JPH021404A - リポソーム製剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は薬物を封入してなるリポソーム製剤およびその
製造法に関する。

従来の技術 癌の治療法として癌部位を局所的に正常体温より数度高
い温度になるまで加温しく４０〜４５℃）、癌細胞だけ
を特異的に傷害するハイパーサーミア療法が盛んに行わ
れるようになっている。この療法においてはそれ単独だ
けではなく、その十分な効用を期待するために同時に化
学療法を施すことも知られている（　Ｊｐｎ、　Ｊ、　
Ｉｌｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ　　Ｏｎｃｏｌ２、、Ｎｏ
、　３．　Ｉ　９８６　）。一方、化学療法剤の場合、
一般に正常細胞への副作用か強く投与■の設定が難しい
という問題点がある。さらに薬物を封入するリポソーム
製剤において、ハイパーサーミアのｔ晶度範囲で内封す
る薬物を放出する特徴を持ったいわゆる熱感受性リポソ
ームをハイパーサーミアに用いることにより、少ない薬
物投与量で癌部位に高濃度に薬物を分布させ、そのター
ゲツティング効果を高めて治療効果を発揮させようとい
う試みがなされている。この報告としては、例えば、（
１）　Ｙａｔｖｉｎ　ｅＬ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、
　２０２．１２９０（１９７ｇ）（２）　Ｙａｔｖｉｎ
　ｅｉａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４１．　１
６０２（１９８１）（３）　Ｂａ５ｓｅｔｔ　ｅＬ　ａ
ｔ、、　Ｊ、　Ｕｒｏｌ、、　　１３５．６１２（１９
８６）があげられる。これらの方法は、静脈内に投与さ
れたリポソームか、血流に乗って癌部位に運ばれてきた
時に、そこで加温依存的にリポソーム膜の相転移変化を
起こし内封薬物を放出し、遊離の薬物を効率よく分布さ
せることをねらったものである。

上記のように、熱感受性リポソームをハイパーサーミア
に利用することは、有望なターゲツティング癌治療法で
あると考えられる。しかし、そのようなターゲツティン
グ効果は、投与されたリポソームか正常体温でどの程度
安定に血液循環内゛を還流し、どの程度ハイパーサーミ
アの温度で局所的に薬物を放出するかに依存するもので
ある。ところが、従来より報告されている熱感受性リポ
ソームでは、リポソームとしての安定性や熱放出性笠に
問題かあり、その効果は十分に期待てきないと考えられ
る。例えば、５ｃｉｅｎｃｅ、　２０２．１２９０（１
９７８）に記載のリポソームの場合、ハイパーサーミア
温度での薬物の放出量が小さく、Ｊ、　Ｕｒｏ＋、、１
３５゜１６０２（１９８６）に記載のリポソームでは、
ハイパーサーミア温度よりも低い温度（例えば、３７〜
３９’Ｃ）ですでにある程度の量の薬物を放出してしま
う。このように、従来の方法で得られるリボン−１、は
熱放出性あるいは安定性に関して解決すべき課題を残し
ている。

すなわら、リポソーム膜の相転移を温度がハイパーサー
ミアの温度（４０〜４５６Ｃ）となるように調製され、
この温度以下では高濃度にかつ長時間安定に薬物かリポ
ソーム内に封入されており、この温度あるいはそれ以上
の温度で、極く短時間に封入薬物を効率よ（放出する実
用的製剤はまだ開発されていない。

課題を解決するための手段 上記の状況に鑑み、本発明者等は静脈［ノイ投与された
薬物封入リポソームがハイパーサーミアにより加熱され
た局所組織内で、その封入薬物を効率よく放出させるこ
とを目的に、リポソーム膜組成の選択、リポソーム内に
封入される薬液の浸透圧の調整、およびリポソーム形態
等の面から種々検討し、本発明を完成したものである。

すなわち本発明は、 （１）膜の相転移温度が４０〜４５℃であるリポソーム
内に、温血動物の生体液浸透圧よりも１．２〜２，５倍
高張の薬物含有液を封入してなるリポソーム製剤、 （２）　アシル基が飽和アシル基であるリン脂質をリポ
ソーム膜の主構成成分とする上記（１）項記載の製剤、 （３）薬物が抗腫瘍剤である上記（１）または（２）項
記載の製剤、 （４）　　リポソームがラージ・ユニラメラ−・ベンク
ルである上記（１）、（２）または（３）項記載の製剤
、 （５）浸透圧か〆晶１１■動物の生体液よりも１２〜２
．５倍高張の薬物含有液を封入し、膜の相転移温度が１
１０〜４５℃であるリポソームを形成せしめることを特
徴とするリポソーム製剤の製造法、（６）　アシル基か
飽和アシル基であるリン脂質を主剤としてリポソーム膜
を構成させる上記（５）項記載の製造法、 （７）薬物か抗腫瘍剤である上記（５）または（６）項
記載の製造法および （８）　　リポソームがラージ・ユニラメラ−・ベンク
ルである上記（５）、（６）または（７）項記載の製造
法である。

