PT1443900E - Composições de veículo lipídico com estabilidade melhorada no sangue - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES DE VEÍCULO LIPÍDICO COM ESTABILIDADE MELHORADA NO SANGUE"

Referências Cruzadas a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o beneficio do documento U.S. N° de Série 60/394 271, apresentado a 9 de Julho de 2002, e do documento U.S. N° de Série 60/331 248, apresentado a 13 de Novembro de 2001. Os conteúdos destes pedidos são aqui incorporados por referência.

Campo Técnico A presente invenção refere-se a composições lipossómicas possuindo um tempo de vida longo em circulação. Estes lipossomas incluem a incorporação de lípidos negativamente carregados que não incluem zwiteriões. Técnica Anterior

Os lipossomas são veículos de distribuição preparados a partir de dispersões aquosas de lípidos anfitílicos organizados em uma ou mais bicamadas à volta de um núcleo aquoso central. Os solutos podem ser enclausurados no compartimento aquoso interno protegendo-os, deste modo, da reacção com os componentes do 1 sangue. De modo a distribuir eficazmente um agente enclausurado num determinado sitio alvo, é desejável que um lipossoma apresente uma longevidade em circulação e retenção de um agente encapsulado óptima.

As propriedades farmacológicas dos lipossomas podem ser alteradas por variação dos tipos de lípidos incorporados na membrana. Os lipossomas compostos por lípidos neutros (sem carga global) são normalmente empregues uma vez que tais lipossomas são estáveis após exposição a numerosos componentes proteicos, de hidratos de carbono e lipídicos presentes no compartimento sanguíneo. A incorporação de lípidos negativamente carregados, tais como fosfatidilserina em composições lipossómicas resultou num aumento do reconhecimento e eliminação de lipossomas da circulação. Kirby, et al., Biochem. J. (1980) 186:591-598. Deste modo, a distribuição de fármacos em sítios de doença é reduzida. Allen, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA (1998) 85:8061-8071.

Uma comparação dos tempos de vida em circulação de lipossomas contendo fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, cardiolipina e fosfatidilserina revelou que os lipossomas de fosfatidilserina foram eliminados rapidamente da circulação, enquanto os lipossomas de cardiolipina, fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol foram eliminados a uma taxa reduzida em ratos (Kao, Y, et al., J. Pharm. Sei. (1980) 69:1338-1349).

Embora seja sabido que certos lipossomas carregados negativamente possam ter utilidade em aplicações in vivo, a utilização destes lípidos para conferir propriedades de longa circulação foi apenas recentemente reconhecida. Documento W099/59547. Estes estudos revelaram que a incorporação de 2 fosfatidilglicerol em lipossomas contendo colesterol/DPPC levaram a estabilidade melhorada no sangue. Estas investigações também revelaram, contudo, que a % de incorporação molar do lípido dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) tem influência nas propriedades em circulação do veiculo como lipossomas colesterol/DPPC, preparados com menos do que 10% molar de DMPG, apresentaram propriedades de estabilidade aumentada no sangue em relação aos preparados com mais do que 10% molar de DMPG. Foi também notado que os componentes lipidicos, tais como diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) e dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC) possuem propriedades indesejáveis e, deste modo, não foram incluídas nestas formulações.

As preparações lipossómicas que contêm fosfatidilglicerol para além de lípidos que formam vesículas adicionais são descritas em Brodt, P., et al., Câncer Immunol. Immunother. (1989) 28:54-58 e por Hope, et al., Patente U.S. 6139871. Nestas preparações, contudo, o lípido carregado negativamente acoplado a uma porção hidrofílica que é não-zwiteriónica, exemplificada por PG, está presente numa quantidade inferior a 10% molar. De um modo semelhante, os lipossomas descritos no documento W099/59547 incluem menos do que 10% molar de PG. Os lipossomas descritos por Akhtar, S., et al., Nucleic Acids Res. (1991) 19:5551-5559 e por Ahl, P. L., et al., Biochim. Biophys. Acta (1997) 1329:370-382 e por Farmer, M. C., et al., Meth. Enzymol. (1987) 149:184-200 contêm quantidades substanciais de colesterol, contrariamente aos lipossomas da presente invenção. Adicionalmente, os lipossomas de Akhtar apresentam temperaturas de transição mais baixas do que 38 °C, uma vez que as cadeias acilo contidas nos fosfolípidos empregues contêm menos do que 18 átomos de carbono. 3 A Patente U.S. 5415869 descreve formulações de taxol contidas nos lipossomas que podem conter fosfatidilcolinas e fosfatidilgliceróis. Não é sugerido que os lipossomas possuam vidas de circulação prolongadas, nem é indicado que sejam preferidas temperaturas de transição acima dos 38 °C. A Patente U.S. 4769250 descreve formulações produzidas a partir de misturas de fosfolípidos aniónicos e neutros incluindo DSPG e DSPC; contudo, estes lipossomas são SUV com dimensões de 45-55 nm.

Foram adicionados crioprotectores às preparações de lipossomas de modo a prevenir os efeitos prejudiciais devidos a congelação e crio-secagem (liofilização). Dissacáridos, tais como trealose, sacarose, lactose, sorbitol, manitol, sacarose, maltodextrina e dextrano são os crioprotectores utilizados mais comuns (ver documento WO01/05372 e Patente U.S. N° 5077056).

Foram utilizados crioprotectores ligados à membrana com o objectivo de melhorar ainda mais a resistência aos danos da congelação e da liofilização. Em particular, os açúcares ligados a superfícies membranares dos lipossomas através de ligantes de oligo (óxido de etileno) que consistem de uma a três unidades de repetição foram descritos como sendo crioprotectores (Bendas, et al., Eur. J. Pharma. Sei. (1996) 4:211-222; Goodrich, et al., Biochemistry (1991) 30:5313-5318; Patente U.S. N° 4915951). Baldeschwieler, et al., relataram que, na ausência do grupo de açúcar terminal, os lipossomas preparados com o próprio ligante de óxido de oligo-etileno foram incapazes de proteger contra a fusão subsequente à congelação (ver Patente U.S. N° 4915951). 4 A inclusão de colesterol nas membranas lipossomais demonstrou reduzir a libertação do fármaco após administração intravenosa (por exemplo, ver: Patentes U.S. N° 4756910, 5077056 e 5225212; Kirby, C., et al., Biochem. J. (1980) 186:591-598; e Ogihara-Umeda, I., et al., Eur. J. Nucl. Med. (1989) 15:617). Geralmente, o colesterol aumenta a espessura da bicamada e a fluidez enquanto diminui a permeabilidade da membrana, interacções de proteína e desestabilização da lipoproteína do lipossoma. Abordagens convencionais à formulação de lipossoma ditam a inclusão de quantidades substanciais (e. g., 30-45% molar) de colesterol ou agentes de rigidificação de membrana equivalentes (tais como outros esteróis) nos lipossomas.

Descrição da Invenção

Esta invenção divulga, por isso, um lipossoma compreendendo: um lipido carregado negativamente possuindo uma porção hidrofílica e uma porção hidrofóbica com uma unidade neutra não-zwiteriónica ligada à porção hidrofílica do lipido. Em particular, os lipossomas, como aqui divulgados, estão substancialmente isentos de colesterol. Os lipossomas irão conter, tipicamente, um agente biologicamente activo. Os lipossomas da invenção apresentam, surpreendentemente, uma longevidade de circulação aumentada na corrente sanguínea. 0 lipido carregado negativamente é, tipicamente, um fosfolípido ou um esfingofosfolípido. De um modo preferido, o lipido é um fosfolípido; i. e., um glicerol ao qual se ligam 5 dois grupos acilo e em que o terceiro hidroxilo está acoplado a um fosfato. A unidade não-zwiteriónica é ligada a este lípido carregado negativamente, de um modo preferido, ao grupo fosfato. De um modo preferido, a unidade não-zwiteriónica é neutra, de modo que a carga negativa global num lípido utilizado nesta invenção seja unicamente devida à carga negativa do componente lipídico. A unidade não-zwiteriónica pode compreender grupos funcionais que conferem uma hidrofilicidade desejada ao lípido, sendo esses grupos seleccionados de álcoois, cetonas, ácidos carboxílicos, éteres e aminas. Uma unidade não-zwiteriónica preferida é um álcool de cadeia curta, tal como glicerol, ou um álcool cíclico, tal como inositol, ou um óxido de polialquileno, tal como PEG.

Numa forma de realização, os lipossomas compreendem mais do que 10% molar de um ou mais dos referidos lípidos de prevenção de agregação - i. e., o lípido carregado negativamente compreendendo uma unidade não-zwiteriónica, como descrito acima; e até 90% molar de um ou mais lípidos de formação de vesículas, em que o lipossoma não contém substancialmente qualquer colesterol. De um modo preferido, a unidade não-zwiteriónica é um álcool de cadeia curta, tal como glicerol, ou é um ciclitol, tal como inositol, ou um óxido de polialquileno. De um modo mais preferido, os lípidos que formam vesículas que constituem o lipossoma são seleccionados, de modo a que a temperatura de transição de fase do lipossoma seja mais do que, pelo menos, 38 °C, de um modo preferido, pelo menos, 40 °C. De um modo preferido, as dimensões dos lipossomas são da ordem de 80-200 nm ± 25 nm. Em relação à protecção contra a lesão por congelação, 6 pode estar presente tão pouco quanto 1% molar do lípido de prevenção de agregação.

Para armazenamento, os lipossomas da invenção podem ser congelados ou liofilizados e podem compreender crioprotectores. A quantidade de crioprotector utilizado depende do tipo de crioprotector e das caracteristicas do lipossoma a ser protegido. Os especialistas na técnica podem testar prontamente vários tipos de crioprotectores e concentrações, para determinar que tipo e concentração de crioprotector funcionam melhor para uma preparação de lipossoma particular. Em geral, foi determinado serem necessárias concentrações de açúcar na ordem de 100 mM e superior para alcançar o nivel de protecção mais elevado. Em termos de moles de fosfolípido de membrana, níveis milimolares na ordem de 100 mM correspondem a aproximadamente 5 moles de açúcar por mole de fosfolípido.

Os lipossomas da invenção podem não compreender substancialmente nenhum crioprotector. O termo "substancialmente nenhum crioprotector" refere-se a lipossomas compreendendo menos do que 2 0 mM de um crioprotector ou menos do que 10 mM de crioprotector. No caso em que estão presentes diferentes concentrações de crioprotector no interior e no exterior do lipossoma, a concentração mais elevada presente no exterior ou no interior é considerada como a concentração referida nestas definições.

No caso dos lipossomas da invenção se destinarem a ser congelados, é preferido, mas não necessário, que os lipossomas estejam substancialmente livres de colesterol e compreendam conjugados lipídicos de polímero hidrofílico, particularmente 7 aqueles com mais do que cerca de 125 daltons, na medida em que os lipossomas são resistentes a fusão e fuga do agente após a congelação. Assim, se os lipossomas se destinarem a serem congelados, estes irão conter cerca de 1-30% molar de um ou mais lípidos conjugados com polímero hidrofílico e até cerca de 99% molar de um ou mais lípidos que formam vesículas e substancialmente nenhum colesterol. De um modo preferido, o conjugado polímero hidrofílico-lípido é um conjugado de lípido-PEG. Os lipossomas também podem conter crioprotectores, tais como trealose, maltose, sacarose, glucose, lactose, dextrano ou aminoglicósidos. A glucose é particularmente preferida.

