JP2931981B2 - リポソーム製剤およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は薬物を封入してなるリポソーム製剤およびそ
の製造法に関する。

従来の技術 癌の治療法として癌部位を局所的に正常体温より数度
高い温度になるまで加温し（40〜45℃）、癌細胞だけを
特異的に傷害するハイパーサーミア療法が盛んに行われ
るようになっている。この療法においてはそれ単独だけ
ではなく、その十分な効果を期待するために同時に化学
療法を施すことも知られている（Jpn.J.Hyperthermic O
ncol ２.,No.3,1986）。一方、化学療法剤の場合、一般
に正常細胞への副作用が強く投与量の設定が難しいとい
う問題点がある。さらに薬物を封入するリポソーム製剤
において、ハイパーサーミアの温度範囲で内封する薬物
を放出する特徴を持ったいわゆるか熱感受性リポソーム
をハイパーサーミアに用いることにより、少ない薬物投
与量で癌部位に高濃度に薬物を分布させ、そのターゲッ
ティング効果を高めて治療効果を発揮させようという試
みがなされている。この報告としては、例えば、 （１）Yatvin et al.,Science,202,1290（1978） （２）Yatvin et al.,Cancer Res.,41,1602（1981） （３）Bassett et al.,J.Urol.,135,612（1986） があげられる。これらの方法は、静脈内に投与されたリ
ポソームが、血流に乗って癌部位に運ばれてきた時に、
そこで加温依存的にリポソーム膜の相転移変化を起こし
内封薬物を放出し、遊離の薬物を効率よく分布させるこ
とをねらったものである。

発明が解決しようとする課題 上記のように、熱感受性リポソームをハイパーサーミ
アに利用することは、有望なターゲッティング癌治療法
であると考えられる。しかし、そのようなターゲッティ
ング効果は、投与されたリポソームが正常体温でどの程
度安定に血液循環内を還流し、どの程度ハイパーサーミ
アの温度で局所的に薬物を放出するかに依存するもので
ある。ところが、従来より報告されている熱感受性リポ
ソームでは、リポソームとしての安定性や熱放出性等に
問題があり、その効果は十分に期待できないと考えられ
る。例えば、Science,202,1290（1978）に記載のリポソ
ームの場合、ハイパーサーミア温度での薬物の放出量が
小さく、J.Urol.,135,1602（1986）に記載のリポソーム
では、ハイパーサーミア温度よりも低い温度（例えば、
37〜39℃）ですでにある程度の量の薬物を放出してしま
う。このように、従来の方法で得られるリポソームは熱
放出性あるいは安定性に関して解決すべき課題を残して
いる。

すなわち、リポソーム膜の相転移温度がハイパーサー
ミアの温度（40〜45℃）となるように調製され、この温
度以下では高濃度にかつ長時間安定に薬物がリポソーム
内に封入されており、この温度あるいはそれ以上の温度
で、極く短時間に封入薬物を効率よく放出する実用的製
剤はまだ開発されていない。

解決を課題するための手段 上記の状況に鑑み、本発明者等は静脈内投与された薬
物封入リポソームがハイパーサーミアにより加熱された
局所組織内で、その封入薬物を効率よく放出させること
を目的に、リポソーム膜組成の選択、リポソーム内に封
入される薬液の浸透圧の調整、およびリポソーム形態等
の面から種々検討し、本発明を完成したものである。す
なわち本発明は、 （１） 膜の相転移温度が40〜45℃であるリポソーム内
に、温血動物の生体液浸透圧よりも1.2〜2.5倍高張の薬
物含有液を封入してなるリポソーム製剤、 （２） アシル基が飽和アシル基であるリン脂質をリポ
ソーム膜の主構成成分とする上記（１）項記載の製剤、 （３） 薬物が抗腫瘍剤である上記（１）または（２）
項記載の製剤、 （４） リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシクル
である上記（１），（２）または（３）項記載の製剤、 （５） 浸透圧が温血動物の生体液よりも1.2〜2.5倍高
張の薬物含有液を封入し、膜の相転移温度が40〜45℃で
あるリポソームを形成せしめることを特徴とするリポソ
ーム製剤の製造法、 （６） アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を主剤
としてリポソーム膜を構成させる上記（５）項記載の製
造法、 （７） 薬物が抗腫瘍剤である上記（５）または（６）
項記載の製造法および （８） リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシクル
である上記（５），（６）または（７）項記載の製造法
である。