本発明のリポソーム・シソ剤においては、リボンーム膜
がハイパーサーミアの温度で相転移を引き起こすように
、すなわち膜の相転移メ、υ度が、４０〜４５℃１好ま
しくは４０〜４３℃となるように構成させる。この膜の
材料としてアシル基が飽和アシル基である各種のリン脂
質（以下、単に「飽和リン脂質」と略称することがある
）を単独あるいは組合せて用いるのか極めて有利である
。例えば、グＪセロリン脂質の２個のアシル基が炭素数
８以上の飽和アルキルであり、少なくともその一方か炭
素数１０以上、好ましくは１２〜１８の飽和アルキル基
であるもの、さらに両方の飽和アシル基か炭素数１２’
−１８の飽和アルキルであるものかより好ましく用いら
れる。このようなリン脂質としては、動植物起源のレシ
チン（例、卵黄レシチン、大豆レシチン）に水素添加し
て得られる水添レシチンやラウリル、ミリストイル、バ
ルミトイル、ステアロイルなどの組合せからなる全合成
または半合成により得られるホスファチジルコリンなと
があけられる。とりわけ、全合成または半合成により得
られるホスファチジルコリンが有＋ＩＩに用いられ、そ
の具体例としては、相転移温度の実測値が以下の（）内
で示されるような、ジミリストイルホスファチンルコリ
ン（ＤＭＰＣ，２３，９℃）、バルミトイルミリストイ
ルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ，２７，２℃）、ミ
リストイルバルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰ
Ｃ，３５，３℃）、／バルミトイルホスファチジルコリ
ン（ＤＰＰＣ。

４１．４℃）、ステアロイルバルミトイルホスファチジ
ルコリン（ＳＰＰＣ，４４，，０℃）、バルミトイルス
テアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ。

４７．４℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（
ＤＳＰＣ，５／１．９℃，）などが好ましく用いられる
。

リポソーム膜の相転移温度は用いられる個々の飽和リン
脂質の相転移温度を重量比例配分して求められる＋１１
転移を副文に近いのて〔文献：　Ｃ，Ｇ。

Ｋｎｉｇｈｔ、　”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；　ｆｒｏｍ　
ｐｈｙｓｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏ　　　ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃ　　　ａｐｐｌｉｃａＬｉｏｎｓ　
　、　　Ｅｌｓｃｖｉｒｅ。

Ｎｏｒｔｈ　　ｌ１ｏｌｌａｎｄ　　ｐ３１０−３１１
　（１９８１））　、この関係を用いて、膜の＋１転移
温度が上記の範囲に入るように飽和リン脂質の組成を選
ぶことができる。膜の相転移温度を上記に示すような範
囲に調整することと、後に述べるように、内封薬液の浸
透圧を特定範囲に調整することにより、得られるリポソ
ーム製剤がハイパーサーミア温度（４０〜４５℃）で膜
の相転移を引き起こし、かつ封入されている薬物を効率
よく放出するという本発明の目的が達せられる。

飽和リン脂質の併用例としては、Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｄｓ
ｐｃの重量比が９５１５〜７０／３０の範囲となるよう
に用いるのが、本発明の目的上、有利であり、さらに好
ましくは９５１５〜８０／２０の範囲で併用するのがよ
い。

本発明において飽和リン脂質はリポソーム膜の構成成分
中約６０重■％以上、好ましくは約７０重量％以上の量
で用いられる。さらに、リポソーム膜を構成させるに際
して、４０〜４５℃の膜相転移諷度が得られる範囲内で
、上記に示した飽和リン脂質と共に、各種の添加物、例
えば膜安定化のための抗酸化剤や電荷１週整剤としての
ガングリオンド、スルファチド等の糖脂質やステアロイ
ルメチルタウリンやオクタデカンスルホン等を少■用い
ることか出来る。この相転移温度の調整は、用いる飽和
リン脂質の各種類や配合割合などを適宜に選択すること
によって行うことができる。

次に、本発明においてリポソーム内に封入される薬物含
有液は、その浸透圧が温血動物の生体液浸透圧よりも１
．２〜２，５倍高張となるように調整される。この液は
、予じめ水に薬物と浸透圧調整剤とを加え、上記浸透圧
となるように調整したものを用いるのか有利である。本
浸透圧調整剤としては、水可溶性で温血動物が生理的に
許容しうるちのであれば、特に制限なく用いることかで
きる。たとえば、塩類（例、食塩）、糖類（例、ぶどつ
糖、マンニット、ソルピｙ＋−）、アミノ酸ｍ（例、グ
リンン、アスパラギン酸、グルタミン酸）などが好まし
く用いられる。とりわけ、シスプラチン（ＣＩ）ＤＩ）
）またはその誘導体を封入するリポソーム製剤の場合、
食塩および糖類の混合水溶液が好ましく用いられる。こ
の場合、食塩はシスプラチンまたはその誘導体の使用量
１重量部に対し４０重量部以上となるように用い、かつ
糖類を温血動物の生体液の浸透圧よりも１．２〜２．５
倍高くなるように加えるのが好ましい。このような浸透
圧調整剤を用いることにより、リポソームに封入された
シスプラチンまたはその誘導体を、保存中、安定に（呆
つことかできる。

本発明において使用される薬物は、ハイパーサーミアと
組合せて相乗効果か期待される薬物で、リポソームに封
入してターゲツティング効果をあげることを目的とする
ものが用いられる。この目的からは、抗腫瘍剤が好まし
い対象Ａｑ物である。

特に水にある程度以上溶解する薬物、たとえばオフター
ル／水間の分配率の対数値かｌＯ以下である薬物に好ま
しく適用できる。このような薬物の具体例としては、シ
スプラチン（ＣＤＤＰ）、カルポプラチン、テトラプラ
チン、イプロプラチンなどの金属錯体、アトリヤマイシ
ン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、アトリヤマイシン、
アンサマイトシンあるいはその誘導体（例、９−チオメ
イタン／ン）、プレオマイシン、Ａｒａ　　Ｃｓタウノ
マインンなどの制癌抗生物質、５−ＦＵ、メトトレキセ
ート、′ｌ゛ＡＣ−７８８〔イソブチル５−フルオロ−
６−（Ｅ）−メルフリリデンアミノオキシ−１゜２．３
，４，５．６−へキサヒドロ−２，４−ジオキソピリミ
ジン−５−カルホキシレート、特開昭５１−１３７８０
号〕などの代謝きっ抗剤、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵなどのア
ルキル化剤、メルフアラン、ミ！・キサントロンなどの
その他の制癌剤、あるいは天然型あるいは遺伝子組換え
型インターフェロン（α、β、γ）や天然型あるいは遺
伝子組換え型インターロイキン２のようなリンホカイン
類があげられる。これらの薬物の中でも特にハイパーサ
ーミアと組合せて相乗効果が期待される薬物で、ノポソ
ームに封入してターゲツティング効果の大きい薬物、す
なわちＩＩ　ｕ　ｎ　を等が投与薬剤投与方法との関係
で標的部位へのより大きなターゲツティング効果を得る
ための薬物の条件として生体からの排出（クリアランス
）が大きいことをあげているように（ファーマシューテ
ィ力ルリサーチ、ｖｏｌ。

