JPH0714865B2 - リポソ−ム製剤およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリポソーム製剤およびその製造法に関する。

従来の技術 薬物を封入したリポソームを静脈内投与し、体内の限定
された部位に薬物をターゲットさせるDrug Delivery
System（DDS）はすでに一般化されている［ジ・グレゴ
リアディスら著：リセプター・メディエイテッド・ター
ゲッティング・オブ・ドラッグス，プレナム・プレス
（G.Gregoriadis et al.,Receptor−mediated targe
ting of drugs,Plenum Press,New York,p243−266
（1980）］。そのようなDDSにおいてまず第一義的に要
求されるリポソームの特性は静脈内投与されたリポソー
ムがより長時間安定に血液とともに体内を循環すること
である。本来リポソームは、その膜成分である脂質と血
液中のリポプロテインなどの成分とのインターラクショ
ンにより、血液中ではそれほど安定ではない。また、静
脈内投与されたリポソームはその物理的形状や生科学的
特性によって、網内系（RES）により異物として認識さ
れ血中から消失しやすい特性を持つ。そのため静脈内投
与されたリポソームの血中からの消失は期待に反して速
い。従って、いかに血中でのリポソームの安定化をはか
り、RESによる認識を回避させて、リポソームの血中か
らの消失時間を延長させるかが、従来より重要な検討課
題とされてきた。例えば、リポソームの膜組成にコレス
テロールを添加することにより血中でのリポソームの安
定性を増大させる報告がある［シ・ジ・ナイト著，「リ
ポソーム；物理構造から治療的応用まで」（C.G.Knigh
t,“Liposomes;from physical structure to thera
peutic applications",Elsevier,North Holland p31
0−311（1981）］。しかしその添加効果はもともと用い
られているリポソームの膜組成に依存して大きく異なる
といえる［バイオチミカ・バイオフイジカ・アクタ（Bi
ochemica et Biophysica Acta）839,1−８（198
5）］。またこれとは別にリポソームの膜組成にシアー
ル基を有する糖蛋白を用いてリポソームの膜表面をシア
ール酸で被覆することによりRESへの分布が迎えられる
という報告がある［ケミカル・アンド・ファーマシュテ
ィカル・ブラタン（Chem.Pharm.Bull.），34,2979−298
8（1986）］。また、それとは反対にそのようなシアー
ル酸を有する糖脂質がRESのひとつである肝臓によく分
布するという報告もある（Biochemica et Biophysica
Acta,497,760−765（1977））。一方、これまでに硫
酸基を有する糖脂質の一つであるスルファチドを用い
て、薬物の血液脳関門（BBバリアー）透過性をあげて薬
物を脳内にターゲットさせた報告がある（バイオケミス
トリー・インターナショナル（Biochemistry Internat
ional），９267−272（1984）、特開昭57−146710）。
すなわちスルファチドを構成成分として調整したリポソ
ームは、スルファチドを含まないコントロールリポソー
ムでは認められない有意に高いBBバリアー透過性を示し
た。しかしRESへの分布の指標となる肝臓への役物の分
布はスルファチド添加によってかえって増大する傾向を
示した。このようなスルファチドの効果は、膜組成とし
て、不飽和のアシル基を有する天然のホスファチジルコ
リンとコレステロールの組合せにおいてえられたもので
ある。

発明が解決しようとする問題点 リポソーム膜組成を改質することにより、静脈内投与後
の血中からの消失時間を延長させる効果的でかつ実用性
の高い手段はまだ開発せれていない。

問題点を解決するための手段 上記の状況に鑑み、本発明者等は静脈内投与されたリポ
ソームが、より長時間、安定に血液とともに体内に循環
させるための方法をリポソーム膜組成に膜改質成分を添
加して膜を改質することにもとめて、種々検討した結
果、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、１）アシル基が飽和アシル基であ
るリン脂質と硫酸基を有する糖脂質とを膜構成成分とす
るリポソーム内に薬物を封入してなるリポソーム製剤お
よび２）薬物を封入してなるリポソーム製剤の製造に際
し、アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と硫酸基を
有する糖脂質とを用いてリポソーム膜を構成させること
を特徴とするリポソーム製剤の製造法、である。

