BRPI0720733A2 - Preparação farmacêutica lipossômica e método para fabricação da mesma. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA- ÇÃO FARMACÊUTICA LIPOSSÔMICA E MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DA MESMA".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se à preparação lipossômica e à pre-

paração farmacêutica lipossômica para encapsulamento de fármaco, especi- almente à preparação farmacêutica lipossômica de mitoxantrona. A presente invenção refere-se, adicionalmente, aos métodos para fabricação do Iipos- soma, preparação farmacêutica lipossômica e seus usos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os Iipossomas podem ser usados como um veículo para muitos fármacos, especialmente fármacos antitumorais (em particular fármacos quimioterpêuticos). Os Iipossomas podem reduzir a distribuição do fármaco nos tecidos normais, porém aumentam o acúmulo de fármaco nos tecidos 15 tumorais, pelo que, aperfeiçoando o índice terapêutico do fármaco. A razão pela qual um Iipossoma pode direcionar passivamente um tumor refere-se às propriedades fisiológicas do tecido tumoral. Os vasos sanguíneos tumorais podem apresentar um tamanho de poro de até 100-780 nm devido ao seu rápido crescimento, embora células endoteliais vasculares normais tenham 20 um espaço típico de cerca de 2 nm. Portanto, os Iipossomas podem se acu- mular passivamente na região tumoral se eles puderem circular por um perí- odo de tempo relativamente longo no sangue e podem apresentar um tama- nho inferior a 200 nm, uma vez que, após os Iipossomas com tamanho pe- queno serem administrados através de injeção intravenosa, eles podem não 25 entrar nos tecidos normais, porém podem penetrar no vaso sanguíneo da região tumoral e chegarem à área de tratamento.

Contudo, não é fácil a obtenção de vantagens terapêuticas com o emprego do Iipossoma e os quatro requisitos que se seguem devem ser satisfeitos: (1) o fármaco pode ser encapsulado no Iipossoma com uma boa 30 eficácia de encapsulamento e um carregamento de fármaco suficiente; (2) o fármaco não será liberado do Iipossoma durante o período de armazena- mento in vitro\ (3) não haverá um vazamento de fármaco que possa ser ob- servado durante a circulação do fármaco lipossômico no sangue; e (4) o fármaco pode ser liberado eficazmente e pelo que exerce seus efeitos tera- pêuticos quando os Iipossomas são acumulados na região tumoral. Com relação às técnicas lipossômicas atuais, os três problemas iniciais foram 5 bem resolvidos, portanto, a liberação racional in vivo do fármaco lipossômico sugere mais atenção. Um problema técnico importante a ser solucionado para o desenvolvimento de alguns fármacos lipossômicos é o controle eficaz da liberação racional dos lipossômicos após direcionamento de uma região tumoral. Isto é especificamente importante para alguns fármacos, tais como, 10 mitoxantrona.

Foi verificado, por um grupo de estudos do Iipossoma no Cana- dá, que uma formulação de Iipossoma possuindo um tamanho de cerca de 100 nm, que havia sido preparada por emprego de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e colesterol como uma camada dupla de fosfolipídeo e 15 carregando o fármaco por um gradiente de ácido cítrico de 300 mM não era tão boa quanto uma mitoxantrona livre. A fim de aperfeiçoar o efeito terapêu- tico do lipossoma, o grupo finalmente alterou a composição da camada du- pla de fosfolipídeo para dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e colesterol e obte- ve uma preparação com índices terapêuticos aperfeiçoados. Contudo, o va- 20 zamento do fármaco pode aumentar durante o período de armazenamento uma vez que a temperatura de fase de transição de DMPC é de 21 °C, de modo que a preparação pode não ser estável (Liposomal formulations of mi- toxantrona, US 5.858.397).

Neopharm Corporation dos USA empregou outra técnica para 25 desenvolver uma formulação de lipossoma de mitoxantrona, onde um carre- gamento negativo transportando cardiolipina foi adicionado à camada dupla de fosfolipídeo. Devido à grande interação entre a cardiolipina e a mitoxan- trona, a mitoxantrona seria inserida na camada dupla de fosfolipídeo em um modo de carregamento passivo. Esta técnica de carregamento passivo é 30 diferente da técnica de carregamento ativo. Em virtude da técnica de carre- gamento ativo, um fármaco será depositado na fase aquosa intralipossômica na forma de precipitação. O estudo clínico da fase I no produto da Neopharm indicou que os fármacos do lipossoma aumentariam a possibilidade de in- fecção ocasional, em comparação ao fármaco livre. O desenvolvimento des- te produto cessou por questões de segurança (Liposomal preparations of mitoxantrona, CN01817424.8).

5 Pacific Institute of Materia Medica (Changchou, China) também

depositou um Pedido de Patente para uma preparação lipossômica de mito- xantrona (A Iiposomal injection of mitoxantrona or mitoxantrona hydrochlori- de and the process for making the same, CN200410041612.1). Neste Pedi- do, o método de gradiente de valor de ph tradicional foi utilizado para carre- 10 gar os fármacos. Este pedido busca proteger uma formulação com uma taxa especifica e não revela os efeitos dos fatores tais como, composição de fos- folipídeos, tipos de sais de tampão na fase aquosa interna, tamanho do li- possoma, taxa de fármaco/lipossoma, etc. na eficácia terapêutica e toxicida- de do lipossoma.

Zhirong Zhang, e outros do West China School of Pharmacy,

Sichuan University também estudaram preparações lipossômicas de mito- xantrona. Eles empregaram fosfatidilcolina de soja com uma temperatura de fase de transição de O0C (que é comercializada sob a marca registrada EPI- KURON 200) para preparar os Iipossomas de cerca de 60 nm. Neste artigo, 20 apenas farmacocinéticos foram estudados sem relação com a toxicidade e eficácia terapêutica da preparação lipossômica obtida. O conteúdo relevante pode ser visto em "Preparation of Iong circulating mitoxantrone Iiposomes and its pharmacokinetics", Zhirong Zhang, Botao Yu and Yisong Duan, Acta Pharmaceutica Sinica, 2002, Vol. 37, N°6; Studies on preparation of Iong cir- 25 culating mitoxantrone Iiposomes with transmembrane ammonium sulfate gradients, Zhirong Zhang, Botao Yu, Yisong Duan and Yuan Huang, Chinese Pharmaceutieal Journal, 2002 Vol. 37, N°12; e Study on the preparation te- chniques of mitoxantrone liposomes, Yisong Duan, West China Journal of Pharmaeeuteal Sciences, 2001 Vol. 16, N0 02.

Nos estudos acima, o tamanho dos Iipossomas é geralmente

controlado na faixa de 80 - 150 nm, uma vez que existe um consenso no campo dos Iipossomas de que um lipossoma com um tamanho de cerca de 100 nm teria a melhor eficiência de direcionamento (Pharmacol. Rev. 1999 51: 691-744). Contudo, conforme mencionado acima, um lipossoma não a- penas teria uma excelente eficiência de direcionamento, porém também, uma liberação suficiente do lipossoma para exercer seu efeito.

5 Conforme indicado acima, de acordo com o campo anterior, o

vazamento do fármaco durante a circulação do sangue seria essencialmente evitado, de modo que o fármaco seria eficazmente transferido para os tumo- res, porém este requisito também resulta em uma dificuldade de liberar o fármaco do lipossoma, quando ele é direcionado para a região tumoral. Nos 10 processos convencionais para fabricação de lipossomas, um fármaco é ge- ralmente encapsulado por uma técnica de carregamento ativo, na qual o fármaco encapsulado no lipossoma está presente em uma forma de precipi- tado coloide não possuindo bioatividade, de modo que, apenas quando o fármaco é liberado eficazmente do lipossoma, ele pode mudar para um fár- 15 maco terapêutico com bioatividade. Se a taxa de liberação do fármaco for muito lenta, o fármaco pode exercer dificilmente sua ação terapêutica, mes- mo que ele tenha direcionado eficazmente a região tumoral, e seu efeito te- rapêutico pode ser mesmo inferior ao de um fármaco não-encapsulado.

Portanto, existe uma necessidade urgente no campo para uma preparação lipossômica capaz de liberar um fármaco com boa capacidade de direcionamento e liberação eficaz do fármaco nos tecidos direcionados e para uma preparação farmacêutica lipossômica correspondente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que 25 alguns fármacos possuindo vários grupos dissociáveis e uma possibilidade de formação de precipitado compacto com contraíon multivalente poderiam ser processados para formarem uma preparação lipossômica unilamelar pe- quena com um índice terapêutico eficazmente aperfeiçoado, de modo que o problema técnico acima seria solucionado.

Portanto, em um aspecto, a presente invenção provê uma prepa-

ração lipossômica com um tamanho de cerca de 30-80 nm possuindo um fosfolipídeo com uma Tm superior a temperatura corpórea na camada dupla de fosfolipídeo, de modo que a temperatura de fase de transição do lipos- soma é superior à temperatura corpórea. Exemplos do dito fosfolipídeo in- cluem, porém não estão limitados à fosfatidilcolina, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de gema de ovo hidrogenada, dípalmi- 5 toil fosfatidilcolina (DPPC) ou distearoil fosfatidilcolina (DSPC) ou suas com- binações.

Em uma concretização, o fosfolipídeo com uma Tm superior à temperatura corpórea na camada dupla de fosfolipídeo representa 50-100% em mol/mol, preferivelmente 55-95% em mol/mol, e mais preferivelmente 55- 95% em mol/mol do teor total de fosfolipídeos.

Opcionalmente, a camada dupla de fosfolipídeo da preparação lipossômica da presente invenção compreende, adicionalmente, fosfolipí- deos adicionais, por exemplo, um fosfolipídeo com uma Tm não-superior à temperatura corpórea, tal como dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e similares. 15 A quantidade do fosfolipídeo na preparação lipossômicas da presente inven- ção pode ser determinada convencionalmente pelos versados na técnica comum, contanto que o valor Tm da preparação lipossômica não seja mar- cantemente reduzido a um valor inferior ao da temperatura corpórea.