Os lipossomas podem ser congelados até cerca de -5 °C, de um modo preferido, abaixo de cerca de -10 °C e, de um modo mais preferido, abaixo de cerca de -20 °C. Estes podem ser liofilizados quando congelados. A presente invenção proporciona, deste modo, uma composição compreendendo lipossomas que contêm, pelo menos, um agente biologicamente activo em que os referidos lipossomas possuem um diâmetro médio entre 80-200 nm +/- 25 nm; e possuem uma temperatura de transição (Tc) de, pelo menos, 38 °C, (a) em que a(s) bicamada(s) ordenada(s) dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: que sao ácidos unidade (i) um ou mais lípidos que formam vesículas, fosfolípidos ou esfingolípidos; (ii) pelo menos 1% molar de um ou mais uma fosfatídicos, cada um acoplado a uma não-zwiteriónica que é um álcool, um ácido, uma cetona, um éster, um éter, uma amida, um aldeído, um ciclitol ou um sacarido; (iii) 5% molar a menos do que 20% molar de colesterol; ou (b) em que a(s) bicamada(s) ordenada(s) dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lípidos que formam vesículas que são fosfolípidos ou esfingolípidos; (ii) pelo menos 1% molar do ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica; (iii) 5% a menos do que 10% de colesterol; e em que em 1(a) e 1(b), o referido agente biologicamente activo está associado com a(s) bicamada(s) ordenada(s) ou está encapsulado num espaço aquoso definido pela(s) referida(s) bicamada(s) ordenada(s).

Assim como a utilização da composição da presente invenção na preparação de um medicamento para utilização num método para administrar um agente biológico a um indivíduo em necessidade do referido agente.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para preservar uma composição lipossomal que compreende congelar ou liofilizar a composição da presente invenção. 9

Breve Descrição das Figuras A Figura IA é um gráfico que apresenta a percentagem do lipido injectado que permanece no sangue, após administração intravenosa de lipossomas carregados com daunorrubicina contendo DSPC/DSPG em proporções molares de 90:10 (círculos a cheio), 80:20 (círculos em branco) e 70:30 (triângulos invertidos). A Figura 1B é um gráfico que apresenta a percentagem de daunorrubicina injectada que permanece no sangue, após administração intravenosa de lipossomas carregados com daunorrubicina contendo DSPC/DSPG em proporções molares de 90:10 (círculos a cheio), 80:20 (círculos em branco) e 70:30 (triângulos invertidos). A Figura 2 é um gráfico que apresenta a proporção FUDR-para-lípido em vários pontos de tempo, após administração intravenosa de lipossomas de DSPC/DSPG (proporção molar 80:20) e DSPC/Chol (proporção molar 55:45) passivamente carregados com FUDR. A Figura 3 é um gráfico que apresenta o efeito do conteúdo de colesterol na percentagem inicial da proporção de FUDR-para-lípido em vários pontos de tempo, após administração intravenosa de lipossomas DSPC/DSPG co-carregados com FUDR e irinotecano. Os lipossomas que continham colesterol a 5% molar (círculos a cheio), 10% molar (círculos a branco), 15% molar (triângulos invertidos, a cheio) e 20% molar (triângulos invertidos, em branco) e os níveis de DSPG foram mantidos constantes a 20% molar. 10 A Figura 4 é um gráfico gue apresenta a percentagem de lípido injectado gue permanece no sangue, após administração intravenosa de lipossomas contendo DSPC/DPPG em proporções molares de 90:10 (círculos a cheio), 80:20 (círculos a branco) e 70:30 (triângulos invertidos). A Figura 5 é um gráfico gue apresenta a percentagem de lípido injectado que permanece no sangue, após administração intravenosa de lipossomas contendo DSPC/PI (planta hidrogenada) em proporções molares de 90:10 (círculos a cheio), 80:20 (círculos a branco) e 70:30 (triângulos invertidos). A Figura 6A é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas de DSPC/DSPG (80:20 proporção molar) co-carregados com FUDR e irinotecano antes de congelação, após carregamento de ambos os fármacos, após congelação a -20 °C durante 24 horas, seguido de descongelação à temperatura ambiente e após congelação a -70 °C durante 24 horas, seguido por descongelação à temperatura ambiente. A Figura 6B é um histograma que apresenta a proporção de FUDR-para-lípido de lipossomas DSPC/DSPG (80:20 proporção molar) co-carregados com FUDR e irinotecano antes de congelação, após carregamento de ambos os fármacos, após congelação a -20 °C durante 24 horas, seguido por descongelação à temperatura ambiente e após congelação a -70 °C durante 24 horas, seguido por descongelação à temperatura ambiente. A Figura 6C é um histograma que apresenta a proporção irinotecano-para-lípido de lipossomas DSPC/DSPG (80:20 proporção molar) co-carregados com FUDR e irinotecano antes de congelação, 11 após carregamento de ambos os fármacos, após congelação a -20 °C durante 24 horas, seguido por descongelação à temperatura ambiente e após congelação a -70 °C durante 24 horas, seguido por descongelação à temperatura ambiente. A Figura 7 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo 300 mM de tampão citrato tanto dentro como fora da membrana dos lipossomas antes de (barra preta) e subsequente a (barra cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG2 0 0 0 (95:5% molar), DPPC/colesterol (55:45% molar) e DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 8 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo 300 mM de tampão citrato tanto dentro como fora da membrana do lipossoma antes de (barra preta) e subsequente a (barra cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar), DSPC/colesterol (55:45% molar) e DSPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 9 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo HBS tanto dentro como fora da membrana lipossómica antes de (barra preta) e subsequente a (barra cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar), DPPC/colesterol (55:45% molar) e DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 10 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo HBS tanto dentro como fora da membrana lipossómica antes de (barra preta) e subsequente a (barra 12 cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DSPC/DSPE-PEG2 0 0 0 (95:5% molar), DSPC/colesterol (55:45% molar) e DSPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 11 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo HBS tanto dentro como fora da membrana lipossómica antes de (barra preta) e subsequente a (barra cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG750 (95:5% molar) e DSPC/DSPEPEG750 (95:5% molar) foram testados. A Figura 12 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas antes de (barra preta) e subsequente a (barra cinzenta) 24 horas de congelação. Os lipossomas que consistem em DAPC/ DSPE-PEG2000 (95:5% molar) foram testados. A Figura 13 é um histograma que apresenta o tamanho de lipossomas contendo citrato a pH 4,0 dentro e HBS fora da membrana lipossómica antes de congelar (barra preta) e subsequente a congelação (barra cinzenta) durante 24 horas. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar) e DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 14 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo citrato a pH 4,0 dentro e HBS fora da membrana lipossómica antes de (barra preta) congelação e subsequente a (cinzento) congelação durante 24 horas. Os lipossomas que consistem em DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar) e DSPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. 13 A Figura 15 é um histograma que apresenta o tamanho dos lipossomas contendo retida glucose antes de congelação (barra preta) e subsequente à congelação (barra cinzenta) durante 24 horas. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar) e DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 16 é um histograma que apresenta a percentagem de encapsulação da glucose em lipossomas antes da congelação (barra preta) e subsequente à congelação (barra cinzenta) durante 24 horas. Os lipossomas que consistem em DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar) e DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5% molar) foram testados. A Figura 17 é um histograma que apresenta o tamanho de lipossomas DPPC/DSPE-PEG2000 contendo doxorrubicina enclausurada antes da congelação (barra preta) e subsequente à congelação (barra cinzenta) durante 24 horas (painel esquerdo) e percentagem de retenção de doxorrubicina (painel direito). A Figura 18 é um gráfico que apresenta a percentagem de encapsulação da doxorrubicina em lipossomas DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5% molar) durante o carregamento em função do tempo. O carregamento foi realizado antes da congelação (círculos a cheio) e subsequente à congelação (círculos a branco). A Figura 19 é um gráfico que apresenta a percentagem de encapsulação de doxorrubicina em lipossomas DSPC/DSPE-PEG2000 (95: 5% molar) durante o carregamento em função do tempo. O carregamento foi realizado antes da congelação (círculos a cheio) e subsequente à congelação (círculos a branco). 14

Modos de Realizar a Invenção "Lipossoma", como aqui utilizado, significa vesículas compreendidas por uma ou mais bicamadas lipídicas ordenadas de forma concêntrica encapsulando uma fase aquosa. A formação dessas vesículas requer a presença de "lípidos que formam vesículas" que são lípidos anfitílicos capazes de assumir ou de serem incorporados numa estrutura em bicamada. Isto inclui os lípidos que são capazes de formar uma bicamada por si só ou quando em combinação com outro lípido ou lípidos. Um lípido anfitílico é incorporado numa bicamada lipídica por possuir a sua unidade hidrofóbica em contacto com a região hidrofóbica interior da membrana em bicamada e sua unidade de cabeça polar orientada em direcção a uma superfície exterior, polar da membrana. A maior parte dos fosfolípidos pertence ao tipo anterior de lípido que forma vesícula enquanto o colesterol é um representante deste último tipo. Lípidos que formam vesículas adequados que podem ser incorporados nos lipossomas ou veículos lipídicos desta invenção podem ser seleccionados de uma variedade de lípidos anfitílicos, incluindo tipicamente fosfolípidos, tais como fosfatidilcolina (PC) e, esfingolípidos, tais como esfingomielina. Nesta descrição, os termos "carga" ou "estrutural" em referência a um lípido significa um lípido que forma vesículas que contribui para a estrutura de um lipossoma.

Os lipossomas preparados de acordo com esta invenção podem ser preparados através de técnicas convencionais utilizadas para 15 preparar vesículas. Estas técnicas incluem o método da injecção de éter (Deamer, et al., Acad. Sei. (1978) 308:250), o método do tensioactivo (Brunner, et al., Biochim. Biophys. Acta (1976) 455:322), o método da congelação-descongelação (Pick, et al., Arch. Biochim. Biophys. (1981) 212: 186) o método da evaporação de fase reversa (Szoka, et al., Biochim. Biophys. Acta (1980) 601:559-571), o método de tratamento ultrassónico (Huang, et al., Biochemistry (1969) 8:344), o método da injecção com etanol (Kremer, et al., Biochemistry (1977) 16:3932) o método da extrusão (Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta (1985) 812:55-65) e o método da prensa francesa (Barenholz, et al., FEBS Lett. (1979) 99:210). Esses processos podem ser utilizados em combinação ou modificados. As vesículas unilamelares pequenas (SUV) podem ser preparadas através do método de tratamento ultrassónico, o método da injecção de etanol e o método da prensa francesa. De um modo preferido, as vesículas multilamelares (MLV) são preparadas através do método da evaporação reversa ou através da simples adição de água à película lipídica seguido por dispersão através de agitação mecânica (Bangham, et al., J. Molar. Biol. (1965) 13:238-252).

Uma preparação de lipossoma particularmente adequada que pode ser utilizada na prática desta invenção são as vesículas unilamelares grandes (LUV). As LUV podem ser preparadas através do método da injecção de éter, o método do tensioactivo, o método da congelação-descongelação, o método da evaporação da fase reversa, o método da prensa francesa ou o método da extrusão. De um modo preferido, as LUV são preparadas de acordo com o método da extrusão. O método da extrusão envolve primeiro combinar lípidos em clorofórmio para produzir uma proporção molar desejada. Um marcador lipídico pode ser opcionalmente 16 adicionado à preparação do lípido. A mistura resultante é seca sob um fluxo de gás de azoto e colocada numa bomba de vácuo até o solvente ser substancialmente removido. As amostras são então hidratadas num tampão apropriado ou mistura de agente ou agentes terapêuticos. A mistura é então passada através de um aparelho de extrusão para obter lipossomas de um tamanho médio definido. 0 tamanho médio dos lipossomas pode ser determinado através de rastreio de luz quasi-elástico utilizando, por exemplo, um separador de tamanho de partícula se 370 submicron NICOMP™ a um comprimento de onda de 632,8 nm.

Os lipossomas que contêm "substancialmente nenhum colesterol" podem conter uma quantidade de colesterol que é insuficiente para alterar significativamente as características de transição de fase do lipossoma (tipicamente menos do que 20% molar de colesterol). 20% molar ou mais de colesterol alarga o intervalos das temperaturas às quais a transição de fase ocorre, com a transição de fase a desaparecer a níveis de colesterol superiores. De um modo preferido, um lipossoma possuindo substancialmente nenhum colesterol possuirá cerca de 15 ou menos e, de um modo mais preferido, cerca de 10% molar ou menos de colesterol, de um modo mais preferido, cerca de 5% molar ou menos, ou cerca de 2% molar ou menos ou cerca de 1% molar ou menos de colesterol . Também, pode não estar presente nenhum colesterol ou ser adicionado quando de preparam lipossomas "sem colesterol".

