CN1148336A - 增大包封量的脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够有效地包容水溶性物质，特别是非电解质水溶性物质的脂质体制剂。脂质体及其包含多层脂质体的悬浮液，其特点是，脂质体膜是由含有基本饱和脂肪酸基的中性磷脂和含有基本饱和脂肪酸基的带电磷脂构成的，所述中性磷脂和带电磷脂的比率为200∶1-3∶1，脂质体的加权平均粒度为50nm-3,000nm，脂质体的包封量(内水相(体积)/脂质(重量))至少为5ml/g。本发明脂质体制剂可包封非电解水溶性物的水溶液，其包封量(内水相/脂质)至少为5ml/g。

Description

增大包封量的脂质体

技术领域

本发明涉及新的脂质体制剂，其悬浮液及其制备方法，并尤其涉及能够包容大量水溶性非电解质药物的脂质体及其悬浮液。

相关技术

脂质体是能包封水相(称作内水相)的，包含单层或多层脂质膜的囊，并且，因为它们能将药物保持在脂质膜内，与外水相分离，所以人们热心地研究，将它作为药物释放系统。脂质体可以包封各种药物，包括高分子量的药物，即包括脂溶性药物和水溶性药物。

脂溶性药物因其与脂质体脂质膜的亲和性而容易包封在脂质体中。另一方面，在水溶性药物中，水溶性电解质药物通过药物电荷与带有相反电荷的磷脂之间的静电作用(日本特许申请号2-187370)或通过脂质体外相和内相之间的pH梯度(WPI 88-271022/38)，可有效地包封在脂质体内水相中。

然而，包封药物的量仍然不是令人满意的。而且，如使用该静电作用法，药物被限制为与“带电”磷脂电荷相反的药物，并且，如果药物带有与使用磷脂相同的电荷，那么，所使用药物在脂质体中的包封比是很低的。而且，如果药物是水溶性非电解质物质，那么不能应用上述方法，因此，有效地将水溶性非电解质药物包封在脂质体中还不是容易的。

作为有效地将水溶性非电解质包封在脂质体内水相的方法，推荐反相蒸发法(Proc Natl.Acad.Sei.USA，Vol.75(9).P4194，1978)，醚注射法(出处同上，Vol.443，P629，1975)等等。然而，因为该方法使用具有低燃点的醚，所以这些方法不能用于工业上大量生产脂质体。由这些方法生产的脂质体为单层脂质体。与多层脂质体比，单层脂质体回缩，因此给予后，在血中的稳定性低。

进一步WO 88/09165中公开了包封水溶性非电解质药物的脂质体，但包封率很低。

本发明公开

因此，本发明提供包含多层脂质体，能够包封或容纳大量水溶性药物，特别是水溶性非电解质药物或具有与磷脂相同电荷药物的脂质体制剂。

经过大量研究，本发明者发现，以特定比例应用符合预先测定条件的中性磷脂和符合预先测定条件的带电磷脂，制备能在内水相中容纳大量水的脂质体，因此完成了本发明。

因此，本发明提供包含多层脂质体的脂质体制剂，其特点是由含有基本饱和脂肪酸基的中性磷脂和含有基本饱和脂肪酸基的带电磷脂来制备脂质体膜，其中，中性磷脂和带电磷脂的重量比为200∶1-3∶1，脂质体的加权平均颗粒直径为50nm-3,000nm，并且脂质体的包封量(内水相(体积)/脂质体(重量))至少为5ml/g。

因此，本发明提供内水相包封量大并因此能容纳大量水溶性药物，特别是水溶性非电解质药物并在血中和贮存期间稳定的脂质体制剂。实现本发明的最佳方案

制备本发明脂质体膜的必需组分之一是含有基本饱和脂肪酸基的中性磷脂。通常，在磷脂中饱和脂肪酸基的碳原子数至少为14，优选至少为15并且更优选至少为16。如果饱和脂肪酸基中碳原子数小于14，那么脂质体容纳内水相的能力降低并且给予后，脂质体在血中的稳定性降低。另一方面，通常，如果在脂肪酸基中碳原子的数为28或更多，生物相容性降低，并且在生产脂质体过程中需要非常高的温度。