本発明のリポソーム製剤の製造に用いられるリン脂質と
しては、アシル基が飽和アシル基であるグリセロリン脂
質あるいはスフインゴリン脂質があげられる。本リン脂
質としては、たとえばその２個のアシル基が炭素数８以
上の飽和アルキルであり、少なくともその一方が炭素数
10以上、好ましくは12〜18の飽和アルキル基であるもの
があげられる。さらに両方の飽和アシル基が炭素数12〜
18の飽和アルキルであるものがより好ましく用いられ
る。このようなリン脂質としては、動植物起源のレシチ
ン（例、卵黄レシチン、大豆レシチン）に水素添加して
得られる水添レシチンやラウリル、ミリストイル、パル
ミトイル、ステアロイルなどの組合せからなる半合成に
よりえられるホスファチジルコリン、ホスファジルエタ
ノールアミン、ホスファジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジルイノシトール、スフインゴ
ミエリンなどがあげられる。さらに具体的には、それぞ
れの相転移温度の実測値が（ ）内で示されるような、
ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC,23.9
℃）、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリン
（PMPC,27.2℃）、ミリストイルパルミトイルホスファ
チジルコリン（MPPC,35.3℃）ジパルミトイルホスファ
チジルコリン（DPPC,41.4℃）、ステアロイルパルミト
イルホスファチジルコリン（SPPC,44.0℃）、パルミト
イルステアロイルホスファチジルコリン（PSPC,47.4
℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC,54.
9℃）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミ
ン（DMPE,50℃）、ジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン（DPPE,60℃）、ジステアロイルホスファ
チジルエタノールアミン（DSPE,60℃以上）、ジミリス
トイルホスファチジルセリン（DMPS,38℃）、ジパルミ
トイルホスファチジルセリン（DPPS,51℃）、ジステア
ロイルホスファチジルセリン（DSPS,50℃以上）、ジミ
リストイルホスファチジルグリセロール（DMPG,23
℃）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DP
PG,41℃）、ジステアロイルホスファチジルグリセロー
ル（DSPG,55℃）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン
（DPSM,41℃）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（D
SSM,57℃）などがあげられる。リン脂質は単独で用いて
もよく併用してもよい。

次に、本発明のリポソーム製剤に用いられる硫酸基を有
する糖脂質としては、硫酸エステルを含むスルファトス
フィンゴ糖、例えばスルファチド［相転移温度は34.8℃
および47.3℃、Biochimica et Biophysica Acta,85
9,246−256（1986）］やラクトシルスルファチドなど、
または硫酸エステルを含むスルファトグリセロ糖脂質、
例えばセミノリピッドやスルホグリセロ糖脂質などがあ
げられる。なかでもスルファチドが好ましく用いられ
る。

本発明においては、上記のようなリン脂質および糖脂質
を構成成分としてリポソーム膜を構成させる。

本発明におけるリン脂質と糖脂質の使用割合は、一般に
リン脂質の100重量部に対し糖脂質を約0.5〜50重量部、
好ましくは約２〜20重量部である。

本リポソーム膜は、その相転移温度が一般に約37〜60
℃、好ましくは約40〜55℃を示すように調整される。こ
の相転移温度の調整は、用いるリン脂質および糖脂質の
各種類や配合割合などを適宜に選択することによって行
なうことができる。

一般にリポソーム膜の相転移温度は用いられる個々の脂
質の相転移温度を重量比例配分して求められる理論的相
転移温度に近いので［文献:C.G.Knight,“Liposomes;fr
om physical structure to therapeutic applicat
ions",Elsevier,North Holland p310−311（198
1）］、この関係を用いて、希望する膜の相転移温度と
なるように脂質組成を選ぶことができる。

通常、上記ような使用割合にすることにより膜の相転移
温度を上記に示すような範囲に調整することができ、得
られるリポソーム製剤の血中での消失時間を長くすると
いう本発明の目的が達せられる。本リポソームの調整に
際しては、本発明の目的を阻害しない範囲において、抗
酸化剤等の安定化剤やその他の添加物（例、浸透圧調整
剤としての糖類）を用いてもよい。