Os termos "lípido que é carregado negativamente a pH fisiológico" ou "lípido carregado negativamente" refere-se aos lípidos que formam vesículas possuindo uma ou mais cargas negativas a pH fisiológico. Lípidos carregados negativamente de 17 forma adequada para utilização nesta invenção podem ser fosfolípidos ou fosfoesfingolipidos. Os lípidos carregados negativamente compreendendo unidades não-zwiteriónicas podem ser incorporados no lipossoma a 5 até 95% molar, de um modo mais preferido, a 10 até 50% molar e, de um modo muito preferido, a 15 até 30% molar. A "unidade não-zwiteriónica" refere-se a uma unidade que não possui cargas opostas a pH fisiológicas, mas é hidrofilica. A carga negativa global num lípido utilizada nesta invenção pode surgir unicamente da presença da carga no lípido carregado negativamente (e. g., no grupo fosfato) ou a carga negativa adicional pode ser devida à presença de um ou mais grupos carregados negativamente residindo na unidade não-zwiteriónica. De um modo preferido, a carga negativa global surge apenas a partir da presença de um ou mais grupos carregados negativamente no lípido, em cujo caso a unidade não-zwiteriónica é um grupo neutro. De um modo preferido, a unidade não-zwiteriónica compreende 2 a 6 átomos de carbono.

Unidades não-zwiteriónicas adequadas contêm grupos funcionais que removem electrões que conferem ao grupo da cabeça características hidrofílicas. Esses grupos funcionais podem ser seleccionados do grupo consistindo de álcoois, ácidos, cetonas, ésteres, éteres, amidas e aldeídos. Os sacáridos também podem ser utilizados a este respeito.

Os monossacáridos incluem arabinose, fucose, galactose, glucose, lixose, manose, ribose e xilose. Os dissacáridos incluem sacarose, lactose, trealose, celobiose, gentiobiose e maltose. Os monossacáridos e os dissacáridos que não se ligam 18 aos receptores celulares são preferidos uma vez que o aumento da eliminação dos lipossomas da circulação pode resultar da ligação do lipossoma à superfície de uma célula.

Quando a unidade não-zwiteriónica é seleccionada para ser neutra a pH fisiológico, é escolhida a incorporação de grupos não ionizáveis, tais como álcoois, cetonas, ésteres, éteres, amidas e aldeídos. A unidade não-zwiteriónica pode ser álcool de cadeia curta, um álcool preferido contendo dois ou mais grupos hidroxilo. 0 álcool pode ser um poliol de cadeia linear do qual o glicerol é um exemplo, que é ligado a um fosfato de um fosfolípido através de um grupo hidroxilo terminal da molécula de glicerol, sendo a molécula resultante denominada um fosfatidilglicerol (PG). De um modo preferido, as cadeias de ácido gordo do fosfatidilglicerol são independentemente caproílo (6:0), octanoílo (8:0), caprilo (10:0), lauroílo (12:0), miristoílo (14:0), palmitoílo (16:0), estearoílo (18:0), araquidoílo (20:0), beenoílo (22:0), lingnoceroílo (24:0) ou fitanoílo, incluindo as versões insaturadas destas cadeias de ácido gordo nas configurações cis ou trans, tais como oleoílo (18:1), linoleoílo (18:2), araquidonoílo (20:4) e docosa-hexaenoílo (22:6). Os fosfolípidos que possuem duas cadeias acilo de 14 a 18 átomos de carbono são preferidos. Em qualquer dos casos, a natureza dos substituintes hidrofóbicos do lípido carregado negativamente é tal que a temperatura de transição de fase do lipossoma é mais do que cerca de 38 °C, de um modo preferido, mais do que cerca de 40 °C. 19 A unidade não-zwiteriónica pode estar ainda numa estrutura em anel, de um modo preferido, um ciclitol. Esses compostos podem ser derivados com vários grupos para conferir à molécula uma solubilidade em água desejada. De um modo preferido, o ciclitol é um inositol ligado a um fosfolípido através do grupo fosfato, sendo o composto resultante fosfatidilinositol. De um modo preferido, as cadeias de ácido gordo do fosfatidilinositol são seleccionados independentemente e são como descrito acima. A unidade não-zwiteriónica pode ser ainda um polímero para formar um "conjugado polímero hidrofílico-lípido." Isto refere-se a um lípido que forma vesículas ligando covalentemente à sua unidade de cabeça polar um polímero hidrofílico e é, tipicamente, formado de um lípido que possui um grupo funcional reactivo na unidade de cabeça polar de modo a ligar o polímero. Grupos funcionais reactivos adequados são, por exemplo, amino, hidroxilo, carboxilo ou formilo. 0 lípido pode ser qualquer lípido descrito na técnica para utilização nesses conjugados, tais como f osf olípidos, esf ingolípidos e ceramidas. De um modo preferido, o lípido é um fosfolípido, tais como PC, PE, PA ou PI, possuindo duas cadeias acilo compreendendo entre cerca de 6 a cerca de 24 átomos de carbono de comprimento com graus variáveis de insaturação. 0 lípido conjugado pode, por exemplo, ser um PE, de um modo preferido, da forma distearoílo. 0 polímero é um polímero biocompatível caracterizado por uma solubilidade em água que permite que as cadeias de polímero se estendam eficazmente para além da superfície do lipossoma, com flexibilidade suficiente que produza uma cobertura de superfície uniforme de um lipossoma. De um modo preferido, o polímero é um polialquiléter, incluindo polimetilenoglicol, poli-hidroxipropilenoglicol, polipropilenoglicol, ácido 20 poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poliacrílico e seus copolímeros, assim como aqueles divulgados nas Patentes dos Estados Unidos da América 5013556 e 5395619. Um polímero preferido é polietilenoglicol (PEG). O conjugado pode ser preparado para incluir uma ligação de lípido-polímero libertável, tal como um péptido, éster, ou ligação persulfureto. 0 conjugado pode também incluir um ligando alvo. As misturas de conjugados podem ser incorporadas nos lipossomas para utilização nesta invenção. 0 termo "lípido conjugado com PEG", como aqui utilizado, refere-se ao conjugado polímero hidrofílico-lípido acima definido, no qual o polímero é PEG.

Um conjugado polímero hidrofílico-lípido, ou outro lípido carregado negativamente contendo não-zwiterião, pode ser preparado para incluir uma ligação lípido-polímero libertável, tais como um péptido, éster ou ligação persulfureto que pode ser clivado em condições fisiológicas selectivas de modo a expor a superfície de um veículo LUV assim que tenha sido alcançada uma biodistribuição desejada, tal como é revelada na Patente dos Estados Unidos da América N° 6043094; ou, em Kirpotin, D., et al. , FEBS Letters (1996) 388:115-188.

Um conjugado polímero hidrofílico-lípido pode também incluir um ligando alvo na extremidade livre do polímero para dirigir o lipossoma para células específicas. Os derivados de polietilenoglicol que permitem a conjugação de um ligando alvo são, por exemplo, metoxi(hidrazido)polietilenoglicol e bis-(hidrazido)polietilenoglicol. 21

Podem ser obtidos lípidos carregados negativamente a partir de fontes naturais ou podem ser sintetizados quimicamente. Os métodos para ligar covalentemente compostos ao grupo da cabeça de um lipido são bem conhecidos na técnica e envolvem geralmente reagir grupos funcionais na porção terminal do grupo da cabeça do lipido com grupos funcionais na unidade a ser ligada. Os lipidos carregados negativamente adequados para a ligação quimica de uma unidade hidrofílica não-zwiteriónica incluem lipidos possuindo um grupo de cabeça polar que termina com um grupo funcional reactivo, tais como fosfato, uma amina. Um exemplo de um lipido particularmente adequado é uma fosfatidiletanolamina, na medida em que contém um grupo amino reactivo. Métodos para preparar derivados de fosfatidiletanolamina foram descritos em Ahl, P., et al., Biochim. Biophys. Acta (1997) 1329:370-382. Exemplos de lipidos carregados negativamente obtidos de fontes naturais que já contêm unidades não-zwiteriónicas incluem fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol obtidos de fontes de ovo e plantas, respectivamente.

Podem ser preparados lipossomas de modo a que sejam sensíveis a subidas da temperatura no meio circundante. A sensibilidade à temperatura desses lipossomas permite a libertação dos compostos enclausurados no espaço aquoso interior do lipossoma e/ou a libertação de compostos associados com a bicamada lipídica, a um sitio alvo que é aquecido (como no processo clinico de hipertermia) ou que está a uma temperatura intrinsecamente superior do que o resto do corpo (como na inflamação). Os lipossomas que permitem a libertação dos compostos de um modo dependente da temperatura são denominados "lipossomas termossensíveis" e contêm níveis de colesterol 22 baixos. Os lipossomas da presente invenção compreendem um lípido que possui uma temperatura de transição de gel-para-líquido cristalino no intervalo hipertérmico (e. g. , o intervalo desde aproximadamente 38 °C a aproximadamente 45 °C) . São preferidos fosfolípidos com uma temperatura de transição de fase desde cerca de 38 °C a cerca de 45 °C e são mais preferidos fosfolipidos cujos grupos acilo estão saturados. Um fosfolipido particularmente preferido é a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC).

Os lipossomas termossensiveis podem incorporar um agente activo de superfície relativamente solúvel em água, tal como um lisolípido, numa bicamada composta principalmente por uma molécula relativamente insolúvel em água, tal como um fosfolipido de di-cadeia (e. g., DPPC). A incorporação do agente activo de superfície na fase gel do componente de lípido principal aumenta a libertação dos conteúdos do lipossoma resultante quando aquecido até uma temperatura de transição de fase gel-líquido cristalino do lípido principal. Os agentes activos de superfície preferidos são lisolípidos, e um agente activo particularmente preferido é a monopalmitoilfosfatidilcolina (MPPC). Agentes activos de superfície adequados são aqueles que são compatíveis com o lípido principal da bicamada, e que dessorvem quando o lípido se funde até à fase líquida. Agentes activos de superfície adequados adicionais para utilização em bicamadas fosfolipídicas incluem álcoois de palmitoílo, álcoois de estearoílo, palmitoílo, estearoílo, monopalmitato de glicerilo, mono-oleato de glicerilo e lípidos mono-acilados, tais como esfingosina e esfingamina. 23

Os lipossomas também podem ser preparados de modo a que a temperatura de transição para líquido cristalino seja superior a 45 °C. Neste caso, os lípidos que formam vesículas constituindo o lipossoma são fosfolípidos, tais como PC ou PE. 0 fosfolípido preferido é PC. Quando se seleccionam os lípidos, devem ser tomadas precauções uma vez que a separação de fases pode ocorrer se os comprimentos da cadeia acilo destes lípidos diferir por quatro ou mais grupos de metileno. De um modo preferido, o lípido possuirá dois ácidos gordos saturados, cujas cadeias acilo serão seleccionadas independentemente do grupo consistindo de estearoílo (18:0), nonadecanoílo (19:0), araquidoílo (20:0), heniecosanoílo (21:0), beenoílo (22:0), tricosanoílo (23:0), lingnoceroílo (24:0) e cerotoílo (26:0). De um modo preferido, pelo menos uma (e de um modo mais preferido ambas) das cadeias acilo serão 18:0, ou mais compridas.

As formas de realização podem utilizar lipossomas possuindo substancialmente nenhum colesterol, possuindo temperaturas de transição de fase acima daquela que seria útil para aplicações termossensíveis (e. g., cerca de 45 °C ou mais) que apresentam um aumento da retenção do fármaco como descrito no documento PCT/CA01/00655 publicado em 15 de Novembro de 2001 (aqui incorporado por referência). Esses lipossomas incluem lipossomas isentos de colesterol possuindo, pelo menos, 60% molar de fosfolípidos possuindo, pelo menos, uma cadeia acilo de mais do que 18 átomos de carbono.

