wesentlicher Anteil ihres inneren Gehalts erhalten bleibt. Die liposomale Dehydratisierung erfordert die Verwendung eines hydrophilen Trocknungsschutzstoffes, wie beispielsweise eines Disaccharidzuckers, sowohl auf den inneren als auch den äußeren Oberflächen der Liposom-Doppelschichten (siehe die US 4,880,635 ). Bei dieser hydrophilen Verbindung wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass sie die Neuanordnung der Lipide im Liposom verhindert, so dass Größe und Gehalt während des Trocknungsvorgangs und während der anschließenden Rehydratisierung erhalten bleiben. Geeignete Eigenschaften von derartigen Trocknungsschutzstoffen sind, dass sie starke Wasserstoffbindungsakzeptoren sind und stereochemische Merkmale aufweisen, welche die intramolekularen Abstände der Liposom-Doppelschicht-Komponenten aufrechterhalten. Alternativ kann auf den Trocknungsschutzstoff verzichtet werden, wenn die Liposomzubereitung vor der Dehydratisierung nicht eingefroren wird und nach der Dehydratisierung ausreichend Wasser in der Zubereitung verbleibt.
Lipidderivatliposomen als Trägersysteme von Markern
Das auf Lipiden basierende System kann zur Diagnose verschiedener Erkrankungen verwendet werden, z. B. typischerweise jenen, die ausgewählt werden aus Krebs, z. B. Gehirn- Brust-, Lungen- Dickdarm- oder Eierstockkrebs, oder aus Leukämie, Lymphom, Sarkom, Karzinom und Entzündungen.
Wie oben bereits erwähnt, umfassen die die Lipidderivate der vorliegenden Erfindung umfassenden Liposomen auch einen Marker. Der Marker kann entweder kovalent mit den Lipidderivatmolekülen verbunden sein oder – was häufiger der Fall ist – in ein auf Lipiden basierendes System eingebunden sein, z. B. im Inneren einer Liposommizelle oder im Membranteil oder in einer Mizelle oder einem Liposom. In einer bestimmten Ausführungsform hat das oben beschriebene auf Lipiden basierende bildverbessernde System die Form von Liposomen, die den Marker umfassen. Das auf Lipiden basierende System kann in einer weiteren Ausführungsform eine zweite Drogensubstanz (pharmazeutisch aktive Bestandteile) einschließen, die eine einzelne oder synergistische pharmazeutische Wirkung in Kombination mit den Lipidderivaten und Lysolipidderivaten haben können, wobei das auf Lipiden basierende System eine Doppelwirkung hat, nämlich die zielgerichtete Verabreichung eines Markers sowie einer Droge oder eines Drogengemisches.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein bildverbesserndes System bereit, das die Form von Liposomen hat und in das eine zweite Drogensubstanz eingebunden ist.
Eine mögliche „zweite Drogensubstanz" ist jede beliebige Verbindung oder Zusammensetzung von Stoffen, die Säugetieren, vorzugsweise Menschen, verabreicht werden kann. Derartige Wirkstoffe können in Säugetieren eine biologische Aktivität entwickeln. Zweite Drogensubstanzen, die an Liposomen gebunden werden können, umfassen unter anderem: antivirale Wirkstoffe wie beispielsweise Acyclovir, Zidovudin und die Interferone, antibakterielle Wirkstoffe wie Aminoglykoside, Cephalosporine und Tetracycline, antifungale Wirkstoffe wie Polyenantibiotika, Imidazole und Triazole, antimetabolische Wirkstoffe wie Folsäure und Purin- und Pyrimidinanaloga, antineoplastische Wirkstoffe wie die Anthracyclinantibiotika und Pflanzenalkaloide, Sterole wie Cholesterol, Kohlenhydrate, z. B. Zucker und Stärken, Aminosäuren, Peptide, Proteine wie Zellrezeptorproteine, Immunoglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glykoproteine, Farbstoffe, mydriatische Verbindungen, Bronchodilatoren, lokale Anästhetika und dergleichen. Besonders interessante zweite Drogensubstanzen werden ausgewählt aus (1) Antitumorwirkstoffen wie Anthracylinderivate, Cisplatin, Paclitaxel, 5-Fluoruracil, Exisulind, Cis-Retinoinsäure, Suldinacsulfid und Vincristin, (ii) Antibiotika und antifungalen Substanzen und (iii) entzündungshemmenden Wirkstoffen wie Steroiden und Nichtsteroiden. Insbesondere die Steroide können auch eine stabilisierende Wirkung auf die Liposomen haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung jeglicher der hier beschriebenen auf Lipiden basierenden bildverbessernden Systeme als kombinierte diagnostische Zusammensetzung und Medikament sowie die Verwendung der hier beschriebenen auf Lipiden basierenden bildverbessernden Systeme zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die verknüpft sind mit dem örtlichen Anstieg extrazellulären Phospholipase-A₂-Aktivität im Gewebe von Säugetieren. Derartige Erkrankungen oder Zustände werden üblicherweise ausgewählt aus Krebs, z. B. einem Gehirn-, Brust-, Lungen-, Dickdarm- oder Eierstockkrebs, oder aus Leukämie, Lymphom, Sarkom, Karzinom und Entzündungen.
Pharmazeutische Zubereitungen und diagnostische Verwendungen
Ebenfalls hierdurch bereitgestellt wird eine pharmazeutische Verbindung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, das Lipidderivat und einen Marker umfasst.
„Pharmazeutisch akzeptable Träger" wie hier verwendet sind jene Medien, die im Allgemeinen für die Verwendung in Verbindung mit der Verabreichung von Lipiden und Liposomen, einschließlich liposomaler Drogenformulierungen, an Säugetiere, einschließlich Menschen, akzeptabel sind.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Allgemeinen entsprechend einer Anzahl von dem Fachmann hinreichend zur Verfügung stehenden Faktoren formuliert, um unter anderem Folgendes zu bestimmen und nachzuweisen: die bestimmten verwendeten lipidkonjugierten Kontrastmittel und/oder zweite Drogensubstanz, die Liposomzubereitung, deren Konzentration, Stabilität und vorgesehene Bioverfügbarkeit, die Erkrankung, Störung oder den Zustand, die/der mit der liposomalen Verbindung behandelt werden soll, den Patienten, dessen Alter, Größe und allgemeinen Zustand sowie den vorgesehenen Verabreichungsweg der Verbindung, z. B. nasal, oral, ophthalmisch, subkutan, intramammär, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär. Typische pharmazeutisch akzeptable Träger zur Verwendung bei parenteraler Drogenverabreichung umfassen zum Beispiel D5W, eine wässrige Lösung, die 5 % Gewichtsvolumen Dextrose enthält, sowie physiologische Salzlösung. Pharmazeutisch akzeptable Träger können zusätzliche Bestandteile enthalten, zum Beispiel diejenigen, welche die Stabilität der enthaltenen aktiven Bestandteile verbessern, wie beispielsweise Konservierungsstoffe und Antioxidationsmittel.
Das Liposom oder Lipidderivativ ist üblicherweise in einem Dispersionsmedium formuliert, z. B. einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermedium.
Für normale diagnostische Anwendungen wird eine Menge der den Marker umfassenden Verbindungen, typischerweise in Höhe von etwa 0,1 bis etwa 1000 mg Lipidderivat je kg des Säugetierkörpers, verabreicht, vorzugsweise intravenös.