本発明はリポソーム膜の構成成分として上記のようなリ
ン脂質および糖脂質を用いることが特徴であって、リポ
ソーム製剤の製法自体には公知の技術が用いられる。例
えば、飽和アシル基を有するリン脂質と硫酸基を有する
糖脂質を含む上記リポソーム膜構成成分をジエチルエー
テル、イソプロピルエーテル、またはクロロホルムなど
の有機溶媒に溶解した後、さらに薬物水溶液を加えて乳
化し、W/O型エマルジョンをえて、40℃以上の温度の減
圧下で有機溶媒を蒸発除去してリバースフェーズエバポ
レイションベシクル（REV）をえることができる。また
上記脂質有機溶媒溶液の有機溶媒を減圧下で蒸発除去し
て薄膜とした後に、薬物溶液を加えて、40℃以上の温度
で混合することによって、マルチラメラーベシクル（ML
V）をえることができる。またさらに、MLVをブローブ型
超音波振盪機で振盪することによってスモールユニラメ
ラーベシクル（SUV）をえることができる。さらに他の
リポソーム製法としてはステイブル プルリラメラー
ベシクル法（特開昭59−00952）や、デハイドレイショ
ン レハイドレイション ベシクル法［C.Kirby eta
l.,バイオテクノロジー（Biotechnology）,Nov.,979（1
984）］が挙げられる。また上記のように硫酸基を有す
る糖脂質を有機溶媒に溶解させるかわりに薬物水溶液に
分散して用いることもできる。さらに、飽和アシル基を
有するリン脂質で予じめ薬物を封入するリポソームを調
整した後に、これを硫酸基を有する糖脂質を含む分散液
に加えて加温下で混合することにより、既にできたリポ
ソーム膜に硫酸基を有する糖脂質を配列させる方法を採
用することもできる。

また脂溶性であって水への溶解度が低い薬物の場合は、
薬物を上記脂質有機溶媒溶液に溶かして薬物を封入する
リポソームをえることができる。このようにしてえられ
る薬物を封入したリポソームは必要とあらば好ましい粒
子サイズに調整することができる。このリポソームはそ
のまま使用してもよいが、例えば、遠心分離、ゲルろ過
あるいは透析によって封入されない遊離の薬物を分離除
去した後に使用するのが好ましい。

次に、本発明において使用される薬物は、DDSの目的で
使用されるものであれば特に限定されず、親水性薬物と
親油性薬物のいずれかあるいは両者の混合物を用いるこ
とができる。たとえばシスプラチンおよびその誘導体
（例、カルボプラチン、スピロプラチン）、アドリヤマ
イシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、アンサ
マイトシン、ブレオマイシン、５−FU、メトトレキセー
トのような抗癌剤、天然型あるいは遺伝子組換え型イン
ターフェロン（α，β、γ）や天然性あるいは遺伝子組
換え型インターロイキン２のようなリンホカイン類、マ
ンガンスーパーオキサイドデスムターゼ（SOD）あるい
はその誘導体であるスーパーオキサイドデスムターゼPE
G（PEG−5000）（特開昭58−16685）のような生理活性
ペプチド類、スルファゼシンのようなベーターラクタム
系抗生物質、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カ
ナマイシンのようなアミノ配糖体系抗生物質、シアノコ
バラミン、ユビキノンのようなビタミン類、アンチモン
酸メグルミンのような抗原虫薬、アルカリホスファター
ゼ等の酵素剤、ヘパリン等の抗血液凝固剤、アモキサノ
クス等の抗アレルギー剤、ムラミルジペプチド、ムラミ
ルトリペプチド、TMD−66（Gann 74（２）,192〜195
（1983）のような免疫賦活剤、プロプラノロル、グルタ
チオンのような一般薬があげられる。

本発明のリポソーム製剤は一般に水剤あるいは乳剤とし
て治療目的に応じて適宜の量を生理食塩水あるいはリン
酸緩衝生理食塩液等に分散して注射あるいは点滴などに
より静脈内に投与して用いられる。