As formas de realização podem utilizar lipossomas que são substancialmente isentos de colesterol que proporcionam um aumento da retenção sistémica de agentes quando carregados de acordo com a técnica de carregamento por gradiente de pH com 24 concentrações de tampão de carga interna abaixo de cerca de 200 mM. Esses lipossomas são descritos no documento U.S. 60/331249 apresentado a 13 de Novembro de 2001, que é aqui incorporado por referência. Os agentes que demonstram uma fraca retenção sistémica em lipossomas isentos de colesterol podem ser retidos de forma mais estável de acordo com esta forma de realização.

As formas de realização podem empregar lipossomas sem colesterol que apresentam retenção sistémica aumentada de agentes terapêuticos encapsulados quando a osmolaridade do tampão interno é seleccionado para valores próximos da osmolaridade de um meio, no qual os lipossomas estão presentes quando administrados por injecção. Esses lipossomas são descritos no documento U.S. 60/331249 apresentado a 13 de Novembro de 2001, que é aqui incorporado por referência. Assim, esta forma de realização inclui a utilização de lipossomas isentos de colesterol contendo soluto baixo e meios de injecção contendo lipossomas isentos de colesterol nos quais o tampão interno de lipossoma é combinado com a osmolaridade do soluto dos meios.

As formas de realização podem utilizar lipossomas "termossensíveis" que destabilizam a temperaturas que podem ser aplicadas a um doente (e. g., cerca de 45 °C ou menos), incluindo aqueles descritos no documento U.S. 60/339405 apresentado a 14 de Dezembro de 2001, que é aqui incorporado por referência. Assim, esta forma de realização podem incluir ou podem resultar da utilização de métodos para distribuir um agente ao sitio de interesse num indivíduo através da administração de lipossomas termossensíveis contendo um agente 25 activo a um indivíduo, permitindo um período de tempo aumentado ao lipossoma, localização para o sítio de interesse e, subsequentemente, administrar o tratamento hipertérmico ao sítio de interesse para provocar a libertação dos conteúdos do lipossoma.

As formas de realização também podem utilizar lipossomas sem colesterol que compreendem unidades hidrofílicas conjugadas com os lípidos. Esses lipossomas são resistentes a fusão e fuga do agente subsequente à congelação e são descritos no documento U.S. 60/331248 apresentado a 13 de Novembro de 2001, que é aqui incorporado por referência.

Num aspecto, são proporcionados lipossomas sem colesterol em que o lípido carregado negativamente é incorporado no lipossoma a mais do que 10% molar. Neste aspecto da invenção, a unidade não-zwiteriónica é, de um modo preferido, um álcool de cadeia curta, tal como glicerol. De um modo muito preferido, os lípidos que formam vesículas constituindo os lipossomas nesta forma de realização da invenção são seleccionados de modo a que a temperatura de transição de fase do lipossoma seja mais do que cerca de 40 °C. Todas as outras características e condições preferidas para este aspecto da invenção são geralmente como descrito acima. A determinação da longevidade de circulação de um lipossoma pode ser realizada através de meios conhecidos na técnica, incluindo os métodos descritos nos Exemplos abaixo envolvendo a administração intravenosa a um animal de teste e monitorizando os níveis no sangue. Esta determinação pode ser realizada para um lipossoma destinado à administração intravenosa através de 26 formulação do lipossoma ou veículo lipídico num veículo ou diluente adequado para a administração intravenosa, administração da formulação e monitorização dos níveis no sangue. A determinação pode ser realizada medindo a quantidade de um componente, tal como um marcador radioactivo presente num lipossoma ou veículo lipídico após administração a um modelo animal da doença.

As formas de realização podem utilizar lipossomas sem colesterol que são seleccionados ou são produzidos para se comportável comparavelmente a lipossomas contendo colesterol através da incorporação de uma unidade hidrofílica conjugada com um lípido, tal como é divulgado no documento U.S. 60/339404 apresentado a 14 de Dezembro de 2001, que é aqui incorporado por referência. Essas formas de realização da presente invenção pode incluir, ou pode resultar, da utilização de métodos de preparação ou selecção de lipossomas utilizando um formato de teste com base na comparação da longevidade de circulação de um lipossoma sem colesterol possuindo uma temperatura de transição de fase moderadamente hipertérmica para a temperatura do corpo do indivíduo para a longevidade de circulação de um lipossoma contendo colesterol comparável. Essas composições de lipossoma seleccionados permitem um aumento da estabilidade dos lipossomas e propriedades de retenção de fármaco.

Assim, a presente invenção proporciona particularmente: 1. Uma composição compreendendo lipossomas que contêm, pelo menos, um agente biologicamente activo em que os referidos lipossomas possuem um diâmetro médio entre 27 80-200 nm + /- 25 nm; e possuem uma temperatura de transiçao (Tc) de, pelo menos, 38 °C, (a) em que a(s) bicamada(s) ordenada(s) dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lípidos que formam vesículas, que são fosfolípidos ou esfingolípidos; (ii) pelo menos 1% molar de um ou mais ácidos fosfatídicos, cada um acoplado a uma unidade não-zwiteriónica que é um álcool, um ácido, uma cetona, um éster, um éter, uma amida, um aldeído, um ciclitol ou um sacárido; (iii) 5% molar a menos do que 20% molar de colesterol; ou (b) em que a(s) bicamada(s) ordenada(s) dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lípidos que formam vesículas que são fosfolípidos ou esfingolípidos; (ii) pelo menos 1% molar de ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica; (iii) 5% a menos do que 10% de colesterol; e em que em l(a) e 1(b), o referido agente biologicamente activo está associado com a(s) bicamada(s) ordenada (s) ou está encapsulado num espaço aquoso definido pela(s) referida(s) bicamada(s) ordenada(s). 28 2. A composição de l(a) em que cada referido ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica é um fosfatidilglicerol (PG) ou um fosfatidilinositol (PI). 3. A composição de 1(b) em que o referido ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica é um ácido fosfatídico acoplado a um polímero hidrofílico. 4. A composição de 3 em que o referido polímero hidrofílico é polietilenoglicol (PEG). 5. A composição de qualquer um de 1-4 em que os referidos lipossomas compreendem, pelo menos, 10% molar do referido ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica. 6. A composição de qualquer um de 1-5 em que o referido lípido que forma a vesícula é diestearoilfosfatidilcolina. 7. A composição de qualquer um de 1-6 em que o referido agente biologicamente activo compreende FUDR e/ou CPT-11 e/ou carboplatina. 8. A composição de qualquer um de 1-7 que é crioestável na ausência de crioprotector. 9. A composição de qualquer um de 1-8 numa forma congelada ou liofilizada. 10. A composição de qualquer um de 1-9 que contém ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. 29 11. Utilização da composição de qualquer um de 1-10 na preparação de um medicamento para utilização num método para administrar um agente biológico a um indivíduo em necessidade do referido agente. 12. Um método para preservar uma composição lipossomal que compreende congelar ou liofilizar a composição de qualquer um de 1-10.

Os lipossomas da invenção serão úteis na distribuição de fármacos e serão assim formulados para conter um agente biologicamente activo.

Pode ser encapsulada uma vasta variedade de agentes nos lipossomas da presente invenção. Os lipossomas desta invenção podem também ser congelados com o agente encapsulado ou o agente pode ser encapsulado subsequente à congelação. O termo "agente" refere-se a unidades químicas que podem ser utilizadas em aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Os termos "agente terapêutico" e "fármaco", como aqui utilizados, referem-se a unidades químicas utilizadas em terapia e para as quais é desejável a distribuição de fármacos à base de lipossomas. Os lipossomas desta invenção podem ser encapsulados com agentes terapêuticos, tais como agentes antineoplásicos, agentes antivirais e agentes antimicrobianos. Os termos "agente antimicrobiano" e "agente antiviral", como aqui utilizados, referem-se a unidades químicas possuindo um efeito no crescimento, proliferação e sobrevivência de micróbios e vírus, respectivamente. Agentes antimicrobianos incluem, mas não estão limitados a, penicilina G, estreptomicina, ampicilina, penicilina, carbenicilina, tetraciclina, estreptomicina, 30 anfotericina B, vancomicina e floxacina e derivados de floxacina, tais como ciprofloxacina, norfloxacina, gatrifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina e trovafloxacina. Agentes antivirais incluem AZT. 0 termo "agente antineoplásico", como aqui utilizado, refere-se a unidades químicas possuindo um efeito no crescimento, proliferação, capacidade invasiva ou sobrevivência de células ou tumores neoplásicos. Agentes terapêuticos antineoplásicos incluem agentes de alquilação, antimetabolitos, antibióticos citotóxicos e vários alcaloides de plantas e seus derivados.

Os agentes podem ser encapsulados dentro dos lipossomas da presente invenção através de técnicas de carregamento passivo conhecidas no campo técnico. Métodos passivos de encapsulação de agentes terapêuticos em lipossomas envolvem a encapsulação do agente durante a síntese dos lipossomas. Neste método, o agente pode estar associado à membrana ou encapsulado num espaço aquoso enclausurado. Isto inclui um método de retenção passivo descrito por Bangham, et al., J. Molar. Biol. (1965) 12:238, em que a fase aquosa contendo o agente de interesse é colocado em contacto com uma película de lípidos secos que formam vesículas depositadas nas paredes de um vaso de reacção. Após agitação por meios mecânicos, o aumento de volume dos lípidos irá ocorrer e irão formar-se vesículas multilamelares (MLV). Utilizando extrusão, as MLV podem ser convertidas em vesículas unilamelares grandes (LUV) ou vesículas unilamelares pequenas (SUV) após sonicação. Outro método de carregamento passivo que pode ser utilizado inclui o descrito por Deamer, et al. , Biochim. Biophys. Acta (1976) 443:629. Este método envolve dissolver lípidos que formam vesículas em éter e, em vez de primeiro evaporar o éter para formar uma película fina numa superfície, 31 esta película a ser posteriormente colocada em contacto com uma fase aquosa a ser encapsulada, a solução de éter é injectada directamente na referida fase aquosa e o éter é evaporado posteriormente, deste modo os lipossomas com agente encapsulados são obtidos. Um outro método que pode ser empregue é a Evaporação de Fase Reversa (REV) um método descrito por Szoka, et ai., P.N.A.S. (1978) 75: 4194 no qual uma solução de lípidos num solvente orgânico insolúvel em água é emulsificado numa fase de veículo aquoso e o solvente orgânico é subsequentemente removido sob pressão reduzida.

Outros métodos de retenção passiva que podem ser utilizados incluem sujeitar os lipossomas a tratamento sucessivo de desidratação e re-hidratação, ou congelação e descongelação. Esta técnica é revelada por Kirby, et al.r Biotechnology (1984) 979-984. Também, Shew, et al., Biochim. Biophys. Acta (1985) 816:1-8 descrevem um método em que os lipossomas preparados por sonicação são misturados em solução aquosa com o soluto a ser encapsulado e a mistura é seca sob azoto num frasco de rotação. Após re-hidratação, são produzidos lipossomas grandes nos quais uma fracção significativa do soluto foi encapsulada.

Os agentes podem ser encapsulados utilizando métodos de encapsulação activos. 0 carregamento activo envolve a utilização de gradientes de transmembrana ao longo da membrana do lipossoma para induzir a incorporação de um agente terapêutico após o lipossoma ter sido formado. Isto pode envolver um gradiente de um ou mais iões incluindo Na+, K+, H+ e/ou uma unidade de azoto protonada. Técnicas de carregamento activas que podem ser utilizadas de acordo com esta invenção incluem carregamento por 32 gradiente de pH, atracçao de carga e transporte de fármaco por um agente que se pode ligar ao fármaco.