Die pharmazeutische Verbindung wird vorzugsweise parenteral durch Injektion, Infusion oder Implantation (intravenös, intramuskulär, intraartikulär, subkutan oder dergleichen) in Dosierungsformen, Formulierungen oder z. B. geeigneten Zuführungsvorrichtungen oder Implantaten, die herkömmliche, nicht toxische pharmazeutisch akzeptabel Träger und Adjuvanzien enthalten, verabreicht.
Die Formulierung und Herstellung derartiger Verbindungen ist Fachleuten für pharmazeutische Formulierungen hinreichend bekannt. Spezifische Formulierungen sind in dem Lehrbuch mit dem Titel „Remington's Pharmaceutical Sciences" aufgeführt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Verbindungen können also das auf Lipiden basierende System in Form einer sterilen Injektion umfassen. Um eine derartige Verbindung herzustellen, werden die geeigneten lipidkonjugierten Kontrastmittel in einem parenteral akzeptablen flüssigen Vehikel dispergiert, das praktischerweise Suspensions-, auflösende, stabilisierende, pH-einstellende Wirkstoffe und/oder Dispersionswirkstoffe umfassen kann. Zu verwendbaren akzeptablen Vehikeln gehören unter anderem Wasser, Wasser, das durch Hinzugabe einer geeigneten Menge an Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid oder eines geeigneten Puffers, 1,3-Butandiol, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung auf einen geeigneten pH eingestellt wird. Die wässrige Formulierung kann auch einen oder mehr Konservierungsstoffe enthalten, zum Beispiel Methyl, Ethyl oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat.
Wenn die Diagnose eines Tumors oder Neoplasmas gewünscht wird, erfordert die wirksame Zuführung eines liposomgekapselten Markers über die Blutbahn, dass das Liposom in der Lage ist, die kontinuierliche (jedoch „undichte") Endothelialschicht und die zugrunde liegende Basalmembran zu durchdringen, welche die einen Tumor mit Blut versorgendenden Gefäße umgibt. Es wurde festgestellt, dass Liposomen geringerer Größe wirksamer sind bei der Extravasation in Tumore durch die Endothelialzellbarriere und zugrunde liegende Basalmembran, die eine Kapillare von Tumorzellen trennt.
Wie hier verwendet, sind „solide Tumore" diejenigen, die an einer anatomischen Stelle außerhalb der Blutbahn wachsen (im Gegensatz zu hämatogenen Tumoren wie Leukämien). Solide Tumore erfordern die Bildung von kleinen Blutgefäßen und Kapillaren, um das wachsende Tumorgewebe zu versorgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der gewählte Marker in einem Liposom gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen; die Liposomen sind so formuliert, dass sie eine Größe aufweisen, die bekanntermaßen die Endothelial- und Basalmembranbarrieren durchdringt. Die resultierende liposomale Formulierung kann parental einem Patienten verabreicht werden, der einer derartigen Behandlung bedarf, vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung. Tumore, die durch einen akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems in der Region des Tumorwachstums gekennzeichnet sind, sind insbesondere für die Behandlung durch die vorliegenden Verfahren geeignet. Die Liposomen bauen sich aufgrund der Lipasewirkung an der Tumorstelle schließlich ab oder können durch beispielsweise thermische oder Ultraschallbestrahlung durchlässig gemacht werden. Anschließend wird der Marker in bioverfügbarer, transportabler löslicher Form freigesetzt. Selbst wenn der Marker nicht freigesetzt wird, wird die Diagnose allein durch die Tatsache ermöglicht, dass das Liposom im betreffenden Gewebe konzentriert ist. Weiterhin kann ein leichter Anstieg der Temperatur, wie er häufig in erkranktem Gewebe festzustellen ist, die Stimulierung extrazellulärer PLA₂ weiter erhöhen.
Die Erkrankung oder der Zustand, die/der zu diagnostizieren ist, ist durch ein erhöhtes PLA₂-Niveau in einem Säugetier gekennzeichnet, das oft durch bösartiges Gewebe verursacht ist, z. B. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gehirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Eicerstockkrebs, Lymphom, Sarkom und Karzinom. Das bösartige Gewebe ist typischerweise der Primärtumor. Alternativ ist das bösartige Gewebe metastatische Zellen, die ihren Ursprung im Primärtumor haben.
Ist eine ortsspezifische zielgerichtete Ansteuerung einer Entzündung gewünscht, erfordert die wirksame Liposomzuführung eines Markers, dass das Liposom eine lange Bluthalbwertszeit besitzt und in der Lage ist, die kontinuierliche Endothelialzellschicht und die zugrunde liegende Basalmembran, welche die Blutgefäße benachbart zu der Stelle der Entzündung umgibt, zu durchdringen. Es wurde festgestellt, dass Liposomen mit geringeren Größen wirksamer bei der Extravasation durch die Endothelialzellbarriere in zugehörige entzündete Regionen sind. Die eingeschränkte Fähigkeit herkömmlicher kleiner Liposomzubereitungen, Marker zu tragen, hat jedoch ihre Wirksamkeit in Bezug auf derartige Zwecke eingeschränkt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, wird der gewählte Marker in einem Liposom gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen; die Liposomen sind so formuliert, dass sie eine Größe aufweisen, die bekanntermaßen die Endothelial- und Basalmembranbarrieren durchdringt. Die resultierende liposomale Formulierung kann parenteral einem Patienten verabreicht werden, bei dem eine Diagnose vorgenommen werden soll, vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung. Entzündete Regionen, die durch einen akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems in der Region der Entzündung gekennzeichnet sind, sind insbesondere für die zielgerichtete Verabreichung durch die vorliegenden Verfahren geeignet.
Es ist bekannt, dass die Aktivität extrazellulärer PLA₂ in Bereichen des Säugetierkörpers abnorm hoch ist, die an Krebs, Entzündungen usw. erkrankt sind. Die vorliegende Erfindung stellt einen Weg bereit, diese Tatsache auszunutzen, und es wird davon ausgegangen, dass die extrazelluläre PLA₂-Aktivität im Vergleich zu einem vergleichsweise normalen Bereich in den erkrankten Bereichen des Körpers mindestens 25 % höher sein sollte (bestimmt in der extrazellulären Umgebung). Es ist jedoch auch vorgesehen, dass das Niveau der extrazellulären PLA₂-Aktivität oft viel höher ist, z. B. mindestens 100 %, z. B. mindestens 200 %, beispielsweise mindestens 400 %. Das bedeutet, dass die Diagnose eines Säugetiers mit nur minimalem Einfluss auf Gewebe durchgeführt werden kann, das ein „normales" Niveau extrazellulärer PLA₂-Aktivität aufweist.
Der Marker kann so angepasst werden, dass er nachweisbar und optional quantifizierbar ist durch ein Nachweisverfahren, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Positronen-Emissions-Romographie (PET), Röntgen, Gamma-Szintigraphie, bildgebendes Verfahren der Magnetresonanz (MR), bildgebendes Verfahren der Computertomographie (CT) und Ultraschalldiagnostik.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Die Beispiele veranschaulichen die Herstellung von und die Versuche zu liposomalen Zubereitungen. Die Herstellung von Verbindungen zur diagnostischen Verwendung kann wie hier beschrieben erfolgen.