A preparação lipossômica da presente invenção pode também compreender, opcionalmente, colesterol de modo à regular a fluidez da membrana lipossômica.

A preparação lipossômica da presente invenção pode também compreender, opcionalmente, excipientes adicionais, especialmente excipi- entes para modificação adicional das características de superfície do Iipos- 25 soma de modo a conferir ao lipossoma melhor comportamento in vivo. Tais excipientes incluem, por exemplo, lipídeos e similares modificados com po- límeros hidrófilos.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma preparação farmacêutica lipossômica, que compreende um fármaco de interesse, espe- cialmente um fármaco iônico multivalente, em uma preparação lipossômica da presente invenção. Portanto, a presente invenção refere-se à preparação farmacêutica lipossômica apresentando um tamanho de 30-80 nm, em que: (1) a preparação farmacêutica lipossômica compreende um fármaco iônico multivalente como ingrediente ativo; (2) a camada dupla de fosfolipídeo com- preende um fosfolipídeo com uma Tm superior à temperatura corpórea, de modo que a temperatura de fase de transição do lipossoma seja superior à 5 temperatura corpórea; e opcionalmente (3) a preparação farmacêutica lipos- sômica compreende fármacos adicionais e/ou excipientes adicionais aceitá- veis na preparação farmacêutica lipossômica. Preferivelmente, as máximas principais de tamanho da preparação farmacêutica lipossômica são centra- das em torno de 35-75 nm, especialmente em torno de 40-60 nm.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para

obtenção da preparação farmacêutica lipossômica acima, o método compre- endendo as etapas que se seguem: (1) preparação de um lipossoma empre- gando um fosfolipídeo com uma Tm superior à temperatura corpórea e op- cionalmente fosfolipídeos adicionais e/ou colesterol; e (2) encapsulamento 15 de um fármaco de interesse, especialmente um fármaco iônico multivalente no lipossoma.

A presente invenção também provê um método para tratamento da doença, compreendendo administração da preparação farmacêutica li- possômica da presente invenção a um indivíduo que precise do tratamento. Preferivelmente, o indivíduo é um mamífero, especialmente um ser humano. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é a farmacocinética in vivo de PLM60 em camundon- gos Kunming e a comparação da mesma com a farmacocinética in vivo de mitoxantrona livre, na qual PLM representa Lipossoma de mitoxantrona PE- 25 Gilada, FM representa mitoxantrona livre, a abscissa representa o tempo (hora) e a ordenada representa o nível no plasma de mitoxantrona (pg de mitoxantrona/mL de plasma).

A figura 2 é o perfil de PLM60 e FM no tumor de camundongos, no qual PLM60 representa lipossoma de mitoxantrona PEGilada, FM repre- senta mitoxantrona livre, a abscissa representa tempo (hora) e a ordenada representa a concentração de mitoxantrona nos tecidos tumorais (pg de mi- toxantrona/g de tecido tumoral). A figura 3 é a comparação das farmacocinéticas in vivo nos ca- mundongos de formulações diferentes, no qual a abscissa representa tempo (hora) e a ordenada representa o nível no plasma de mitoxantrona (Mg de mitoxantrona/mL de plasma) e as dosagens de formulações diferentes são 5 todas de 4 mg/kg.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Normalmente, os Iipossomas são formados com fosfolipídeos e colesterol como materiais de membrana. Estes dois ingredientes não são apenas os materiais básicos para formação da camada dupla de lipossoma, porém também possuem funções fisiológicas muito importantes.

As propriedades físicas da membrana lipossômica estão proxi- mamente relacionadas à temperatura. Quando a temperatura é elevada, as cadeias laterais de acila da camada dupla de lipídeo alteraram a forma de fileira ordenada para fileira desordenada. Este tipo de alteração pode resul-

tar em muitas modificações das propriedades físicas da membrana de lipí- deo. Por exemplo, o estado de "gel" pode se alterar para estado de "cristal líquido", a seção transversal da membrana pode aumentar, a espessura da camada dupla pode diminuir, a fluidez da membrana pode aumentar. A tem- peratura na qual tais alterações acontecem é denominada temperatura de 20 fase de transição. Atemperatura de fase de transição da membrana lipídica pode ser determinada por Calorimetria Diferencial de Varredura, Ressonân- cia de Rotação do Elétron (ESR) e similares. A temperatura de fase de tran- sição da membrana lipossômica depende dos tipos de fosfolipídeos. De mo- do geral, quanto mais longa a cadeia lateral de acila, maior a temperatura de 25 fase de transição; e vice versa. Por exemplo, a temperatura de fase de tran- sição de dimiristoil fosfatidilcolina é 24°C, enquanto as da dipalmitoil fosfati- dilcolina e da distearoil fosfatidilcolina são de 41°C e de 58°C, respectiva- mente. A fluidez da membrana é uma propriedade importante do lipossoma. Na temperatura de fase de transição a fluidez da membrana aumentará e o 30 fármaco encapsulado no lipossoma apresentará a taxa de liberação máxima. Assim, a fluidez da membrana afeta diretamente a estabilidade do liposso- ma. Em uma concretização, a presente invenção fornece uma prepa- ração de lipossoma apresentando um tamanho de cerca de 30-80 nm e um fosfolipídeo com uma Tm superior à temperatura corpórea na camada dupla de fosfolipídeo, de modo que a temperatura de fase de transição do Iipos- 5 soma seja superior à temperatura corpórea.

Preferivelmente, a preparação farmacêutica lipossômica da pre- sente invenção é preparada por emprego dos fosfolipídeos com uma tempe- ratura de fase de transição Tm relativamente alta, tal como fosfatidilcolina. Se a Tm da fosfatidilcolina for superior à temperatura corpórea, o compri- mento de sua cadeia de hidrocarbonetos preferivelmente não será inferior a

16 carbonos. Preferivelmente, os fosfolipídeos da presente invenção inclu- em, porém não estão limitados à fosfatidilcolina de soja hidrogenada, fosfati- dilcolina de gema de ovo hidrogenada, dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ou distearoil fosfatidilcolina (DSPC), ou suas combinações.

Na preparação lipossômica da presente invenção, os fosfolipí-

deos com uma Tm superior à temperatura corpórea na camada dupla de fosfolipídeo representam cerca de 50-100% em mol/mol, preferivelmente cerca de 55-95% em mol/mol, mais preferivelmente cerca de 60-90% em mol/mol em relação ao teor total de todos fosfolipídeos. Opcionalmente, a 20 camada dupla de fosfolipídeo pode compreender fosfolipídeos adicionais, por exemplo, fosfolipídeos com uma Tm não-superior à temperatura corpó- rea, tal como dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e similares. Tais fosfolipídeos podem estar presentes no lipossoma em qualquer quantidade apropriada, contanto que isto não coloque a temperatura de fase de transição da prepa- 25 ração lipossômica abaixo da temperatura corpórea. A quantidade apropriada pode ser determinada de acordo com técnicas convencionais pelos versados na técnica comum.

Preferivelmente, a preparação lipossômica da presente invenção pode compreender, adicionalmente, colesterol. O colesterol tem a função de regular a fluidez da membrana. Quando a membrana lipossômica compre- ende 50% em (mol/mol) colesterol, a fase de transição da membrana lipos- sômica pode desaparecer. O colesterol é denominado "tampão de fluidez" por Papahadjopoulos e outros, uma vez que a adição do colesterol aos fos- folipídeos sob temperatura de fase de transição pode reduzir a fileira orde- nada da membrana e aumentar a fluidez da membrana, enquanto a adição do colesterol aos fosfolipídeos acima da temperatura de fase de transição 5 pode aumentar a fileira ordenada da membrana e reduzir a fluidez da mem- brana. Na preparação lipossômica da presente invenção, o teor de colesterol pode ser de 2-60% em mol/mol, 5-55% em mol/mol ou 10-50% em mol/mol em relação à quantidade total de ingredientes do lipossoma. Mais especifi- camente, o teor de colesterol pode ser de 15-45% em mol/mol, por exemplo, 10 de 20-40% em mol/mol em relação à quantidade total de ingredientes do lipossoma. O teor de colesterol no lipossoma da presente invenção pode ser determinado facilmente de acordo com técnicas convencionais pelos versa- dos na técnica comum.

Deve ser apreciado que a camada dupla de fosfolipídeo no Ii- possoma da presente invenção também pode compreender excipientes adi- cionais, especialmente excipientes para modificação adicional das caracte- rísticas de superfície do lipossoma, de modo a conferir melhores comporta- mentos in vivo ao lipossoma. Tais excipientes incluem, por exemplo, subs- tâncias lipídicas modificadas com polímeros hidrófilos, e os exemplos das mesmas sendo distearoil fosfatidil etanolamina modificada com PEG (DSPE- PEG), distearoil fosfatidil glicerol modificado com PEG (DSPG-PEG), coles- terol modificado com PEG (col-PEG), distearoil fosfatidil etanolamina modifi- cada com polividona (DSPE-PVP), distearoil fosfatidil glicerol modificado com PEG (DSPG-PVP) ou colesterol modificado com PEG (col-PVP). Os ditos excipientes também podem ser materiais de membrana modificados com um anticorpo específico ou ligante. A quantidade de tais excipientes no lipossoma da presente invenção pode ser determinada de acordo com técni- cas convencionais pelos versados na técnica comum, por exemplo, pode ser de 0,1-20% em mol/mol, preferivelmente de 0,3-18% em mol/mol, mais pre- feriveímente de 0,5-15% em mol/mol, especialmente de 0,8-12% em mol/mol, por exemplo, de 1-10% em mol/mol, ou 2-8% em mol/mol, 2,5-7% em mol/mol, 3-6% em mol/mol, etc. em relação ao número molar de fosfoli- pídeos. Nos casos que empregam lipídeos modificados com PEG como ex- cipientes, o peso molecular da fração de PEG pode ser, por exemplo, de 400-20.000 Dalton, preferivelmente 600-15.000 Dalton, mais preferivelmente 800-10.000 Dalton, especialmente 1.000-8.000 Dalton, por exemplo, 1.200- 5 5.000 Dalton. O uso de PEG na presente invenção também pode ser deter- minado facilmente de acordo com experimentos convencionais pelos versa- dos na técnica comum.