本発明のリポソーム製剤においては、リポソーム膜が
ハイパーサーミアの温度で相転移を引き起こすように、
すなわち膜の相転移温度が、40〜45℃、好ましくは40〜
43℃となるように構成させる。この膜の材料としてアシ
ル基が飽和アシル基である各種のリン脂質（以下、単に
「飽和リン脂質」と略称することがある）を単独あるい
は組合せて用いるのが極めて有利である。例えば、グリ
セロリン脂質の２個のアシル基が炭素数８以上の飽和ア
ルキルであり、少なくともその一方が炭素数10以上、好
ましくは12〜18の飽和アルキル基であるもの、さらに両
方の飽和アシル基が炭素数12〜18の飽和アルキルである
ものがより好ましく用いられる。このようなリン脂質と
しては、動植物起源のレシチン（例、卵黄レシチン、大
豆レシチン）に水素添加して得られる水添レシチンやラ
ウリル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルな
どの組合せからなる全合成または半合成により得られる
ホスファチジルコリンなどがあげられる。とりわけ、全
合成または半合成により得られるホスファチジルコリン
が有利に用いられ、その具体例としては、相転移温度の
実測値が以下の（）内で示されるような、ジミリストイ
ルホスファチジルコリン（DMPC,23.9℃）、パルミトイ
ルミリストイルホスファチジルコリン（PMPC,27.2
℃）、リミストイルパルミトイルホスファチジルコリン
（MPPC,35.3℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリ
ン（DPPC,41,4℃）、ステアロイルパルミトイルホスフ
ァチジルコリン（SPPC,44.0℃）、パルミトイルステア
ロイルホスファチジルコリン（PSPC,47,4℃）、ジステ
アロイルホスファチジルコリン（DSPC,54.9℃）などが
好ましく用いられる。

リポソーム膜の相転移温度は用いられる個々の飽和リ
ン脂質の相転移温度を重量比例配分して求められる相転
移温度に近いので〔文献:C.G.Knight,“Liposomes;from
physical structure to therapeutic applications",E
lsevire,North Holland p310−311（1981）〕、この関
係を用いて、膜の相転移温度が上記の範囲に入るように
飽和リン脂質の組成を選ぶことができる。膜の相転移温
度を上記に示すような範囲に調整することと、後に述べ
るように、内封薬液の浸透圧を特定範囲に調整すること
により、得られるリポソーム製剤がハイパーサーミア温
度（40〜45℃）で膜の相転移を引き起こし、かつ封入さ
れている薬物を効率よく放出するという本発明の目的が
達せられる。

飽和リン脂質の併用例としては、DPPC/DSPCの重量比
が95/5〜70/30の範囲となるように用いるのが、本発明
の目的上、有利であり、さらに好ましくは95/5〜80/20
の範囲で併用するのがよい。

本発明において飽和リン脂質はリポソーム膜の構成成
分中約60重量％以上，好しくは約70重量％以上の量で用
いられる。さらに、リポソーム膜を構成させるに際し
て、40〜45℃の膜相転移温度が得られる範囲内で、上記
に示した飽和リン脂質と共に、各種の添加物、例えば膜
安定化のための抗酸化剤や電荷調整剤としてのガングリ
オシド、スルファチド等の糖脂質やステアロイルメチル
タウリンやオクタデカンスルホン等を少量用いることが
出来る。この相転移温度の調整は、用いる飽和リン脂質
の各種類や配合割合などを適宜に選択することによって
行うことができる。

次に、本発明においてリポソーム内に封入される薬物
含有液は、その浸透圧が温血動物の生体液浸透圧よりも
1.2〜2.5倍高張となるように調整される。この液は、予
じめ水に薬物と浸透圧調整剤とを加え、上記浸透圧とな
るように調整したものを用いるのが有利である。本浸透
圧調整剤としては、水可溶性で温血動物が生理的に許容
しうるものであれば、特に制限はなく用いることができ
る。たとえば、塩類（例、食塩）、糖類（例、ぶどう
糖，マンニット、ソルビット）、アミノ酸類（例、グリ
シン，アスパラギン酸，グルタミン酸）などが好ましく
用いられる。とりわけ、シスプラチン（CDDP）またはそ
の誘導体を封入するリポソーム製剤の場合、食塩および
糖類の混合水溶液が好ましく用いられる。この場合、食
塩はシスプラチンまたはその誘導体の使用量１重量部に
対し40重量部以上となるように用い、かつ糖類を温血動
物の生体液の浸透圧よりも1.2〜2.5倍高くなるように加
えるのが好ましい。このような浸透圧調整剤を用いるこ
とにより、リポソームに封入されたシスプラチンまたは
その誘導体を、保存中、安定に保つことができる。