Beispiel 1
Liposomherstellung
Unilamellare vollständig hydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC). DPPC wurde von Avanti Polar Lipids bezogen, und 1-O-DPPC wurde in unserem Labor synthetisiert. Abgewogene Mengen DPPC oder 1-O-DPPC wurden kurz in Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit einem schwachen N₂-Strom entfernt, und die Lipidfilme wurden über Nacht unter niedrigem Druck getrocknet, um Spuren des Lösungsmittels zu entfernen. Multilamellare Vesikels wurden hergestellt durch Dispersion der getrockneten Lipide in einer Pufferlösung, die enthielt: 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Die multilamellaren Vesikel wurden zehn Mal durch zwei gestapelte Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 100 nm extruidert, wie von Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168, beschrieben.
Unter Verwendung eines N-DSC II Differenzialscan-Kalorimeters (Calorimetry Sciences Corp., Provo) des leistungskompensierenden Typs mit einem Zellvolumen von 0,34 ml wurden Wärmekapazitätskurven ermittelt. Vor dem Scannen wurde die Liposomsuspension 50 min in dem Kalorimeter bei Ausgangstemperatur äquilibriert. Eine Scanrate von +10 °C/h wurde verwendet. Die Lipidkonzentration betrug 1 mM. Der Gel-Fluid-Übergang der multilamellaren Liposomen (MLV) ist durch einen abrupten Übergang erster Ordnung gekennzeichnet, was sich durch den schmalen Peak in den in 1a und 1b (obere Kurven) für 1-O-DPPC und DPPC dargestellten Wärmeübergangskurven widerspiegelt. Der scharfe Peak spiegelt das Übergangsverhalten von multilamellaren Liposomen wider und steht im Gegensatz zu dem für unilamellare Liposomen (LUV) beobachteten weiteren Gel-Fluid-Übergang (Pedersen et al., 1996, Biophys. J. 71, 554-560), wie in 1a und 1b (untere Kurven) für die unilamellaren extrudierten 1-O-DPPC- und DPPC-Liposomen gezeigt.
Beispiel 2
Reaktionszeitprofil und Verzögerungszeitmessungen für Phospholipase A₂
Phospholipase A₂ aus gereinigtem Schlangengift (PLA₂ der Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde nach dem Verfahren von Maraganore et al., J. Biol. Chem. 259, 13839-13843, isoliert. Dieses PLA₂-Enzym gehört zu der Klasse der sekretorischen 14-kD-Enzyme mit geringem Molekulargewicht, die eine strukturellen Ähnlichkeit mit humaner extrazellulärer Phospholipase A₂ aufweisen, wobei sie auf einen gemeinsamen Molekularmechanismus der durch Phospholipase katalysierten Hydrolyse an der Lipid-Membran-Grenzfläche hindeuten (Wery et al., Nature 352, 79-82; Honger et al. Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren et al., Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Unilamellare vollständig hydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und aus 1-O-DPPC mit 5 und 10 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanayl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) oder 5 und 10 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (1-O-DPPE-PEG2000), wie oben beschrieben. Die Bestimmungsbedingungen für das in 2 gezeigte PLA₂-Reaktionszeitprofil und die Verzögerungszeit und der Prozentanteil der Hydrolyse von Tabelle 1 waren: 0,15 mM unilamellare Liposomen, 150 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Tabelle 1. Verzögerungszeit und Prozentanteil von hydrolysiertem 1-O-DPPC bei 41 °C gemäß Bestimmung durch HPLC. Die Lipidkonzentration betrug 0,150 mM in einem 10-mM-HEPES-Puffer (pH = 7,5)
Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Hinzugabe von 8,9 μl einer 42 μM PLA₂ (150 mM) Vorratslösung zu 2,5 ml der thermostatisierten Liposomsuspension (0,150 ml/l), die vor Hinzugabe der PLA₂ 800 s äquilibriert wurde. Das charakteristische Lag-Bursi-Verhalten der PLA₂ gegenüber den Liposomen wird signalisiert durch einen plötzlichen Anstieg der intrinsischen Fluoreszenz der PLA₂ bei 340 nm nach Anregung bei 285 nm, gefolgt von einer damit einhergehenden Abnahme der 90°-Lichtstreuung der Lipidsuspension (Honger et al., Biochemistry 35, 9003-9006). Vor Hinzugaben von PLA₂ und 1200 s nach der beobachteten Verzögerungszeit wurden Proben für die HPLC-Analyse der Menge von verbliebenem, nicht hydrolysiertem 1-O-DPPC und folglich der Menge von erzeugtem 1-O-Nexadecyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin (Lyso-1-O-PPC) entnommen. 100 μl Allquote wurden aus der Lipidsuspension entnommen und schnell mit 1 ml Chloroform/Methanol/Essigsäure(2:4:1)-Lösung gemischt, um die enzymatische Reaktion zu löschen. Die Lösung wurde mit 1 ml Wasser gewaschen, und 20 μl der schweren organischen Phase wurden für die HPLC verwendet. Die HPLC-Chromatogramme in 3 zeigen die Mengen an 1-O-DPPC vor und nach (t = 2050 s) der Hinzugabe von PLA₂ (t = 800 s) zu der Liposomsuspension. Die HPLC-Analyse erfolgte unter Verwendung einer 5-μm-Diolsäule, einer mobilen Phase zusammengesetzt aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, v/v) und eines Verdampfungslichtstreuungsdetektors. Der Umsatz der durch PLA₂ katalysierten Lipidhydrolyse von 1-O-DPPC zu Lyso-1-O-PPC wurde durch HPLC (siehe Tabelle 1) gemessen. Die intrinsische Enzymfluoreszenz und 90°-Lichtstreuung wurden als eine Funktion der Zeit gemessen, wie in 2 gezeigt.
Beispiel 3
Durch Phospholipase A₂ induzierte Freisetzung einerleines eingekapselten wasserlöslichen Modelldroge und/oder Kontrastmittels
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposomen wurden hergestellt unter Anwesenheit von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch Hydratisieren eines 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin-Films in einer HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 für eine Stunde bei 10 °C über der Phasenübergangstemperatur. Unilamellare Liposomen wurden durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei gestapelte 100-nm-Polycarbonatfilter gebildet. Die unilamellaren Liposomen wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein enthaltenden 1-O-DPPC-Liposomen wurden von dem freien Calcein unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten chromatographischen Säule getrennt.
Die Bestimmungsbedingungen für die durch PLA₂ induzierte Calcein-Freisetzung waren 25 μM unilamellare 1-O-DPPC-Liposomen, 25 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5 oder 8,0), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Bei 900 s wurde PLA₂ zu 2,5 ml der thermostatisierten 1-O-DPPC-Liposomsuspension hinzugegeben, die vor Hinzugabe von PLA₂ mindestens 20 min bei 37 °C äquilibriert wurde. Der Prozentanteil des freigesetzten Calceins wird bestimmt als: % Freisetzung = 100 × (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B), wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach Hinzugabe des Enzyms, I_B die Hintergrundfluoreszenz und I_T die nach Hinzugabe von Triton X-100 gemessene Gesamtfluoreszenz ist, die zu einer vollständigen Freisetzung des Calceins durch Aufbrechen der 1-O-DPPC-Liposomen führt. PLA₂ induziert bei Gesamtfreisetzung von 90 Prozent des eingeschlossenen Calceins in den 1-O-DPPC-Liposomen, wie in 4 gezeigt.