术语“基本饱和的”指完全饱和的脂肪酸(不含c-c双键)，或脂肪酸不饱和程度很低。因为脂肪酸基是基本饱和的，所以，整个中性磷脂的不饱和程度，用碘值表示，必须不超过20，优选碘值不超过10。如果不饱和程度太高，那么包封率降低，并且脂质体容易氧化，难以加热灭菌。

本发明所使用的中性磷脂是中性甘油磷脂，例如，部分或完全氢化的天然存在的，例如大豆或蛋黄衍生物，或合成的磷脂酰胆碱，部分半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。

制备本发明脂质体膜的另一必要组分是包含基本饱和脂肪酸基的带电磷脂。通常，在脂肪酸基中碳原子的数目至少为14，优选至少为15，并且更优选至少为16。如果脂肪酸基中碳原子的数目小于14，那么脂质体容纳内水相的能力降低并且给予后，脂质体在血中的稳定性降低。

另一方面，如果脂肪酸基中碳原子的数目为28或更大，那么生物相容性降低，并且在生产脂质体期间，需要很高的温度。术语“基本饱和的”指所用脂肪酸是完全饱和的(不含c-c双键)，或脂肪酸的不饱和程度很低。因为脂肪酸基是基本上不饱和的，所以，整个带电磷脂的不饱合程度，用碘值表示，必须不超过20，并优选碘值不超过10。如果不饱合程度太高，那么包封率降低，并且脂质体容易氧化，难以加热灭菌。

本发明所使用的带电磷脂是带正电或带负电荷的甘油磷脂。例如带负电荷的磷脂包括磷脂酰丝氨酸，例如部分或全部氢化的天然存在的，例如大豆或蛋黄衍生物，或半合成或合成的磷脂酰丝氨酸，部分半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)或二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)；磷脂酰甘油，例如，部分或完全氢化的天然存在的例如大豆或蛋黄衍生物，或半合成的磷脂酰甘油，部分半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)；磷脂酰肌醇，例如，部分或完全氢化的，天然存在的，例如大豆或蛋黄衍生物，或半合成或合成磷脂酰肌醇，部分半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPZ)或二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPZ)；磷脂酸，例如，部分或完全氢化的天然存在的，例如大豆或蛋黄衍生物，或半合成或合成的磷脂酸，部分半合成或合成的二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。

例如，带正电荷的脂质为磷脂酸与氨基醇的酯，如二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸与羟乙基二胺的酯。

尽管该带电磷脂是单独使用的，但可使用一个以上的带电磷脂。在使用一个以上带电磷脂时，优选带电磷脂都带正电荷，或带电磷脂都带负电荷，以便阻止脂质体的聚集。

按照本发明，中性磷脂和带电磷脂重量比为200∶1-3∶1，优选60∶1-4∶1，并且更优选40∶1-5∶1。如果该比值超过200∶1-3∶1，那么包封量降低，并且难以获得本发明的好处。

除上述两种必需组分外，本发明脂质体可包含各种任意组分。例如，可加入脂质总量0.01-2摩尔％，优选0.1-1摩尔％的维生素E(α-生育酚)和/或维生素E醋酸酯作为抗氧剂。而且，为了控制给药后，脂质体的药物动力学，可加入脂质总量2-10摩尔％，优选4-8摩尔％的聚甘油酯衍生物或聚乙二醇脂质衍生物。通过加入这些组分，可控制药物动力学，因此阻止肝脏和脾(网状内皮组织系统)捕获脂质体及其从血中清除。

