KR20120059447A - 콜레스테롤 수준 저하 리포좀 - Google Patents

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스테파니 폴로크
레이몬드 드웩
니콜 지츠만
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더 챈슬러 마스터즈 앤드 스칼라스 오브 더 유니버시티 오브 옥스포드
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Abstract

세포 진입이 가능한 지질 입자를 사용하여 세포 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 그러한 지질 입자는 세포 콜레스테롤 수준 증가에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방과, 복제에 있어서 세포 콜레스테롤에 의존적인 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

Description

콜레스테롤 수준 저하 리포좀{CHOLESTEROL LEVEL LOWERING LIPOSOMES}
관련 출원
본 출원은 2009년 3월 27일에 출원된 미국 가출원 제61/202,699호를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
일반적으로 본 출원은 그 자신이 치료제로서 유용하거나 약물 전달에 사용될 수 있는 리포좀과 같은 지질 입자, 약물 전달 방법, 구체적으로는 리포좀과 같은 지질 입자를 이용한 약물 전달 방법에 관한 것이다.
개요
세포 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 세포 진입이 가능한 리포좀 또는 미셀과 같은 지질 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
도면
도 1에는 a) 메발로네이트 경로 및 이소프레노이드 합성과, b) 상이한 세포 표적에 대한 상이한 치료제의 영향이 도시되어 있다. PP = 피로포스페이트, FTI = 파네실 트랜스퍼라제 저해제, GGTI = 제라닐제라닐 트랜스퍼라제 저해제, IPP = 이소펜틸 피로포스페이트.
도 2에는 하기의 선택된 지질: A) 22:6 PE; B) 22:6 PC; C) PI; D) PS; E) DOPE; F) CHEMS가 개략적으로 도시되어 있다.
도 3에는 항-액틴 항체 및 항-HMGCS 둘 모두를 이용한 22:6 ER 리포좀-처리, JC-1-감염 Huh7.5 세포 (MOI=0.5)의 웨스턴 (Western) 블롯 분석의 결과가 제시되어 있다.
도 4에는 22:6 PE:22:6 PC:PI:PS-처리, JC1-감염 Huh7.5 세포 (MOI=0.5)로부터의 유리 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤 둘 모두에 대한 정량화 결과가 제시되어 있다.
도 5에는 22:6 리포좀으로 처리된 PHA-자극 PBMC에 대한 정량화 결과가 제시되어 있다.
도 6A 내지 도 6E에는 JC-1-감염 Huh7.5 세포 (MOI=0.02)를 22:6 ER 리포좀으로 16일 동안 처리한 것에 관한 데이터가 제시되어 있다. (A) 처리 전체에 걸친 Huh7.5 세포에서의 JC-1 HCVcc 감염 수준. (B) JC-1 HCVcc 분비. (C) 분비된 JC-1 HCVcc 입자의 감염성. (D) 세포에서의 유리 콜레스테롤 수준. (E) 세포에서의 에스테르화 콜레스테롤. 데이터는 독립적인 두 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균을 나타낸다.
도 7은 22:6 ER 리포좀-처리, 페길화 (PEGyated) 22:6 ER 리포좀-처리 및 외인성 콜레스테롤 (15 ㎍/ml 및 150 ㎍/ml의 콜레스테롤의 최종 농도)로 처리된 미처리 JC-1 HCVcc에 대한 감염성 데이터가 제시되어 있다.
도 8에는 JC-1 HCVcc (MOI=0.5)에 의한 감염 이전에 22:6 ER 리포좀으로 4일 동안 처리한 미감염 Huh7.5 세포의 정량화 결과가 제시되어 있다.
도 9A에는 22:6 ER 리포좀을 이용한 4일간의 처리 동안 HIV-1의 유전적으로 다양한 3가지 일차 단리체 (LAI, 93UG067, 및 93RW024)의 평균 분비율이 도시되어 있다. 도 9B에는 22:6 ER 리포좀-처리 PBMC로부터 분비된 HIV-1의 감염성이 도시되어 있다.
도 10에는 무혈청 완전 DMEM에서 24 h 동안 리포단백질 수용체의 발현의 상향조절 및 하향조절을 위하여 사용되는 약물 (각각 SQ 및 25-HC)의 존재 하에 인큐베이션된 미감염 Huh7.5 세포에 대한 실험 결과가 도시되어 있다.
도 11에는 Huh7.5 세포의 1시간 감염 동안 HCVcc 바이러스 원액에 22:6 puER 리포좀을 첨가한 것에 대한 실험 결과가 도시되어 있다.