A preparação lipossômica da presente invenção é uma prepara- ção lipossômica unilamelar pequena e teria um tamanho apropriado. Preferi- velmente, o tamanho da preparação é de 30-80 nm, mais preferivelmente de 35-70 nm, especial e preferivelmente de 40-60 nm. O tamanho do lipossoma pode ser determinado pelo analisador de tamanho de partícula ou microscó- pio de elétrons ou outro dispositivo. Deve ser entendido que as partículas do lipossoma na presente invenção podem não apresentar um tamanho com- pletamente uniforme, porém um intervalo de uma faixa de tamanho, devido à natureza do lipossoma propriamente e propriedades do processo de fabrica- ção. Portanto, na preparação lipossômica da presente invenção, a presença das partículas de lipossoma fora da faixa-padrão declarada pode não ser excluída, contanto que ela não afete de forma evidente as características da preparação lipossômica ou preparação farmacêutica da presente invenção.

O lipossoma na presente invenção pode ser preparado por vá- rios métodos adequados, incluindo, por exemplo, método de dispersão de película, método de injeção, método de dispersão ultrassônica, método de liofilização, método de congelamento-descongelamento e similares. De a- 25 cordo com os sistemas de partida empregados para preparação do liposso- ma, os métodos podem ser divididos em: (1) métodos com base em mem- brana de lipídeo seca, lipídeo em pó; (2) métodos com base em agentes emulsionantes; (3) métodos de preparação de lipossoma com base em mice- Ias mistas; e (4) métodos de preparação de lipossoma com base em uma 30 mistura de fase tripla de etanol, fosfolipídeos e água. O encapsulamento do fármaco pode ser implementado, tanto por modo de carregamento passivo quanto por modo de carregamento ativo. Estes métodos podem ser encon- trados em muitos artigos de revisão a respeito dos lipossomas.

Durante ou após a obtenção da preparação lipossômica, muitos métodos adequados podem ser empregados para encapsular um fármaco no lipossoma e formar a preparação farmacêutica lipossômica. Métodos a- dequados incluem, por exemplo, métodos de carregamento ativo e métodos de carregamento passivo. Método de carregamento ativo é geralmente reali- zado por métodos de gradiente, por exemplo, um método de gradiente de sulfato de amônio, isto é, empregando uma solução de sulfato de amônio como fase aquosa para preparar, primeiramente, um lipossoma compreen- dendo sulfato de amônio na fase intralipossômica e extralipossômica, então formando um gradiente de concentração de sulfato de amônio entre a fase intralipossômica e extralipossômica por remoção de sulfato de amônio extra- lipossômico. NH4+ intralipossômico se dissocia em NH3 e H+, o que conduz à diferença de concentração de H+ (isto é gradiente de pH) entre a fase intrali- possômica e extralipossômica, de modo que, após um fármaco extralipos- sômico no estado molecular entrar na fase aquosa intralipossômica, ele mu- da para o estado iônico, pelo que, o fármaco não pode retornar à fase aquo- sa extralipossômica e o lipossoma apresenta menos vazamento de fármaco e é mais estável. O método de carregamento passivo pode ser realizado pe- Io método de injeção de solvente orgânico, método de dispersão de película, método de congelamento-descongelamento e similares.

Na presente invenção, quaisquer ingredientes de fármacos a- propriados podem ser empregados. Preferivelmente, o ingrediente farmacêu- tico ativo na preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção é 25 um fármaco iônico multivalente. O termo "fármaco iônico multivalente" signi- fica um fármaco apresentando dois ou mais grupos dissociáveis com uma constante de dissociação pKa de 4,5-9,5, de modo que o fármaco possui mais cargas positivas ou mais cargas negativas nas faixas de pKa. Preferi- velmente, a dita constante de dissociação está na faixa de 5,0-9,5. Mais pre- 30 ferivelmente, a dita constante de dissociação está na faixa de 5,5-9,5. Espe- cial e preferivelmente, a dita constante de dissociação está na faixa de 6,0-

9,0, especialmente 6,5-9,0. O valor da pKa de cada grupo dissociável do fármaco iônico pode ser determinado facilmente de acordo com técnicas convencionais pelos versados na técnica comum.

Na presente invenção, os fármacos iônicos multivalentes podem incluir, porém não estão limitados aos fármacos anticâncer, por exemplo, fármacos úteis para prevenção ou tratamento dos cânceres que se seguem: câncer pulmonar (tal como, câncer pulmonar de célula não-pequena), câncer pancreático, câncer mamário, câncer retal ou mieloma múltiplo, câncer hepá- tico, carcinoma cervical, carcinoma gástrico, carcinoma da próstata, carci- noma retal e/ou carcinoma da bexiga. Portanto, em uma concretização da presente invenção, o fármaco iônico multivalente é um fármaco anticâncer iônico multivalente. Preferivelmente, o fármaco iônico multivalente é mitoxan- trona, vincristina, vinorelbina ou vinblastina. Mais preferivelmente, o dito fár- maco iônico multivalente é mitoxantrona e pode combinar, opcionalmente, com pelo menos um dos fármacos adicionais, que pode ser, por exemplo, um fármaco antitumor, tal como, vincristina, vinorelbina ou vinblastina, e si- milares.

É necessário observar, especificamente, que na presente inven- ção, o fármaco iônico multivalente também pode ser uma combinação de um, dois ou mais dos fármacos acima, por exemplo, uma combinação de 20 dois fármacos anticâncer, uma combinação de um ou mais fármacos anti- câncer com outros fármacos adicionais, tais como, imunopotenciador e uma combinação de dois ou mais outros tipos de fármacos.

Deve ser observado que os fármacos lipossômicos da presente invenção podem também compreender, opcionalmente, um ou mais fárma- 25 cos iônicos não-multivalentes além dos fármacos iônicos multivalentes men- cionados acima, que podem ser administrados em combinação com os fár- macos iônicos multivalentes conforme mencionados acima. A administração em combinação compreende administração com todos os componentes em uma preparação, e também compreende a administração em combinação na 30 forma de dosagem unitária separada.

Deve ser apreciado que o fármaco como ingrediente ativo, con- forme mencionado no documento, compreende não apenas sua forma origi- nal, porém também seus derivados, por exemplo, solvatos (tais como, hidra- tos e produtos de adição de álcool), pró-fármacos e outros derivados fisiolo- gicamente aceitáveis, bem como metabolitos ativos e similares. Derivados, promedicamentos e outros derivados fisiologicamente aceitáveis, bem como 5 metabolitos ativos de um fármaco são bem conhecidos dos versados na téc- nica comum.

A preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção pode compreender, adicionalmente, contraíons multivalentes com cargas opostas as do ingrediente ativo. Exemplos de contraíons multivalentes inclu- 10 em, porém não estão limitados aos ânions de ácido orgânico, tais como â- nions de ácido dos seguintes ácidos orgânicos saturados ou insaturados que se seguem: ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico e ácido maleico e similares; um â- nions de ácido inorgânico, tais como, ânion de sulfato, ânion de fosfato e 15 similares. Entre os mesmos são preferidos o ânion de citrato, ânion de sulfa- to ou ânion de fosfato. Adicionalmente, os ditos contraíons multivalentes também podem ser aminoácidos, tais como, cisteína e similares. Sem dese- jar estar ligado a qualquer teoria específica, presume-se que o contraíon multivalente seja capaz de formar um precipitado insolúvel com um fármaco 20 de interesse (por exemplo, fármaco iônico multivalente) encapsulado no li- possoma, pelo que, a existência do fármaco iônico multivalente no lipossoma é estabilizada.

A preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção compreende, adicional e opcionalmente excipientes e veículos adicionais conhecidos no campo farmacêutico, tais como, sacarose, histidina, antioxi- dantes, estabilizantes, dispersantes, preservantes, diluentes, solventes, sais para alterar a pressão osmótica e similares.

Em uma concretização, a presente invenção fornece um método para obtenção da preparação farmacêutica lipossômica da presente inven- ção, compreendendo: primeiramente obtenção da preparação lipossômica da presente invenção, conforme mencionado acima, e subsequente incuba- ção de um fármaco de interesse com a preparação lipossômica em uma condição apropriada. Mais especificamente, o método para obtenção da preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção compreende as etapas que se seguem: (1) dissolução dos excipientes lipídicos apropriados para a preparação de um lipossoma em um solvente orgânico apropriado, tal 5 como álcool f-butílico ou ciclo-hexano, então liofilização para obtenção de um pó liofilizado; (2) hidratação do pó Iiofilizado com uma solução contendo um contraíon do ingrediente ativo do fármaco de interesse para formar um lipossoma vazio; (3) remoção do contraíon extralipossômico por um meio apropriado,tal como, diálise ou cromatografia de coluna e similares, a fim de 10 formar um gradiente de contraíon entre a fase intralipossômica e a fase ex- tralipossômica; e (4) incubação do fármaco com o lipossoma para obter o fármaco lipossômico. Descrições com relação aos fosfolipídeos, colesterol, excipientes e similares vide acima quanto à preparação lipossômica.