就包含上述磷脂的本发明脂质体而言，总脂质浓度通常为20mg/ml-100mg/ml，优选40mg/ml-90mg/ml，并且更优选50mg/ml-80mg/ml，以便促进药物在脂质体中的包封。

本发明脂质体容纳并包封溶解在内部水相中的药物。该药物可以是水溶电解质型或非电解质型，但本发明的好处尤其在于包封非电解质型的药物。包封在本发明脂质体中的药物包括：

                  低分子量化合物

X线显影剂：

碘克沙醇，碘海醇，碘帕醇，iobazol，碘美普尔，ioxylan，碘普罗胺，isovist，磺美普尔，碘喷托，iobromide，碘西胺(iosymide)，ioberu-zol，碘曲仑，碘酞硫，碘西醇(ioclecymel).1，3-二-(N-3，5-二(2，3-二羟基丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基)-N-羟基乙酰氨基)丙烷；

MRI显影剂：

Dimeglumine gadopentetate gadodiamide，prohance.

抗肿瘤剂：

·Anthracycline型抗肿瘤剂如盐酸阿霉素，盐酸柔红霉素，表柔比星。

·喜树碱(Camptotecin)衍生物

盐酸Irinotecen

·抗代谢药如氨甲喋呤，Cytocinarabineside等。

·植物生物碱如硫酸长春碱，硫酸长春新碱(Vinclistime Sulfate)紫杉酚，taxotel等。

·激素(hormons)如枸橼酸它莫西芬。

·博来霉素衍生物，如硫酸博来霉素等。

·放线菌素衍生物，如放线菌素D等。

·顺铂(Cisplastin)

·MylomycinC

·Neocartinostatin

抗生素：

·四环素类如盐酸四环素等

·氨基糖甙类抗生素硫酸庆大霉素等

·其它抗生素如硫酸链霉素等。

化疗剂

·吡啶酮-羧酸抗菌剂，如氧氟沙星，Lebofloxicin，诺氟沙星，环丙沙星(Cyprofloxacin)，依诺沙星。

·磺胺药

·抗病毒药如阿昔洛韦

                    高分子量物质

肽和蛋白质：

干扰素，白细胞介素，肿瘤坏死因子，胞壁酰基肽，促红细胞生成素(erythropoetins)，表皮生长因子(EGF)，克隆刺激因子(CSF)，神经生长因子(NGF)，肝生长因子(HGF)，超氧化物歧化酶等。

核酸：

DNAS，如抗感觉(antisense)低聚核甘酸，

RNA(肽核酸(PNA))。

上述药物以等渗溶液的形式(与身体的生理渗透压比)包封在脂质体中，使得给药后，脂质体可稳定地保留在身体中。作为溶媒，可使用水，缓冲剂溶液如Tris-HCl缓冲剂，磷酸盐缓冲剂，枸橼酸盐缓冲剂等等。为了获得等渗透溶液，将药物在产生等渗溶液的浓度下溶解在溶媒中。例如，因为药物的溶解度低，单独应用药物不能产生等渗溶液，那么可向溶媒中加入其它无毒水溶性物质，例如盐如氯化物，糖如甘露糖醇，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇等，由此形成等渗溶液。

下面，说明制备本发明脂质体的方法。本发明脂质体的特征是，它们都是多层脂质体，这样以便于它们在给药后稳定地存在于血中，并且它们都具有较高的包封量。按照制备多层脂质体所使用的常规方法可制备本发明脂质体。这些方法包括Bangham法(J.mol.Diol.13，238-252，1965)，多元醇法(Japanese Examined Patent Publica-tion(KOKOKU)No.4-36734)，脂质溶液法(Japanese ExaminedPatent Pubeicoation(KOKOKU)No.4-36735)，力化学法(JapaneseExamined Patent Publication(KOKOK U)No.4-28412)。