Beispiel 4
Phospholipase-A₂-gesteuerte Durchlässigkeitserhöhung einer Modell-Target-Membran
Multilamellare Modellmembran-Target-Liposomen wurden unter Anwesenheit von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch Hydratisieren eines 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin(D-O-SPC)-Films in einer HEPES-Pufferlösung bei pH 7,5 für eine Stunde bei 10 °C über der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55 °C). Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehmaliges Extrudieren der multilamellaren Target-Liposomen durch zwei gestapelte 100-nm-Polycarbonatfilter. Die unilamellaren Liposomen wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Überganstemperatur abgekühlt, und die Calcein enthaltenden Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Säule von dem freien Calcein getrennt. Die aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-snglycero-3-phosphocholin zusammengesetzten unilamellaren Trägerliposomen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Die Calcein-Freisetzung aus den Target-Liposomen wird ermittelt durch Messung der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm. Die Konzentration der D-O-SPC und 1-O-DPPC-Liposomen betrug 25 μM. Schlangengift-PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde hinzugegeben (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, die zu der Bildung von 1-O-Hexadecyl-2-hydroxy- sn-glycero-3-phosphocholin (Lyso-1-O-PPC) und Fettsäurehydrolyseprodukten führt. Mit dem Entfernen von Calcein aus den D-O-SPC-Liposomen ist aufgrund der Einbindung der keine Doppelschicht bildenden Lyso-1-O-PPC und Fettsäurehydrolyseprodukte in die Target-Lipidmembran ein linearer Anstieg der Fluoreszenz bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm zu beobachten, wenn das Calcein in das umgebende Puffermedium verdünnt wird, wie in 5 gezeigt. Der freigesetzte Prozentanteil der Modelldroge und/oder des Kontrastmittels Calcein wird wie oben beschrieben bestimmt (siehe Beispiel 3).
Beispiel 5
Hämolysebestimmung
Unilamellare vollständig hydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und aus 1-O-DPPC mit 5 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) oder mit 5 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000 (1-O-DPPE-PEG2000). Die Lipide wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hydratisiert. Zu Referenzwecken wurde 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholin (ET-18-OCH_S) in PBS in die Bestimmung mit aufgenommen.
Die Hämolysebestimmung wurde nach der Beschreibung von Perkins et al., Biochim. et Biophys. Acta 1327, 61-68 durchgeführt. Nacheinander wurde jede Probe kurz mit PBS verdünnt, und 0,5 ml jeder verdünnten Suspension der 1-O-DPPC-Liposomen wurden mit 0,5 ml gewaschenen humanen roten Blutzellen (RBC) gemischt [4 % in PBS (v/v)]. Für die Kontrollen wurden 0,5 ml Suspension aus roten Blutzellen mit entweder 0,5 ml Pufferlösung (negative Hämolysekontrolle) oder 0,5 ml Wasser (positive Hämolsysekontrolle) gemischt. Proben und Standard wurden in einen 37-°C-Inkubator eingebracht und 20 Stunden bewegt. Die Röhrchen wurden bei geringer Geschwindigkeit (2000 × G) 10 Minuten zentrifugiert, um RBC-Pellets zu bilden. 200 μl des Überstands wurden durch Extinktion bei 550 nm unter Verwendung eines Perkin-Elmer 320 Scan-Spektrophotometers quantitativ bestimmt. 100 Prozent Hämolyse wurde definiert als die maximale mit dem Detergens Triton 100 erreichte Hämolysemenge. Das Hämolyseprofil in 6 zeigt einen niedrigen Hämolysewert (unter 5 Prozent) für 2 mM 1-O-DPPC- Liposomen. 6 zeigt auch, dass geringe ET-18-OCH_S-Konzentrationen einen wesentlichen Hämolysegrad induzieren.
Beispiel 6
Erhöhung der Phospholipase-A₂-Aktivität durch polymergepfropfte 1-O-DPPC-Lipide
Unilamellare vollständig hydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und 1-O-DPPC mit 5 oder 10 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Bestimmungsbedingungen für die PLA₂-Verzögerungszeitmessungen waren 0,15 mM unilamellare Liposomen, 150 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5),1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Hinzugabe von 8,9 μL einer 42-μM-PLA₂-Vorratslösung zu 2,5 ml der thermostatisierten Liposomsuspension, die vor Hinzugabe von PLA₂ 800 Sekunden bei 41 °C äquilibriert wurde. Die vor Beginn der schnellen enzymatischen Aktivität vergangene Zeit wird bestimmt durch einen plötzlichen Anstieg der intrinsischen Fluoreszenz von PLA₂ bei 340 nm nach Anregung bei 285 nm. Die in 7 dargestellten Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der Verzögerungszeit, wenn 5 und 10 mol% von 1-O-DPPE-PEG350 in die 1-O-DPPC-Liposomen aufgenommen werden.
Beispiel 7
Herstellung von aus 1-O-DPPE-PEG350, DSPE-PEG750 und 1-O-DPPE-PEG2000 zusammengesetzten Mizellen
Mizelles wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(methoxy(polyethylenglykol)-750 (DSPE-PEG750) oder 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000 (1-O-DPPE-PEG2000). Abgewogene Mengen der Polymerlipide wurden in Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit einem schwachen N₂-Strom entfernt. Die Lipidfilme wurden anschließend über Nacht unter niedrigem Druck getrocknet, um Spuren des Lösungsmittels zu entfernen. Mizellen wurden hergestellt durch Dispersion der getrockneten Polymerlipide in einer Pufferlösung mit: 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Beispiel 8
Permeabilitätsanstieg einer Target-Modellmembran, gesteuert durch Phospholipase-A₂-Hydrolyse von Mizellen
Multilamellare Modellmembran-Targetliposomen wurden hergestellt unter Anwesenheit einer fluoreszierenden Modelldroge und/oder des Kontrastmittels Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch Hydratisieren eines 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin(D-O-SPC)-Films in einer HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 für eine Stunde bei 10 °C über der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55 °C). Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei gestapelte 100-nm-Polycarbonatfilter. Die unilamellaren Liposomen wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein enthaltenden Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten chromatographischen Säule von dem freien Calcein getrennt. Aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-750 (DSPE-PEG750) oder 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000 (1-O-DPPE-PEG2000) zusammengesetzte Mizellen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt. Die Calcein-Freisetzung aus dem Target-Liposom wird bestimmt durch Messung der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm.
Die Konzentration von D-O-SPC und der Polymerlipidmizellen betrug 25 μM. Schlangengift-PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde hinzugegeben (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, die zu einer sofortigen Bildung des Lyso-1-O-PPE und der freien Fettsäurehydrolyseprodukte führt. Mit Freisetzung des Calceins aus den D-O-SPC-Liposomen ist aufgrund der Einbindung des/der keine Doppelschicht bildenden Polymerlyso-1-O-lipids und Fettsäuren in die Target-Lipidmembran ein linearer Anstieg der Fluoreszenz bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm zu beobachten, wenn das Calcein in die umgebende Pufferlösung verdünnt wird, wie in 8 gezeigt. Der freigesetzte Prozentanteil des Calceins wird wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt. Die PLA₂-katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 induzierte die schnellste Freisetzungsrate, während das DPPE mit der längsten an die Kopfgruppe gebundenen Polymerkette (PEG2000) die langsamste Freisetzungsrate induzierte.