３　、　ｐ、　３３３−＜１９８６乃、単に溶液として
投与した時にクリアランスの大きい薬物に対する適用価
値が高い。その意味ではＣＤＤＰをはじめとする白金錯
体はハイパーサーミアとの併用効果が十分に期待でき、
またクリアランスの大きい薬物の一つで、特に望ましく
用いられる。

薬物の封入量は、治療効果の目的を達しうるように、薬
効量や１回当りの投与量を考慮して対象薬物に応じて適
宜に選択すればよいが、通常はできるだけ封入量が大き
くなるようにリポソームの調製条件を選択する。

本発明のリポソーム製剤は、上で説明したような膜構成
成分と封入液を用いて調製されるが、その製法自体は公
知の技術を適用しうる。リポソームは、マルチラメラ−
・ベシクル（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌ
ｅ、　　Ｍ　Ｌ　Ｖ　）、スモール・ユニラメラ−・ベ
シクル（ｓｍａｌｌ　　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　　ｖ
ｅｓｉｃｌｅ、　　５ＵＶ）あるいはラージ・ユニラメ
ラー・ベシクル（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｎｅｌｌａｒ　
　ｖｅｓｉｃｌｅ、　　Ｌ　Ｕ　Ｖ　）の３種類に大き
く分けられ、これらの公知の調製法に従って製造できる
。本発明においては、ハイパーサーミア温度でのターゲ
ツティング効果をより高くあげうるという点で、ＬＵＶ
であることが最も好ましい。

ＬＵＶの範囲には逆相蒸発法リポソーム（ｒｅｖｅｒｓ
ｅ−ｐｈａＳｅ　　ｅｖａｐｏｒａＬｉｏｎ　　ｖｅｓ
ｉｃｌｅ、　　ＲＥＶ）およびオリゴラメラベシクルも
含まれる。

ＬＵＶの作成法には、一般に（１）ＲＥＶ法、（２）透
析法・デタージエント法あるいは（３）フレンチプレス
法の３つの方法かあり、本発明においてはこれらのいず
れの方法も次のようにして適用し得る。

（１）の方法：飽和リン脂質を有機溶媒に溶解した’ｔ
ｅｌ　（油相）に前記の薬物および浸透圧調整剤を含有
する液（水相）を加えＷ１０エマルジョンを調製し、次
いで有機溶媒を揮散させて、ゲルを形成させ、さらに有
機溶媒を蒸散させることにより、本発明のリポソーム製
剤か得られる。有機溶媒としては、たとえばジエチルエ
ーテル、インフロビルエーテルあるいはクロロホルムか
有利に用いられる。これら有機溶媒は混合して用いるこ
ともてき、例えばクロロホルム１容量部とイソプロピル
エーテルを１−１．５容０を部の混合溶液かあげられる
。有機溶媒は水相液量に対して少なくとも０８倍容量を
用いるが、多量に加えるのは好ましくなく、通常は３倍
容量までの範囲である。有機溶媒を過剰に用いることは
リポソーム内に封入される薬液の浸透圧調整を困難にす
るとともにリポソームのスケールアンプ製法を困難にす
るからである。

（２）の方法：　飽和リン脂質を適当な界面活性剤の存
在下に、薬物および浸透圧調整剤を含有する水相に可溶
化させ、次いでこの液を透析に付し、界面活性剤を徐々
に除去することにより、本発明のリポソーム製剤が得ら
れる（Ｊ、　Ｂｒｕｎｎｅｒ　ａｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｍｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡｃＬａ、　　
４４５．　３２２（１９７６））（３）の方法：　飽和
リン脂質と薬物および浸透圧調整剤を含有する水性液と
を用いて、常法によりＭＬＶまたはＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　（
ｓｔａｂｌｅ　　ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉ
ｃｌｅ）を調製し、適当な径を有するフィルターで加圧
ろ過することにより、本発明のリポソーム製剤か得られ
る［Ｍ、　Ｊ、　ｌ１ｏｐｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｍｉ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　ＡｃＬａ、　　８１２．　５５（
１９８５）］　。

リポソーム製法としては、ざらにデノ）イドレインヨン
　レバイドレイジョン　ベシクル法〔ＣＫｉｒｂｙ　ｃ
ｔ　ａｌ８．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｎｏｖ
、　、　９７９（１９８４））等のＬＵＶ作成法を利用
することもできる。

このようにして得られるリポソーム製剤は、場合によっ
てはこのまま使用できるが、一般にはリポソーム内に封
入されない遊離の薬物を除去し、使用目的等を考慮して
適宜の液に分散しておくのが好ましい。遊離の薬物はリ
ポソーム調製液を透析ハ、り中に入れ、透析することに
より実施できる。