通常，通过将上述磷脂溶解在挥发性有机溶剂如氯仿，甲醇，二氯甲烷，乙醇等，或所述有机溶剂的混合溶剂和水中，除去所述溶剂。将得到的残渣混合到含水溶性药物的水相中，并振摇或搅拌混合物，可制备所需要的多层囊。

作为上述方法中除去溶剂的步骤，Rangham’s法使用蒸发，而喷雾干燥法使用喷雾干燥。也可使用冷冻干燥。

在上述脂质体制备方法中，不限制所使用与脂质相关的溶剂的量。并且使脂质体溶解的量是适宜的。按照常规方法，如减压蒸发法，如果必要，在惰性气体存在下，通过蒸发，可除去得到的脂质和溶剂混合物中的溶剂。就通常使用的有机溶剂言，例如上述挥发性有机溶剂和混合溶剂含10份所述有机溶剂和最多1份水。

为了通过冷冻干燥除去溶剂，选择溶剂，使得可在大约0.005-0.1托的减压下在温度低于溶剂冰点，通常在-30℃--50℃下，除去溶剂，并将溶剂除去。通常，为了通过喷雾干燥除去溶剂，将空气压力控制到1.0kg/cm²，将空气流速控制到0.35cm²/分，并将进气口温度调至温度高于所用溶剂的沸点。例如，溶剂为氯仿。将温度调至60-90℃，并通过常规方法将溶剂除去。

在等于或高于所用脂质的相转变温度(Tc)下，将得到的脂质残渣与含药物如造影剂的水溶液混合，并将混合物在等于或高于所述Tc温度下剧烈地或轻轻地振摇或搅拌，得到所需要的脂质体及其组合物。

考虑到药物的包封比，在含药物的液相中电解质离子的浓度应该尽可能地低，并且通常，除药物外包括阳离子和阴离子在内的离子总浓度应不超过大约40mM，更优选不超过大约20mM。

尽管通过总平均粒度来表示脂质体的粒度，但考虑包封量时，优选使用加权平均粒度。

本发明脂质体的加权平均粒度通常为50nm-3,000nm，优选150nm-1000nm，更优选200nm-500nm。如果粒度小于200nm，不能获得充分的包容量，并且如果粒度大于3000nm，当脂质体凝聚时，可能阻断毛细血管。为了获得上述要求的粒度，将具有较大粒度的脂质体挤压，通过具有预先测定孔径的滤器过滤(Biochem.Biopiy.Acta Vol.557，P9(1979))。

如此制得的脂质体以在水性溶媒(外液)中的悬浮液的形式存在，并且用作药用组合物。在制备脂质体过程中，未包封在脂质体中的药物的溶液可存在于外液中。或者，可用其它外液代替脂质体外存在的溶液。在任何情况下，优选外液(分散溶媒)与内水相是等渗的。

考虑到脂质体在长期贮存过程中的稳定性，在如此制得的脂质体悬浮液中的电解质离子的浓度应该尽可能地低，并且通常，除药物外，包括阳离子和阴离子在内的离子的总浓度应该不超过大约40nm，更优选不超过大约20mM。也可以在保证脂质体或所使用的药物稳定的pH范围内选择脂质体悬浮液的pH，并且通常，该范围为pH3-8。

本发明脂质体的包封量至少为5ml/g脂质，优选至少6ml/g，并且更优选8ml/g，进一步更优选至少10ml/g，在用蔗糖溶液(280mM)作为分散溶媒来制备脂质体情况下，包封量可能大于12ml/g。

通常，通过增加脂质体脂质的浓度，水溶性非电解质药物在脂质体中的包封比越来越高，但最大值仅为50％，并且甚至即使增加脂质体脂质的浓度，包封比也不可能超过该最大值。

不论脂质体脂质的浓度是否很高，按照制备多层脂质体经常使用的常规方法可得到在内水相中有效地容纳水溶性物质，尤其是非电解质水溶性药物的本发明多层脂质体。脂质体可加热灭菌而不会引起变色，改变粒度，脂质体凝聚或改变包容比，并且在血中是稳定的，在一年以上的贮存期内是稳定的，并且通过化学方法，作为脂质体组合物是稳定的。