実施例 以下に実施例、試験例および実験例をあげて本発明をさ
らに具体的に説明する。なお、以下に用いられるスルフ
ァチドは牛脳より抽出精製してえられたものである。

相転移温度の測定は示差熱分析法によった。

実施例１ 270mgのDPPC、30mgのDSPCおよび30mgのスルファチドを
１リッターのビーカー内でクロロホルムとイソプロピル
エーテルの1:1の混合溶液70mlに溶解させた。それにあ
らかじめ生理食塩液と同じ浸透圧となるように調整して
おいたpH7の６−カルボキシフルオレッセイン（６−C
F）溶液を10ml加えプローブ型超音波振盪機（Ohtake）
で乳化し、W/O型エマルジョンを作製した。超音波の照
射は50ワットの条件で30秒間、10回くりかえして行っ
た。このようにしてえたエマルジョンをロータリーエバ
ポレーターにかけて、60℃、減圧下で有機溶媒を留去し
REVをえた。エバポレーターの真空度は初めは高く、有
機溶媒の蒸発が進むにつれて真空度をさげて突沸しない
ように調節した。その後さらにREV中に残存する少量の
有機溶媒を窒素ガスをふきつけることにより留去した。
次いで、えられたREVに適当量の生理食塩溶液を加え10m
lとし、1.2ミクロンのフィルター（Acrodisc,Gelman）
でろ過し、透析膜（Spectrapor,Spectrum Medical）を
用いて生理食塩溶液下で24時間透析することにより６−
CFを封入したリポソームをえた。さらに、リポソーム中
に封入された６−CFの量を定量することにより（註
１）、６−CFの封入率は、22.4％であることがわかっ
た。また、このリポソーム膜の相転移温度は42.1℃であ
った。

（註１）リポソーム中の６−CF含量の測定および封入率
の計算 リポソーム0.1mlをリン酸緩衝生理食塩液（PBS、pH7.
2）で100倍希釈後、さらに0.02％トリトンＸ−100を含
有するPBSで100倍希釈し、60℃、30分加温して、リポソ
ームを破壊し、その溶液の蛍光強度を測定（日立、F300
0蛍光スペクトロメーター、励起波長494nm、測定波長51
5nm）することによりリポソーム分散液中の総６−CF量
を求めた。またそれとは別にリポソーム0.1mlをPBSで10
000倍希釈し、その2.5mlを遠心分離型フィルター（Cent
risart、SM13249E、Sartorius）でろ過し、そのろ液の
蛍光強度を測定することにより封入されないでリポソー
ム分散液中に残存する遊離の６−CF量をもとめた。

実施例２ 実施例１で用いられる30mgスルファチドの代わりに15mg
のスルファチドを用いて、実施例１と同じ方法で封入率
が23.3％の６−CFを封入し、相転移温度42.4℃のリポソ
ームをえた。

実施例３ 実施例１で用いられる30mgスルファチドの代わりに45mg
のスルファチドを用いて、実施例１と同じ方法で封入率
が18.9％の６−CFを封入し、相転移温度42.4℃のリポソ
ームをえた。

実施例４ 実施例１で用いられる270mgのDPPCおよび30mgのDSPCの
代わりに、210mgのDPPCおよび90mgのDSPCを用いて、実
施例１と同じ方法で封入率が29.1％の６−CFを封入し、
相転移温度41.7℃のリポソームをえた。

実施例５ 実施例１で用いられるスルファチドをクロロホルム、イ
ソプロピルエーテルの混合溶液に溶解させる代わりに、
そこで用いられる６−CF溶液に分散させて、実施例１と
同じ方法で封入率が18.8％の６−CFを封入し、相転移温
度42.1℃のリポソームをえた。