Preferivelmente, o lipídeo é um fosfolipídeo, especialmente um lipídeo com uma temperatura de fase de transição relativamente alta, por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilcolina de soja hidrogenada, fosfatidilcolina de gema de ovo hidrogenada, dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ou distearoil fosfatidilcolina (DSPC), ou suas combinações. Opcionalmente, o dito lipídeo também pode compreender colesterol em uma quantidade, por exemplo, de 2-60% em mol/mol, 5-55% em mol/mol ou 10-50% em mol/mol. Mais especi- ficamente, a quantidade de colesterol pode ser de 15-45% em mol/mol, por exemplo, 20-40% em mol/mol em relação número de mol total de todos os ingredientes no lipossoma. Os versados na técnica comum podem determi- nar a quantidade de colesterol, dependendo de requisitos específicos para a temperatura de fase de transição do lipossoma a ser obtida e as proprieda- des desejadas.

Uma vez que a preparação farmacêutica lipossômica é obtida, a eficácia de encapsulamento do fármaco no lipossoma pode ser determinada por técnicas convencionais. Métodos para determinação da eficácia de en- 30 capsulamento do lipossoma incluem ultrafiltração, diálise, cromatografia de coluna, centrifugação de minicoluna, e similares. A ultrafiltração não é em- pregada devido aos altos requisites para dispositivos de experimento; a cro- matografia de coluna não é empregada uma vez que a diluição requer uma grande quantidade de eluente e o teor do fármaco é muito baixo, de modo que isto dificulta a determinação do teor, além disto, a diluição de uma gran- de quantidade de eluente pode também conduzir ao vazamento do fármaco 5 no lipossoma, pode ser conhecido de dados experimentais que a eficácia de encapsulamento para a diálise é menor (talvez devido ao rompimento do lipossoma após diluição) e o tempo para diálise é longo, assim o método não é considerado apropriado. A determinação da eficácia de encapsulamento por centrifugação de minicoluna possui as seguintes vantagens: taxa de dilu- 10 íção menor para solução do lipossoma, sem a necessidade de instrumentos caros.

A preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção assegura, não apenas, eficácia de encapsulamento e carregamento de fár- maco suficientes, porém também a não liberação do fármaco do lipossoma 15 durante armazenamento in vitro, vazamento não-observado de fármaco do lipossoma durante circulação do sangue para aumento da toxicidade. Um efeito importante que pode ser observado do fármaco lipossômico da pre- sente invenção é que a taxa de liberação é acelerada de modo eficaz, o ín- dice terapêutico do lipossoma é aperfeiçoado, o período de meia-vida é sig- 20 nificativamente prolongado, a toxicidade é marcantemente reduzida em comparação aos produtos atualmente no mercado e assim os efeitos tera- pêuticos eficazes do fármaco são obtidos. Por exemplo, para uma prepara- ção farmacêutica lipossômica obtida empregando-se fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), a toxicidade da 25 mesma é marcantemente reduzida e o seu índice terapêutico é significati- vamente reduzido. Ao contrário, se uma camada dupla de fosfolipídeo for composta de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), a liberação do fármaco será muito rápida e conduzirá a uma toxicidade observável, mesmo a segurança não sendo tão boa quanto a de um fármaco livre. Sem desejar estar ligado a 30 qualquer teoria, presume-se que a preparação lipossômica unilamelar pe- quena da presente invenção possa acelerar a liberação do fármaco, uma vez que a preparação lipossômica unilamelar pequena pode conter mais partícu- Ias lipossômicas nas quais está contida precipitação do fármaco com tama- nho de partícula pequeno, em comparação à preparação lipossômica unila- melar maior, se a taxa de fármaco/lipídeo for fixa. A precipitação do fármaco com tamanho de partícula pequeno teria uma área de superfície específica 5 relativamente grande e assim teria uma taxa de dissolução mais rápida nas mesmas condições.

Além disso, a preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção seria preparada empregando fosfolipídeos apropriados de modo obter uma liberação eficaz do fármaco nos tecidos-alvo, especialmente nos tumores. Preferivelmente, a camada dupla de fosfolipídeo da preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção é composta de fosfolipídeos com uma temperatura de fase de transição relativamente alta. Durante os experimentos, foi verificado que a toxicidade da preparação diminuiria signi- ficativamente e o índice terapêutico seria notavelmente aperfeiçoado se a fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e a dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ou similares fossem empregadas na preparação. Se a camada du- pla de fosfolipídeo for composta de dimirístoil fosfatidilcolina (DMPC), a libe- ração do fármaco seria muito rápida e conduziria a uma toxicidade notável e mesmo a segurança não seria tão boa quanto em um fármaco não- encapsulado.

A preparação farmacêutica lipossômica da presente invenção pode ser administrada a um paciente que precise da mesma em uma via de administração geralmente usada na no campo. Em uma concretização da presente invenção, o fármaco lipossômico é formulado em uma preparação 25 para administração parenteral. Em uma concretização preferida da presente invenção, o fármaco lipossômico é administrado por injeção.

A presente invenção também provê um método para o tratamen- to da doença, especialmente tumores em um paciente, o método compreen- dendo administração da preparação farmacêutica lipossômica da presente 30 invenção ao paciente que precise do tratamento. Preferivelmente, um méto- do de termoterapia (tal como um método de termoterapia radioativa) também pode ser aplicado em combinação com um paciente com tumor, a fim de me- Ihorar o efeito terapêutico da preparação farmacêutica lipossômica. Na pre- sente invenção, o paciente pode ser um mamífero, preferivelmente um ser humano.

A presente invenção também refere-se ao uso da preparação lipossômica ou preparação farmacêutica lipossômica conforme mencionado acima na fabricação de um fármaco para tratamento de um paciente com tumor.

A presente invenção é ilustrada, adicionalmente, pelos exemplos que se seguem, que são apenas exemplares e não devem ser tidos como limitando a presente invenção.

Parte 1: Preparação dos Iipossomas Exemplo 1

Métodos Gerais para Preparação dos Lipossomas

1. Método Geral 1

Fosfolipídeo (por exemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), di- palmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ou dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC)) e co- lesterol (razão molar de 1:1 a 10:1) são dissolvidos em um solvente orgâni- co, tal como álcool í-butílico ou ciclo-hexano, para formar uma solução límpi- da. A solução é tratada por liofilização convencional para obter um pó Iiofili- 20 zado. O pó Iiofilizado é hidratado 60-65°C com (50-1.000 mM) solução de sulfato de amônio, solução de ácido cítrico ou solução de sulfato de metal de transição (por exemplo, sulfato de níquel), e agitado por cerca de 1 hora pa- ra obter vesículas multilamelares heterogêneas. O tamanho das vesículas obtidas é reduzido por um microfluidificador ou um aparelho de extrusão de 25 pressão alta para obter os lipossomas. Uma amostra dos Iipossomas obtidos é diluída 200 vezes com solução de NaCI a 0,9% e detectada por NanoZS. A solução de tampão extralipossômica é removida por aparelho de ultrafiltra- ção para formar um gradiente de transmembrana dinâmico. Uma solução de cloridrato de mitoxantrona (10 mg/mL) é adicionada aos lipossomas vazios a 30 uma taxa de lipossoma/fármaco apropriada, e a carregamento do fármaco é conduzido a 60-65°C. Após incubação por cerca de 1 hora, uma cromatogra- fia de exclusão de gel é empregada de modo a determinar eficácia de en- capsulamento (EE).

2. Método Geral 2

Fosfolipídeo (por exemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) ou dimiristoil fosfatidilcolina 5 (DMPC)) e colesterol (razão molar de 1:1 a 10:1) são misturados e uma dis- tearoil fosfatidiletanolamina modificada com polietileno glicol (DSPE-PEG) em 0,1-20% por mol de fosfolipídeo é adicionada ao mesmo tempo. A mistu- ra obtida é dissolvida em um solvente orgânico, tal como álcool f-butílico ou ciclo-hexano, para formar uma solução límpida. A solução é tratada por Iiofi- 10 lização convencional para obter um pó liofilizado. O pó Iiofilizado é hidratado 60-65°C com (50-1.000 mM) solução de sulfato de amônio, solução de ácido cítrico ou solução de sulfato de metal de transição (por exemplo, sulfato de níquel) e agitado por cerca de 1 hora para obter vesículas multilamelares heterogêneas. O tamanho das vesículas obtidas é reduzido por um micro- 15 fluidificador ou um aparelho de extrusão de pressão alta para obter os lipos- somas. Uma amostra dos lipossomas obtidos é diluída 200 vezes com solu- ção de NaCI a 0,9% e detectada por NanoZS. A solução de tampão extrali- possômica é removida por aparelho de ultrafiltração para formar um gradien- te de transmembrana dinâmico. Uma solução de cloridrato de mitoxantrona 20 (10 mg/mL) é adicionada aos lipossomas vazios a uma taxa de Iiposso- ma/fármaco apropriada e a carregamento do fármaco foi conduzido a 60- 65°C. Após incubação por cerca de 1 hora, uma cromatografia de exclusão de gel é empregada de modo a determinar eficácia de encapsulamento (EE). Exemplo 2

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM60

HSPC, colesterol e DSPE-PEG2000 a uma razão em peso de 3:1:1 foram dissolvidos em álcool t-butílico a 95% para formar uma solução límpida. A solução foi tratada por liofilização para obter um pó liofilizado. O pó liofilizado foi hidratado com uma solução de sulfato de amônio (300 mM) 30 a 60-65°C e agitado por cerca de 1 hora para obter vesículas multilamelares heterogêneas possuindo uma concentração final de fosfolipídeo de 96 mg/mL. O tamanho das vesículas foi reduzido por um microfluidificador para obter os lipossomas. Uma amostra dos lipossomas obtidos foi diluída 200 vezes com NaCI a 0,9% e detectada por NanoZS, apresentando um tama- nho médio de cerca de 60 nm e uma máxima principal entre 40 nm and 60 nm. A solução de sulfato de amônio extralipossômico foi removida por um 5 aparelho de ultrafiltração e substituída por uma solução com 250 mM de sa- carose e 50 mM de glicina para formar um gradiente de transmembrana di- nâmico. Uma solução de cloridrato de mitoxantrona (10 mg/mL) foi adiciona- da aos lipossomas vazios a uma razão de lipossoma/fármaco de 16:1, e o carregamento do fármaco foi conduzido a 60-65°C. Após incubação por cer- 10 ca de 1 hora, a eficácia de encapsulamento (EE) foi determinada como 100% por uma cromatografia de exclusão de gel. Os lipossomas obtidos fo- ram denominados PLM60.