Os lipossomas podem ser carregados de acordo com a técnica de carregamento por gradiente de pH. De acordo com esta técnica, são formados lipossomas que encapsulam uma fase aquosa de um pH seleccionado. Os lipossomas hidratados são colocados num ambiente aquoso de um pH seleccionado diferente para remover ou minimizar uma carga no fármaco ou outro agente a ser encapsulado. Assim que o fármaco se move dentro do lipossoma, o pH do interior resulta num estado de fármaco carregado, que previne o fármaco de permear a bicamada lipidico, deste modo enclausurar o fármaco no lipossoma.

Para criar um gradiente de pH, o meio externo original é substituído por um meio novo externo possuindo uma concentração de protões diferente. A substituição do meio externo pode ser realizada através de várias técnicas, tais como, passando a preparação de vesícula lipídica através de uma coluna de filtração em gel, e. g., uma coluna de Sephadex, que foi equilibrada com o novo meio (como apresentado nos exemplos abaixo) ou por centrifugação, diálise ou técnicas relacionadas. 0 meio interno pode ser ácido ou básico em relação ao meio externo.

Após estabelecimento de um gradiente de pH, é adicionado um agente carregável de gradiente de pH à mistura e a encapsulação do agente no lipossoma ocorre como descrito acima. 33 0 carregamento utilizando um gradiente de pH pode ser realizado de acordo com os métodos descritos nas Patentes U.S. N° 5616341, 5736155 e 5785987, aqui incorporados por referência.

Agentes terapêuticos que podem ser carregados utilizando o carregamento de gradiente de pH compreendem uma ou mais unidades ionizáveis, de modo a que a forma neutra da unidade ionizável permite que o fármaco atravesse a membrana do lipossoma e a conversão da unidade numa forma carregada provoca a retenção do fármaco encapsulado no lipossoma. As unidades ionizáveis podem compreender, mas não estão limitadas a compreender, amina, ácido carboxilico e grupos hidroxilo. Os agentes que carregam em resposta a um interior acidico podem compreender unidades ionizáveis que são carregadas em resposta a um ambiente acidico enquanto os fármacos que carregam em resposta a um interior básico compreende unidades que são carregadas em resposta a um ambiente básico. No caso de um interior básico, podem ser utilizadas as unidades ionizáveis incluindo, mas não limitado a, ácido carboxilico ou grupos hidroxilo. No caso de um interior acidico, podem ser utilizadas as unidades ionizáveis incluindo, mas não limitadas a, grupos amina primários, secundários e terciários. De um modo preferido, o agente carregável de gradiente de pH é um agente terapêutico e, de um modo muito preferido, um agente antineoplásico, agente antimicrobiano ou um agente antiviral. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser carregados em lipossomas pelo método de carregamento de gradiente de pH e, por isso, podem ser utilizados nesta invenção incluem, mas não estão limitados a, antibióticos de antraciclina tais como doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, epirrubicina, aclarrubicina e idarrubicina; antibióticos antineoplásicos, tais como mitomicina, bleomicina e 34 dactinomicina; vinca alcaloides, tais como vinblastina, vincristina e navelbina; derivados de purina, tais como 6-mercaptopurina e 6-tioguanina; derivados de purina e pirimidina, tais como 5-fluorouracilo; camptotecinas, tais como topotecano, irinotecano, lurtotecano, 9-aminocamptotecina, 9-nitrocamptotecina e 10-hidroxicamptotecina; citarabinas, tais como arabinose de citosina; agentes antimicrobianos, tais como ciprofloxacina e seus sais. Esta invenção não está limitada aos fármacos presentemente disponíveis, mas estende-se a outros ainda não desenvolvidos ou disponíveis comercialmente e que podem ser carregados utilizando os gradientes de pH de transmembrana.

Podem ser empregues vários métodos para estabelecer e manter um gradiente de pH através de um lipossoma. Isto pode envolver a utilização de ionóforos que podem inserir na membrana do lipossoma e transportar iões através das membranas na permuta para protões (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5837282). Os encapsulados no interior do lipossoma que são capazes de transportar protões através da membrana lipossómica e, desse modo, estabelecer um gradiente de pH (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5837282) também pode ser utilizada. Estes tampões compreendem uma unidade ionizável que é neutra quando desprotonada e carregada quando protonada. A forma neutra desprotonada do tampão (que está em equilíbrio com a forma protonada) é capaz de atravessar a membrana do lipossoma e, desse modo, deixar um protão para trás no interior do lipossoma e, deste modo, provocar um aumento do pH do interior. Exemplos desses tampões incluem cloreto de metilamónio, sulfato de metilamónio, sulfato de etilenodiamónio (ver Patente U.S. N° 5785987) e sulfato de amónio. Também podem ser utilizados 35 tampões de carga interna que são capazes de estabelecer um pH interno básico. Neste caso, a forma neutra do tampão é protonada, de modo que os protões são transportados para fora do interior do lipossoma para estabelecer um interior básico. Um exemplo de um tal tampão é acetato de cálcio (ver Patente U.S. N° 5939096) .

Podem ser utilizados métodos de atracção de carga para carregar activamente agentes terapêuticos. Os mecanismos de atracção de carga para o carregamento do fármaco envolvem criar um potencial de transmembrana através da membrana pela criação do gradiente de concentração para uma ou mais espécies carregadas. Assim, para um fármaco que é carregado negativamente quando ionizado, é criado um potencial de transmembrana através da membrana que possui um potencial interno que é positivo em relação ao potencial externo. Para um fármaco que está carregado positivamente, pode ser utilizado o potencial de transmembrana oposto.

Numa forma de realização, subsequente à preparação, os lipossomas são sujeitos a temperaturas abaixo de 0 °C, de modo a estarem presentes no estado congelado. Os lipossomas podem ser congelados através de: imersão em azoto liquido, gelo seco, um congelador convencional a -20 °C ou um congelador convencional a -80 °C ou -70 °C. Em exemplos alternativos, os lipossomas podem estar congelados em azoto liquido seguido por imersão num congelador. Os lipossomas podem ser armazenados estavelmente no estado congelado durante períodos de tempo extensos até serem utilizados. Subsequentemente à congelação, os lipossomas podem ser então descongelados para utilização posterior, por sujeição a temperaturas acima de 0 °C. 36

Os lipossomas podem compreender agentes encapsulados antes de serem sujeitos a temperaturas abaixo de 0 °C. Isto pode envolver o carregamento do agente em lipossomas pré-formados utilizando técnicas de carregamento activo e passivo acima mencionadas. Se o agente encapsulado é um agente terapêutico, os lipossomas descongelados podem ser utilizados directamente em terapia seguindo processos conhecidos para administração de agentes encapsulados em lipossoma.

Os lipossomas podem ser carregados activamente com agente subsequentemente à congelação. Isto permite que sejam proporcionados lipossomas para os fabricantes de fármacos numa forma não encapsulada que os fabricantes podem subsequentemente carregar activamente com agente. Um método de carregamento activo preferido é o método de carregamento de gradiente de pH descrito acima. Os lipossomas podem ser congelados com um gradiente de pH através da membrana ou o gradiente pode ser criado subsequentemente à congelação.

No caso em que o gradiente é criado subsequentemente à congelação, o tampão externo pode ser permutado e substituído por um novo meio externo possuindo uma concentração diferente de protões. 0 pH externo também pode ser ajustado através da adição de um ácido ou uma base. A substituição do meio externo pode ser realizado através de várias técnicas, tal como através da passagem da preparação da vesícula lipídica através de uma coluna de filtração em gel, e. g., um coluna de Sephadex, que foi equilibrada com o novo meio (como apresentado nos exemplos abaixo) ou por centrifugação, diálise ou técnicas relacionadas. 37 0 meio interno pode ser ácido ou básico em relaçao ao meio externo.

Os lipossomas da presente invenção podem também estar sujeitos a mais do que um ciclo de congelação e descongelação.

Após congelação, a preparação de lipossomas pode ser desidratada através da remoção do solvente aquoso no qual os lipossomas são imersos. Os lipossomas são, de um modo preferido, desidratados utilizando equipamento de liofilização convencional ou dispositivos equivalentes; isto é, são, de um modo preferido, desidratados sob pressão reduzida. Antes da utilização, a preparação de lipossomas secos pode ser reconstituída através da adição de um solvente apropriado no qual os lipossomas devem ser suspensos. De um modo preferido, a preparação de lipossomas é desidratada através da introdução de pressão reduzida. Meios para aplicar pressão reduzida incluem a utilização de bombas de vácuo ou dispositivos equivalentes. 0 processo de desidratação é, de um modo preferido, realizado a temperaturas reduzidas em vez de à temperatura ambiente. Assim que os lipossomas foram desidratados, eles podem ser armazenados durante períodos de tempo prolongados até serem utilizados. 0 termo "crioestável" nesta descrição refere-se a lipossomas que são substancialmente resistentes a qualquer um de vários efeitos indesejáveis que ocorrem após a exposição da composição lipossomal a uma temperatura abaixo de cerca de 0 °C suficiente para provocar um dos efeitos indesejáveis. Os efeitos indesejáveis incluem, mas não estão limitados a, um aumento no tamanho do lipossoma, distribuição do tamanho ou turbidez da preparação do lipossoma devido à agregação e/ou fusão dos 38 lipossomas, e perda do agente encapsulado. Tipicamente, os efeitos colaterais indesejáveis ocorrem a uma temperatura abaixo de 0 °C, mais tipicamente, abaixo de -5 °C e, ainda mais tipicamente, abaixo de -10 °C.

Pode ser avaliado se um lipossoma é ou não crioestável, por exemplo, medindo os efeitos indesejáveis associados com a exposição dos lipossomas a temperaturas abaixo de 0 °C. A medição da alteração no tamanho dos lipossomas antes e após sujeição a temperaturas abaixo de 0 °C pode ser efectuada como descrito a seguir utilizando varrimento de luz quasi-elástica (QELS). A fusão dos lipossomas pode também ser medida por outros meios incluindo transferência de energia de ressonância por fluorescência. Isto envolve a medição da transferência de energia de uma sonda excitada para uma segunda sonda devido à grande proximidade das duas sondas. A medição da libertação de um agente encapsulado subsequentemente à congelação pode ser efectuada como divulgado a seguir. O agente encapsulado pode ser incorporado nos lipossomas utilizando métodos de carga activos ou passivos descritos acima. A fuga do agente enclausurado pode ser medida pela determinação de uma quantidade de agente enclausurado antes de e subsequentemente à congelação. O agente pode ser quantificado por contagem de cintilações no caso do agente radiomarcado ou por espectroscopia no caso de um agente que compreende uma absorvência detectável para quantificação. Alternativamente, o agente pode ser quantificado por cromatografia gasosa, cromatografia líquida de elevado desempenho, absorção atómica e técnicas relacionadas.

As preparações de lipossomas podem também ser visualmente inspeccionadas para evidência macroscópica de lesões de 39 congelação, tais como a presença de partículas macroscópicas e para clareza da suspensão ou turbidez em comparação com amostras controlo não congeladas. A turbidez pode ser medida utilizando um espectrofotómetro a 650 nm. Os lipossomas podem também ser testados para grandes partículas, agregados ou outras alterações que podem indicar que o lipossoma não é crioestável a centrifugação. Subsequentemente à centrifugação, o tubo de centrífuga é observado para a presença de partículas no fundo do tubo que podem ser vistas a olho nu.

Os efeitos indesejáveis associados com a exposição dos lipossomas a temperaturas abaixo de 0 °C podem ser comparados a formulações de lipossoma equivalentes contendo colesterol.

Esta invenção também inclui a composição desta invenção para utilização no tratamento de um mamífero afectado por ou susceptível de ou suspeito de estar afectado por um distúrbio (e. g., cancro) . Os exemplos das utilizações médicas das composições da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, tratar o cancro, tratar as doenças cardiovasculares, tais como hipertensão, arritmia cardíaca e restenose, tratar infecções bacterianas, fúngicas ou parasíticas, tratar e/ou prevenir doenças através da utilização das composições da presente invenção como vacinas, tratar inflamação ou tratar doenças auto-imunes. O tratamento ou administração será, de forma geral, compreendido para administrar a composição farmacêutica numa dosagem suficiente para melhorar o referido distúrbio ou os seus sintomas.