本発明において使用される薬物は、ハイパーサーミア
と組合せて相乗効果が期待される薬物で、リポソームに
封入してターゲッティング効果をあげることを目的とす
るものが用いられる。この目的からは、抗腫瘍剤が好ま
しい対象薬物である。特に水にある程度以上溶解する薬
物、たとえばオクタール／水間の分配率の対数値が10以
下である薬物に好ましく適用できる。このような薬物の
具体例としては、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチ
ン、テトラプラチン、イプロプラチンなどの金属錯体、
アドリヤマイシン、マイトマイシンＣ（MMC）、アクチ
ノマイシン、アンサマイトシンあるいはその誘導体
（例、９−チオメイタンシン）、ブレオマイシン、Ara
−Ｃ、ダウノマイシンなどの制癌抗生物質、５−FU、メ
トトレキセート、TAC−788〔イソブチル５−フルオロ−
６−（Ｅ）−フルフリリデンアミノオキシ−1,2,3,4,5,
6−ヘキサヒドロ−2,4−ジオキソピリミジン−５−カル
ボキシレート，特開昭59−13780号〕などの代謝きっ抗
剤、BCNU、CCNUなどのアルキル化剤、メルファラン、ミ
トキサントロンなどその他の制癌剤、あるいは天然型あ
るいは遺伝子組換え型インターフェロン（α、β、γ）
や天然型あるいは遺伝子組換え型インターロイキン２の
ようなリンホカイン類があげられる。これらの薬物の中
でも特にハイパーサーミアと組合せて相乗効果が期待さ
れる薬物で、リポソームに封入してターゲッティング効
果の大きい薬物、すなわちHunt等が投与薬剤投与方法と
の関係で標的部位へのより大きなターゲッティング効果
を得るための薬物の条件として生体からの排出（クリア
ランス）が大きいことをあげているように（ファーマシ
ューティカルリサーチ、vol.3,p.333−（1986））、単
に溶液として投与した時にクリアランスの大きい薬物に
対する適用価値が高い。その意味ではCDDPをはじめとす
る白金錯体はハイパーサーミアとの併用効果が十分に期
待でき、またクリアランスの大きい薬物の一つで、特に
望ましく用いられる。

薬物の封入量は、治療効果の目的を達しうるように、
薬効量や１回当りの投与量を考慮して対象薬物に応じて
適宜に選択すればよいが、通常はできるだけ封入量が大
きくなるようにリポソームの調製条件を選択する。

本発明のリポソーム製剤は、上で説明したような膜構
成成分と封入液を用いて調製されるが、その製法自体は
公知の技術を適用しうる。リポソームは、マルチラメラ
ー・ベシクル（multilamellar vesicle,MLV）、スモー
ル・ユニラメラー・ベシクル（small unilamellar vesi
cle,SUV）あるいはラージ・ユニラメラー・ベシクル（l
arge unilamellar vesicle,LUV）の３種類に大きく分け
られ、これらの公知の調製法に従って製造できる。本発
明においては、ハイパーサーミア温度でのターゲッティ
ング効果をより高くあげうるという点で、LUVであるこ
とが最も好ましい。LUVの範囲には逆相蒸発法リポソー
ム（reversephase evaporation vesicle,REV）およびオ
リゴラメラベシクルも含まれる。

LUVの作成法には、一般に（１）REV法、（２）透析法
・データジエンド法あるいは（３）フレンチプレス法の
３つの方法があり、本発明においてはこれらのいずれの
方法も次のようにして適用し得る。

（１）の方法：飽和リン脂質を有機溶媒に溶解した液
（油相）に前記の薬物および浸透圧調整剤を含有する液
（水相）を加えW/Oエマルジョンを調製し、次いで有機
溶媒を揮散させて、ゲルを形成させ、さらに有機溶媒を
蒸散させることにより、本発明のリポソーム製剤が得ら
れる。有機溶媒としては、たとえばジエチルエーテル，
イソプロピルエーテルあるいはクロロホルムが有利に用
いられる。これら有機溶媒は混合して用いることもで
き、例えばクロロホルム１容量部とイソプロピルエーテ
ルを１〜1.5容量部の混合溶液があげられる。有機溶媒
は水相液量に対して少なくとも0.8倍容量を用いるが、
多量に加えるのは好ましくなく、通常は３倍容量までの
範囲である。有機溶媒を過剰に用いることはリポソーム
内に封入される薬液の浸透圧調整を困難にするとともに
リポソームのスケールアップ製法を困難にするからであ
る。

（２）の方法：飽和リン脂質を適当な界面活性剤の存在
下に、薬物および浸透圧調整剤を含有する水相に可溶化
させ、次いでこの液を透析に付し、界面活性剤を徐々に
除去することにより、本発明のリポソーム製剤が得られ
る〔J.Brunner et al.,Biochmi.Biophys.Acta,445,322
（1976）〕。