Beispiel 9
Hydrolyse von aus DSPE-PEG750 zusammengesetzten Mizellen
Der Hydrolyse der aus DSPE-PEG750 zusammengesetzten Mizellen folgte die Analyse der Menge der erzeugten Stearinsäure. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Hinzugabe von 8,9 μL einer 42 μM PLA₂ (150 nM) Vorratslösung zu 2,5 ml einer thermostatisierten Mizellensuspension von DSPE-PEG750 (0,150 mM), die vor der Hinzugabe von PLA₂ bei 45 °C für 600 Sekunden äquilibriert wurde. Das charakteristische Burst-Verhalten von PLA₂ gegenüber den Mizellen wird signalisiert durch einen plötzlichen Anstieg der intrinsischen Fluoreszenz von PLA₂ bei 340 nm nach Anregung bei 285 nm, gefolgt von einer damit einhergehenden Abnahme der 90°-Lichtstreuung der Lipidsuspension (Henger et al., Biochemistry 35, 9003-9006). Proben für die HPLC-Analyse der Menge der erzeugten Stearinsäure wurden vor der Hinzugabe von PLA₂ und 100 s nach der beobachteten Verzögerungszeit entnommen. Das HPLC-Chromatogramm in 9 zeigt die Menge der erzeugten Stearinsäure 100 s nach der beoabachteten Verzögerungszeit (10 s) bei 45 °C. Die durch Hydrolyse erzeugte Menge (0,156 mM) an Stearinsäure betrug 100 % der Hydrolyse der DSPE-PEG750-Polymerlipide. Die HPLC-Analyse erfolgte unter Verwendung einer 5-μm-Diolsäule, einer aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, v/v) zusammengesetzten mobilen Phase und eines Verdampfungslichtstreuungsdetektors (Siehe Beispiel 2).
Beispiel 10
Modellbeispiele
Polymerbeschichtete Liposomen können aufgrund einer langen Gefäßzirkulationszeit und einer passiven zielgerichteten Zuführung durch undichte Blutgefäße in erkranktem Gewebe als vielseitige Markerzuführungssysteme dienen. In den hier angegebenen Beispielen ist ein experimentelles Modellsystem beschrieben, das ein neues Prinzip für die verbesserte und programmierbare Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführung veranschaulicht, die eine erhöhte Aktivität von extrazelluärer Phospholipase A₂ im erkrankten Target-Gewebe vorteilhaft nutzt. Die Phospholipase A₂ hydrolysiert einen auf Lipiden basierenden Proenhancer in dem Trägerliposom, wobei Lysophospholipid und freie Fettsäuren produziert werden, die erwiesenermaßen synergistisch zu einer erhöhten Liposomdestabilisierung und Drogenfreisetzung mit gleichzeitiger Erhöhung der Durchlässigkeit der Target-Membran führen. Das vorgeschlagene System kann thermosensitiviert werden und stellt einen rationellen Weg bereit zur Entwicklung von intelligenten auf Liposomen basierenden Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführungssystemen durch Einbindung in trägerspezifische Lipid-basierte Proenhancer, Prodestabilisatoren oder Prodrogen, durch Phospholipase A₂ automatisch nur an den erkrankten Target-Stellen aktiviert werden, beispielsweise in entzündetem, infiziertem oder kanzerösem Gewebe.
Die Droge und/oder das Kontrastmittel nimmt die veränderte Pharmakokinetik des liposomalen Trägers an und kann dem erkrankten Gewebe prinzipiell durch Verwendung einer Kombination aus physikochemischen und pathophysiologischen Faktoren an der Stelle des Liposomträgers bzw. der Target-Membran zielgerichtet zugeführt werden. Liposomen, in die Glykolipide oder Lipopolymere, wie beispielsweise Polyethylenglykol(PEG)lipide, bekannt als Liposomen, zeigen eine verbesserte Stabilität im Gefäßsystem, möglicherweise aufgrund des durch die Polymerbeschichtung verursachten sterischen Schutzes. Die verlängerte Zirkulationszeit dieser Liposomen in Kombination mit einer erhöhten Gefäßporösität des erkrankten Gewebes bildeten die Basis für die positiven klinischen Ergebnisse für spezifische Systeme, einschließlich Antikrebsdrogen wie Doxorubicin sowie antibakterielle und entzündungshemmende Drogen sowie spezifische Kontrastmittelzuführungssysteme zu Bildgebungszwecken (z. B. Mn-basierte MR-Bildgebungswirkstoffe) Niesman et al. J. Liposome Res. 4, 939-957; Koenig and Brown, Invest. Radiol. 20, 297; Basic et al., Magn Reson, Med. 13, 44-61; Niesmam et al., Invest Radiol. 25, 545-551.
Liposomen sind sich selbst organisierende Lipidsysteme, und ihre Stabilität ist daher in hohem Maße gesteuert durch unspezifische physikalische Interaktionen. Einblicke in die molekulare Steuerung der physikalischen Eigenschaften von Liposomen sind daher wichtig für die Manipulation und maßgeschneiderte Beeinflussung der Liposomeigenschaften in Bezug auf spezifische Zwecke der Drogenzuführung. Zum Beispiel wurde der thermisch induzierte Gel-Fluid-Lipidphasenübergang ausgenutzt und die Gestaltung von Systemen zur erhöhten Freisetzung von Drogen aufgrund von Hyperthermie optimiert. In letzter Zeit wurden programmierbare fusogene PEG-Liposomen, welche die Antikrebsdroge Mitoxantron enthalten, mit Hilfe einer zeitverzögerten Freisetzung von doppelschichtstabilisierenden Lipiden der Liposomen, die sich an den Tumorstellen durch Extravasation akkumuliert haben, hergestellt. Es wäre wünschenswert, wenn ein intelligentes und vielseitiges Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführungssystem gestaltet werden könnte, das über einen integrierten dualen virtuellen Auslösemechanismus verfügt für gleichzeitig (i) eine verbesserte selektive Drogenfreisetzung im Target-Gewebe und (ii) einen verbesserten Transport der Droge und/oder des Kontrastmittels in die erkrankten Zellen. Dieses Prinzip ist in 11.a schematisch dargestellt.
Anhand der hier angegebenen Beispiele wird die Entwicklung eines einfachen und operativen experimentellen biophysikalischen Modellsystems beschrieben, das einen derartigen an den pathologischen Target-Stellen auszulösenden dualen Mechanismus unterstützt. Das Modell geht von einer erhöhten Aktivität extrazellulärer Phospholipase A₂ an den erkrankten Stellen aus, wie es bei entzündetem und kanzerösem Gewebe der Fall ist, bei dem das Niveau extrazellulärer PLA₂ um ein Vielfaches erhöht sein kann. Bei Einwirkung extrazellulärer PLA₂ hat sich gezeigt, dass die Phospholipide der PEG-Liposomen im Vergleich zu herkömmlichen unbeschichteten Liposomen einer verstärkten Hydrolyse unterzogen werden. Das führt zu einer Destabilisierung der Liposomen und einer verstärkten Freisetzung der eingekapselten Droge. Die Hydrolyseprodukte, Lysophospholipide und freie Fettsäuren, wirken wiederum als Absorptions-Enhancer für die Durchdringung der Drogen und/oder des Kontrastmittels über die Target-Membran hinweg. Auf diese Weise verhalten sich die Phospholipide der Trägerliposomen als Prodestabilisatoren an der Stelle des Trägers und als Proenhancer an der Stelle der Target-Membran. Die molekularen Einzelheiten dieses Prinzips sind in 11.b schematisch dargestellt.