実施例６ 360mgのDPPC、40mgのDSPCおよび40mgのスルファチドを
１リッタービーカー内で、クロロホルム40mlに溶解させ
た。さらに、ロータリーエバポレーターを用いて有機溶
媒を留去し、ガラス壁に脂質薄膜を形成させた。薄膜中
に残存する微量の有機溶媒は、窒素ガスをふきつけるこ
とにより除去した。このようにして作製した薄膜に、60
℃の温度下で、あらかじめ60℃に保っておいた実施例１
で用いた６−CF溶液を10ml加えて、ボルテックスするこ
とによりMLVをえた。このようにしてえられたMLVに対し
て、実施例１で用いられるプロープ型超音波振盪機を用
いて超音波の照射を50ワットの条件で約10分間行いSUV
をえた。さらに実施例１と同じ方法でろ過および透析を
行い、封入率が5.5％の６−CFを封入し、相転移温度42.
1℃のリポソームをえた。

実施例７ 実施例６で用いられる360mgのDPPCおよび40mgのDSPCの
代わりに、280mgのDPPCおよび120mgのDSPCを用いて、実
施例６と同じ方法で封入率が6.0％の６−CFを封入し、
相転移温度42.1℃のリポソームをえた。

実施例８ 実施例６で用いられる360mgのDPPCおよび40mgのDSPCの
代わりに、400mgのDSPCを用いて、実施例６と同じ方法
で封入率が7.0％の６−CFを封入し、相転移温度52.9℃
のリポソームをえた。

実施例９ 実施例６の方法において、スルファチドを初めからMLV
の膜成分とする代わりに、あらかじめスルファチド抜き
のMLVを実施例６と同じ条件で作製した後、40mgのスル
ファチドを分散する生理食塩液10mlを加え60℃の温度下
で約30分間混合することによりMLV膜にスルファチドが
スパイクしたMLVを作製し、以下実施例６と同じ方法で
封入率が4.5％の６−CFを封入し、相転移温度42.1℃の
リポソームをえた。

実験例１−１ 上記実施例１、２、３、４および６のリポソームに対し
て、スルファチドを含まないリポソームを作製した。ま
た、実施例１の270mgのDPPC、30mgのDSPCおよび30mgの
スルファチドの代わりに、250mgの卵黄レシチン、40mg
のコレステロールおよび40mgのスルファチドを用いて実
施例１と同じ方法でリポソームを作製した。また、さら
にこのリポソームに対してスルファチドを含まないリポ
ソームを作製した。

実験例１−２ 上記実施例１、２、３、４および６で得られたリポソー
ムと、スルファチドを加えないで同様に調整したリポソ
ームの各0.1−0.5mlをラットに静脈内投与することによ
り血中からのリポソームの消失を調べると（註２）、第
１、２、３、４および５図の結果をえた。これらの各図
に示されるように、スルファチドを含むリポソームの１
時間後、２時間後、４時間後および６時間後の血中濃度
はいずれもそれを含まない対照リポソームよりも高く、
それぞれ、平均11.4、14.6、15.2および20.9倍となっ
た。一方、卵黄レシチンおよびコレステロールより調整
したスルファチドを含むリポソームの血中からの消失
は、第６図に示されるように対照リポソームと同様に速
いことがわかった。これらの結果が示すように、リポソ
ーム膜組成として飽和系のアシル基を有するリン脂質と
硫酸基を有する糖脂質を用いる本発明のリポソームの製
法は、リポソームの静脈内投与後の血液中からの消失時
間の延長のために効果的でかつ実用性の高い手段といえ
る。

実験例１−３ 実験例１−２で用いたリポソームをラットに静脈内投与
して１時間後の肝臓中の６−CF濃度を測定しリポソーム
のRESへの分布を調べると（註２）、表１の結果をえ
た。これらの結果は、リポソームの血中からの消失時間
が延長し、肝臓などのRESへの分布が減少したことを示
している。

（註２）６−CFリポソームの血中濃度および肝臓中濃度
の測定方法 尾静脈よりえたヘパリン処理血液0.2mlに10mlのPBSを加
えた血液分散液をえた。さらにこれを遠心分離（3000rp
m,10分）してえられる分離上清5mlにトリトンＸ−100を
0.05ml加えて60−70℃加温下でリポソームを破壊し、放
出される６−CFの蛍光を測定することにより、血中のリ
ポソーム濃度を求めた。また開腹脱血後えられた肝臓を
0.02％トリトンＸ−100を含有するPBSにつけ、100mlの
容積とし組織破壊機（Polytom、Kinematica）で組織を
破壊し、さらに60−70℃で加温処理した後、６−CFがす
べて遊離するホモジネートをえた。このホモジネートは
遠心分離型（50000g、10分）した後20−50倍希釈後0.45
ミクロンのメンブランフィルター（Acrodisk,Gelman）
でろ過後その蛍光を測定することにより肝臓中のリポソ
ーム濃度をもとめた。