（３）の方法：飽和リン脂質と薬物および浸透圧調整剤
を含有する水性液とを用いて、常法によりMLVまたはSPL
V（stable plurilamellar vesicle）を調製し、適当な
径を有するフィルターで加圧ろ過することにより、本発
明のリポソーム製剤が得られる〔M.J.Hope et al.,Bioc
hmi.Biophys.Acta,812,55（1985）〕。

リポソーム製法としては、さらにデハイドレイション
レハイドレイション ベシクル法〔C.Kirby et al.,B
iotechnology,Nov.,979（1984）〕等のLUV作成法を利用
することもできる。

このようにして得られるリポソーム製剤は、場合によ
ってはこのまま使用できるが、一般にはリポソーム内に
封入されない遊離の薬物を除去し、使用目的等を考慮し
て適宜の液に分散しておくのが好ましい。遊離の薬物は
リポソーム調製液を透析バック中に入れ、透析すること
により実施できる。

この透析においては、リポソーム調製後、薬物を封入
するリポソームと未封入の薬物を含有する液をホローフ
ァイバーに注入し、次いで透析外液を流すことにより、
未封入の薬物を極めて効率よく除去できる。具体的な方
法としては、ホローファイバー（約25cm,有効膜面積1.5
m²）中に、リポソーム調製液を約150ml/分の速度で注入
し、ホローファイバーにかかる膜圧が０となるように、
透析外液を約500ml/分の速度で流すことにより好ましく
実施できる。ホローファイバーは適宜の数を並列に配す
ることによって、さらに効率を上げ得る。本ホローファ
イバーによる透析法によると、500mlのリポソーム調製
液から25分間の短時間に遊離の薬物を完全に除去するこ
とができる。

透析外液は、遊離の薬物を除去する目的からは単に生
理食塩水であってもよいが、後述するように静脈投与に
よる治療目的に用いる場合は、その投与形態に合うよう
な分散液を透析外液として用いるのが好都合である。こ
の場合、透析外液としてはたとえば前述のような透析圧
調整剤の水溶液を用いることができる。

次に、本発明のリポソームの粒径は一般に0.1〜２μ
ｍの範囲に調整されるが、0.1〜0.5μｍであるとさらに
好ましい。粒径の調整は、リポソームの調製時に、たと
えば前記（１）の方法ではW/Oエマルジョンをホモジナ
イズするときの操作条件によって調整することができ、
また得られたリポソームを適当な径の膜によりろ過を行
なって目的とする粒径のものを選択してもよい。

本発明のリポソーム製剤は封入される薬物の種類に対
応した癌の治療目的に使用できる。例えば、抗腫瘍剤を
封入してなる本リポソーム製剤を、担癌温血動物（兎、
ラット、マウスなどの実験動物；犬，猫などの愛玩動
物；ヒト）のハイパーサーミアにおいて静脈内投与する
ことにより極めて優れた治療効果を示す。この場合、本
製剤は注射あるいは点滴投与が可能なように、常法に従
って適宜の分散液に分散させて投与する。この分散液
は、前述にあげた浸透圧調整剤の水溶液を用いることが
できるが、その浸透圧は温血動物の生体液に等張とする
のが一般的であるが、２倍程度まで高張であってもよ
い。

次に、投与量は、疾患、症状、抗腫瘍剤の種類によっ
て適宜決定し得るが、たとえばCDDPを封入する製剤の場
合、CDDPが成人、一回投与当り約0.5〜30mgとなるよう
に投与するのがよい。投与は、ハイパーサーミアにかけ
てから約５〜15分後から開始するのが最も好ましいが、
これ以前に投与しても特に支障はない。ハイパーサーミ
アは局所ハイパーサーミアであればいかなる形態でもよ
く、40〜45℃に疾患が加温されていればよい。従って、
本リポソーム製剤は、ハイパーサーミアの対象となる固
形癌（例、消火器癌、肺癌、乳癌、泌尿祈願、皮膚癌、
脳腫瘍など）に対する抗腫瘍製剤として有用である。