Das experimentelle Modellsystem besteht aus unbeschichteten Liposomen, einem polymerbeschichteten Liposomträger und einer Modell-Target-Membran. Der Träger ist ein 100 nm unilamellares Liposom, hergestellt aus Dipalmitoylphosphatidylcholinlipiden (DPPC) mit 2,5 mol% Lipopolymer des Typs Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE)- PEG2000. Die Target-Membran ist ein weiteres Liposom, hergestellt aus 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-phosphatidylcholin (D-O-SPC), das ein Phospholipid ist, bei dem die Acylbindungen der Stearoylketten Etherbindungen sind. Im Gegensatz zu DPPC ist D-O-SPC gegenüber einer durch PLA₂ katalysierten Hydrolyse inert und ahmt so die Stabilität einer intakten Target-Zellmembran gegenüber einem Abbau durch deren eigene Enzyme nach. Diese experimentelle Bestimmung, die eine gleichzeitige wie auch eine separate Untersuchung der Wirkung von Destabilisatoren an den Trägerliposomen und der Wirkung von Enhancern an der Target-Membran erlaubt, umfasst den Einschluss einer/eines wasserlöslichen fluoreszierenden Calcein-Modelldroge und/oder Kontrastmittels in einer selbstlöschenden Konzentration im Inneren des nicht hydrolysierbaren Target-Liposoms anstatt im Trägerliposom. Das erhöhte Niveau extrazellulärer PLA₂ an der Target-Membran kann dann simuliert werden durch Hinzugabe extrazellulärer PLA₂, um die hydrolytische Reaktion in einer Suspension des Träger und des Target-Liposoms einzuleiten. Die Durchdringung von Calcein durch die D-C-SPC-Target-Membran hindurch wird anschließend anhand des Anstiegs der Fluoreszenz überwacht. Um die Wirkung des Vorhandenseins der PEG-Lipide im Trägerliposom zu untersuchen, wurde ein ähnliches Experiment mit herkömmlichen unbeschichteten DPPC-Liposomen durchgeführt, das vorteilhafterweise zur zielgerichteten Ansteuerung von makrophagenreichen Organen des RES, wie beispielsweise Leber und Milz, angewendet werden kann. Um die durchlässigkeitsverbessernde Wirkung von Lysophospholipiden mit der von freien Fettsäuren zu vergleichen und zu unterscheiden, wurden weiterhin Experimente ohne Enzyme durchgeführt, bei denen die Lysophospholipid und freien Fettsäuren gleichzeitig oder getrennt zu den Target-Liposomen hinzugegeben wurden.
In 12.a sind die Ergebnisse für die Freisetzung von Calcein als eine Funktion der Zeit nach Hinzugabe von PLA₂ zu dem System gezeigt. Der Reaktionszeitverlauf der bestimmten verwendeten PLA₂ weist ein charakteristisches Lag-Burst-Verhalten mit einer sogenannten Verzögerungszeit auf, die praktischerweise als Maß für die Enzymaktivität verwendet werden kann. Wenn die Trägerliposomen die Lipopolymere, DPPE-PEG2000 enthalten, ist eine drastische Abnahme der Verzögerungszeit und eine damit einhergehende Erhöhung der Freisetzungsrate zu beobachten, was im Einklang mit früheren Feststellungen des erhöhten extrazellulären PLA₂-Abbaus von polymerbeschichteten Liposomen steht.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Produkte der durch PLA₂ katalysierten Hydrolyse der DPPC-Lipide des DPPC-liposomalen Trägers, Lysophospholipid und freie Fettsäuren, die in einem 1:1-Gemisch erzeugt werden, in die Target-Membran eingebunden werden, was zu einem starken Anstieg der Membrandurchlässigkeit führt. Diese Produkte, die eine sehr geringe Wasserlöslichkeit besitzen, sind aufgrund ihrer nicht zylindrischen molekularen Formen dafür bekannt, dass sie in der Membran ein Krümmungsbeanspruchungsfeld induzieren oder eine leichte laterale Phasentrennung, was zu Membrandefekten und einer erhöhten Durchlässigkeit führt. Dies wird durch die Daten in 13 gestützt, die zeigen, dass die getrennte Hinzugabe von Lysophospholipid oder Fettsäure zu dem vorliegenden Target-System unter Abwesenheit von PLA₂ zu einer erhöhten Rate der Calceinfreisetzung über die Target-Membran hinweg führt. Das wesentliche Ergebnis ist jedoch die Tatsache, dass bei gleichzeitiger Hinzugabe von Lysophospholipid und freie Fettsäure in einem 1:1-Gemisch ein drastischer Anstieg der Freisetzungsrate zu beobachten ist, wie 13 zeigt. Dies deutet stark darauf hin, dass die beiden Enhancer synergistisch zusammenwirken, was die einzigartige Möglichkeit unterstreicht, eine durch PLA₂ katalysierte Hydrolyse zur kombinierten Destabilisierung des Trägerliposoms und der Verbesserung des Drogentransports über die Target-Membran hinweg zu nutzen. Die synergistische Wirkung wird weiterhin verstärkt durch die Tatsache, dass extrazelluläre PLA₂ durch ihre eigenen Hydrolyseprodukte aktiviert wird, was die abbaubaren Phospholipide des Trägerliposoms als eine Art von Proaktivatoren zeigt.
Es sollte darauf hingewiesen warden, dass die Wirkung in dem vorliegenden Modellsystem der Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführung unter Verwendung von Lipiden als Proenhancern und Prodestabilisatoren über die extrazelluläre PLA₂-Aktivität dynamisch ist und sich auf ein intrinsische Zeitskala bezieht. Diese Zeitskala ist die wirksame Retentionszeit der Trägerliposomen in der Nähe der Target-Membran. Je schneller das Enzym aktiv wird, desto schneller erfolgt die Drogen- und/oder Kontrastmittelfreisetzung und desto größer ist die Drogen- und/oder Kontrastmittelabsorption während der Zeit, die der Träger in der Nähe des Targets verbringt. Weiterhin ist es so, dass, je schneller das Enzym arbeitet, es desto leichter für die Hydrolyse von anderen Drogen tragenden Liposomen, die sich der erkrankten Target-Stelle nähern, verfügbar wird. Nachdem festgestellt wurde, dass die extrazelluläre PLA₂-Aktivität genutzt werden kann, um die Drogenfreisetzung zu steuern, eröffnen sich mehrere rationelle Wege für intelligente Verbesserungen des vorgeschlagenen Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführungssystems durch die Verwendung von hinreichend bekannten Mechanismen zur Veränderung der extrazellulären PLA₂-Aktivität durch Manipulation der physikalischen Eigenschaften der Lipid-Doppelschicht, gegenüber denen das Enzym bekanntermaßen empfindlich ist. Die Strategie besteht also darin, bestimmte physikalische Eigenschaften der Trägerliposomen zu modifizieren, ohne deren Gefäßzirkulationszeit wesentlich zu verändern. Dieses allgemeine Prinzip wird veranschaulicht durch den Nachweis der Wirkung von sowohl einem physikochemischen Faktor, der Lipidzusammensetzung des Trägers, als auch einem umgebungsbezogenen (thermodynamischen) Faktor, der örtlichen Temperatur an der Target-Stelle.