实施例

下面，通过实验和实施例，更详细的说明本发明。

实验

(1)制备脂质体：

首先，将1g的脂质称重并向该脂质中加入60ml氯仿，甲醇和水的混合物(体积比为100∶20∶0.1)将混合物在水溶上(65℃)加热至脂质溶解。在60℃旋转汽化器中将溶液蒸发，除去溶剂。

将残渣进一步在真空中干燥2小时，形成脂质膜。将等渗蔗糖水溶液(280mM)加热至65℃，并将50ml该加热溶液加到脂质膜中，并用混合器混合10分钟，同时在65℃下加热。然后在加压下，通过0.1μm孔径的聚碳酸酯膜滤器过滤混合物，制备多层囊(MLV)。

将如此制得的部分MLV放入玻璃小瓶中，并在121℃下高压灭菌20分钟。

(2)测定粒度

按照准弹性光散射法，利用动态光散射仪DLS-700(tsukaDenshi Kabushiki Icaisha)，测定如此制得的脂质体的加权平均粒度。

(3)测定包封量

通过包容在脂质体中的水溶性非电解质蔗糖的比值，即脂质体对蔗糖的包封比，计算脂质体内水相的体积。例如，如果蔗糖的包封比为30％，那么1ml脂质体制剂的30％，即0.3ml是内水相的体积。包封量定义为每单位脂质(重量)的内水相体积(体积)。例如，如果脂质体制剂的浓度为0.2g/ml，并且蔗糖的包封比为30％，因为在1ml脂质体中，0.02g脂质包含0.3ml内水相体积，那么包封量为15ml/g。

按照凝胶过滤法，测定在脂质体制剂中蔗糖的包封比。即，利用生理盐水作为流动相，将脂质体制剂通过凝胶过滤柱过滤(载体：Pharmocia，交联葡聚糖G50；柱直径：16mm；柱高：30mm)，并分级收集洗脱液(2.5ml/馏分)。从每个馏分中取0.8ml等分试样，加入2ml甲醇，再加入1ml氯仿。将混合物搅拌至全透明。

加入1ml氯仿，搅拌后，向混合物中加入1.2ml蒸馏水，然后搅拌并在冷却的离心机(Kubota Shoji K.K.，Type KR-702)中离心(3500rpm，10分钟，室温)。通过苯酚-硫酸酯法测定分离两相上层(水-甲醇相)中提取的蔗糖浓度。如果提取液中蔗糖的浓度高，那么用蒸馏水适当地稀释提取液，取0.8ml等分试样并用甲醇，氯仿和蒸馏水提取。

在洗脱液中提取到的蔗糖的总量(在25个馏分中提取到的蔗糖的量)除以在空体积中洗脱的脂质体馏分中蔗糖的量，得到包封比。注意到终点的脂质体馏分为蔗糖浓度最小时的馏分。

(4)脂质体组分的影响

如表1所示，将通过氢化蛋黄产生的卵磷脂(EPC)制得的氢化卵磷脂(HEPC)和由氢化大豆产生的卵磷脂制得的氢化卵磷脂合成的磷脂酰丝氨酸(HSPS)称重，并按上述方法制备脂质体制剂，并在加热灭菌后，如上所述，测定脂质体制剂粒度和包封量。

表1

                  粒度(nm，平均值±标准差)  包封量(ml/g脂质)

  重量HEPC      HSPS      高压灭菌前  高压灭菌后  高压灭菌前  高压灭菌后0.985g    0.015g    373±179    349±180    9.8         9.60.975g    0.025g    265±122    271±128    15.5        15.50.950g    0.050g    237±111    260±119    16.0        15.80.909g    0.091g    260±118    227±102    13.9        14.30.850g    0.150g    235±115    241±113    14.1        13.80.800g    0.200g    197±91     92±87      8.9         8.9(5)粒度的影响