実施例 以下に実施例、実験例および試験例を示し本発明をさ
らに具体的に説明する。

実施例１ 540mgのDPPCと60mgのDSPCを0.2リッターのビーカー内
でクロロホルムとイソプロピルエーテルの1:1の混合溶
液30mlに溶解した。一方、水にCDDPを溶解し、この液の
浸透圧が生理食塩水の浸透圧の1.9倍となるように食塩
を溶解して、500μg/mlのCDDP含有食塩水溶液を調製し
た。この水溶液30mlを、上記の飽和リン脂質の溶解液に
加えて、乳化機（ポリトロン、キネマチカ）で10分間、
さらにプローブ型超音波振とう機（大岳製作所、日本）
で20分間それぞれ乳化しW/Oエマルジョンを作製した。
このようにして得たエマルジョンを0.5リッターのナス
形フラスコに移し、ロータリーエバポレターにかけて、
60℃、減圧下で有機溶媒を留去しLUVを得た。次いで、
得られたLUVを1.2μｍのフィルター（Acrodisc,Gelma
n）でろ過した。リポソーム内に封入される薬液の浸透
圧が1.9倍となることはこのときのリポソームの浸透圧
を測定することにより確認した（註１）。さらに、得ら
れたLUV分散液を透析膜（Spectropor,Spectrum Medica
l）を用いて生理食塩水で24時間透析することによりリ
ポソーム分散液に含まれる遊離のCDDPを除去し、CDDPが
上記高張液と共に封入されたリポソーム製剤を得た。こ
の時のリポソームのCDDP封入率は26.5％（註２）でリポ
ソームの膜の相転移温度は約41℃であった。

註１ 浸透圧の測定法 リポソームに封入される薬物溶液、リポソームを分散
させるための分散液（透析液）、あるいはリポソームの
放出試験液の浸透圧は、これらの各溶液3mlを浸透圧測
定装置（Osmometer,Amuco）にかけることにより測定し
た。また、実際にリポソーム内に封入された薬液の浸透
圧は有機溶媒を留去して得られる未透析リポソーム3ml
を直接に浸透圧装置にかけることにより求められる未透
析リポソームのリポソーム外液（分散液）の浸透圧と等
しいとして求めた。なおこの測定で浮遊するリポソーム
がリポソーム外液の浸透圧値に影響しないことが脂質添
加実験あるいは既知の浸透圧を持つ透析液でリポソーム
を透析した後の浸透圧測定実験で確認された。

註２ リポソーム内に封入されているCDDPおよびリポソ
ーム外液（分散液）に残存する遊離のCDDPの定量法。

リポソーム内に封入されているCDDP含量は、リポソー
ム0.1mlを1.9mlの生理食塩水と混合し、その混液0.1ml
をさらに24mlの蒸留水と混合し、その混液中のプラチナ
量を原子吸光（Hitachi）で測定することにより求め
た。また、リポソーム外液に存在する浮遊のCDDP量はリ
ポソーム0.1mlを1.9mlの生理食塩水と混合し、その混液
約2mlをセントリザルトフィルター（SM13249 E、Sartri
us）でろ過し、そのろ液を蒸留水で25倍希釈した後その
中に含まれるプラチナ量を原子吸光で測定することによ
り求めた。またCDDPのリポソームへの封入率は、リポソ
ームの作成に用いた薬液濃度に対するリポソーム内に封
入された薬液濃度の百分率として求めた。

註３ リポソーム膜の相転移の測定 リポソーム膜の相転移の測定はリポソームサンプル15
μをサンプラーにとりDSC（Seiko）で測定した（昇温
速度５℃/min）。

実施例２ リポソーム内に封入されるCDDP薬液の浸透圧が生理食
塩水の1.7倍となるようにして、それ以外はすべて実施
例１と同じ方法で、CDDPを封入するリポソーム製剤を得
た。

実施例３ リポソーム内に封入されるCDDP薬液の浸透圧が生理食
塩水の1.5倍となるようにして、それ以外はすべて実施
例１と同じ方法で、CDDPを封入するリポソーム製剤を得
た。

実施例４ リポソーム内に封乳されるCDDP薬液を浸透圧が生理食
塩水の2.1倍となるようにして、それ以外すべて実施例
１と同じ方法で、CDDPを封入するリポソーム製剤を得
た。

実施例５ 実施例１で用いられるクロロホルムとイソプロピルエ
ーテルの1:1の混合溶液の代わりにクロロホルムとイソ
プロピルエーテルの2:3の混合溶液を用いて、それ以外
はすべて実施例１と同じ方法で、CDDPを封入するリポソ
ーム製剤を得た。

実施例６ 実施例２で用いられるクロロホルムとイソプロピルエ
ーテルの1:1の混合溶液30mlの代わりに該溶液60mlを用
いて、それ以外はすべて実施例２と同じ方法で、CDDPを
封入するリポソーム製剤を得た。

実施例７ 実施例２で用いられるクロロホルムとイソプロピルエ
ーテルの1:1の混合溶液30mlの代わりに該溶液24mlを用
いて、それ以外はすべて実施例２と同じ方法で、CDDPを
封入するリポソーム製剤を得た。