Para o tratamento de deficiências humanas, pode esperar-se que um médico qualificado determine como as composições da 40 presente invenção devem ser utilizadas no que respeita à dose, horário e via de administração, utilizando protocolos estabelecidos. Estas aplicações que podem também utilizar o escalonamento de dose devem activar os agentes encapsulados nas composições de distribuição do veiculo da presente invenção e apresentem toxicidade reduzida para tecidos saudáveis do indivíduo.

As composições farmacêuticas compreendendo os lipossomas da invenção são preparadas de acordo com técnicas convencionais e compreende, ainda, um veículo farmaceuticamente aceitável. Geralmente, será empregue soro fisiológico normal como o veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados incluem, e. g. , água, água tamponada, 0,4% de soro fisiológico, 0,3% de glicina, 5% de dextrose e semelhantes, incluindo glicoproteínas, para estabilidade melhorada, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas convencionais, bem conhecidas de esterilização. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas para utilização ou filtradas em condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de tonicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, etc. Adicionalmente, a suspensão de lipossomas pode incluir agentes de protecção de lípido que protegem os lípidos contra radicais livres e lesões peroxidativas de lípido no armazenamento. Os redutores de radicais livres lipofílicos, tais 41 como alfatocoferol e quelantes específicos para ferro solúveis em água, tais como ferrioxamina, são adequados. A concentração de lipossomas nas formulações farmacêuticas pode variar de forma vasta, i. e., de menos do que cerca de 0,05%, normalmente a ou, pelo menos, de cerca de 2-5% a 10 a 30% em peso e serão seleccionados primariamente por volumes fluidos, viscosidades, etc., de acordo com o modo de administração particular seleccionado. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada para baixar a carga de fluido associada com o tratamento. Alternativamente, os lipossomas compostos de lípidos irritantes podem ser diluídos para baixar concentrações para diminuir a inflamação no sítio da administração. Para diagnóstico, a quantidade de lipossomas administrados dependerá da marcação particular utilizada, o estado de doença a ser diagnosticada e o julgamento do médico.

De um modo preferido, as composições farmacêuticas são administradas parentericamente, i. e., intraarterialmente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente, ou intramuscularmente ou via aerossol. Os métodos de administração de aerossol incluem administração intranasal e pulmonar. De um modo mais preferido, as composições farmacêuticas são administradas intravenosamente ou intraperitonealmente por uma injecção de bólus. Por exemplo, ver Rahman, et al., Patente U.S. N° 3993754; Sears, Patente U.S. N° 4145410; Papahadjopoulos, et al. , Patente U.S. N° 4235871; Schneider; Patente U.S. N° 4224179; Lenk, et al. , Patente U.S. N° 4522803; e Fountain, et al., Patente U.S. N° 4588578. As formulações particulares que são adequadas para esta utilização são encontradas em 42

Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, PA, 17a ed. (1985).

Os exemplos que se seguem são colocados para ilustrar, mas não limitar, a invenção.

Preparaçao A Métodos para a Preparação de Grandes Lipossomas Unilamelares

Os lipidos foram dissolvidos em solução de clorofórmio e subsequentemente secos sob uma corrente de azoto gasoso e colocados numa bomba de vácuo para remover o solvente. Os níveis vestigiais de lípido radioactivo 3H-CHE ou 14C-CHE foram adicionados para quantificar lípido durante o processo de formulação e a seguir a administração intravenosa. A película de lípido resultante foi colocada sob um vácuo elevado durante um mínimo de 2 horas. A película de lípido foi hidratada na solução indicada para formar vesículas multilamelares (MLV). A preparação resultante foi extrudada 10 vezes através de filtros de policarbonato empilhados com um dispositivo de extrusão (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC) para conseguir um tamanho médio de lipossoma entre 80 e 150 nm. Todos os lipidos constituintes de lipossomas são reportados em % molar. 43

Preparação B Métodos para Quantificaçao de Carga de Fármaco

Em vários pontos de tempo após iniciação da carga do fármaco, foram removidas fracções e passadas através de uma coluna de centrifugação de Sephadex G-50 para separar o fármaco livre do encapsulado. Os níveis de lípido foram determinados por contagem em líquido de cintilação. Quando empregues, os níveis de daunorrubicina radiomarcada (3H-daunorubicina) e FUDR o ( H-FUDR) presentes no eluente foram medidos por contagem em líquido de cintilação. Os níveis de irinotecano foram medidos por absorvência a 370 nm contra uma curva padrão do fármaco livre. Para um volume especificado de eluente, foi adicionado Triton X—100 para solubilizar os lipossomas contendo irinotecano. A seguir à adição do detergente, a mistura foi aquecida a 100 °C e deixada a arrefecer à temperatura ambiente antes da medição da absorvência.

Exemplo 1 A Estabilidade no Sangue dos Lipossomas DSPC Aumentou com o Conteúdo Crescente de Fosfatidilglicerol (PG)

Foi investigada a capacidade de diferentes níveis de fosfatidilglicerol (PG) prolongarem o tempo de residência no sangue e de melhorarem as propriedades de retenção do fármaco de lipossomas contendo diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) como o componente de lípido global. Os lipossomas DSPC foram preparados com níveis variados de distearoilfosfatidilglicerol (DSPG) e 44 carregados com daunorrubicina em resposta ao CuS04 encapsulado. Os níveis de lípido no plasma e as concentrações de fármaco foram determinados após administração a murganhos.

Os lipossomas DSPC contendo DSPG a 10, 20 e 30% molar foram preparados como descrito nos métodos por dissolução de DSPC em clorofórmio e lípidos de DSPG em clorofórmio/metanol/água (16:8:1 v/v) e combinando as preparações em proporções molares de 90:10, 80:20 e 70: 30 em conjunto com o marcador radioactivo 14C-CHE. As películas de lípido foram deixadas sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual seguido por re-hidratação em 150 mM de CuS04, 20 mM de histidina, pH 7,4. Os lipossomas foram depois mudados de tampão para soro fisiológico para remover o cobre externo e depois trocado por 300 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, 5 mM de EDTA (tampão SHE) , pH 7,4 utilizando uma coluna de diálise de fluxo tangencial manipulada manualmente. A incorporação de daunorrubicina (contendo níveis vestigiais de 3H-daunorubicina) nos lipossomas de DSPC/DSPG foi estabelecida por incubação dos lipossomas com fármaco a uma proporção em peso de fármaco-para-lipido de 0,1. A carga completa de fármaco, medida por análise em coluna de centrifugação como descrito nos métodos, foi conseguida após incubação da solução a 60 °C. O tampão externo foi trocado por soro fisiológico utilizando a coluna de fluxo tangencial manipulada à mão. Os lipossomas DSPC/DSPG carregados com daunorrubicina resultantes foram injectados em murganhos Balb/c (3 murganhos por ponto de tempo) a uma dose de lípido de 100 mg/kg e uma dose de fármaco de 10 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados, o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em microtainers revestidos com EDTA. 45

As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. A recuperação do lipido e do fármaco foi monitorizada pela contagem de cintilações das duas marcas. Os pontos de dados representam a média dos resultados, +/- desvio padrão (DP).

Os resultados demonstraram que a residência óptima do sangue dos lipossomas foi conseguida pela incorporação de 20% molar de DSPG (Figura IA). Em contraste, Mehta et al., no documento W099/59547 reportou que os lipossomas DPPC/Chol preparados com menos do que 15% molar de DMPG mostraram meias vidas prolongadas no sangue relativamente aos lipossomas preparados com 20% molar de DMPG. Os lipossomas nestes estudos anteriores utilizaram um lipido global (DPPC) possuindo uma temperatura de transição de fase inferior à empregue na presente invenção e colesterol (Chol) como um lipido estabilizante. Deste modo, estes resultados demonstraram que a natureza dos componentes lipidicos que constituem os lipossomas contendo fosfatidilglicerol pode afectar as propriedades do veiculo no plasma.

Anteriormente, foi demonstrado que os lipossomas preparados com polímeros hidrofílicos, tais como polietilenoglicol e lípidos, tais como GMi têm a capacidade para prolongar o tempo de vida em circulação dos lipossomas. Estes resultados ilustram que o polímero, poli(etilenoglicol) (PEG), não é necessário para a estabilidade no plasma e que as unidades não-zwiteriónicas, tais como glicerol ligado ao grupo da cabeça podem conferir propriedades de circulação longa aos lipossomas. Embora não querendo ficar ligado à teoria, a presença dos grupos hidroxilo no grupo da cabeça de PG pode facilitar a ligação de hidrogénio 46 com moléculas de água no meio externo criando um escudo de hidratação que circunda o lipossoma.

Os resultados apresentados na Figura 1B indicam que os níveis no plasma do sangue de daunorrubicina também aumentaram com os níveis crescentes de DSPG. Estes dados demonstram, deste modo, que adicionalmente à diminuição da eliminação dos lipossomas do compartimento sangue, os lipossomas contendo de PGDS apresentem excelentes propriedades de retenção do fármaco in vivo.

Exemplo 2

Retenção de 5-Fluoro-2'-Desoxiuridina (FUDR) é Óptima Quando Encapsulada em Lipossomas Contendo PG, Sem Colesterol 0 efeito de uma incorporação de colesterol (Chol) em formulações lipossómicas na retenção in vivo de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) passivamente enclausurada foi examinada e comparada com as propriedades de retenção de FUDR encapsulado em lipossomas contendo fosfatidilglicerol. Isto foi efectuado por encapsulação passiva de FUDR em lipossomas consistindo de DSPC/Chol (55:45 proporção molar) e DSPC/DSPG (80:20 proporção molar) e comparando as proporções de fármaco-para-lípido após administração das formulações a murganhos. Os lipossomas DSPC/Chol foram seleccionados como um controlo para estes estudos, uma vez que esta formulação foi historicamente utilizada na técnica devido à sua capacidade de reter de forma óptima o fármaco, em parte devido ao efeito estabilizante do colesterol. O DSPG foi incorporado em lipossomas DSPC a 20% molar uma vez que se verificou que este nível de PG conferia aos lipossomas uma óptima longevidade em circulação como demonstrado no Exemplo 1.

As películas de lípido DSPC/Chol e DSPC/DSPG marcadas com 14C-CHE foram preparadas como descrito no Exemplo 1 e hidratados numa solução consistindo de FUDR em HBS, pH 7,4 contendo níveis vestigiais de 3H-FUDR. Subsequentemente à extrusão, os lipossomas trocaram o tampão para soro fisiológico normal através da utilização de diálise de fluxo tangencial. Os lipossomas carregados com FUDR foram administrados a murganhos Balb/c (3 murganhos por ponto de tempo) a uma dose de FUDR de 20 pmol/kg com uma dose resultante de lípido de 200 pmol/kg. Nos pontos de tempo indicados, o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em microtainers revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. A recuperação de lípido e as concentrações de fármaco no plasma foram determinados por contagem em liquido de cintilação. Os pontos de dados são a média +/- DP de 3 pontos.