この透析においては、リポソーム調製後、薬物を封入す
るリポソームと未封入の薬物を含有する液をホローファ
イバーに注入し、次いで透析外液を流すことにより、未
封入の薬物を極めて効率よく除去できる。具体的な方法
としては、ホローファイバー（約２５ｃｍ、有効膜面積
１．５ｍつ中に、リポソーム調製液を約１５Ｍ！／分の
速度で注入し、ホローファイバーにかかる膜圧が０とな
るように、透析外液を約５００＋Ｊ／分の速度で流すこ
とにより好まし〈実施できる。ホローファイバーは適宜
の故を並列に配することによって、さらに効率を上げ得
る。本ホローファイバーによる透析法によると、５００
Ｍ！、のリポソーム調製液から２５分間の短時間に遊離
の薬物を完全に除去することができる。

透析外液は、遊離の薬物、を除去する目的からは単に生
理食塩水であってもよいが、後述するように静脈投与に
よる治療目的に用いる場合は、その投与形態に合うよう
な分散液を透析外液として用いるのが好都合である。こ
の場合、透析外液としてはたとえば前述のような浸透圧
調整剤の水溶液を用いることができる。

次に、本発明のリポソームの粒径は一般に０．１〜２μ
ｍの範囲に調整されるか、０．１〜０．５μｍであると
さらに好ましい。粒径の調整は、リポソームの、割裂時
に、たとえば前記（１）の方法ではＷ１０エマルジョン
をホモジナイズするときの操作条件によって調整するこ
とかでき、また得られたりポソームを適当な径の膜によ
りろ過を行なって目的とする粒径のものを選択してもよ
い。

本発明のリポソーム製剤は封入される薬物の種類に対応
した癌の治療目的に使用できる。例えば、抗腫瘍剤を封
入してなる本リポソーム製剤を、担癌温血動物（兎、ラ
ット、マウスなどの実験動物；犬、猫などの愛玩動物：
ヒト）のハイパーサーミアにおいて静脈内投与すること
により極めて優れた治療効果を示す。この場合、本製剤
は注射あるいは点滴投与が可能なように、常法に従って
適宜の分散液に分散させて投与する。この分散液は、前
述にあげた浸透圧調整剤の水溶液を用いることができる
が、その浸透圧は温血動物の生体液に等張とするのが一
般的であるが、２倍程度まで高張であってもよい。

次に、投与量は、疾患、症状、抗腫瘍剤の種類によって
適宜決定し得るが、たとえばＣＤＤＰを封入する製剤の
場合、ＣＤＤＰか成人、１回投与当り約０５〜３０ｍｇ
となるように投与するのがヨイ。投与は、ハイパーサー
ミアにかけてから約５〜１５分後から開始するのが最も
好ましいが、これ以前に投与しても特に支障はない。ノ
１イパーサーミアは局所ハイパーサーミアであればいか
なる形態でもよく、４０〜４５℃に患部か加温されてい
ればよい。従って、本リポソーム製剤は、ハイパーサー
ミアの対象となる固形癌（例、消化２ｇ癌、肺癌、乳癌
、泌尿器癌、皮膚癌、脳腫瘍など）に対する抗腫瘍製剤
として有用である。

火朋週 以下に実施例、実験例および試験例を示し本発明をさら
に具体的に説明する。

実施例１ ５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇのＤ　Ｓ　Ｉ）　Ｃを
０．２リツターのビーカー内でクロロホルムとイソプロ
ピルエーテルのＰＩの！　６　溶ｉ＆　３０　ｔｔｄｌ
に溶解した。一方、水にＣＤＤＰを溶解し、この液の浸
透圧が生理食塩水の浸透圧の１．９倍となるように食塩
を溶解して、５００μｇ／ｒＪのＣＤＤＰ含有食塩水溶
液を調製した。この水溶液３０成を、上記の飽和リン脂
質の溶解液に加えて、乳化機（ポリトロン、キ不マチカ
）で１０分間、さらにプローブ４（ｙ４超音波振とう機
（大岳製作所、日本）で２０分間それぞれ乳化しＷ１０
エマルンヨンを作製した。このようにして得たエマルシ
コンを０．５リツターのナス形フラスコに移し、ロータ
ノーエバポレターにかけて、６０’Ｃ１減圧下で有（幾
溶媒を留去しＬＵＶを得た。次いて、得られたＬ　Ｕ　
Ｖを１．２μｍのフィルター（ＡｃｒｏｄｉｓｃＧｅｌ
ｍａｎ）でろ過した。リポソーム内に封入される、ｌｌ
ｉ！液の浸透圧が１．９　ｔ＝となることはこのときの
Ｊポソームの浸ノｈ圧を測定することにより確認した（
、ｉ′Ｅｌ　）。さらに、得られたＬ　Ｕ　Ｖ分１１り
液を透析膜（ＳｐｃｃＬｒｏｐｏｒ、　　Ｓｐｅｃｔｒ
ｕｍ　　Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて生理食塩水で２４時
間Ｊｈ析することによりリポソーム分散液に含まれる遊
離のＣＤ　Ｄ　Ｉ）を除去し、ＣＤ　Ｉ）　Ｐか上記高
張液と共に封入されたリポソーム製剤を得た。この時の
リボ゛／−ムのＣＤＤＰ封入率は２６．５％（註２）で
リポソームの膜の相転移温度は約４ピＣであった。

註ｌ　浸透圧の測定法 リポソームに封入される薬物溶液、リポソームを分散さ
せるための分散液（透析液）、あるいはリポソームの放
出試験液の浸透圧は、これらの各溶液３滅を浸透圧測定
装置（Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ、　Ａｍｕｃｏ）にかけるこ
とにより測定した。また、実際にリポソーム内に封入さ
れた薬液の浸透圧は有機溶媒を留去して得られる未透析
リポソーム３滅を直接に浸透圧装置にかけることにより
求められる未透析リポソームのリポソーム外液（分散液
）の浸透圧と等しいとして求めた。なおこの測定で浮遊
するリポソームがリポソーム外液の浸透圧値に影響しな
いことが脂質添加実験あるいは既知の浸透圧を持つ透析
液でリポソームを透析した後の浸透圧測定実験で確認さ
れた。