実施例８ 4.5gのDPPCと0.5gのDSPを0.5リッターのビーカー内で
クロロホルムとイソプロピルエーテルの1:1の混合溶液2
50mlに溶解した。この溶液に、浸透圧が生理食塩水の浸
透圧の1.9倍となるようにあわかじめ調製しておいた500
μg/mlのCDDP食塩水溶液を250ml加え、乳化機（Polytro
n,Kinematika）で10分間、さらにバス型超音波振とう機
（Laboratory Supplies,New York）で20分間それぞれ乳
化しW/Oエマルジョンを作製した。このようにして得ら
れたエマルジョンを１リッターのナス形フラスコに移し
替えロータリーエバポレターにかけて、以下実施例１と
同様の方法で溶媒留去および透析を行って、CDDPが上記
高張溶液と共に封入されたリポソーム製剤を得た。この
リポソーム膜の相転移温度は約40℃であった。

実施例９ 18gDPPCと2gのDSPCを２リッターのビーカー内でクロ
ロホルムとイソプロピルエーテルの1:1の混合溶液1000m
lに溶解した。この溶液に浸透圧が生理食塩水の浸透圧
の1.9倍となるようにあらかじめ調製しておいた500μg/
mlのCDDP食塩水溶液を1000ml加え軽く混合した後、乳化
機（３リッター用ホモミキサー、特殊機化）で60分間乳
化しW/Oエマルジョンを作製した。このようにして得た
エマルジョンを同じホモミキサーを用いて、60℃減圧下
で有機溶媒を留去することによりLUVを得た。さらに得
られたLUVの一部500mlを人工透析機〔ホローファイバー
旭化成製，日本：約25cm,有効膜面積1.5m²〕中に、約
150ml/分の速度で注入し、透析外液として生理食塩水を
ホローファイバーにかかる膜圧が０となるように、約50
0ml/分の速度で流すことにより、遊離のCDDPを透析除去
し、CDDPが上記高張溶液と共に封入されたリポソーム製
剤を得た。このリポソーム膜の相転移温度は約42℃であ
った 実施例10 実施例９で得られた透析前のリポソーム30mlを生理食
塩水の浸透圧の1.5倍の浸透圧となるように調製した食
塩液を用いて実施例１と同様の方法で透析をし遊離のCD
DPを除去することによりリポソーム製剤を得た。

実施例11 実施例９で得られた透析前のリポソーム30mlを、生理
食塩水の浸透圧の1.9倍の浸透圧となるように調製した
ぶどう糖液を用いて実施例１と同様の方法で透析し、遊
離のCDDPを除去することによりリポソーム製剤を得た。

実施例12 実施例９で得られた透析前のリポソーム30mlを、生理
食塩水の浸透圧の1.9倍の浸透圧となるように生理食塩
水にブドウ糖を加えて調製した食塩ぶどう糖液を用いて
実施例１と同様の方法で透析し、遊離のCDDPを除去する
ことによりリポソーム製剤を得た。

実施例13 実施例１で用いられる540mgのDPPCと60mgのDSPCの代
わりに480mgのDPPCと120mgのDSPCを用いて、それ以外は
実施例１と同じ方法で、CDDPを封入するリポソーム製剤
を得た。この時のリポソーム膜の相転移温度は約41℃で
あった。

実施例14 実施例１で用いられる540mgのDPPCと60mgDSPCの代わ
りに600mgのDPPCと60mgのステアロイルメチルタウリン
ナトリウム（SMT）を用いて、それ以外は実施例１と同
じ方法で、CDDPを封入するリポソーム製剤を得た。この
時のリポソーム膜の相転移温度は約41℃であった。

実施例15 実施例１で用いられる540mgのDPPCと60mgのDSPCの代
わりに600mgのDPPCと60mgのオクタデカンスルホン酸（O
DS）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、CDDP
を封入するリポソーム製剤を得た。この時のリポソーム
膜の相転移温度は約42℃であった。

実施例16 実施例１で用いられる540mgのDPPCと60mgDSPCの代わ
りに540mgのDPPCと60mgのスルファチド（SF）を用い
て、それ以外は実施例１と同じ方法で、CDDPを封入する
リポソーム製剤を得た。この時のリポソーム膜の相転移
温度は約41℃であった。

実施例17 実施例１で用いられる500μg/mlのCDDPの代わりに200
μg/mlの５−FUを用いて、それ以外は実施例１と同じ方
法で、５−FUを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例18 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに200μ
g/mlのTAC−788を用いて、それ以外は実施例１と同じ方
法で、TAC−788を封入するリポソーム製剤を得た。

実施例19 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに50μg
/mlの９−チオメイタンシン（特開昭57−192381号）を
用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、９−チオメ
イタンシンを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例20 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに200μ
g/mlのMMCを用いて、それ以外は実施例１と同じ方法
で、MMCを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例21 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに500μ
g/mlのアクラルビシン（Ara−Ｃ）を用いて、それ以外
は実施例１と同じ方法で、Ara−Ｃを封入するリポソー
ム製剤を得た。