実験例１−４ 上記実験例１、２、３および４のリポソームとこれらの
リポソームに対するスルファチドを含まないリポソーム
のPBSで10000倍希釈したものの熱放出性を昇温システン
ムと連結した蛍光測定装置を用いて、リポソームからの
６−CFの放出量を連続的に測定することにより求め、リ
ポソーム膜の相変化（ゲルから液晶への変化）を調べ
た。この放出曲線より求められる熱放出開始温度は表２
の結果となった。

実施例10 実施例１で用いられる６−CF溶液の変わりに、500μg/m
l濃度のシスプラチン（CDDP）生理食塩溶液を用いて、
実施例１と同じ方法でCDDPの封入率が21.5％で、相転移
温度42.1℃のリポソーム製剤をえた。

（註３）リポソーム中のCDDP含量の測定方法 リポソーム0.1mlを0.5mlの生理食塩溶液に分散させ、そ
の2.5mlを連結ならびに加温処理し、えられたリポソー
ムの破壊液約2.5mlをCentrisaltでろ過し、そのろ液0.1
mlにジエチルジチオカルバメート（DDTC）を10％含有す
る0.1N NaOH溶液を2ml加え、30分間室温下で放置後え
られるアダクトをｎ−ヘキサン5mlで抽出して、その抽
出液をHPLC（カラム;Zorbax CN、溶液;n−ヘキサン／
イソプロピルアルコール＝8/2;UV＝250nm）で定量し、
リポソーム分散液の総CDDP量をもとめた。またそれとは
別に、リポソームの生理食塩液の残り約2.5mlをCentris
altでろ過し、同上の条件でアダクトとしてリポソーム
分散中のリポソームに封入されないで存在する遊離のCD
DP量を定量した。

実施例11 実施例10で用いられるCDDP溶液の代わりに６−CFとCDDP
の濃度がそれぞれ25mM、250μg/mlである混合溶液を用
いて、実施例10と同じ方法で６−CFおよびCDDPをそれぞ
れ封入率18.2％および17.6％で同時に封入し、相転移温
度42.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例12 実施例10で用いられる30mgスルファチドの代わりに15mg
のスルファチドを用いて、実施例10と同じ方法で封入率
が18.4％のCDDPを封入し、相転移温度42.4℃のリポソー
ム製剤をえた。

実施例13 実施例11で用いられる30mgスルファチドの代わりに15mg
のスルファチドを用いて、実施例11と同じ方法で６−CF
およびCDDPをそれぞれ封入率16.5％および16.2％で同時
に封入し、相転移温度42.4℃のリポソーム製剤をえた。

実施例14 実施例10で用いられる30mgスルファチドの代わり45mgの
スルファチドを用いて、実施例10と同じ方法で封入率1
9.4％のCDDPを封入し、相転移温度41.7℃のリポソーム
製剤をえた。

実施例15 実施例11で用いられる30mgスルファチドの代わりに45mg
のスルファチドを用いて、実施例11と同じ方法で６−CF
およびCDDPをそれぞれ封入率17.6％および16.8％で同時
に封入し、相転移温度41.7℃のリポソーム製剤をえた。

実施例16 実施例10で用いられ270mgのDPPCおよび30mgのDSPCの代
わりに、210mgのDPPCおよび90mgのDSPCを用いて、実施
例10と同じ方法で封入率23.4％のCDDPを封入し、相転移
温度44.5℃のリポソーム製剤をえた。