Exemplo 3

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM85 HSPC, colesterol e DSPE-PEG2000 a uma razão em peso de

3:1:1 foram dissolvidos em álcool t-butílico a 95% para formar uma solução límpida. A solução foi tratada por liofilização para obter um pó liofilizado. O pó liofilizado foi hidratado com uma solução de sulfato de amônio (300 mM) a 60-65°C e agitado por cerca de 1 hora para obter vesículas multilamelares 20 heterogêneas possuindo uma concentração final de fosfolipídeo de 96 mg/mL. O tamanho das vesículas foi reduzido por um aparelho de extrusão de pressão alta para obter os lipossomas. Uma amostra dos lipossomas ob- tidos foi diluída 200 vezes com solução de NaCI e detectada por NanoZS, apresentando um tamanho médio de cerca de 85 nm. A solução de sulfato 25 de amônio extralipossômico foi removida por um aparelho de ultrafiltração e substituída por uma solução com 250 mM de sacarose e 50 mM de glicina para formar um gradiente de transmembrana dinâmico. Uma solução de clo- ridrato de mitoxantrona (10 mg/mL) foi adicionada aos lipossomas vazios a uma razão de lipossoma/fármaco de 16:1 e o carregamento do fármaco foi 30 conduzido a 60-65°C. Após incubação por cerca de 1 hora a eficácia de en- capsulamento (EE) foi determinada como 100% por uma cromatografia de exclusão de gel. Os lipossomas obtidos foram denominados PLM85. Exemplo 4

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM100

O mesmo método descrito no Exemplo 3 foi usado para preparar lipossoma de cloridrato de mitoxatrona PLM100, no qual a formulação era idêntica aquela de PLM60 e PLM85, porém o tamanho dos lipossomas era de 100 nm.

Exemplo 5

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM60-dppc

DPPC1 colesterol e DSPE-PEG2000 a uma razão em peso de 3:1:1 foram misturados, e outras etapas foram idênticas aquelas do Exemplo 2. Os lipossomas obtidos foram denominados PLM60-dppc.

Exemplo 6

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM60-dmpc

DMPC1 colesterol e DSPE-PEG2000 a uma razão em peso de 3:1:1 foram misturados, e outras etapas foram idênticas aquelas do Exemplo

2. Os lipossomas obtidos foram denominados PLM60-dmpc.

Exemplo 7

Preparação de Lipossoma de Mitoxantona PLM60-dmpc-0.1

DMPC1 colesterol e DSPE-PEG2000 a uma razão em peso de 3:1:0.1 foram misturados, e outras etapas foram idênticas aquelas do Exem- plo 2. Os lipossomas obtidos foram denominados PLM60-DMPC-0.1. Exemplo 8

Preparação de Lipossoma de Adiamicina PLD60

Adriamicina foi substituída por mitoxantrona durante a etapa de carregamento de fármaco e outras etapas foram idênticas aquelas do Exem- plo 2. Os lipossomas obtidos foram denominados PLD60.

Parte 2: Liberação do fármaco de diferentes formulações lipossômicas Exemplo 9

Diferenças de liberação de fármaco entre lipossoma de adriamicina PLD60 e lipossoma de mitoxantrona PLM60

No presente exemplo, mitoxantrona e adriamicina foram carre- gadas sob um gradiente de pH. Se uma determinada concentração de clore- to de amônio fosse adicionada a um meio de liberação, moléculas de amônia livres difundiriam-se para a fase interna do lipossoma com a ajuda do gradi- ente, de modo que o pH da fase interna seria elevado e o fármaco protonado na fase interna seria convertido em sua forma neutra podendo difundir atra- vés da membrana. Este processo aceleraria a dissolução de precipitação da fase interna do lipossoma neste meio tempo. A velocidade de liberação do fármaco foi controlada por ambas a dissolução da precipitação e a permeabi- lidade da membrana do lipossoma. As condições para liberação do fármaco foram como se segue. Os lipossomas foram diluídos 25 vezes com meios de liberação. Os meios de liberação eram isotônicos, tinham um pH de 7,4 e tinham uma concentração de cloreto de amônio de 2, 10 e 40 mM, respecti- vamente. Os lipossomas diluídos foram colocados em tubos de diálise e a diálise foi realizada em 2 mL de lipossoma diluído por 400 mL de meio de liberação a 37°C. As amostras foram tomadas em pontos de tempo diferen- tes para análise até 96 horas mais tarde.

Os dados obtidos foram submetidos a uma análise de regressão. Nos meios de liberação possuindo 2, 10 e 40 mM de cloreto de amônio, os períodos de meia-vida de liberação de fármaco de PLD60 foram de 94,3, 31,9 e 11,2 horas, respectivamente. Com relação ao PLM60, nenhuma libe- ração óbvia foi observada nos três meios de liberação. Uma vez que PLD60 e PLM60 não tem diferença na composição e no tamanho, a diferença da característica de cinética de liberação do fármaco seria atribuía a seus as- pectos farmacêuticos diferentes. A adriamicina e amitoxantrona são ambas antibióticos de antraciclina e suas diferenças repousam no fato de que a a- driamicina contém um grupo dissociável em pH fisiológico, enquanto a mito- xantrona contém dois grupos dissociáveis (pKa = 8,15) em pH fisiológico. Este exemplo ilustra que um fármaco com grupos multidissociáveis, tais co- mo, mitoxantrona pode formar uma precipitação complexa com contraíons quando um método de carregamento ativo é empregado, de modo que a liberação in vitro do fármaco é significativamente mais lenta. Por outro lado, um fármaco com um grupo unidissociável, tal como uma adriamicina, seria liberado muito rapidamente, mesmo em um meio de liberação sem plasma, quando for empregado um lipossoma de tamanho pequeno.

Exemplo 10

Comportamentos de Liberação dos Lipossomas de Mitoxantona com Tama- nhos Diferentes

Duas condições de liberação foram tomadas para comparar os

comportamentos de liberação dos lipossomas de mitoxantrona com tama- nhos diferentes.

Condição de Liberação 1: um lipossoma foi diluído 25 vezes com um meio de liberação. O meio de liberação contendo plasma humano a 50% foi ajus- 10 tado para ser isotônico por glicose e tinha um pH de 7,4. Outras condições eram idênticas aquelas do Exemplo 9. Os dados obtidos foram submetidos a uma análise de regressão. O resultado mostrou que o período de meia-vida de liberação de PLM60 foi de 56,4 horas, enquanto PLM85 não foi significa- tivamente liberado sob as mesmas condições.

Condição de Liberação 2: um meio de liberação contendo plasma humano a 50% e 20 mM de cloreto de amônio foi empregado e as outras condições sendo idênticas aquelas do Exemplo 9. Os dados obtidos foram submetidos a uma análise de regressão. O resultado mostrou que o período de meia- vida de liberação de PLM60 foi de 26,2 horas, enquanto o período de meia- 20 vida de liberação de PLM85 foi de 36,7 horas.

Este exemplo indicou, de modo suficiente, que a liberação do fármaco seria suficientemente melhorada por redução do tamanho do lipos- soma.

Exemplo 11

Comportamentos de liberação dos lipossomas de mitoxantrona com compo- sições de membrana diferentes

Foram empregadas as mesmas condições de liberação confor- me descritas no Exemplo 9. O resultado indicou que a meia-vida de libera- ção de PLM60-DPPC foi de 116 horas, a meia-vida de liberação de PLM60- 30 DMPC foi de 26 horas e a meia-vida de liberação de PLM60-DMPC-0.1 foi de 15 horas. Este exemplo indicou que o emprego de um fosfolipídeo com uma temperatura de fase de transição Tm mais baixa aceleraria a liberação do fármaco. Contudo, se a liberação do fármaco fosse acelerada excessiva- mente, a toxicidade do fármaco aumentaria muito e isto foi adicionalmente confirmado nos exemplos seguintes.

Parte 3: Farmacocinéticas in vivo 5 Exemplo 12

Comportamento farmacocinético de PLM60 nos camundongos Kunming e a comparação entre PLM60 e mitoxantrona livre

Este exemplo foi conduzida em camundongos Kunming machos com um peso corpóreo de cerca de 20g. Níveis diferentes de dosagem de mitoxantrona foram injetados através da veia da cauda dos camundongos. As dosagens de PLM60 foram de 1, 2 e 4 mg/kg e a dosagem de mitoxan- trona livre (FM) foi de 2 mg/kg. Amostras de plasma foram retiradas em pon- tos de tempo diferentes. Os métodos para processamento e detecção de amostras de plasma foram descritos no documento: Methods in enzymology, Vol: 391, p176-185. Os resultados foram mostrados na Tabela 1 e Figura 1, na qual foi claramente indicado que o período de meia-vida da mitoxantrona foi significativamente estendido por encapsulamento dos lipossomas. Na mesma dosagem, PLM60 apresentou um tempo de retenção na circulação sanguínea 32 vezes aquele de FM, e um AUC 3.700 vezes aquele de FM. Um gráfico de AUC contra dose indicou que PLM60 apresentou uma farma- cocinética linear in vivo.