용어의 정의
달리 특정되지 않으면, 단수형은 "하나 이상"을 의미한다.
본원에 사용될 때, "바이러스 감염"이라는 용어는 바이러스가 건강한 세포에 침입하고, 그 세포의 번식 기구를 이용하여 배가되거나 복제되며 궁극적으로 그 세포를 용해시켜 세포를 사멸시키고 바이러스를 방출하며 새롭게 생성된 자손 바이러스에 의해 다른 세포가 감염되는 질환 상태를 기술한다. 특정 바이러스에 의한 잠재적 감염은 또한 바이러스 감염의 가능한 결과이다.
본원에 사용될 때, "바이러스 감염을 치료 또는 예방하는"이라는 용어는 특정 바이러스의 복제를 저해하거나, 바이러스 전파를 저해하거나, 바이러스가 그 자신을 그의 숙주에서 확립하지 못하도록 하고, 바이러스 감염에 의해 야기되는 질환의 증상을 개선하거나 경감시킴을 의미한다. 치료는 바이러스 로드의 감소, 사망률 및/또는 이환율의 감소가 있을 경우, 치료적 치료로 간주된다.
"치료제"라는 용어는 생리학적 상태, 예컨대 바이러스 감염 또는 그에 의해 야기되는 질환의 치료를 보조할 수 있는 분자 또는 화합물과 같은 에이전트 (agent)를 나타낸다.
"리포좀"이라는 용어는 일반적으로 구형 이중층이 형성된 것인 이중층 형성에 있어서의 지질 포함 입자로 정의될 수 있다. "리포좀"이라는 용어는 단일라멜라형 리포좀 및 다중라멜라형 리포좀 둘 모두를 포함한다. 본원에서 논의된 리포좀은 하기 약어로 표시되는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다:
CHEMS는 콜레스테릴 헤미숙시네이트 지질을 나타낸다.
DOPE는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 지질을 나타낸다.
DOPC는 디올레오일포스파티딜콜린 지질을 나타낸다.
PE는 포스파티딜에탄올아민 지질 또는 그의 유도체를 나타낸다.
PEG-PE는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 콘쥬게이션된 PE 지질을 나타낸다. PEG-PE의 일례로는 폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일포스파티딜에탄올아민 지질이 있을 수 있다. PEG의 PEG 성분의 분자량은 다양할 수 있다.
Rh-PE는 리사민 로다민 B-포스파티딜에탄올아민 지질을 나타낸다.
MCC-PE는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p- 말레이미도메틸)시클로헥산-카르복사미드] 지질을 나타낸다.
PI는 포스파티딜이노시톨 지질을 나타낸다.
PS는 포스파티딜세린 지질을 나타낸다.
"세포내 전달"이라는 용어는 캡슐화 물질을 리포좀으로부터 임의의 세포내 구획 내로 전달하는 것을 나타낼 수 있다.
IC50 또는 IC90 (50 또는 90의 저해 농도)은 각각 바이러스 감염의 50% 또는 90% 감소를 성취하는 데 사용되는 치료제의 농도를 나타낼 수 있다.
PBMC는 말초 혈액 단핵 세포를 나타낸다.
sCD4는 가용성 CD4 분자를 나타낸다. "가용성 CD4" 또는 "sCD4" 또는 "D1D2"는 수성 용액 형태로 존재하고 HIV Env의 형태를 변경시킴으로써 천연 막-고정 CD4의 활성을 모방할 수 있는 CD4 분자 또는 그의 단편을 의미하며, 이는 당업계의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같다. 가용성 CD4의 일례로는 예를 들어 문헌[Salzwedel et al. J. Virol. 74:326 333, 2000]에 기술된 2개 도메인의 가용성 CD4 (sCD4 또는 D1D2)가 있다.
MAb는 단클론 항체를 나타낸다.
DNJ는 데옥시노지리마이신을 나타낸다.
NB-DNJ는 N-부틸 데옥시노지리마이신을 나타낸다.
NN-DNJ는 N-노닐 데옥시노지리마이신을 나타낸다.
BVDV는 소 바이러스성 설사 바이러스를 나타낸다.
HBV는 B형 간염 바이러스를 나타낸다.
HCV는 C형 간염 바이러스를 나타낸다.
HIV는 인간 면역결핍 바이러스를 나타낸다.
Ncp는 세포-비변성 (non-cytopathic)을 나타낸다.