実施例17 実施例11で用いられる270mgのDPPCおよび30mgのDSPCの
代わりに、210mgのDPPCおよび90mgのDSPCを用いて、実
施例11と同じ方法で６−CFおよびCDDPをそれぞれ封入率
21.7％および18.1％で同時に封入し、相転移温度44.5℃
のリポソーム製剤をえた。

実施例18 実施例６で用いられる６−CF溶液の代わりCDDP生理食塩
溶液を用いて、実施例10と同じ方法で封入率6.2％のCDD
Pを封入し、相転移温度42.1℃のリポソーム製剤をえ
た。

実施例19 実施例18で用いられるCDDP溶液の代わり６−CFとCDDPの
混合溶液を用いて、実施例11と同じ方法で６−CFおよび
CDDPをそれぞれ封入率5.8％および4.5％で同時に封入
し、相転移温度42.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例20 実施例６で用いられる360mgのDPPCおよび40mgのDSPCの
代わりに、280mgのDPPCおよび120mgのDSPCを用いて、実
施例６と同じ方法で封入率7.4％のCDDPを封入し、相転
移温度44.5℃のリポソーム製剤をえた。

実施例21 実施例20で用いられるCDDP溶液の代わり６−CFとCDDPの
混合溶液を用いて、実施例20と同じ方法で６−CFおよび
CDDPをそれぞれ封入率6.2％および4.9％で同時に封入
し、相転移温度44.5℃のリポソーム製剤をえた。

実験例２−１ 上記実施例11、13、17および19の方法において、スルフ
ァチドを加えないほかは同様の方法によりそれぞれリポ
ソーム製剤を作製した。

実験例２−２ 上記実施例11、13、17および19のリポソーム製剤とこれ
らのリポソームに対応するスルファチドを含まないリポ
ソームの各0.1−0.5mlをラットに静脈内投与して、６時
間までの血中での６−CF濃度を測定することにより血中
からのリポソームの消失を調べると、スルファチドを含
むリポソームの１時間後、２時間後、４時間後および６
時間後の血中濃度はいずれもそれを含まない対照リポソ
ームよりも高く、それぞれ平均8.5、19.7、16.4および2
8.5倍となった。また１時間までの血中でのCDDP濃度を
測定すると（註４）、いずれも６−CFと同程度の濃度を
示し、CDDPが血中で６−CFと共にリポソームに封入され
て存在することを示した。これらの結果が示すように、
リポソーム膜組成として飽和系のアシル基を有するリン
脂質と硫酸基を有する糖脂質を用いる本発明のリポソー
ムの製法は、リポソームの静脈内投与後の血液中からの
消失時間を延長させるために効果的でかつ実用性の高い
手段といえる。

（註４）CDDPの血中濃度の測定方法 尾静脈よりえたヘパリン処理血液0.2mlに2mlのPBSをく
わえた血液分散液をえた。さらにこの遠心分離してえら
れる分離上清1mlに1mlのDDT溶液を加えて前述のCDDPの
定量方法と同様にして血中の総CDDP量を定量した。

実施例22 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わりに308μｇプ
ロテイン/mlのインターロイキン２（IL−２）水溶液
（溶液の種類;25mM酢酸アンモニウム溶液pH6）を用い
て、実施例１と同じ方法で封入率24.4％のIL−２（註
６）を封入し、総転移温度42.1℃のリポソーム製剤をえ
た。なお、リポソーム中の遊離のIL−２は、遠心分離
（Sorvall、分離条件;50000g,30分）で分離した。

（註６）リポソーム中のIL−２含量の測定方法 超遠心分離により遊離のIL−２を除去したIL−２を封入
するリポソームに等量の0.4％トリトンＸ−100水溶液
（V/V）をくわえ、７℃で30分インクベイションするこ
とによりリポソームを破壊し、遊離してくるIL−２また
は、超遠心分離によりえられる上清をグラジエントを用
いたHPLC（カラム;Ultrapore,UV＝210nm）で定量した。
なおHPLCの溶離液としては、アセトニトリル／水（40/6
0V/V）に0.1％のトリフロロ酢酸（V/V）を含む液（Ａ
液）およびアセトニトリル／水（65/35V/V）に0.1％の
トリフロロ酢酸（V/V）を含む液（Ｂ液）を用い、以下
の条件でグラジエントを行った。時間 Ａ液 Ｂ液 ０分 90％ 10％ 20分 ０％ 100％ 25分 ０％ 100％30分 90％ 10％ 流速;0.9ml/分 実施例23 実施例22で用いられるIL−２溶液の代わりに６−CFとIL
−２のそれぞれ25mM、154μｇプロテイン／濃度である
混合溶液を用いて、実施例22と同じ方法で６−CFおよび
IL−２をそれぞれ封入率19.0％および18.5％で同時に封
入し、相転移温度42.1℃のリポソーム製剤をえた。