実施例22 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに1mg/m
lのダウノマイシンを用いて、それ以外は実施例１と同
じ方法で、ダウノマイシンを封入するリポソーム製剤を
得た。

実施例23 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに200μ
g/mlのBCNUを用いて、それ以外は実施例１と同じ方法
で、BCNUを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例24 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに200μ
g/mlのCCNUを用いて、それ以外は実施例１と同じ方法
で、CCNUを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例25 実施例１で用いられる500μg/mlCDDPの代わりに308μ
g/mlのインターロイキン２（IL−２）を用いて、それ以
外は実施例１と同じ方法で、IL−２を封入するリポソー
ム製剤を得た。

実施例26 560mgのDPPCと40mgのDSPCを0.2リッターのビーカー内
でクロロホルムとイソプロピルエーテルの1:1の混合液6
0mlに溶解した。一方、30mlの水にCDDP10mg、食塩60mg
およびマンニット1530mgを溶解した。この水溶液30mlを
上記の飽和リン脂質溶液に加えて、実施例１と同様に乳
化、有機溶媒を留去してLUVを得た。次いで実施例１と
同様にLUVを1.2μｍのフィルターで過し浸透圧を測定
すると生理的食塩水の1.8倍であった。このLUVを実施例
１と同様に透析しCDDPを封入するリポソーム製剤を得
た。このリポソーム膜の相転移温度は約42℃であった。

実験例１ 実施例１〜16で得られたリポソーム製剤について、放
出試験液として生理食塩水を用いて熱放出性（註４）を
調べて、表１の結果を得た。すなわち、実施例１〜16の
いずれのリポソーム製剤も39℃ではCDDPをほとんど放出
せず（１％以下）、ハイパーサーミア温度に加温しない
限り安定に薬物をリポソーム内に保持する特性を示し
た。また42℃ではいずれも70％以上のCDDPが放出され、
ハイパーサーミア加温でほとんどの薬物を短時間で放出
するという良好な熱放出性を示した。

註４ リポソームの熱放出試験 リポソーム0.1mlを放出試験液としての生理食塩水あ
るいは種々の浸透圧に調整した食塩水溶液1.9mlに分散
し、39℃あるいは42℃で15分間加温した後のリポソーム
外液（放出試験液）に放出されるCDDP量を註２で述べた
リポソーム外液に存在する遊離のCDDPの定量と同じ方法
で測定し、放出率はリポソーム含量に対する百分率とし
て求めた。

実験例２ 実施例１のサンプルについて、39℃および42℃以下の
温度での熱放出性を調べたところ、37℃で0.0％、38℃
で0.0％、40℃で10.3％、41℃で88.4％、45℃で76.0％
であった。この結果、ハイパーサーミアの温度領域で十
分に熱放出するが、それよりも低い温度では安定に薬物
を封入する特性を示した。また、これとは別に上記のリ
ポソームサンプルを一定流量で細いチュウブ（PE50）に
通し、チュウブの一部分を加熱し、それによって熱放出
されるCDDP量を調べた結果、ハイパーサーミアの温度加
温で数秒以内でほとんどの薬物が放出されることを示
し、ハイパーサーミアによるリポソームからの薬物の放
出は爆発的に起こり、短時間で完結することを示した。

実験例３ リポソームに封入されるCDDP薬液の浸透圧が生理食塩
水の浸透圧の0.6倍、0.8倍および1.0倍（いずれも本発
明のリポソームにおけるよりも低い浸透圧）となるよう
にして、それ以外はすべて実施例１と同じ方法でCDDPを
封入するリポソームを作成した（サンプル１、２、
３）。また、サンプル４として、リポソームに封入され
るCDDP薬液の浸透圧が生理食塩水の浸透圧の3.0倍（本
発明のリポソームにおけるよりも高い浸透圧）および透
析液の浸透圧が2.5倍となるようにしてCDDPを封入する
リポソームを作成した。また、実施例１で用いられる54
0mgのDPPCと60mgDSPの代わりに300mgのDPPCと300mgのDS
PC（相転移温度48℃）あるいは600mgのDSPC（相転移温
度55℃）を用いて、実施例１と同じ方法で、ハイパーサ
ーミアの温度より高い膜相転移温度を有し、CDDPを封入
するリポソームを作成した（サンプル５、６）。これら
のリポソームについて生理食塩水を試験液として、熱放
出性を調べたところ、表２のような結果が得られた。す
なわち、表２のサンプル１、２および３の42℃での放出
率に見られるようにリポソーム内に封入される薬液の浸
透圧が低すぎると、ハイパーサーミアの温度で薬物を十
分に放出しないことを示した。また一方、サンプル４の
38℃での放出率に示されるようにリポソーム内に封入さ
れる薬液の浸透圧が高すぎるとリポソームは不安定とな
り、リポソーム膜の相変化に基づく薬物の放出とは異な
り熱非依存的に薬物の一部を漏出してしまうことを示し
た。また、表２のサンプル５および６の42℃での放出率
に示されるようにリポソームの膜の相転移温度がハイパ
ーサーミアの温度よりも高いと、たとえ封入薬液の浸透
圧がうまく調整されていても熱放出性が得られないこと
を示した。