註２　リポソーム内に封入されているＣ　１．）　Ｄ　
Ｐおよびリポソーム外液（分散液）に残存する遊離のＣ
ＤＤＰの定量法。

リポソーム内に封入されているＣＤＤＩ）ｉＱは、Ｊボ
ソーム０．１１ｎＩｌをＩ　、　９　ｈａの生理食塩水
と混合し、その混液０．１旋をさらに２４成の蒸留水と
混合し、その混液中のプラチナ量を原子吸光（１１ｉＬ
ａｃｈｉ）で測定することにより求めた。また、リポソ
ーム外液に（ｊ在する１７−遊のＣＩ）　Ｄ　Ｐ　ｌは
リポソーム０．１　ｒＪ７ｉ−１、９旋の生理食塩水と
混合し、そのｌ１％’ｒｌｌ約２蔵をセントリザルトフ
ィルター（３Ｍ１３２４９　Ｅ、　５ａｒｔｒｉｕｓ）
でろ過し、そのろ液を蒸留水で２５倍希釈した後その中
に含まれるプラチナ量を原子吸光で測定することにより
求めた。またＣＤ　Ｄ　Ｉ−）のリポソームへの封入率
は、リポソームの作成に用いた薬液、農度に対するリポ
ソーム内に封入された薬液濃度の百分率として求めた。

註３　リポソーム膜の１回転移の測定 Ｊボソーム膜の＋１転移の１ｌｔｌｌ定はリポソームサ
ンプル１５μＱをサンプラーにとりＤ　Ｓ　Ｃ（Ｓｅｉ
ｋｏ）て測定した（昇１晶速度５℃／ｍ１ｎ）。

実施例２ Ｊポソーム内に封入されるＣ　Ｄ　Ｉ）　ｌ）・側皮の
浸透１Ｆか生理食塩水の１７倍となるようにして、それ
以外はすべて実施例１と同じ方法で、ＣＤ　Ｉ）　Ｐを
封入するりポノームル２剤を得た。

実施例３ リポソーム内に封入されるＣＤＤＰ薬液の浸透圧が生理
食塩水の１．５倍となるようにして、それ以外はすへて
実施例１と同じ方法で、ＣＤＤＰを封入するリポソーム
製剤を得た。

実施例４ リポソーム内に封入されるＣＤＤＰ薬液の浸透圧か生理
食塩水の２．１倍となるようにして、それ以外はすべて
実施例１と同じ方法で、ＣＤＤＰを封入するリポソーム
製剤を得た。

実施例５ 実施例１で用いられるクロロホルムとイソプロピルエー
テルの１１の混合溶液の代わりにクロロホルムとイソプ
ロピルエーテルの２６３の混合溶液を用いて、それ以外
はすべて実施例１と同じ方法で、ＣＤＤＰを封入するリ
ポソーム製剤を得た。

実施例６ 実施例２で用いられるクロロホルムとイソプロピルエー
テルのｌ＝１の混合溶液３０旋の代わりに該溶液６０威
を用いて、それ以外はすべて実施例２と同じ方法で、Ｃ
ＤＤ’Ｐを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例７ 実施例２て用いられるクロロホルムとイソプロピルエー
テルの１＝１の混合溶液３０滅の代わりに該溶液２４旋
を用いて、それ以外はすべて実施例２と同じ方法で、Ｃ
ＤＤＰを封入するリポソーム・製剤を得た。

実施例８ ４．５ｇのＤＰＰＣと０．５ｇのＤＳ　ＰＣを０．５ノ
ツターのビーカー内でクロロホルムとイソプロピルエー
テルの１：ｌの混合溶液２５０滅に溶解した。この溶液
に、浸透圧が生理食塩水の浸透圧の１９倍となるように
あらかじめ調製しておいた５００μｇ／滅のＣＤＤＰ食
塩水溶液を２５０１１Ｊ１．加え、乳化機（Ｐｏ１ｙｔ
ｒｏｎ、　Ｋｉｎｅｍａｔｉｋａ）で１０分間、さらに
バス型超音波振とう機（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｕｐｐ
ｌｉｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）で２０分間それぞれ乳
化しＷ１０エマルジョンを作製した。このようにして得
られたエマルジョンを１リツターのナス形フラスコに移
し替えロータリーエバポレターにかけて、以下実施例１
と同様の方法で溶媒留去および透析を行って、ＣＤＤＰ
が上記高張溶液と共に封入されたリポソーム製剤を得た
。このリポソーム膜のｔ回転移温度は約４０’Ｃであっ
た。

実施例９ １８ｇのＤＰＰＣと２ｇのＤＳ　ＰＣを２　’）　２タ
ーのビーカー内でクロロホルムとイソプロピルエーテル
のｌ：ｌの混合溶液１０００　ｒｕｎに溶解した。

この溶液に浸透圧が生理食塩水の浸透圧の１９倍となる
ようにあらかしめ調製しておいた５００μｇ／７ＪのＣ
ＤＤＰ食塩水溶液をＩ０００ｍｆ！加え軽く混合した後
、乳化機（３リツター用ホモミキサー、特殊機化）で６
０分間乳化しＷ１０エマルションを作うνした。このよ
うにして得たエマルシヨンを同じホモミキサーを用いて
、６０℃減圧下で有機溶媒を留去することによりＬＵＶ
を得た。さらに得られたＬＵＶの一部５００　ｒｒｄｌ
を人工透析機〔ホローファイバー　脂化成製１日本、約
２５Ｃｍ。