Cp는 세포 변성을 나타낸다.
ER은 소포체를 나타낸다.
CHO는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell)를 나타낸다.
MDBK는 매딘-다비 (Madin-Darby) 소 신장 세포를 나타낸다.
PCR은 폴리머라아제 연쇄 반응을 나타낸다.
FOS는 유리 올리고당류를 나타낸다.
HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피를 나타낸다.
PHA는 피토헤마글루티닌을 나타낸다.
FBS는 소 태아 혈청을 나타낸다.
TCID50은 50% 조직 배양물 감염 용량을 나타낸다.
ELISA는 효소 결합 면역흡착 분석법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)을 나타낸다.
IgG는 면역글로불린을 나타낸다.
DAPI는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌을 나타낸다.
PBS는 인산염 완충 염수를 나타낸다.
LD는 지질 소적을 나타낸다.
NS는 비-구조적임을 나타낸다.
"MOI"는 감염 다중도를 나타낸다.
DMEM은 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 나타낸다.
관련 문서
본 발명의 개시 내용에는 미국 특허 공개 제20080138351호; 미국 특허 공개 제20090252785호; 및 미국 특허 공개 제20030124160호의 전문이 참고로 포함된다.
대식세포 및 콜레스테롤 대사:
간세포를 제외한 다른 세포와 같이 대식세포는 콜레스테롤을 임의의 인지가능한 정도로 분해할 수 없다. 따라서 세포 콜레스테롤 함량은 본질적으로 콜레스테롤 유입과 콜레스테롤 유출 사이의 균형일 수 있다. 세포에 콜레스테롤을 전달하는 2가지 주요 기작은 세포내 콜레스테롤 생합성과 혈장 저밀도 리포단백질 (low-density lipoprotein, LDL)의 수용체-매개된 흡수일 수 있다. 콜레스테롤 전달의 이들 2가지 주요 경로 각각은 콜레스테롤 결핍의 경우 세포의 필요성을 충분히 충족시킬 수 있으며, 이들 둘 모두는 고도로 조절될 수 있다 (문헌[Brown and Goldstein 1999], 완전한 인용을 위해서는 하기 "참고문헌" 섹션을 참조). 그러나, 일부 병리생리학적 상태, 예컨대 염증에서, 높은 혈장중 LDL 농도 및 산화 스트레스는 변형된, 대부분 산화된 LDL을 형성할 수 있다 (문헌[Steinberg, Parthasarathy et al. 1989]). 변형된 LDL은 대식세포를 포함하는 몇몇 세포 유형에서 발현되는 스캐빈저 수용체 (scavenger receptor, SR)와 상호작용할 수 있다. 변형된 리포단백질의 흡수는 세포 콜레스테롤 함량에 반응하여 조절되는 것이 아니며, 과도한 콜레스테롤을 대식세포로 제어불가능하게 전달할 수 있다 (문헌[Hajjar and Haberland 1997]; [Dhaliwal and Steinbrecher 2000]). 콜레스테롤 유출 증가에 의해 상쇄되지 않으면, 이것은 콜레스테롤이 축적되게 하고 지질 축적 거품 세포 (lipid-laden foam cell)가 형성되게 하며, 이어서 동맥벽에서 지방 선조가 발달되게 할 수 있는데, 이는 아테롬성 동맥 경화 플라크의 진행에 있어서의 가장 초기의 단계들 중 하나이다. 콜레스테롤-축적 대식세포는 아테롬성동맥경화증의 병인의 기타 요소, 예컨대 염증의 영속화, 평활근 세포의 표현형 변경, 및 세포외 기질 단백질의 과다 생성을 트리거링할 가능성이 또한 있을 수 있다 (문헌[Lusis 2000]). 과도한 콜레스테롤은 콜레스테롤의 생합성 및 LDL 수용체 발현의 하향조절에 의해 상쇄될 수 있다. 그러나, LDL 흡수 및 콜레스테롤 합성의 감소에 의해 변경 LDL에 의해 전달되는 심하게 과도한 콜레스테롤을 상쇄하는 세포의 능력은 한정될 수 있다. 과도한 유리 콜레스테롤을 상쇄하는 2가지 다른 기작은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 콜레스테롤 유출일 수 있다. 콜레스테릴 에스테르 합성이 일시적 완화를 제공할 수 있지만, 콜레스테릴 에스테르의 계속적인 생성은 세포내 지질 소적이 과도하게 축적되게 할 수 있다. 대식세포에 콜레스테롤이 과다로딩되는 것에 의해 대식세포의 아폽토시스 (apoptosis) 및 괴사가 일어날 수 있고, 이는 후기 아테롬성 동맥 경화 플라크의 괴사성의 그리고 석회화된 코어에 기여한다 (문헌[Tabas 2002]; [Tabas 2002]).