Tabela 1: Farmacocinética de PLM60 e FM em camundongos Kunming

PLM60 PLM60 PLM60 FM 4 mg/kg 2 mg/kg 1 mg/kg 2 mg/kg Parâmetros Valor Valor Valor Valor AUC 0- 1.451,666 728,398 452,709 0,198 48(mg/L*h) AUC 0- 1.654,543 892,437 503,078 0,199 °°(mg/L*h) AUMC 0-48 21.838,034 12.050,681 7.049,259 0,103 AUMC 0-°° 36.234,611 24.686,917 10.488,811 0,135 MRT 0-48(h) 15,043 16,544 15,571 0,517 MRT 0-°°(h) 21,900 27,662 20,849 0,675 PLM60 PLM60 PLM60 FM

4 mg/kg 2 mg/kg 1 mg/kg 2 mg/kg

Tmax(h) 0,083 0,083 0,250 0,083

Cmax(mg/L) 86,329 47,513 25,970 0,699

Exemplo 13

Distribuição de PLM60 e FM no tecido em camundongos portando tumor

Não foram apresentadas diferenças óbvias na distribuição de PLM60 e FM no tecido em camundongos portando tumor. Os camundongos Kunming machos apresentando um peso corpóreo de cerca de 20 g foram empregados no presente exemplo. Os camundongos foram inoculados de- baixo da articulação da pata direita com células de sarcoma S-180 a uma taxa de 5 x 105. Os fármacos foram injetados através da veia nos camun- dongos quando o tumor cresceu para 0,4-0,7 g. Após a administração dos fármacos, os camundongos foram executados em vários pontos de tempo e seus tecidos retirados de modo a determinar a concentração de mitoxantro- na. Os tecidos incluíram corações, fígados, baços, pulmões, rins, intestinos, medulas ósseas e tumores. Os resultados mostraram que PLM60 apresen- tou um direcionamento muito claro dos tecidos tumorais.Os dados detalha- dos foram mostrados na Tabela 2 e figura 2.

Tabela 2: Dados de distribuição de PLM60 e FM no tecido de camundongos normais

Tecido PLM-60 FM 4 mg/kg 4 mg/kg t(h) C-pg/g SD t(h) C-pg/g SD Coração 1 4,01 0,38 1 5,385 0,679 4 3,39 0,38 4 3,517 0,952 8 3,48 0,64 8 3,197 0,357 16 2,83 0,57 24 2,943 0,549 24 2,06 0,48 Fígado 1 6,78 0,78 1 4,770 0,997 4 5,99 0,67 4 3,556 0,543 8 6,31 0,38 8 2,659 0,439 16 6,22 0,95 24 1,937 0,346 Tecido 24 PLM-60 0,65 FM 4 mg/kg 4 mg/kg 4,52 Baço 1 4,66 1,37 1 4,044 0,414 4 4,36 0,67 4 4,460 0,494 8 4,78 1,70 8 3,774 2,676 16 7,56 2,13 24 7,752 2,469 24 5,91 1,00 Pulmão 1 8,44 1,08 1 10,205 1,732 4 4,58 2,36 4 8,024 1,859 8 6,33 1,43 8 7,018 0,728 16 5,12 1,24 24 8,082 0,844 24 2,89 0,23 Rins 1 7,09 0,84 1 18,243 1,238 4 7,12 1,17 4 17,192 5,010 8 7,04 0,96 8 13,409 1,251 16 6,75 1,16 24 7,463 1,209 24 5,82 0,84 Intestino 1 1,66 0,66 1 1,532 0,309 4 2,33 0,66 4 2,140 0,655 8 2,34 0,64 8 2,551 1,204 16 2,42 0,51 24 3,936 1,625 24 2,25 0,32 Medula ós¬ 1 1,09 0,54 1 0,127 0,041 sea 4 0,64 0,14 8 0,73 0,16 16 0,54 0,24 24 0,12 0,02 Tumor 1 91,28 7,41 1 0,0614 0,007« 4 63,90 8,56 4 0,0133 0,002' 8 54,01 8,04 16 38,61 9,19 24 10,41 2,67 15

20

Exemplo 14

Comparação farmacocinética das diferentes formulações lipossômicas

Os animais empregados neste exemplo eram similares aos do Exemplo 12. PLM60-DPPC, PLM60-DMPC-0.1 e PLM60-DMPC a 4 mg/kg foram injetados nos camundongos através da veia da cauda. Os dados fo- ram mostrados na Tabela 3 e figura 3. Foi mostrado que a farmacocinética dos fármacos lipossômicos mudou significativamente com a alteração da composição da membrana lipossômica. Os valores MRT de PLM60-DPPC, PLM60-DMPC-0.1 e PLM60-DMPC in vivo foram de 14,22, 7,914 e 10,123 horas, respectivamente. A diferença entre PLM60-DPPC e PLM60-DMPC repousou nos comprimentos das cadeias de hidrocarboneto dos fosfolipí- deos que eram de 16 e 14 carbonos, respectivamente. O comprimento da cadeia de acila influenciaria significativamente a permeabilidade da mem- brana da camada dupla de fosfolipídeo. A temperatura da fase de transição de DPPC era de 410C e a temperatura de fase de transição de DMPC era de 23°C. A diferença entre PLM60-DMPC-0.1 e PLM60-DMPC repousou no grau de PEGilação. A liberação do fármaco lipossômico no plasma depende de dois fatores: um é a liberação do fármaco lipossômico através da camada dupla de fosfolipídeo e o outro é a retirada pela lipoproteína e sistema reticu- Ioendotelial (RES). Uma vez que a PEGilação de PLM60-DMPC-0.1 não foi completa, a liberação causada pelos componentes do plasma teve mais in- fluencias nisto.

Tabela 3: Comparação das farmacocinéticas in vivo de diferentes formula- ções lipossômicas nos camundongos

PLM60-DPPC PLM60-DMPC- PLM60-DMPC

4 mg/kg 0,1 4 mg/kg 4 mg/kg

Parâmetro Valor Valor Valor

AUC 0-48(mg/L*h) 1.506,710 174,849 337,641 AUC 0-°°(mg/L*h) 1.581,242 175,705 344,134 AUMC 0-48 21.425,274 1.383,757 3417,981 AUMC 0-«° 26.235,613 1.478,267 3.818,856 MRT 0-48(h) 14,220 7,914 10,123 MRT 0-°°(h) 16,592 8,413 11,097 5

10

15

PLM60-DPPC PLM60-DMPC- PLM60-DMPC

4 mg/kg 0,1 4 mg/kg 4 mg/kg

Tmax(h) 1,000 1,000 1,000

Cmax(mg/L) 81,976 19,853 39,115

Parte 4: Comparação da toxicidade de formulações diferentes Exemplo 15

Comparação de Toxicidade Aguda entre PLM60 E FM

100 camundongos Kunming (metade machos e metade fêmeas) com um peso corpóreo de 18-22 g foram divididos em 10 grupos, cada grupo com 10 camundongos, metade machos e metade fêmeas. Os camundongos dos grupos 1-5 receberam níveis de dose diferentes de FM, enquanto os camundongos dos grupos 6-10 receberam nível de dose equivalente do fár- maco lipossômico. Alterações no peso corpóreo foram observadas e a hora da morte de cada animal foi registrada. Os animais mortos foram dissecados e autopsiados. Os resultados de todos os grupos foram ilustrados na Tabela

4, que mostrou que a toxicidade aguda de PLM60 foi bem menor em relação a FM.

Tabela 4: Comparação da toxicidade aguda de PLM60 e FM nos camundon- gos Kunming

Lipossoma e Tempo de sobrevivência Tempo de sobrevivência dos dose dos camundongos machos camundongos fêmeas (dias) (dias) mg/kg N0 1 N0 2 CO N0 4 N0 5 N0 1 N0 2 N0 3 N0 4 N0 5 O Z FM 20 7 8 8 9 6 8 8 8 9 NA FM 12 18 13 13 NA 7 12 12 13 14 NA FM 7.2 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA FM 4.32 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA FM 2.59 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA PLM60 20 17 NA 12 NA NA NA NA NA NA NA PLM60 12 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA PLM60 7.2 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA PLM60 4.32 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA PLM60 2.59 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA: Nenhum dado, isto é, nenhum animal morto ao final da observação do experimento.

Exemplo 16

Comparação da toxicidade aguda de formulações lipossômicas diferentes 5 90 camundongos machos Balb/c com um peso corpóreo de 18-

22 g foram divididos em 9 grupos, cada grupo contendo 10 camundongos. Os camundongos do grupo 1 receberam 6 mg/kg de FM, enquanto os ca- mundongos dos outros 8 grupos receberam 6 e 12 mg/kg de PLM60, PLM60-DPPC e PLM60-DMPC-0.1 e PLM60-DMPC respectivamente. Alte- 10 rações no peso corpóreo foram observadas e a hora da morte de cada ani- mal foi registrada. Os animais mortos foram dissecados e autopsiados. Os resultados da morte dos camundongos do grupo FM e grupos de fármaco lipossômico foram mostrados na Tabela 5. Este experimento mostrou que a ordem da toxicidade aguda foi: PLM60 < PLM60-DPPC < PLM60-DMPC-0.1 15 FM < PLM60-DMPC. Este experimento também confirmou que a liberação do fármaco poderia ser adicionalmente acelerada por emprego de vesículas unilamelares pequenas e fosfolipídeo com uma Tm menor como a composi- ção de camada dupla, tal como, PLM60-DMPC, pelo que, resultando em mais toxicidade in vivo. Deve ser observado que a toxicidade dos lipossomas 20 com PEGilação incompleta foi inferior em relação à dos lipossomas com PEGilação mais completa. Isto pode ser atribuído ao fato de que sob a ação da lipoproteína e o ataque do sistema imune durante a circulação no sangue, PLM60-DMPC-0.1 com PEGilação incompleta liberaria o fármaco mais fa- cilmente em comparação ao PLM60-DMPC e não liberaria repentinamente 25 nos tecidos importantes, pelo que, exibindo uma toxicidade mais baixa, po- rém a toxicidade de PLM60-DMPC-0.1 ainda era mais equivalente àquela da mitoxantrona livre.