有効膜面積１．５ｍ２）中に、約１５０滅／分の速度で
注入し、透析外液として生理食塩水をホローファイバー
にがかる膜圧がＯとなるように、約５００滅／分の速度
で流すことにより、遊離のＣＤ　Ｄ　Ｉ）を透析除去し
、ＣＤＤＰが上記高張溶液と共に封入されたリポソーム
製剤を得た。このリポソーム膜のｆ回転移温度は約４２
℃であった実施例１Ｏ 実施例９で得られた透析前のリポソーム３０Ｍ１を生理
食塩水の浸透圧の１．５倍の浸透圧となるようにＮ、Ｍ
　装した食塩液を用いて実施例１と同様の方法で透析を
し）Ｌｆｌ離のＣＤＤＰを除去することによりリポソー
ム製剤を得た。

実施例１１ 実施例９で得られた透析前のリポソーム３（ｂＪを、生
理食塩水の浸透圧の１．９倍の浸透圧となるように調製
したぶとう糖液を用いて実施例１と同［工の方法で透析
し、遊１雑のＣＤＤＰを除去することによりリポソーム
製剤を得た。

実施例１２ 実施例９で得られた透析前のリポソーム３０　ｒ、＋１
を、生理食塩水の浸透圧の１．９倍の浸透圧となるよう
に生理食塩水にブドウ糖を加えて調製した食塩ぶどう糖
液を用いて実施例１と同様の方法で透析し、遊離のＣＤ
ＤＰを除去することによりリポソーム製剤を得た。

実施例１３ 実施例１で用いられる５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇ
ＤＳＰＣの代わりに４８０ｍｇのＤＰＰＣと１２０ｍｇ
のＤＳＰＣを用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で
、ＣＤＤＰを封入するリポソーム製剤を得た。この時の
リポソームの膜の相転移ｌ温度は約４１℃てあった〇 実施例１４ 実施例１で用いられる５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇ
ＤＳＰＣの代わりに６００ｍｇのＤ　Ｉ）　Ｐ　Ｃと６
０ｍｇのステアロイルメチルタウリンナトリウム（ＳＭ
Ｔ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、ＣＤ
ＤＰを封入するリポソーム製剤を得た。

この時のリポソーム膜の相転移温度は約４ピＣであった
。

実施例１５ 実施例１て用いられる５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇ
ＤＳＰＣの代わりに６００ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇの
オクタデカンスルホン酸（ＯＤ　Ｓ　）を用いて、それ
以外は実施例１と同じ方法で、ＣＤＤＰを１１人するリ
ポソーム製剤を得た。この時のリポソーム膜の相転移温
度は約４２℃てあった。

実施例１６ 実施例１て用いられる５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇ
ＤＳＰＣの代わりに５４０ｍｇのＤＰＰＣと６０ｍｇの
スルファチド（ＳＦ）を用いて、それ以外は実施例１と
同じ方法で、ＣＤＤＰを封入するリポソーム製剤を得た
。この時のリポソーム膜の１１１・１云（多１品度は約
４ピＣてあった。

実施例１７ 実施例１で用いられる５００Ｉｉｇ／）ｉ、１．ｃＤＤ
Ｐの代わりに２００１１ｇ／滅の５−ＦＵを用いて、そ
れ以外は実施例１と同じ方法で、５−ＦＵを封入するリ
ポソーム製剤を得た。

実施例１８ 実施例１で用いられる５００μｇ／　ｒｔ、ｆｌＣＤ　
Ｄ　Ｐの代わりに２００μｇ／旋のＴＡＣ−７８８を用
いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、ＴＡＣ−７８
８を封入するリポソーム製剤を得た。

実施例１９ 実施例１で用いられる５００μｇ／旋ＣＤＤＰの代わり
に５０μｇ／＋Ｊの９−チオメイタンシン（特開昭５７
−１９２３８１号）を用いて、それ以外は実施例１と同
じ方法で、９−チオメイタンシンを封入するリポソーム
製剤を得た。

実施例２０ 実施例１で用いられる５００μｇ／ノｒＪＣＩ）　Ｄ　
Ｐの代わりに２００μｇ／ｙＪのＭＭＣを用いて、それ
以外は実施例１と同じ方法で、ＭＭＣを封入するリポソ
ーム製剤を得た。

実施例２１ 実施例１で用いられる５００μｇ／ｈＪｃＤＤＰノ代ワ
りに５００μｇ／ｙ４のアクラルビンン（Ａｒａ−Ｃ）
を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法て、Ａｒａ−
Ｃを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例２２ 実施例１で用いられる５　００　ｔｔｇ／１ｎ１ｃ　Ｄ
　Ｄ　Ｐの代わりに１　ｍｇ／　ｒＪのダウノマイシン
を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、ダウノマ
イシンを封入するリポソーム製剤を得た。

実施例２３ 実施例１て用いられる５００μｇ／ＩＪｃＤＤＰの代わ
りに２００μｇ／　ｒａｆｔのＢＣＮＵを用いて、それ
以外は実施例１と同じ方法で、ＢＣＮＵを封入するリポ
ソーム製剤を得た。

実施例２４ 実施例１で用いられる５００μｇ／ＩＣＤＤＰの代わり
に２００μｇ／＋Ｊ！のＣＣＮＵを用いて、それ以外は
実施例１と同じ方法で、ＣＣＮＵを封入するリポソーム
製剤を得た。

実施例２５ 実施例１で用いられる５００μｇ／　ｔｒ、１．ＣＤ　
Ｄ　Ｐの代わりに３０８μｔｖ’ｒｒｔｌのインターロ
イキン２（＋１．−２）を用いて、それ以外は実施例１
と同じ方法で、ＩＬ−２を封入するリポソーム製剤を得
た。