実験例４ 実施例１および３のリポソームについて放出試験液の
浸透圧を種々に変えて、熱放出性を調べると表３のよう
な結果となった。すなわち、これらの結果はリポソーム
の放出性に及ぼす浸透圧の効果は概ね熱放出試験液の浸
透圧に対するリポソーム内に封入される薬物含有液の浸
透圧の比率（表３に示されるOsm（in）/Osm（out））で
決まることを示した。これは放出試験液の浸透圧が異な
るものの、実験例１で示したように42℃の良好な放出性
（約70％以上）を得るには、リポソーム内に封入される
薬物含有率の浸透圧の、リポソームが実際に熱放出すべ
き生体液の浸透圧（約300Osm）に対する比率が1.2以上
である必要があり、またリポソームの良好な安定性（38
℃では放出しない）を得るためには、その比率は2.5以
下であることが望ましいことを示している。

実験例５ 実施例１および８のリポソームを冷所（約５℃）に３
ケ月保存した後のリポソームから漏出した遊離のCDDPを
測定した結果いずれも２％以下であった。本発明のリポ
ソームは非常に安定であることを示した。

試験例 Meth A担癌マウス（BALB/C,雌マウス,1群５匹，平均
体重20g）に、実施例１で得られたCDDP封入のリポソー
ムを生理食塩水で希釈し、CDDPとして10,20あるいは40
μg/マウス（一匹）となるように静脈投与した。この投
与開始後15分から30分間にわたって、癌部位（側腹皮
下）のみを40〜45℃となるように熱板で加温した。この
投与を１日に１回ずつ２回行なった後、21日間経過後に
脳腫瘍重量を測定した。本リポソーム製剤投与群の平均
腫瘍重量（Ｔ）と無処置群の平均腫瘍重量の比（T/C）
を測定し、第１図の結果を得た。図中、−●−は加温し
て本発明のリポソーム製剤を投与した群、…○…は加温
せずに単にCDDPを投与した群、…●…は非加温下に本発
明のリポソーム製剤を投与した群、または○は加温して
CDDP水溶液を投与した群についての各測定結果を示す。

この図から明らかなように、本発明のリポソーム製剤
を加温下に投与することにより、顕著な抗腫瘍効果が得
られた。

本発明の作用と効果 本発明のリポソーム製剤は、膜の相転移温度が40〜45
℃でかつリポソームに封入される薬物含有液の浸透圧が
温血動物の生体液よりも1.2〜2.5倍高張という点が特徴
である。抗腫瘍剤を封入せしめた本発明のリポソーム製
剤は、40〜45℃で極めて高い薬物放出性を示し、ハイパ
ーサーミア療法と組合せて顕著な抗腫瘍効果が得られ
る。

【図面の簡単な説明】 第１図は、試験例においてCDDPを封入する本発明のリポ
ソーム製剤をマウスに投与したときの抗腫瘍効果を対照
群と比較して示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＢｉＯＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ. 20，Ｎｏ．12，ｐｐ．3462−3467 （1981) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 9/127 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】膜の相転移温度が40〜45℃であるリポソー
   ム内に、温血動物の生体液浸透圧よりも1.2〜2.5倍高張
   の薬物含有液を封入してなるリポソーム製剤。
2. 【請求項２】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を
   リポソーム膜の主構成成分とする請求項（１）記載の製
   剤。
3. 【請求項３】薬物が抗腫瘍剤である請求項（１）または
   （２）記載の製剤。
4. 【請求項４】リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシ
   クルである請求項（１），（２）または（３）記載の製
   剤。
5. 【請求項５】浸透圧が温血動物の生体液よりも1.2〜2.5
   倍高張の薬物含有液を封入し、膜の相転移温度が40〜45
   ℃であるリポソームを形成せしめることを特徴とするリ
   ポソーム製剤の製造法。
6. 【請求項６】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を
   主剤としてリポソーム膜を構成させる請求項（５）記載
   の製造法。
7. 【請求項７】薬物が抗腫瘍剤である請求項（５）または
   （６）記載の製造法。
8. 【請求項８】リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシ
   クルである請求項（５），（６）または（７）記載の製
   造法。