Tabela 5: Comparação da toxicidade aguda de lipossomas diferentes

Tempo de sobrevivência dos Formulação e dose(mg/kg) camundongos(dias)

123456789 10

NNNNNNNNNN hM"b AAAAAAAAAA Formulação e dose(mg/kg)

Tempo de sobrevivência dos camundongos(dias)

10

15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PLM60-6 N N N N N N N N N N A A A A A A A A A A PLM60-12 N N N N N 10 N N N 11 A A A A A A A A Plm60DPPC-6 N N N N N N N N N N A A A A A A A A A A Plm60DPPC-12 10 10 12 11 N N N 13 N 14 A A A A Plm60-DMPC-6 4 N N 3 6 7 7 6 N N A A A A Plm60DMPC-12 3 3 5 3 3 3 4 3 3 3 Plm60DMPC-0.1-6 N N N N N N N N N N A A A A A A A A A A Plm60DMPC-0.1-12 10 12 10 12 10 10 10 11 10 10 NA:Nenhum animal morto ao final da observação experimental.

Exemplo 17

Comparação da Toxicidade de Formulações de Lipossoma com Tamanhos Diferentes

Camundongos machos C57 com um peso corpóreo de 18-22 g foram empregados na comparação de toxicidade de PLM60, PLM85 e PLM100. A dose foi de 9 mg/kg. Os resultados indicaram que as variações de peso corpóreo causadas pelas três formulações lipossômicas eram equi- valentes, o que confirmou que as três formulações lipossômicas não apre- sentaram diferença significativa na toxicidade sob condições experimentais. Nos camundongos do grupo FM, o peso corpóreo diminuiu em 30% e cerca de 20% nos camundongos mortos.

Parte 5: Efeitos Antitumorais in vivo Exemplo 18

Comparação dos efeitos do tratamento de PLM60 e FM no sarcoma S-180

Camundongos portando tumor ascítico que foram inoculados com células tumorais S180 7 dias antes foram executados por degolamento e fluido ascítico viscoso e leitoso foi extraído e diluído com meio RPMI 1640. Após diluição, o número de células tumorais foi ajustado para 2,5 x 106 célu- las/mL. 0,2 mL da suspensão de células tumorais contendo cerca de 5 x 105 células tumorais foi inoculado nos tecidos da parte inferior da articulação da pata dianteira dos camundongos machos KM com um peso corpóreo de 18- 5 22 g. Após inoculação, as células na suspensão de células tumorais residu- ais foram contadas sob Iuz de microscópio e as células tumorais vivas so- mavam mais de 95%. O número de camundongos inoculados foi de 80.

Sete dias após inoculação, 39 camundongos com tumores de corte limpo apresentando um diâmetro de cerca de 5 mm foram seleciona- 10 dos e divididos em 5 grupos por ambos volume do tumor e peso corpóreo, isto é, 7 camundongos no grupo de controle de inócuo, 8 camundongos em cada grupo de 4 mg/kg de PLM60, grupo de 6 mg/kg de PLM60, grupo de 4 mg/kg de FM e grupo de 6 mg/kg de FM. Os camundongos receberam inje- ção intravenosa.

Os camundongos reproduziram normalmente após administra-

ção. Os diâmetros dos tumores foram medidos por calibrador de precisão 3 vezes por semana e os pesos corpóreos foram medidos ao mesmo tempo. O volume do tumor (TV) foi calculado com a seguinte fórmula: V = 1/2 χ a χ b2, na qual a e b representam comprimento e largura, respectivamente. Os vo- 20 lumes tumorais foram calculados por emprego dos resultados de medição. Os camundongos foram decapitados no vigésimo primeiro dia após inocula- ção, os tumores foram retirados e pesados. A taxa de inibição do tumor (%) foi calculada com a fórmula que se segue: taxa de inibição do tumor = (1 - peso médio do tumor do grupo de fármaco/peso médio do tumor do grupo de 25 controle) 100%. O resultado experimental foi testado pelo teste t.

A Tabela 6 mostrou que o crescimento do tumor sólido S180 foi significativamente suprimido no grupo de 4 mg/kg de PLM60 e no grupo de 6 mg/kg de PLM60. Tabela 6: Efeitos de PLM60 no peso do tumor sólido de S180 Grupo Peso do tumor (mg) Taxa de inibição do tumor (%) Controle 2.813,8±884,2 PLM60 4 mg/kg 421,9±215,4a 85,00 PLM60 6 mg/kg 332,4±162,5a 88,19 Mitoxantona livre 4 mg/kg 2.828,5±1.067,8 --- Mitoxantona livre 6 mg/kg 2.293,311.720,0 18,50 a: em comparação com o grupo de controle, p < 0,01 Exemplo 19

Efeitos do Tratamento de PLM60 e FM no modelo de ascitos L1210

Camundongos BDF1 de tumor ascítico que foram inoculados com células tumorais ascíticas L1210 7 dias antes foram executados por degolamento e fluido ascítico viscoso e leitoso foi extraído sob condição as- séptica e diluído com meio RPMI 1640. Após diluição, o número de células tumorais foi ajustado para 2,5 χ 106 células/mL. 0,2 mL da suspensão de células tumorais contendo cerca de 5 χ 105 células tumorais foi inoculado na cavidade abdominal de um camundongo BDF1 fêmea de 7-8 semanas de idade. Após inoculação, as células na suspensão de células tumorais residu- ais foram contadas sob Iuz de microscópio e as células tumorais vivas so- mavam mais de 95%.

24 horas mais tarde, os camundongos foram divididos em 8 gru- pos por peso corpóreo e receberam administração de FM a 2, 4 e 8 mg/kg, e PLM60 a 2, 4, 6 e 8 mg/kg por injeção em um volume de 20 mL/kg através da veia da cauda, respectivamente. Após administração, os camundongos reproduziram normalmente. Seus pesos corpóreos foram medidos 3 vezes por semana, a hora da morte de cada camundongo foi observada e registra- da e o tempo de sobrevivência foi calculado. O tempo de sobrevivência mé- dio (MST) e o tempo de sobrevivência mediano foram empregados para ava- liar o tempo de sobrevivência de cada grupo. Observação experimental foi mantida por 60 dias após a inoculação.

Os dados foram analisados por software de estatística SPSS 11.5. Os resultados mostraram que todos os grupos de administração exibi- ram aumento significativo no tempo de sobrevivência em comparação ao grupo de controle e que o grupo de PLM60 (8 mg/kg) exibiu aperfeiçoamento significativo do tratamento em comparação ao grupo FM na mesma dose (P < 0,05). Os resultados foram mostrados na Tabela 7.

Tabela 7: Efeitos do tumor ascítico L1210 no tempo de sobrevivência dos camundongos BDF1

Grupo Dose Número Número Tempo de sobrevivência (In¬ Taxa (mg/kg) de de tervalo de confiança de 95%) de Tempo de Tempo de sobrevivência sobrevivência médio mediano Controle --- 13 13 9,62±0,40 9,00+0,25 0 (8,83-10,40) (8,51-9,49) PLM60 2 12 11 20,17±3,77 14,00+1,15 8,33 (12,77-27,56) (11,74-16,26) 4 12 9 36,75±4,00 31,00+0,85 25,00 (28,92-44,58) (29,33-32,67) 6 12 10 28,42±4,49 25,00+3,46 16,67 (19,63-37,21) (18,21-31,79) PLM60 2 12 9 36,4214,08 29,00+1,71 25,00 (28,41-44,42) (25,65-32,35) 4 11 2 57,55+1,60 Nb 81,82 (54,40-60,69) 6 12 5 48,00+4,38 Nb 58,33 (39,42-56,58) 8 12 4 53,00+3,71 Nb 66,67 (45,72-60,28) Nb: Apenas alguns animais morreram ao final da observação experimental de 60 dias e o tempo de sobrevivência mediano não pode ser calculado.

Exemplo 20

Efeitos do tratamento com PLM60 e FM no modelo de metástase no fígado relacionado a L1210

Camundongos BDF1 portando tumor ascítico que foram inocula- dos com células tumorais ascísticas L1210 7 dias antes foram executados por degolamento e fluido ascítico viscoso e leitoso foi extraído sob condição asséptica e diiuíao com meio RPMI 1640. Após diluição, o número de células tumorais foi ajustado para 2,5 χ 105 células/mL. 0,2 mL da suspensão de células tumorais contendo cerca de 5 χ 104 células tumorais foi inoculado intravenosamente em um camundongo BDF1 macho com 7-8 semanas de vida. Após inoculação, as células na suspensão de células tumorais residu- 5 ais foram contadas sob Iuz de microscópio e as células tumorais vivas so- mavam mais de 95%. Sessenta e dois camundongos foram inoculados no total.

24 horas mais tarde, os camundongos foram agrupados e rece- beram administração. Após a administração, os camundongos reproduziram 10 normalmente. Os pesos corpóreos dos camundongos foram medidos 3 ve- zes por semana, a hora da morte de cada camundongo foi observada e re- gistrada e o tempo de sobrevivência foi calculado. A observação experimen- tal foi mantida por 60 dias após a inoculação.

O resultado mostrou que todos os camundongos no grupo de 15 controle morreram entre o décimo primeiro e o décimo quarto dia após ino- culação, todos os camundongos nos três grupos de nível de dose de FM morreram entre o décimo primeiro e o décimo sétimo dia após inoculação, todos os camundongos no grupo de PLM60 de 2 mg/kg morreram entre o décimo quinto e o vigésimo novo dia após inoculação, apenas um camun- 20 dongo no grupoPLM60 de 6 mg/kg morreu no trigésimo nono dia após inocu- lação e nenhum camundongo no grupo PLM60 8 mg/kg morreu durante a observação.