将0.909gHEPC和0.091HSPC称重，除使用孔径为1.0μm，0.8μm，或0.6μm的聚碳酸酯膜滤器加压过滤外，按照上述方法，制备脂质体制剂。如上所述，在加热灭菌前后，测定粒度和包封量。结果见表2。

表2

            粒度(nm，平均值±标准差)  包封量(ml/g脂质)

滤器孔径  高压灭菌前  高压灭菌后  高压灭菌前  高压灭菌后

1.0μm    260±118    227±102    13.9        14.3

0.8       225±102    214±102    14.1        14.2

0.6       213±92     213±93     10.8        10.6(6)各种带电脂质的影响

将表3中所显示的0.950gHBPc和0.050g带电脂质称重，并按上述方法，制备脂质体制剂，在加热灭菌前后，测定粒度和包封量。

表3

         粒度(nm，平均值±标准差) 包封量(ml/g脂质)

带电脂质

          加热前      加热后      加热前  加热后

HSPS      237±111    260±119    16.0    15.8

DSPG      254±121    252±123    14.6    14.7

DPPA      276±123    239±111    14.8    14.6实施例1包封X线显影剂，碘克沙醇

将0.640g由蛋黄产生的氢化磷脂酰胆碱(HEPC)和0.064g由HEPC合成的氢化磷脂酰丝氨酸(NEPC)称重，并向称重的磷脂中加入60ml氯仿，甲醇和水的混合物(体积比为100∶20∶0.1)。

将混合物在水溶上(65℃)加热来溶解磷脂，并将得到的溶液在60℃旋转汽化器中加热，蒸发掉溶剂。将残渣进一步在真空中干燥2小时形成脂质膜。将含碘克沙醇(1，3-二(乙酰基氨基-N，N′-二〔3，5-二(2，3-二羟丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基〕-2-羟基丙烷)(0.4g/ml)和蔗糖(0.05g/ml)的水溶液加热至65℃，并将10ml该加热溶液与脂质膜混合，用混合器将混合物搅拌10分种，同时加热至65℃，将该混合物在加热下，通过孔径为1.0μm的聚碳酸酯滤器过滤来制备多层囊(MLV)。

将如此制得的MLV放入小玻璃瓶中并在121℃下高压灭菌20分钟。结果见表4。

注意，除通过在246nm吸收率测定碘克沙醇的浓度外，按照实验(3)的方法测定包封量。

表4

粒度(nm±S.D.)    高压灭菌前    高压灭菌后

包封量            260±116      251±120

(ml/g脂质)        6.4           6.5

碘/脂质重量比     1.3           1.3

包封率(％)        45.1          45.8实施例2，包封碘克沙醇

按照实施例1中所述的方法，制备含碘克沙醇的脂质体制剂，结果见表5。

表5

在制剂中的浓度(mg/ml)               粒度         包封量    碘/脂质重量比HEPC    HEPS 碘克沙醇     AC前      AC后    AC前 AC后  AC前   AC后60.4    6.4    400      260±116  251±120  6.4  6.5   1.3    1.360.4    6.4    200      273±125  275±118  7.8  8.0   0.8    0.8注：AC＝高压灭菌实施例3，包封G毒毛旋花甙

将5.0g HEPC和0.5g HEPES称重并加到烧瓶中，其中加入氯仿，甲醇和水的混合物(体积比100∶20∶0.1)通过在水溶(65℃)中加热，将组分溶解。在60℃旋转汽化器上蒸掉溶剂，残渣进一步在真空中干燥12小时，形成脂质膜。另一方面，将5.0gHEPES和0.5g二硬脂酰磷脂酸(DSPA)称重，如上所述制备脂质膜。将烧瓶中的部分膜称重并用于制备脂质体。即，将含G毒毛旋花甙(5mg/ml)和蔗糖(0.09g/ml)的水溶液加热到65℃，并将50mlG毒毛旋花甙的水溶液加至预先加到玻璃烧杯中的脂质膜(1g)中，用高速均化器(Tokushu Kika Kogyo，Osaka，Japan)将混合物搅拌1分钟，同时在65℃下加热。将混合物在加压下，通过孔径为1.0μm的，由聚碳酸酯树脂制成的膜滤器过滤两次来制备多层囊(MLV)。