実施例２６ ５６０ｍｇのＤＰＰＣと４０ｍｇのＤＳＰＣを０．２リ
ツターのビーカー内でクロロホルムとイソプロピルエー
テルのｌ＝１の混合液６０産に溶解した。一方、３０ｙ
ｆの水にＣＤＤＰｌｏｍｇ、食塩６０　ｍｇおよびマン
ニット１５３０ｍｇを溶解した。

この水溶液３０滅を上記の飽和リン脂質溶液に加えて、
実施例１と同様に乳化、有機溶媒を留去してＬＵＶを得
た。次いで実施例１と同様にＬＵＶを１２μｍのフィル
ターで濾過し浸透圧を測定すると生理的食塩水の１．８
倍であった。このＬＵＶを実施例１と同様に透析しＣＤ
ＤＰを封入するリポソーム製剤を得た。このリポソーム
膜の相転移温度は約４２℃であった。

実験例１ 実施例１〜１６で得られたリポソーム製剤について、放
出試験液として生理食塩水を用いて熱放出性（註４）を
調べて、表１の結果を得た。すなわら、実施例１〜１６
のいずれのリポソーム０川旙も３９℃てはＣＤＤＰをほ
とんと放出せず（１％以下）、ハイパーサーミア温度に
加ｌ晶しない限り安定に薬物をリポソーム内に（♀持す
る特性を示した。

また４２℃ではいずれも７０％以上ＣＤＤＰか放出され
、ハイパーサーミア加温てほとんとの薬物を短時間で放
出するという良好な熱放出性を示した。

註４　リポソームの熱放出試験 リポソーム０川旙を放出試験液としての生理食塩水ある
いは種々の浸透圧に調整した食塩水溶液１．９顧に分散
し、３９℃あるいは４２℃で１５分間加温した後のリポ
ソーム外液（放出１拭験液）に放出されるＣＤＤＰＩを
註２で述へたリポソーム外液に存在する遊離のＣＤＤＰ
の定量と同し方法で測定し、放出率はリポソーム含量に
対する百分率として求めた。

表１ 実施例１１．９ 実施例２１．７ 実施例３１．５ 実施例４２．１ 実施例５１．９ 実施例６１．５ 実施例７１．９ 実施例８１．９ 実施例９１．９ 実施例１０　　１．９ 実施例１１　　１．９ 実施例１２　　１．９ 実施例１３　　１．９ 実施例１４　　１．９ 実施例１５　　１．９ 実施例１６　　１．９ ０．０　　　　８９．５ ０．０　　　　７９．６ ０．１　　　　７５．２ ０．２　　　　８６．９ ０．９　　　　８９．５ ０．０　　　　８６．９ ０．１　　　　８３．２ ０．１　　　　８４．４ ０．６　　　　８１．９ ０．３　　　　８０．７ ０．０　　　　８０．０ ０．０　　　　８２６ ０．０　　　　７０．８ ０．３　　７４．９ ０．２　　　　７１．４ ０．０　　　　９９．３ ａ）　リポソーム内に封入されている薬液の浸透圧を表
わし、生理食塩水の浸透圧をｌとした時の相対値で示さ
れる。

実験例２ 実施例１のサンプルについて、３９℃および４２℃以外
の温度での熱放出性を調べたところ、３７℃で０．０％
、３８℃で０，０％、４０℃て１０．３％、４ピＣで８
８．４％、４５℃で７６０％であった。この結果、ハイ
パーサーミアの温度領域で十分に熱放出するか、それよ
りも低いｌ温度では安定に薬物を封入する特性を示した
。また、これとは別に上記のリポソームサンプルを一定
流ｂ１で細いチュウブ（ＰＥ５０）に通し、チュウブの
一部分を加熱し、それによって熱放出されるＣＤＤＰ量
を調べた結果、ハイパーサーミアの温度加温で数秒以内
ではとんとの薬物か放出されることを示し、ハイパーサ
ーミアによるリポソームからの薬物の放出は爆発的に起
こり、短時間で完結することを示した。

実験例３ Ｊポソームに封入されるｃｏｏｐｚ液の浸透圧か生理食
塩水の浸透圧の０．６倍、０８倍および１　、０　（ｒ
η（いずれも本発明のリポソームにおけるより茎、低い
浸透圧）となるようにして、それ以外はすべて実施例１
と同じ方法でＣＤ　Ｄ　Ｐを封入するリポソームを作成
した（サンプル１，２．３）。また、サンプル４として
、リポソームに封入されるＣＤＤＰ薬液の浸透圧が生理
食塩水の浸透圧の３．０ｆ３（本発明のリポソームにお
けるよりも高い浸透圧）および透析液の浸透圧か２，５
倍となるようにしてＣＤＤＰを封入するリポソームを作
成した。また、実施例１て用いられる５４０ｍｇのＤＰ
ＰＣと６０ｍｇＤＳＰＣの代わりに３００ｍｇのＤＰｐ
ｃと３００ｍｇのＤＳ　ＰＣ（相転移を温度４８℃）あ
るいは６００ｍｇのＤＳ　ＰＣ（相転移温度５５℃）を
用いて、実施例１と同じ方法で、ハイパーサーミアの温
度より高い膜用転移温度を何し、ＣＤＤＰを封入するリ
ポソームを作成した（サンプル５．６）。これらのリポ
ソームについて生理食塩水を試験液として、熱放出性を
調へたところ、表２のような結果が得られた。すなわち
、表２のサンフル１．２および３の４２℃ての放出率に
見られるようにリポソーム内に封入される薬液の浸透圧
か低すぎると、ハイパーサーミアの温度で薬物を十分に
放出しないことを示した。また一方、サンプル４の３８
℃ての放出率に示されるようにリポソーム内に封入され
る薬液の？ＩＪ’ｌｉ圧が高すぎるとリポソームは不安
定となり、リポソーム膜の相変化に基づく薬物の放出と
は異なり熱非依存的に薬物の一部を漏出してしまうこと
を示した。また、表２のサンプル５および６の４２℃で
の放出率に示されるようにリポソームの膜の相転移ｌ温
度かハイパーサーミアのｔ温度よりも高いと、たとえ封
入薬液の浸透圧がうまく調整されていても熱放出性が得
られないことを示した。