Kurzkettige Phospholipide, wie beispielsweise Didecanoylphosphatidylcholin (DCPC), aktivieren extrazelluläre PLA₂. Die Wirkung auf die Calceindurchdringung über die Target-Membranen hinweg, die durch Einbindung einer geringen Menge an DCPC in die PEG-Trägerliposome induziert wird, ist ebenfalls in 12.a dargestellt. Die Freisetzung erfolgt aufgrund einer nahezu sofortigen Aktivierung des ENzyms sehr schnell. Weitherhin haben wir festgestellt, dass extrazelluläre PLA₂ deaktiviert wird (Daten nicht abgebildet), wenn eine große Menge an Cholesterol (= 20 mol%) in Liposomen eingebunden wird. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass eine geringe Menge an Cholesterol (= 3 mol%) extrazelluläre PLA₂ aktiviert. Diese bedeutenden Feststellungen sind von besonderem Interesse, da die Blutzirkulationszeit von PEG-Liposomen als nahezu gleich angegeben wird, ob ohne Cholesterol oder mit großen Mengen an Cholesterol.
Die Temperatur hat bekanntermaßen eine drastische und in hohem Maße nicht lineare Wirkung auf die extrazelluläre PLA₂-Aktivierung in der Region des Gel-Fluid-Phasenübergangs von gesättigten Phospholipid-Doppelschichten. Diese Wirkung wird nicht durch Veränderungen des Enzyms verursacht, sondern durch drastische laterale strukturelle Veränderungen der Lipid-Doppelschicht. Es ist möglich, diese Wirkung in dem vorliegenden Drogen- und/oder Kontrastmittelzuführungssystem vorteilhaft zu nutzen, wie durch die Daten in 12.b nahegelegt. Mit Annäherung der Temperatur an die Übergangstemperatur von 41 °C wird die Rate der Calcein-Freisetzung progressiv erhöht, wie durch die Zeit der Calcein-Freisetzung von 50 %, t_50%, quantifiziert, dargestellt im Einschub in 12.b Vormals wurde vorgeschlagen, dass Hyperthermie ausgenutzt werden könnte, um die Drogenfreisetzung zu erhöhen, und dass eine örtliche Erwärmung in vordefinierten Tumorbereichen genutzt werden könnte, um Drogen tragende Liposomen örtlich zu destabilisieren, indem die erhöhte Undichtheit von Liposomen bei ihrem Phasenübergang ausgenutzt würde. In dem hier vorgeschlagenen neuen Modelldrogen- und/oder Kontrastmittelzuführungssystem sind diese thermosensitiven Möglichkeiten integriert und durch die thermische Sensitivität der extrazellulären PLA₂ gegenüber den physikalischen Eigenschaften der Trägerliposomen vollständig ausgenutzt. Im Gegensatz zu dem Fall, in dem die thermische Wirkung nur durch eine örtliche Temperaturerhöhung unter Anwendung externer Wärmequellen an einer vorbestimmten Tumorstelle einer bestimmten minimalen Größe erreicht werden kann, wird die PLA₂-gesteuerte Freisetzung überall dort erhöht, wo die Temperatur und die Konzentration der extrazellulären PLA₂ erhöht sind, z. B. in entzündetem Gewebe, und zwar unabhängig von der Größe der erkrankten Region und ohne zuvor eine Lokalisierung des erkrankten Gewebes vornehmen zu müssen.
DPPC, DCPC, D-O-SPC und DPPE-PEG2000 wurden von Avanti Polar Lipids bezogen. Das DPPE-PEG2000-Lipopolymer enthält 45 Monomere in der PEG-Polymerkette. Die PLA₂ aus gereinigtem Schlangengift (Agkistrodon piscivorus piscivorus) war ein großzügiges Geschenk von Dr. R. L. Biltonen. Dieses PLA₂-Enzym gehört zu der Klasse der sekretorischen 14-kD-Enzyme mit geringem Molekulargewicht, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit humaner extrazellulärer Phospholipase A₂ aufweisen. Multilamellare Target-Liposomen in Anwesenheit von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM wurden durch Hydratisieren eines D-O-SPC-Films in einer HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 für eine Stunde bei 10 °C über der Phasenübergangstemperatur T_m = 55 °C hergestellt. Unilamellare Liposomen wurden durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei gestapelte 100-nm-Polycarbonatfilter hergestellt. Die unilamellaren Liposomen wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein enthaltenden Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten chromatographischen Säule von dem freien Calcein getrennt. Die unilamellaren Trägerliposomen von DPPC, DCPC und DPPE-PEG2000 wurden auf ähnliche Weise hergestellt (T_m = 41 °C). Die Calcein-Freisetzung aus den Target-Liposomen wird bestimmt durch Messung der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm. Alle Messungen werden bei Temperaturen durchgeführt, bei denen sich die Lipide der Träger- wie auch der Target-Liposomen im Gelzustand befinden.
Beispiel 11
Bestimmung der von der Phospholipase-A₂-Konzentration abhängigen Freisetzung
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposomen mit 10 mol% 1-O-DPPE-PEG350 wurden hergestellt unter Anwesenheit von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch Hydratisieren eines Films von 90 % 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphochotin und 10 % 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] in einer HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 für eine Stunde bei 10 °C über der Phasenübergangstemperatur. Unilamellare Liposomen wurden durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei gestapelte 100-nm-Polycarbonatfilter gebildet. Die unilamellaren Liposomen wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein enthaltenden Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten chromatographischen Säule von dem freien Calcein getrennt.
Die Bestimmungsbedingungen für die durch PLA₂ induzierte Calcein-Freisetzung waren 25 μM unilamellare Liposomen, 50, 1 und 0,02 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. PLA₂ wurde zu 2,5 ml der thermostatisierten Lipidsuspension hinzugegeben, die vor Hinzugabe von PLA₂ mindestens 300 s bei 35,5 °C äquilibriert wurde. Der Prozentanteil des freigesetzten Calceins wird bestimmt als: % Freisetzung = 100 × (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B), wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach Hinzugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz und I_T die nach Hinzugabe von Triton X-100 gemessene Gesamtfluoreszenz, die zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der 1-O-DPPC-Liposomen führt. 14 zeigt, dass die induzierte Freisetzung von Calcein am langsamsten erfolgte, wenn lediglich 0,02 nM PLA₂ zu der Liposomsuspension hinzugegeben wurden.
Beispiel 12
In-vivo-Hämolyse
Bestimmung
Gruppen von Mäusen (n = 5/Gruppe; Gewicht 18 bis 22 g) wurden in vivo mit Puffer (PBS), ET-15 OCH₃ (50 mg/kg) und aus 1-O-DPPC zusammengesetzten Liposomen mit 5 mol% 1-O-DPPE-PEG2000 (68,7 und 137,5 mg/kg) behandelt. 30 min nach der Injektion wurden 100 μl Blut direkt von dekapitierten, mit CO₂ anästhesierten Mäusen in heparinisierte Röhrchen gesammelt. Das Blut wurde- bei 500 × G 10 min zentrifugiert, und Plasma wurde entnommen und bei -20 °C bis zur Analyse gelagert.