按照实验(2)和(3)段中所述的方法，测定粒度和包封率，此外，在测定包封率中，通过测定由1ml凝胶过滤后的馏分和4ml甲醇稀释制得的液体的吸收率(221nm)来测定G毒毛旋花甙的量。结果见表6。

表6

脂质组分           HEPC/HEPS(10∶1)  HEPC/DSPA(10∶1)

粒度(nm±S.D.)     205±101          208±98

包封率             34.2              45.1

包封量(l/g脂质)    13.7              18.0实施例4，包封水杨酸钠

按照实施例3中所述的方法，用实施例3中制备的部分脂质膜来制备脂质体。即，将含水杨酸钠(10mg/ml)和蔗糖(0.05g/ml)的水溶液加热至65℃，并将50ml水杨酸钠水溶液加至预先加到玻璃烧杯中的脂质膜中，如实施2所述制备MLV。

按照实验(2)段中所述的方法测定粒度。通过超声地滤法测定包封率。具体地，将0.5ml脂质体放入50ml校准烧瓶中并用5％葡萄糖水溶液加满至50ml。将2.5ml稀溶液(A溶液)加到安装有浮标的超声过滤装置(Centrisart^，Cut-off 20000，SARTORIUS)的外层管中，并在室温和3500rpm转速下离心10分种。从浮标中得到滤液，向1ml滤液中加入2ml甲醇，在297nm处测定吸收率(ABS(B))。另一方面，将2ml甲醇加到1mlA溶液中，并在299nm处测定吸收率(ABS(A))。

按照下列等式计算包封率：

包封率＝(ABS(A)-ABS(B))/ABS(A)×100％

表7

脂质组分          HEPC/HEPS(10∶1) HEPC/DSPA(10∶1)

粒度(nm±S.D.)    250±75          253±78

包封率            40.3             41.9

包封量(l/g脂质)   16.1             16.7实施例5、包封Levofloxacin

按照实施例2中所描述的方法，用实施例2中制备的部分脂质膜来制备脂质体。即，将Levofloxacin(0.1mg/ml)和蔗糖(0.09g/ml)的水溶液加热至65℃，并将50ml Levofloxacin的水溶液加至预先称重并加到玻璃烧杯中的脂质膜(1g)中，按照实施例2中所描述的方法，得到脂质体。

按照实验(2)和(3)段中所描述的方法，测定粒度和包封率，此外，在测定包封率中，通过测定含有由4ml甲醇和1ml凝胶滤过后的馏分制得的脂质体组分脂质的液体的荧光(激发波长356nm；荧光波长455nm)，测定Levofloxacin的量。结果见表8。

表8

脂质组分          HEPC/HEPS(10∶1) HEPC/DSPA(10∶1)

粒度(nm±S.D.)    326±234         367±175

包封率(％)        27.6             24.6

包封量(l/g脂质)   11.0             9.8实施例6

将10.0gHEPC和1.0gHEPS称重并加至烧瓶中，其中加入500ml氯仿，甲醇和水的混合物(体积比为100∶25∶0.1)，在水浴上(65℃)加热，将溶解组分。在旋转汽化器中，通过将混合物在60℃下加热，将溶剂蒸发掉。将残渣进一步在真空中干燥12小时，制备脂质膜。将烧瓶中的部分膜称重，并用它来制备脂质体。即，将100ml含碘克沙醇(407mg/ml)和D-山梨糖醇(8mg/ml)的水溶液预先加热至65℃，将该溶液加至含脂质膜(5.63g)的玻璃烧杯中，用高速均化器(Tokushu Kika Kogyo，Osalca，Japan)将混合物搅拌大约5分钟，同时在65℃下加热。将混合物通过孔径为0.4μm，由聚碳酸酯制得的膜滤器过滤一次来制备多层囊，并向其中加入Tris-HCl缓冲中剂(得到的Tris-HCl的浓度为：8mM；pH：7.8)然后，将其放入玻璃小瓶中并在121℃下高压灭菌20分钟。