Os dados foram analisados por software de estatística SPPS

11.5. Os resultados mostraram que o grupo FM de 6 mg/kg e todos os gru- 25 pos de fármaco lipossômico exibiram um aumento significativo no período de sobrevivência dos camundongos em comparação ao grupo de controle de placebo. No mesmo nível de dose, mitoxantrona lipossômica exibiu um au- mento significativo no período de sobrevivência dos camundongos em com- paração à mitoxantrona livre. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Tabela 8: Efeitos da inoculação intravenosa de L1210 no período de sobrevi- vência de camundongos BDF1

Grupo Dose Número Número Tempo de sobrevivência (In¬ Taxa (mg/kg) de de tervalo de confiança de 95%) de Tempo de Tempo de sobrevivência sobrevivên¬ médio cia mediano Controle --- 6 6 11,83±0,48 11,0 0 (10,90-12,77) PLM60 2 8 8 12,13±0,61 11,0 0 (10,93-13,32) 4 8 8 13,25±0,53 13,00±0,46 0 (12,22-14,28) (12,11- 13,89) 6 8 8 14,50±0,71 14,00±0,91 0 (13,11-15,89) (12,21- 15,79) PLM60 2 8 8 19,13±1,57 18,00±1,41 0 (16,04-22,21) (15,23- 20,77) 4 8 5 36,50±6,51 22,00±5,660 37,50 (23,75-49,25) ,61 (10,91- 33,09) 6 8 1 57,38±2,46 Nb 87,50 (52,56-62,19) 8 8 0 Na Na 100,00 Na: Nenhum animal morreu até o final de 60 dias de observação do experi- mento e o tempo de sobrevivência médio não foi calculado.

Nb: Apenas um dos animais morreu ao final de 60 dias de observação do experimento e o tempo de sobrevivência mediano não foi calculado.

Exemplo 21

Efeitos do tratamento com mitoxantrona lipossômica de tamanhos diferentes no tumor ascístico L1210 O esquema experimental e o modo de processar os dados foram

os mesmos que no Exemplo 19. Cinco grupos foram estabelecidos, incluindo grupo de controle, grupo FM, grupo PLM60, grupo PLM85 e grupo PLM100. A dosagem de administração para camundongos em cada grupo foi de 4 mg/kg. Os resultados foram mostrados na Tabela 9. Os resultados mostra- ram que o lipossoma com tamanho menor tinha efeitos de tratamento melho- res.

Tabela 9: Efeitos do tumor ascítico L1210 no tempo de sobrevivência dos 5 camundongos BDF1

Grupo Dose Número Número Tempo de sobrevivência (In¬ Taxa (mg/kg) de de tervalo de confiança de 95%) de Tempo de Tempo de sobrevivência sobrevivên¬ médio cia mediano Con¬ --- 12 12 9,08±0,19 9,00±0,21 0 trole FM 4 12 8 38,67±3,54 36,00±6,06 33,33 PLM6 4 12 4 47,00±2,88 Nb 66,67 0 PLM8 4 12 8 39,17±4,1 38,00±11,26 33,33 PLM1 4 12 10 30,08±3,59 23,00±2,89 16,66 00 Nb: Apenas alguns animais morreram ao final de 60 dias de observação do experimento e o tempo de sobrevivência médio não foi calculado.

Alguns exemplos preferidos da presente invenção são descritos acima, porém estes exemplos de modo algum pretendem limitar o escopo da 10 invenção. Além do que foi descrito e ilustrado no texto, um versado na técni- ca comum poderá conceber outras modificações e variações da presente invenção após leitura da descrição da mesma e todas estariam cobertas no escopo de proteção da presente invenção. Todas patentes, pedidos de pa- tente publicados e publicações citados no presente documento são incorpo- 15 rados como referência e seus textos plenamente incorporados a presente.

Claims (20)

1. Fármaco lipossômico, em que (1) o fármaco lipossômico com- preende um fármaco iônico multivalente como um ingrediente ativo, que a- presenta dois ou mais grupos dissociáveis com uma constante de dissocia- ção de 4,5-9,5; (2) o tamanho do lipossoma é de 30-80 nm; (3) a camada dupla de lipossoma compreende os materiais que se seguem: um fosfolipí- deo com uma temperatura de fase de transição (Tm) superior à temperatura corpórea, colesterol e um lipídeo modificado com polímero hidrófilo e (4) a fase intralipossômica compreende um contraíon multivalente.

2. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1, onde o tamanho do lipossoma é de 35-75 nm, preferivelmente 40-70 nm, especial- mente 40-60 nm.

3. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a constante de dissociação pKa do ingrediente ativo é 5,0-9,5, prefe- rivelmente 5,5-9,5, mais preferivelmente 6,0-9,0, especialmente 6,5-9,0.

4. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o dito fármaco iônico multivalente é um fármaco anticâncer, tal como mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, vinblastina ou qualquer combinação do mesmo, preferivelmente mitoxantrona.

5. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o contraíon multivalente porta duas ou mais cargas opostas ao in- grediente do fármaco ativo e, por exemplo, é um radical de ácido orgânico, tal como um radical de ácido dos ácidos orgânicos saturados ou insaturados que se seguem: ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico e ácido maleico, etc.; um radi- cal de ácido inorgânico, tal como, radical de sulfato, radical de fosfato; ou uma forma iônica de aminoácido, tal como, cisteína, preferivelmente radical de citrato, radical de sulfato ou radical de fosfato.

6. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 5, em que o contraíon multivalente é radical de sulfato.

7. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo com uma temperatura de fase ‘ de transição (Tm) superior à temperatura corpórea no fosfolipídeo é selecio- nado de fosfatidilcolina, fosfatidilcolina de soja hidrogenada, fosfatidilcolina de gema de ovo hidrogenada, dipalmitoil fosfatidilcolina, distearoil fosfatidil- colina ou uma combinação do mesmo.

8. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 7, em que a camada dupla de fosfolipídeo compreende adicionalmente um fosfoli- pídeo com uma temperatura de fase de transição Tm não-superior à tempe- ratura corpórea, tal como dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e similares, além de um fosfolipídeo com uma temperatura de fase de transição Tm superior à temperatura corpórea.

9. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 8, em que o fosfolipídeo com uma temperatura de fase de transição Tm superior à temperatura corpórea na camada dupla de fosfolipídeo representa cerca de 50-100% em mol/mol, preferivelmente 55-95% em mol/mol, mais preferivel- mente 60-90% em mol/mol em relação ao teor total de fosfolipídeos.

10. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o teor de colesterol é cerca de 2-60% em mol/mol, por exemplo, 5- 55% em mol/mol, especialmente 10-50% em mol/mol, especificamente 15- 45% em mol/mol, mais especificamente 20-40% em mol/mol em relação ao número de mois total de ingredientes na camada dupla do lipossoma.

11. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os lipídeos modificados com polímeros hidrófilos são selecionados de distearoil fosfatidil etanolamina modificada com PEG (DSPE-PEG), diste- aroil fosfatidil glicerol modificado com PEG (DSPG-PEG), colesterol modifi- cado com PEG (col-PEG), distearoil fosfatidil etanolamina modificada com polividona (DSPE-PVP), distearoil fosfatidil glicerol modificado com polivido- na (DSPG-PVP), ou colesterol modificado com PEG (col-PVP), ou suas combinações, em uma quantidade preferivelmente de 0,1-20% em mol/mol, tal como 0,3-18% em mol/mol, 0,5-15% em mol/mol, 0,8-12% em mol/mol, 1- 10% em mol/mol, 2-8% em mol/mol, 2,5-7% em mol/mol ou 3-6% em mol/mol, etc. em relação ao número molar de fosfatídeos.

12. Preparação lipossômica de acordo com a reivindicação 11, que compreende fosfatidilcolina de soja hidrogenada, colesterol e distearoil fosfatidil etanolamina modificada com PEG em uma razão em mol de 3:1:1, na qual a distearoil fosfatidil etanolamina modificada com PEG é preferivel- mente uma distearoil fosfatidil etanolamina modificada com PEG2000.

13. Fármaco lipossômico de acordo com a reivindicação 1, em que a temperatura de fase de transição Tm do lipossoma é superior à tem- peratura corpórea.

14. Método para preparação do fármaco lipossômico como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1-13, que compreende as etapas que se seguem: (1) preparação de um lipossoma inerte com um tamanho de 30-80 nm empregando um fosfolipídeo com uma Tm superior à temperatura corpórea, colesterol e um lipídeo modificado com polímero hidrófilo; e (2) encapsulamento de um fármaco de íon multivalente no lipossoma, em que o fármaco de íon multivalente possui dois ou mais grupos dissociáveis com uma constante de dissociação de 4,5-9,5 e a fase interna do lipossoma compreende um contraíon multivalente.

15. Preparação farmacêutica lipossômica que compreende o fármaco lipossômico como definido em qualquer uma das reivindicações 1- 13 e/ou um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

16. Preparação farmacêutica lipossômica de acordo com a rei- vindicação 15, que compreende, adicionalmente, um ou mais outros ingredi- entes farmacêuticos.

17. Preparação farmacêutica lipossômica de acordo com a rei- vindicação 15 ou 16, que compreende, adicionalmente, um sal para alterara pressão osmótica, um agente de tamponamento e/ou um antioxidante e simi- lar.

18. Método para tratamento de uma doença, especialmente um tumor em um paciente, o método compreendendo: administração de um fármaco lipossômico como definido em qualquer uma das reivindicações 1- 13 ou a preparação farmacêutica lipossômica como definida em qualquer uma das reivindicações 15-17 ao paciente que necessite de tal tratamento.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, que compreende, adicionalmente, aplicação a um paciente com tumor de uma termoterapia combinatória, tal como uma termoterapia radioativa.

20. Uso do fármaco lipossômico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-13 ou da preparação farmacêutica lipossômica como definida em qualquer uma das reivindicações 15-17 na fabricação de um fármaco para o tratamento de um paciente portando um tumor.