Os resultados na Figura 2 demonstraram que FUDR foi optimamente retido nas formulações DSPC/DSPG (80:20 proporção molar) em relação às formulações DSPC/Chol (55:45 proporção molar). Estes resultados sugerem que a retenção melhorada de FUDR é realizada quando PG é empregue como um lípido estabilizante como um substituto dor colesterol. 48

Exemplo 3

Diminuição no Conteúdo em Colesterol Resulta na Retenção Aumentada de FUDR em Lipossomas Contendo PG Contendo Irinotecano 0 efeito do colesterol na retenção de FUDR passivamente enclausurado em lipossomas contendo de PG subsequentemente carregados com irinotecano foi investigada de modo a examinar o efeito do colesterol na retenção de FUDR numa formulação contendo dois fármacos encapsulados. A requerente demonstrou anteriormente que uma interacção sinergistica de dois fármacos in vivo ocorre optimamente se as taxas de libertação dos dois fármacos forem comparáveis. A retenção do fármaco pode ser ajustada por controlo dos parâmetros tais como o comprimento da cadeia acilo dos lípidos constituintes, o conteúdo em colesterol e a osmolaridade do compartimento interno do lipossoma. Estes estudos foram conduzidos de modo a explorar a capacidade do colesterol para modular a taxa de libertação de um fármaco em lipossomas duplamente carregados com o último objectivo de conseguir a libertação coordenada e ambos os fármacos. De modo a determinar o efeito dos níveis crescentes de colesterol na retenção de FUDR passivamente enclausurado, os lipossomas contendo DSPG foram preparados com 5, 10, 15 e 20% molar de colesterol e as proporções de fármaco-para-lípido no plasma foram medidos após administração intravenosa a murganhos. Como no exemplo anterior, PG foi incorporado nos lipossomas a 20% molar uma vez que se verificou que este nível de PG conferia optimamente propriedades de circulação longa aos lipossomas DSPC. 49

As películas de lípido consistindo de DSPC/Chol/DSPG com colesterol incorporado a 5, 10, 15 e 20% molar e com PG mantido constante a 20% molar foram preparadas como descrito no Exemplo 1 por dissolução de DSPC e colesterol em clorofórmio e DSPG em clorofórmio/metanol/água e combinando as preparações nas proporções molares apropriadas. Após remoção do solvente, as películas de lípido foram redissolvidas em clorofórmio e secas de novo, seguido por hidratação numa solução consistindo de 250 mM de CuS04 contendo 25 mg/mL de FUR com níveis vestigiais de 3H-FUDR. Após extrusão, os lipossomas trocaram o tampão para 300 mM de sacarose, 20 de HEPES, 30 mM de EDTA, pH 7,4 utilizando uma coluna de diálise de fluxo tangencial manipulável à mão. Subsequentemente à troca do tampão, as amostras foram carregadas com irinotecano a 50 °C a uma proporção molar fármaco-para-lípido de 0,1:1 e trocadas para HBS, pH 7,4 utilizando a coluna de fluxo tangencial manipulada à mão. Os lipossomas duplamente carregados resultantes foram administrados a murganhos Balb/c a 340 pmol de lípido/kg, 34 pmol de FUDR/kg e 34 pmol de irinotecano/kg. O sangue foi recuperado nos pontos de tempo indicados por punção cardíaca e colocado em microtainers revestidos com EDTA; três murganhos foram utilizados para cada ponto de tempo (como nos exemplos anteriores, os pontos dos dados são a média +/- o DP). As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. As concentrações de lípido e FUDR foram determinadas por contagem em líquido de cintilação e as concentrações de irinotecano foram determinadas por análise de HPLC.

Os resultados na Figura 3 demonstraram que como o conteúdo de colesterol em lipossomas DSPC contendo 20% molar de DSPG é aumentado, existe uma diminuição concomitante na percentagem 50 resultados

Estes inicial da proporção FUDR-para-lípido. demonstraram, deste modo, que o colesterol pode ser empregue para controlar a cinética de libertação do fármaco de lipossomas contendo PG carregados com um segundo fármaco.

Exemplo 4

Estabilidade no Sangue dos Lipossomas pode ser Melhorada por

Incorporação_de_Dipalmitoilf osf at idilqlicerol_(DPPG)_e

Fosfatidilinositol (PI) 0 tempo de residência no plasma dos lipossomas DSPC contendo dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) e fosfatidilinositol (PI) foi examinado de modo a determinar se estes lípidos também podiam imprimir propriedades de circulação longa a estes lipossomas de modo semelhante ao observado para os DSPG. Os DSPG e DPPG contêm ambos um grupo cabeça de glicerol, mas difere na medida em que a cadeia acilo de DSPG contém 18 átomos de carbono saturados enquanto as cadeias acilo de DPPG contêm apenas 16 átomos de carbono saturados. 0 PG e PI partilham caracteristicas químicas comuns de modo que ambos contêm um grupo fosfato negativamente carregado escudado por uma unidade neutral hidrofílica.

Os lipossomas DPPG contendo 10, 20 e 30% molar de DPPG foram preparados como apresentado no Exemplo 1, excepto que os lípidos de DPPG foram dissolvidos em clorofórmio/metanol (94:6 v/v) e 3H-CHE foi empregue como o lípido marcado. As películas de lípido resultantes foram hidratadas em HBS, pH 7,4 e após extrusão, os lipossomas foram injectados em murganhos Balb/c (3 murganhos por 51 ponto de tempo) numa dose de lípido de 100 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados, o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em microtainers revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. A recuperação do lípido foi monitorizado por contagem em líquido de cintilação e os pontos dos dados representam a média dos resultados +/- DP.

Os lipossomas DSPC/PI foram preparados por dissolução de lípidos DSPC em clorofórmio e PI de plantas hidrogenado em clorofórmio/metanol/água (8:4:1 v/v) . Os lípidos foram depois combinados em conjunto com uma proporção molar de DSPC para PI de 90:10, 80:20 e 70:30 com uma quantidade apropriada de 3H-CHE.

Foi removido clorofórmio sob uma corrente de N2 gás enquanto a temperatura foi mantida a 70 °C até permanecer muito pouco solvente. As películas de lípido resultantes foram colocadas sob vácuo para remover o grosso do solvente. As películas foram redissolvidas numa solução de clorofórmio contendo metanol seguido por remoção do solvente como indicado acima. As películas de lípido foram colocadas numa bomba de vácuo durante a noite para remover o restante solvente seguido por re-hidratação em HBS, pH 7,4. Após extrusão, as LUV resultantes foram injectadas em murganhos Balb/c (3 murganhos por ponto de tempo) numa dose de lípido de 100 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados, o sangue foi colhido por punção cardíaca e colocado em microtainers revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. A recuperação de lípido foi monitorizada por contagem em líquido de cintilação e os pontos de dados representam os resultados médios +/desvio padrão. 52

Os resultados resumidos na Figura 4 indicam que os lípidos DPPG transmitem aos lipossomas DSPC propriedades de circulação longa. Deste modo, a diminuição do comprimento do componente da cadeia acilo do lípido PG pela remoção de dois grupos metileno não parece influenciar substancialmente a capacidade destes lípidos conferir aos lipossomas propriedades de circulação longa.

Os resultados apresentados na Figura 5 demonstraram que, de modo semelhante aos lipossomas contendo de PG, formulações preparadas com PI apresentam tempos de vida prolongados em circulação. 0 grupo da cabeça inositol de PI parece, deste modo, actuar do mesmo modo como um grupo da cabeça de glicerol de PG para estimular a estabilidade dos lipossomas no plasma.

Exemplo 5

Lipossomas de Fosfatidilglicerol Contendo Níveis Baixos de Colesterol Resistem aos Efeitos Prejudiciais da Congelação

É preferível que as preparações de lipossoma apresentem propriedades de estabilidade químicas e físicas estendidas de modo a que estas composições sejam de utilização prática. Isto requer, frequentemente, a utilização de formatos de produto congelado ou congelado-seco (liofilizado) de modo a evitar a degradação de fármaco lábil e/ou componentes de lípido. Sem a utilização de crioprotectores, os lipossomas são geralmente propensos a ruptura mecânica, agregação e fusão durante o processo de descongelação/re-hidratação. De modo a examinar se os lipossomas contendo fosfatidilglicerol co-carregados com FUDR 53 e irinotecano e preparados com colesterol abaixo de 20% molar foram resistentes aos efeitos prejudiciais da congelação, os lipossomas DSPC foram preparados com 0,5, 10, 15 e 20% molar de colesterol e sujeitos a temperaturas de -20 °C e -70 °C. O tamanho do lipossoma foi medido antes e após congelação e antes e após carga do fármaco de modo a medir o grau da agregação de lipossoma induzida por carga do fármaco e descongelação após congelação.

As películas de lipido com 0-20% molar de colesterol, DSPG e DSPC e niveis vestigiais de 14C-CHE foram preparadas como descrito nos métodos. As películas de lipido foram re-hidratadas em 250 mM de CuSCq contendo 100 mM de FUDR com níveis vestigiais de 3H—FUDR. Após extrusão, os lipossomas foram trocados de tampão para soro fisiológico e depois para 300 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, 30 mM de EDTA, (tampão de SHE) pH 7,4 utilizando uma coluna de fluxo tangencial manipulada à mão. Esta amostra foi depois trocada para 300 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, pH 7,4 para remover qualquer EDTA no tampão exterior. Os lipossomas foram carregados com irinotecano por incubação dos lipossomas com o fármaco a 50 °C durante 5 minutos, a uma proporção molar 0,1:1 fármaco-para-lípido. O fármaco livre foi removido das amostras com a troca de tampão para HBS utilizando fluxo tangencial. As amostras foram dimensionadas antes e após a carga do fármaco utilizando um dimensionador de partículas NICOMP. Para estudos de congelação, as amostras foram congeladas a -20 °C e -70 °C durante 24 horas. Após congelação, as amostras foram descongeladas à temperatura ambiente e uma fracção da amostra foi depois aplicada a uma coluna de centrifugação Sephadex G-50 e depois centrifugada. A proporção molar de fármaco para mole de lipido para o eluente da coluna de centrifugação foi produzida 54 utilizando contagem de liquido de cintilações para determinar as concentrações de lípido e 5-FUDR e absorvência a 370 nm contra uma curva padrão para determinar as concentrações de irinotecano. O dimensionamento de partículas dos lipossomas eluídos foi também determinado utilizando varrimento de luz quasi-elástico. Os valores de desvio padrão para as medições do tamanho do lipossoma variaram de 24% a 34% para os lipossomas antes de congelação, de 31% a 61% após congelação a -20 °C e de 32% a 47% para congelação a -70 °C. Todos os valores de Chi quadrado foram inferiores a 1.

Os resultados resumidos na Figura 6A mostram que os lipossomas co-encapsulados com FUDR e irinotecano apresentam estabilidade óptima após congelação-descongelação a -70 °C como evidenciado pela observação de que o tamanho do lipossoma não alterou substancialmente antes de e subsequentemente à congelação. A observação da retenção de FUDR e irinotecano nos lipossomas duplamente carregados antes e após congelação a -20 e -70 °C revelou que FUDR foi bem-retido ao longo do processo de congelação/descongelação (Figura 6B) . Foram feitas observações semelhantes para a retenção de irinotecano antes e após congelação a -20 e -70 °C (Figura 6C) . Cumulativamente, estes resultados demonstraram que a estabilização de lípidos tais como fosfatidilglicerol pode ser empregue para proteger lipossomas contra os efeitos prejudiciais de congelação sem necessitar da presença de crioprotectores. 55

Exemplo 6

Lipossomas Sem Colesterol Preparados na Ausência de um Gradiente de pH Resiste a Agregação Subsequentemente a Congelação