高压灭菌后，按照实验(2)和(3)段中所描述的方法，测定产品的粒度和包封率。结果见表9。

表9粒度(nm±S.D.)     315±157包封率(％)         38.4包封量(L/g脂质)    6.82碘/脂质的重量比    1.36

Claims (22)

1.脂质体及其包含多层脂质体的悬浮液，其特征是，脂质体的膜是由含有基本饱和脂肪酸基的中性磷脂和含有基本饱和脂肪酸基的带电磷脂构成的，所述中性磷脂和所述带电磷脂的重量比为200∶1-3∶1，脂质体的平均粒度为50nm-3,000nm，脂质体的包封量(内水相(体积)/脂质(重量))至少为5ml/g。

2.权利要求1中的脂质体及其悬浮液，其中，中性磷脂和带电磷脂的脂肪酸基数至少为14。

3.权利要求2中的脂质体及其悬浮液，其中，中性脂质为磷脂酰胆碱。

4.权利要求3中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酰胆碱为二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱。

5.权利要求2中的脂质体及其悬浮液，其中，带电磷脂为磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸或磷脂酸和氨基醇的酯。

6.权利要求5中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酰丝氨酸为二棕榈酰磷脂酰丝氨酸或二硬脂酰磷脂酰丝氨酸。

7.权利要求5中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酰甘油为二棕榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰甘油。

8.权利要求5中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酰肌醇为二棕榈酰磷脂酰肌醇或二硬脂酰磷脂酰肌醇。

9.权利要求5中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酸为二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸。

10.权利要求5中的脂质体及其悬浮液，其中，磷脂酸与氨基醇的酯为二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸与羟基乙二胺的酯。

11.权利要求1-10中任一脂质体及其悬浮液，其中，中性磷脂与带电磷脂的重量比为60∶1-4∶1。

12.权利要求1-11中任一脂质体及其悬浮液，其中，脂质体的平均粒度为150nm-1000nm。

13.权利要求1-11中任一脂质体及其悬浮液，其中，包封量至少为6ml/g。

14.权利要求1-11中任一脂质体及其悬浮液，其中，包封量至少为8ml/g。

15.权利要求1-11中任一脂质体及其悬浮液，其中，包封量至少为10ml/g。

16.权利要求1-15中任一脂质体及其悬浮液，其中，总脂质浓度为20mg/ml-100mg/ml。

17.权利要求1-15中任一脂质体及其悬浮液，其中，总脂质浓度为40mg/ml-90mg/ml。

18.权利要求1-15中任一脂质体及其悬浮液，其中，总脂质浓度为50mg/ml-80mg/ml。

19.权利要求1-18中任一脂质体及其悬浮液，其中，将水溶性药物包封在脂质体的内水相中。

20.权利要求1-19中任一脂质体及其悬浮液，其中，将水溶性并且非电解质药物包封在脂质体的内水相中。

21.权利要求1-19中任一脂质体及其悬浮液，其中，将水溶性并且带有与带电磷脂相反电荷的药物包封在脂质体的内水相中。

22.制备脂质体及其悬浮液的方法，其特征是，将含有基本饱和脂肪酸基的中性磷脂和含有基本饱和脂肪酸基的带电磷脂溶解在溶剂中，除去溶剂，得到残渣，并将残渣与可含有药物的水溶液混合，振摇或搅拌。