表２ サンプル１０．６　　　０．０　　　　０．０サンプル
２　　０．８　　　０．０　　　　２．５サンプル３　
　１．０　　　０．０　　　３０．４サンプル４　　３
，０　　３８．７　　　９５．８サンプル５　　０．６
　　　０．０　　　　０．０ａ）　リポソーム内に封入
されている薬液の浸透圧を表わし、生理食塩水の浸透圧
を１とした時の相対値で示される。

実験例４ 実施例１および３のリポソームについて放出試験液の浸
透圧を種々に変えて、熱放出性を１週へると表３のよう
な結果となった。すなわら、これらの結果はリポソーム
の放出性に及はす浸透圧の効果は概ね熱放出試験液の浸
透圧に対するリポソーム内に１．１人される薬物含有液
の浸透圧の比率（表３に示されるＯｓｍ（ｉｎ）１０ｓ
ｍ（ｏｕｔ））で決まることを示した。これは放出試験
液の浸透圧が異なるものの、実験例Ｉで示したように４
２℃の良好な放出性（約７０％以上）を得るには、リポ
ソーム内に封入される薬物含有液の浸透圧の、リポソー
ムが実際に熱放出すべき生体液の浸透圧（約３０００ｓ
ｍ）に対する比率が１．２以上である必要があり、また
リポソームの良好な安定性（３８℃では放出しない）を
得るためには、その比率は２５以下であることか望まし
いことを示している。

（以　下　余　白） 表３ ａ）　リポソーム内に封入されている薬液の浸透圧を表
わし、生理食塩水の浸透圧を１とした時のｔ目射値とし
て示される。

ｂ）熱放出試験液の浸透圧を表わし、生理食塩水の浸透
圧を１とした時の÷目射値として示される。

実験例５ 実施例１および８のリポソームを冷所（約５℃）に３ケ
月１呆存したｉ＆のリポソームからｌ届出したノル離の
ＣＤ　Ｄ　Ｉ）を測定した結果いずれも２％以下であっ
た。本発明のリポソームは非常に安定であることを示し
た。

試験例 ＭｅｔｈＡ担癌マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ，酸マウス、１ｎ
１５匹、平均体重２０ｇ）に、実施例１で得られたＣＤ
Ｉ）　Ｐ封入のリポソームを生理食塩水で希釈し、ＣＤ
ＤＰとして１０．２０あるいは４０μｇ／マウス（−匹
）となるように静脈投与した。この投与開始１稔１５分
から３０分間にわたって、癌部位（側腹皮下）のみを４
０〜４５℃となるように熱板で加７１ｍシた。この投与
を１日に１回ずつ２回行なった後、２１日経過後に腫瘍
型■を測定した。本リポソーム製剤投与１：１−の平均
腫瘍重量（Ｔ）と１１１（処置ＩＩＴの平均腫瘍車量の
比（Ｔ／Ｃ）を測定し、第１図の結果を得た。図中、−
・−は加温して本発明のＪポソーム製剤を投与したｌｉ
ｆ、−一一〇−一−は加温せずに単にＣＤＤＰを投与し
た群、−−−・−一−は非’Ｊｌｌ　ｌ！！下に本発明
のリポソーム製剤を投与した肝、または○は加温してＣ
ＤＤＰ水溶液を投与したｌｉ１′についての各測定結果
を示す。

この図から明らかなように、本発明のリポソーム製剤を
加温下に投与することにより、顕著な抗腫瘍効果か得ら
れた。

本発明の作用と効果 本発明のリポソーム製剤は、膜の１目転移温度か１１０
〜４５℃でかつリポソームに封入される薬物含有液の浸
透圧か温血動物の生体１１によりも１２〜２５倍高張と
いう点が特徴である。抗腫１α剤を封入せしめた本発明
のリポソーム製剤は、４０〜４５℃で極めて高い薬物放
出性を示し、ノ・イパーサーミア療法と組合せて顕著な
抗腫瘍効果が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試験例においてＣＤＤＰを封入する本発明の
リポソーム製剤をマウスに投与したときの抗腫瘍効果を
対照群と比較して示したものである。 牧寿量（杓／勿人１ご）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）膜の相転移温度が４０〜４５℃であるリポソーム
   内に、温血動物の生体液浸透圧よりも１．２〜２．５倍
   高張の薬物含有液を封入してなるリポソーム製剤。
2. （２）アシル基が飽和アシル基であるリン脂質をリポソ
   ーム膜の主構成成分とする請求項（１）記載の製剤。
3. （３）薬物が抗腫瘍剤である請求項（１）または（２）
   記載の製剤。
4. （４）リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシクルで
   ある請求項（１）、（２）または（３）記載の製剤。
5. （５）浸透圧が温血動物の生体液よりも１．２〜２．５
   倍高張の薬物含有液を封入し、膜の相転移温度が４０〜
   ４５℃であるリポソームを形成せしめることを特徴とす
   るリポソーム製剤の製造法。
6. （６）アシル基が飽和アシル基であるリン脂質を主剤と
   してリポソーム膜を構成させる請求項（５）記載の製造
   法。
7. （７）薬物が抗腫瘍剤である請求項（５）または（６）
   記載の製造法。
8. （８）リポソームがラージ・ユニラメラー・ベシクルで
   ある請求項（５）、（６）または（７）記載の製造法。