Os lípidos foram preparados em clorofórmio e subsequentemente secos sob uma corrente de azoto gasoso e colocado numa bomba de vácuo durante a noite. As amostras foram depois hidratadas com 300 mM de tampão citrato a pH 4,0, ou soro fisiológico tamponado com HEPES (HBS) pH 7,4 e passados através de um dispositivo de extrusão (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC) 10 vezes com 80 e 100 nm de filtros de policarbonato. O tamanho médio de lipossomas foi determinado por varrimento de luz quasi-elástico (QELS) utilizando um dimensionador de partículas submicron NICOMP 370 a um comprimento de onda de 632,8 nm. Os lipossomas foram congelados em azoto líquido (-196 °C) durante 24 h, deixados a descongelar à temperatura ambiente seguido por determinação do tamanho médio do lipossoma utilizando um dimensionador de partículas NICOMP. A Figura 7 mostra que o tamanho de lipossomas DPPC/DSPEPEG2 0 0 0 (95:5 % molar) (lipossomas sem colesterol) hidratados em 300 mM de citrato não apresentaram alterações substanciais no tamanho antes de e subsequentemente à congelação. Em contraste, os lipossomas DPPC/chol (55:45 % molar) e DPPC/ colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar), também hidratados em 300 mM de citrato, aumentou o tamanho aproximadamente dez vezes subsequentemente à congelação. Foi apresentado o mesmo perfil dos lipossomas DSPC/DSPE-PEG2 0 0 0 (95:5 % molar), DSPC/col (55:45 % molar) e 56 DSPC/colesterol/ DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar) hidratados em citrato como exemplificado na Figura 8. O tamanho dos lipossomas DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) hidratados em HBS também não apresentaram alterações substanciais no tamanho subsequentemente à congelação como apresentado na Figura 9. Em contraste, DPPC/chol (55:45 % molar) e os lipossomas DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar), também hidratados em HBS, apresentaram aumentos substanciais no tamanho subsequentemente à congelação (também Figura 9). A Figura 10 mostra que o tamanho de lipossomas DSPC/DSPEPEG20 0 0 (95:5 % molar) hidratados em HBS não se alterou subsequentemente à congelação enquanto os lipossomas hidratados com HBS e consistindo de DSPC/colesterol (55:45 % molar) e DSPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar) também seguiram o mesmo perfil como na Figura 9. A Figura 11 mostra que lipossomas consistindo de DPPC/DSPE-PEG750 (95:5 % molar) e DSPC/DSPEPEG750 (95:5 % molar) e hidratados em HBS também não alteram o tamanho subsequentemente à congelação demonstrando assim que os polímeros hidrofílicos de baixo peso molecular também protegem contra a agregação de lipossomas devido a congelação nos sistemas sem colesterol. A Figura 12 mostra que lipossomas consistindo de DAPC/DSPE-PEG2000 (95: 5 % molar) e hidratados em HBS também não alterou o tamanho substancialmente subsequentemente à congelação demonstrando, assim, que o aumento no comprimento da cadeia acilo não afecta as propriedades de crioestabilidade. 57

Exemplo 7

Lipossoma PEGuilado com Gradiente de pH Sem Colesterol Resiste a Agregação Subsequentemente a Congelação

Os lipossomas consistindo de DPPC/DSPEPEG2000 (95:5 % molar) e DPPC/colesterol/DSPEPEG2000 (50:45:5 % molar) foram preparados de acordo com o método do Exemplo 7 (utilizando citrato como o tampão de hidratação) excepto que se seguiu a extrusão e determinação de tamanho, os lipossomas foram passados através de uma coluna Sephadex G50 equilibrada em HBS de modo a produzir um gradiente de pH. Os lipossomas resultantes foram congelados em azoto liquido (-196 °C) durante 24 h, deixado a descongelar à temperatura ambiente seguido por uma segunda determinação de tamanho médio do lipossoma. A Figura 13 mostra que o tamanho de lipossomas de gradiente de pH DPPC/DSPEPEG2 0 0 0 (95:5 % molar), não apresentaram alterações substanciais no tamanho subsequentemente à congelação. Em contraste, os lipossomas de gradiente de pH DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50: 45:5 % molar), também hidratado em 300 mM de citrato, aumentado no tamanho aproximadamente três vezes subsequentemente à congelação. Do mesmo modo, como exemplificado na Figura 14, os lipossomas de gradiente de pH consistindo de DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) não demonstraram alterações no tamanho subsequentemente à congelação enquanto DSPC/colesterol/DSPE-PEG2000 lipossomas o fizeram. 58

Exemplo 8

Crioestabilidade de Lipossomas Sem Colesterol e Contendo Colesterol Compreendendo Glucose Encapsulada

Os lipossomas foram preparados de acordo como o Exemplo 7, excepto que a hidratação foi efectuada numa solução de 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 50 mM de glucose pH 7, 4 com vestígios de 14C-glucose. Os lipossomas resultantes contendo passivamente glucose encapsulada foram dimensionados e depois passados através de uma coluna Sephadex G50 de 10 mL em HBS para remover a glucose do meio exterior. A percentagem de inclusão de glucose foi medida por contagem em liquido de cintilação. Os lipossomas foram congelados a -196 °C, deixados a descongelar à temperatura ambiente seguido por determinação de tamanho utilizando análise QELS. A percentagem de encapsulação de glucose foi medida após congelação passando os lipossomas através de uma coluna de centrifugação Sephadex G50 de 1 mL equilibrada com HBS seguido por contagem de cintilações do eluente. A Figura 15 mostra que os lipossomas DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) contendo glucose enclausurada são resistentes a agregação induzida por congelação. Os DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar), por outro lado, aumentam no tamanho subsequente ao passo de congelação. Os métodos convencionais necessitam da presença de crioprotectores e ambas as superfícies interiores e exteriores do lipossoma. Estes resultados mostram que a presença de crioprotectores no interior do lipossoma é suficiente para protecção de congelação/descongelação. 59 A percentagem de encapsulação de glucose antes de e após congelação é representada na Figura 16. Os lipossomas consistindo de DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) não apresentaram perda de glucose após congelação. Em contraste, a fuga de glucose após congelação ocorreu com lipossomas consistindo de DPPC/colesterol/DSPE-PEG2000 (50:45:5 % molar).

Exemplo 9

Crioestabilidade de Lipossomas Isentos de Colesterol Compreendendo Doxorrubicina Encapsulada

Os lipossomas com gradientes de pH transmembranar foram preparados como no Exemplo 8. A doxorrubicina foi adicionada à mistura de lipossomas a uma proporção de 0,2:1 de doxorrubicina: lipido e incubada durante 2 h, a 37 °C, para os lipossomas DPPC/DSPEPEG2000. Após incubação, a mistura foi passada através de uma coluna de centrifugação Sephadex G50 de 1 mL equilibrada com HBS. A concentração em lipido do eluente foi medida por contagem em liquido de cintilação. Para medir os níveis de doxorrubicina, foi ajustado um volume definido do eluente para 100 pL seguido pela adição de 900 pL de 1% de

Triton X-100 para dissolver a membrana lipossómica. A amostra foi aquecida até ficar com aparência enevoada e a Abs4so foi medida após equilíbrio à temperatura ambiente. As concentrações de doxorrubicina foram calculadas pela preparação de uma curva padrão. 60

Os lipossomas encapsulados com doxorrubicina foram passados através de uma coluna Sephadex G50 de 10 mL em HBS (pH 7,4) para trocar o tampão externo por HBS. O lípido e os níveis de doxorrubicina foram determinados como acima. Os lipossomas foram congelados a -196 °C durante 24 h, seguido por análise QELS para determinar o novo tamanho dos lipossomas após descongelação à temperatura ambiente. Os lipossomas foram a seguir passados através de uma coluna de centrifugação G50 Sephadex equilibrada com HBS e as concentrações de lípido e de doxorrubicina medidas como acima.

Como apresentado na Figura 17, os lipossomas DPPC/DSPEPEG2000 (95:5 % molar) que encapsulam doxorrubicina não aumentaram em tamanho subsequentemente a congelação. A doxorrubicina foi também retida nesta formulação após congelação.

Exemplo 10

Lipossomas Crioestáveis Isentos de Colesterol Carregados com Fármaco Subsequentemente a Congelação

Os lipossomas foram preparados como no Exemplo 6 e congelados durante 24 horas a -196 °C. Um subconjunto das amostras foi carregado com doxorrubicina antes da congelação ("carregados de fresco") e outro subconjunto subsequente a congelação. A carga de DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) foi efectuada a 37 °C durante 2 horas, e a 60 °C durante 15 minutos para os lipossomas DSPC/DSPE-PEG2000. A determinação da percentagem de encapsulação de doxorrubicina foi efectuada como 61 no Exemplo 10. Os lipossomas contendo colesterol não foram carregados devido a agregação. Os lipossomas consistindo de DPPC/DSPE-PEG2000 (95: 5 % molar) foram carregados por incubação a 37 °C enquanto os lipossomas consistindo de DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) foram carregados por incubação a 60°C.

As Figuras 18 e 19 mostram que lipossomas DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5 % molar) e DSPC/DSPE-PEG2000 carregados antes de e subsequente a congelação apresentam perfis de carga semelhantes.

Estes resultados demonstraram que os lipossomas isentos de colesterol podem ser activamente carregados com o agente subsequente a congelação. Isto permite que os lipossomas congelados sejam proporcionados numa forma não encapsulada para subsequente carga com um agente.

Podem ser feitas várias modificações aos sistemas anteriores sem se afastar dos seus ensinamentos básicos. Embora a presente invenção tenha sido descrita com detalhe substancial com referência a uma ou mais formas de realização especificas, os especialistas na técnica reconhecerão que podem ser feitas alterações às formas de realização especificamente divulgados neste pedido, ainda assim estas modificações e melhorias estão no âmbito e espirito da invenção, como apresentado nas reivindicações que se seguem. Todos os documentos publicações ou patentes citados nesta descrição são aqui incorporados por referência como se cada uma destas publicações ou documentos fosse especificamente e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência. 62 A citação das publicações acima ou documentos não pretende ser uma admissão de que qualquer dos anteriores é técnica anterior pertinente, nem constitui qualquer admissão como os conteúdos ou data destas publicações ou documentos.

Lisboa, 25 de Julho de 2012 63

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo lipossomas que contêm, pelo menos, um agente biologicamente activo em que os referidos lipossomas possuem um diâmetro médio entre 80-200 nm +/- 25 nm; e possuem uma temperatura de transição (Tc) de, pelo menos, 38 °C, (a) em que a(s) bicamada(s) ordenadas dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lipidos que formam vesículas, que são fosfolípidos ou esfingolípidos; (ii) pelo menos 1% molar de um ou mais ácidos fosfatídicos cada um acoplado a uma unidade não-zwiteriónica que é um álcool, um ácido, uma cetona, um éster, um éter, uma amida, um aldeído, um ciclitol ou um sacárido; (iii) 5% molar a menos do que 20% molar de colesterol; ou (b) em que as bicamada(s) ordenadas dos referidos lipossomas consiste(m) essencialmente de: (i) um ou mais lipidos que formam vesículas, que são fosfolípidos ou esfingolípidos; 1 (ii) pelo menos 1% molar de ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica; (iii) 5% a menos do que 10% de colesterol; e em que em l(a) e 1(b), o referido agente biologicamente activo está associado com as bicamada(s) ordenada(s) ou está encapsulado num espaço aquoso definido pelas referidas bicamada(s) ordenada(s).
2. 2. Composição da reivindicação l(a), em que cada um dos referidos ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica é um fosfatidilglicerol (PG) ou um fosfatidilinositol (PI).
3. 3. Composição da reivindicação l(b), em que o referido ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica é um ácido fosfatídico acoplado a um polímero hidrofílico.
4. 4. Composição da reivindicação 3, em que o referido polímero hidrofílico é polietilenoglicol (PEG).
5. 5. Composição de qualquer das reivindicações 1-4, em que os referidos lipossomas compreendem, pelo menos, 10% molar dos referidos ácido fosfatídico acoplado a uma unidade não-zwiteriónica.
6. 6. Composição de qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido lípido formador de vesícula é diestearoilfosfatidilcolina. 2
7. 7. Composição de qualquer das reivindicações 1-6, em que o referido agente biologicamente activo compreende FUDR e/ou CPT-11 e/ou carboplatina.
8. 8. Composição de qualquer das reivindicações 1-7 que é crioestável na ausência de crioprotector.
9. 9. Composição de qualquer das reivindicações 1-8 numa forma congelada ou liofilizada.
10. 10. Composição de qualquer das reivindicações 1-9 que contém ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Utilização da composição de qualquer das reivindicações 1-10 na preparação de um medicamento para utilização num método para administrar um agente biológico a um indivíduo em necessidade do referido agente.
12. 12. Método para conservar uma composição lipossomal que compreende congelação ou liofilização da composição de qualquer das reivindicações 1-10. Lisboa, 25 de Julho de 2012 3