Der Hämolysegrad wurde durch Extinktion bei 550 nm unter Verwendung eines Perkin-Elmer 320 Scan-Spektrophotometers gemessen. 25 μl Plasma wurden mit 2,5 ml PBS oder 2,5 ml 10 % Triton X-100 gemischt. 100 Prozent Hämolyse wurden definiert als die maximale Hämolysemenge, die gewonnen wurde aus dem Plasma von mit PBS behandelten Mäusen, gemischt mit 10 % Triton X-100, und 0 Prozent als Plasma von mit PBS behandelten Mäusen, gemischt mit PBS.
Das Hämolyseprofil in Tabelle 2 zeigt einen niedrigen Hämolysewert für die Mäuse, die mit 2 mM aus 1-O-DPPC mit 5 mol% 1-O-DPPE-PEG2000 zusammengesetzten Liposomen behandelt wurden. Die mit ET-18-OCH_S behandelten Mäuse starben innerhalb des 30-Minuten-Zeitraums.
Tabelle 2. Prozentanteil Hämolyse, ± Standardfehler, nach 30 min und Anzahl der überlebenden Mäuse in jeder Gruppe
Wie hier verwendet, sind „solide Tumore" diejenigen, die an einer anatomischen Stelle außerhalb der Blutbahn wachsen (im Gegensatz zu hämatogenen Tumoren wie Leukämien). Solide Tumore erfordern die Bildung von kleinen Blutgefäßen und Kapillaren, um das wachsende Tumorgewebe zu versorgen.
Beispiel 13
Hydrolyse von negativ geladenen Liposomen durch Phospholipase A₂ in zellfreier Peritonealflüssigkeit von Ratten
Zellfreie Peritonealflüssigkeit von Ratten mit einer durch Casein induzierten akuten Entzündung wurde hergestellt durch Injektion von 5 ml 1 % Natriumcaseinat in die Peritonealhöhle einer männlichen SRPD-Ratte mit einem Gewicht von 250 bis 260 g. Die Ratte wurde nach 24 Stunden durch Ausbluten getötet, und die Entzündungsflüssigkeit wurde aus dem Peritoneum entnommen und bei 1500 G 20 min zentrifugiert, um eine zellfreie Peritonealflüssigkeit zu erhalten.
Negativ geladene vollständig hydratisierte unilamellare Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 89 mol% Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 10 mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) und 1 mol% 1,2-Bis-(1-pyrendecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin (Bis-py-DPC). Bis-py-DPC ist ein PLA₂-Substrat mit zwei benachbarten Pyrenfluorophoren, die Dimere bilden, welche sich in einem angeregten Zustand befinden (Eximere) und die nach Anregung bei 342 bei nm 470 nm emittieren. Eine durch Phospholipase katalysierte Hydrolyse trennt die beiden Fluorophoren, die dann bei 380 nm emittieren (Monomere).
15 zeigt die nach Anregung bei 342 nm erhaltenen Emissionsspektren von in negativ geladenen Liposomen eingebundenem Bis-py-DPC (0,100 mM) vor und nach Hinzugabe von 100 nM PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus). Die beobachtete Änderung im Emissionsspektrum nach der durch Phospholipase vermittelten Hydrolyse wird in einer fortlaufenden Bestimmung genutzt, wobei die Eximeremission bei 470 nm gleichzeitig mit der Monomeremission bei 380 nach Anregung bei 342 nm gemessen wird. 16 zeigt das Reaktionszeitprofil einer durch Rattenphospholipase A₂ katalysierten Hydrolyse der negativ geladenen Liposomen. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Hinzugabe von zellfreier Peritonealflüssigkeit zu 2,5 ml einer thermostatisierten Liposomsuspension, die vor Hinzugabe der PLA₂ 60 s äquilibriert wurde. Das charakteristische Lag-Burst-Verhalten der Phospholipase wird signalisiert durch einen plötzlichen Anstieg der Monomerfluoreszenz bei 380 nm und einer anschließenden Abnahme der Eximerfluoreszenz, wie in dem Einschub in 16 gezeigt.
Die Bestimmungsbedingungen für das in 16 gezeigte PLA₂-Reaktionszeitprofil waren: 0,100 mM unilamellare negativ geladene Liposomen, 100 μl unverdünnte zellfreie Peritonealflüssigkeit, 10 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl.
LITERATURANGABEN

Torchilin, V. P. (1998) Liposomes as carriers of contrast agents for in vivo diagnostics. In: Lasic and Papahadjopoulos (Hrsg.) Medical Applications of Liposomes. Elsevier Science S. 515-543.
Kaiser, E. (1999) Phospholipase A2: its usefulness in laboratory diagnostics. Crit Rev Clin Lab Sci 36(2):65-163.

Claims

Verwendung eines auf Lipiden basierenden Systems, das ein Lipidderivat und einen Marker umfasst, wobei das Lipidderivat (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7 Kohlenstoffatomen und ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen sowie (b) einen hydrophilen Anteil hat, wobei das Lipidderivat außerdem in dem Maße ein Substrat für extrazelluläre PLA₂ ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abspaltbar ist, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt, wodurch ein Lipidderivat, von dem das organische Radikal abgespaltet worden ist, in Form eines Lysolipidderivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei in dem System Lipopolymere oder Glykolipide eingeschlossen sind, so dass auf der Oberfläche des Systems hydrophile Ketten dargestellt sind, zur Darstellung einer diagnostischen Verbindung zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einem örtlichen Anstieg der extrazellulären PLA₂-Aktivität in Säugetiergewebe verknüpft sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ¹¹¹In, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ¹¹C; Gd, Mn, Eisenoxid, Argon, Stickstoff, Iod, Brom und Barium besteht.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipidderivat die folgende Formel hat:
wobei X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂ ausgewählt werden; Y -OC(O)- ist und Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom mit R² verbunden ist; R¹ eine aliphatische Gruppe mit der Formel Y¹Y² ist; R² ein organisches Radikal mit mindestens 7 Kohlenstoffatomen ist; worin Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)n7-(CH=CH)_n8r-(CH₂)_n9 ist und die Summe aus n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; und n2, n4, n6 und n8 unabhängig jeweils Null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist, worin jedes Y¹-Y² unabhängig durch. Halogen oder C_1-4-alkyl substituierbar ist, R³ aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten der Phosphatidsäure und Bioisosteren der Phosphatsäure und Derivaten davon ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R² eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von mindestens 7 Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R² eine Gruppe mit der Formel Y¹Y² ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Prodrug 15 bis 100 Mol-% des gesamten dehydratisierten auf Lipiden basierenden Systems ausmacht.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das auf Lipiden basierende System die Form von Liposomen hat, wobei eine zweite Drogensubstanz eingeschlossen ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker kovalent mit dem Lipidderivat verbunden ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung oder der Zustand, die bzw. der durch ein erhöhtes PLA₂-Niveau in einem Säugetier gekennzeichnet ist, durch bösartiges Gewebe verursacht wird, das zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Gehirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Kolonkrebs, Eierstockkrebs, Lymphoma, Sarcoma und Carcinoma besteht.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das bösartige Gewebe der Primärtumor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das bösartige Gewebe aus metastatischen Zellen besteht, die ihren Ursprung in dem Primärtumor haben.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker mittels eines Verfahrens nachweisbar ist und/oder quantifiziert wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus der Positron-Emissionstomographie (PET), dem Röntgen, der Gamma-Szintigraphie, dem bildgebenden Verfahren der Magnetresonanz (MR), dem bildgebenden Verfahren der Computertomographie (CT) und der Ultraschalldiagnostik besteht.