実験例３−１ 上記実験例23の方法において、スルファチドを加えない
ほかは同様の方法によりリポソームを作成した。

実験例３−２ 上記実施例23のリポソームとこのリポソームに対するス
ルファチドを含まないリポソーム0.1−0.5mlをラットに
静脈内投与して、６時間までの血中での６−CFの濃度を
測定することにより血中からリポソームの消失を調べる
と、スルファチドを含むリポソームの１時間後、２時間
後、４時間後および６時間後の血中濃度はいずれもそれ
を含まない対照リポソームよりも高く、それぞれ平均1
0.9、11.0、15.3および14.7倍となった。これらの結果
が示すように、リポソーム膜組成として飽和系のアシル
基を有するリン脂質と硫酸基を有する糖脂質を用いる本
発明のリポソームの製法は、リポソームの静脈内投与後
の血液中からの消失時間を延長させるために効果的でか
つ実用性の高い手段といえる。

実施例24 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わり、100μ/mlの
濃度のアンサマイトシン生理食塩溶液を用いて、実施１
と同じ方法で、アンサマイトシンを封入し、相転移温度
42.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例25 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わり、5mg/mlの濃
度のメトトレキセート生理食塩溶液を用いて、実施１と
同じ方法で、メトトレキセートを封入し、相転移温度4
2.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例26 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わり、200μg/ml
濃度のマイトマイシンＣ生理食塩溶液を用いて、実施１
と同じ方法で、マイトマイシンＣを封入し、相転移温度
42.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例27 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わり、1mg/mlの濃
度のアドリヤマイシン生理食塩溶液を用いて、実施１と
同じ方法でアドリヤマイシンを封入し、相転移温度42.1
℃のリポソーム製剤をえた。

実施例28 実施例１で用いられる６−CF溶液の代わり、3mg/mlの濃
度のブレオマイシン生理食塩溶液を用いて、実施１と同
じ方法でブレオマイシンを封入し、相転移温度42.1℃の
リポソーム製剤をえた。

発明の効果 本発明のリポソーム製剤は、静脈内投与後、長時間安定
に血液とともに体内を循環し、そのことにより薬物本来
の毒性を緩和するとともに特定の病巣への薬物のターゲ
ット効果を増大させ、薬物の持続的治療効果をたかめる
ために有用である。とりわけ、抗癌剤を封入してなる本
発明のリポソーム製剤は、癌の加温療法時に投与するこ
とによって治療効果の向上が期待でき、この場合にはリ
ポソーム膜の相転移温度が約40〜55℃のものを好ましく
用い得る。

【図面の簡単な説明】

第１、２、３、４および５図は、それぞれ実施例１、
２、３、４および６で得られたリポソーム製剤をラット
に静脈内投与した後の経過時間とリポソーム製剤の血中
濃度との関係を示す。また、同様に第６図は、実験例１
−１の方法で得られたリポソームの血中濃度変化を示
す。各図中、 はスルファチドを加えないで調整したリポソームの場合
の血中濃度の変化を示す。血中濃度は、投与量に対する
百分率を意味し、ラットの全血液量は体重の１割とし
た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と
   硫酸基を有する糖脂質とを膜構成成分とするリポソーム
   内に薬物を封入してなるリポソーム製剤。
2. 【請求項２】薬物を封入してなるリポソーム製剤の製造
   に際し、アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と硫酸
   基を有する糖脂質とを用いてリポソーム膜を構成させる
   ことを特徴とするリポソーム製剤の製造法。