세포에서의 콜레스테롤 생합성에 있어서의 메발로네이트 경로:
메발로네이트-이소프레노이드 경로에서의 제1 단계는 HMG-CoA 신타제 (HMGCS)의 작용에 의해 아세토아세틸-CoA를 통하여 아세틸-CoA로부터 3-히드록시-3-메틸글루타릴 (HMG)-CoA를 합성하는 것을 포함할 수 있다. 자연에서 가장 고도로 조절되는 효소들 중 하나인 HMG-CoA 리덕타제 (HMGCR)는 HMG-CoA의 메발론산으로의 전환을 촉매할 수 있다 (문헌[Goldstein and Brown 1990]). 스타틴 및 비포스포네이트에 의한 메발로네이트 경로 및 하류의 이소프레노이드 생합성 경로의 합리적인 치료적 조작이 집중적으로 연구되었으며, 이는 다양한 질환에서 흥미로운 그리고 혁명적인 옵션임이 밝혀졌다 (문헌[Buhaescu and Izzedine 2007]). 도 1에는 메발로네이트 경로 및 이소프레노이드 생합성이 제시되어 있다. 특정한 주요 치료제의, 그의 상이한 세포 표적에 대한 영향이 또한 표시되어 있다.
콜레스테롤 및 바이러스 복제:
다수의 바이러스가 그의 복제에 있어서 콜레스테롤에 의존할 수 있다. 그러한 바이러스는 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 HSV 1 또는 HSV 2 바이러스일 수 있는 단순 포진 바이러스 (예를 들어, 문헌[Itzhaki and Wozniak 2006] 참조), 및 엡스타인 바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Katzman and Longnecker 2003] 참조); 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스일 수 있는 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, 문헌[Sun and Whittaker 2003] 참조); 레트로바이러스, 예컨대 쥐 백혈병 바이러스 (예를 들어, 문헌[Beer, Pedersen et al. 2005] 참조) 및 HIV 1 또는 HIV 2인 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV) (예를 들어, 문헌[Manes, del Real et al. 2000]; [Campbell, Crowe et al. 2001] 참조); 폭스바이러스과 (Poxviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 백시니아 (vaccinia) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Chung, Huang et al. 2005] 참조); 폴리오마 바이러스 (예를 들어, 문헌[Kaur, Gopalakrishna et al. 2004] 참조); 토가바이러스과 (Togaviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 세미리키 포레스트 (Semiliki Forest) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Chatterjee, Eng et al. 2002] 참조); 필로바이러스과 (Filoviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 에볼라 (Ebola) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Empig and Goldsmith 2002] 참조) 및 마버그 (Marburg) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Bavari, Bosio et al. 2002]) 참조; 플라비바이러스 (Flavivirus) 속에 속하는 바이러스, 예컨대 뎅기 (dengue) 바이러스 (예를 들어, 문헌[Reyes-del Valle, Chavez-Salinas et al. 2005] 참조) 및 헤파시바이러스 (Hepacivirus) 속에 속하는 바이러스, 예컨대 C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV) (예를 들어, 문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008])를 포함하는, 플라비바이러스과 (Flaviviridae family)에 속하는 바이러스; 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 홍역 바이러스 (예를 들어, 문헌[Manie, Debreyne et al. 2000] 참조), 및 헤파드나바이러스과 (Hepadnaviridae family)에 속하는 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV) (예를 들어, 문헌[Bremer, Bung et al. 2009] 참조)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 바이러스 전부가 대식세포에 영향을 줄 수 있는 것은 아니며, 이는 콜레스테롤 요건이 특정 세포 유형의 감염에 한정되지 않음을 나타낸다. 콜레스테롤이 엔벨로프된 (enveloped) 바이러스의 막의 중요한 성분일 수 있음이 널리 인식되지만, 놀랍게도 콜레스테롤이 바이러스 복제에 왜 그리고 어떻게 연루되는지에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 바이러스 복제에서의 콜레스테롤의 역할에 관한 대부분의 지식은 원형질 막의 스핑고지질-풍부 및 콜레스테롤-풍부 마이크로도메인, 지질 래프트 (raft)의 기능에 한정될 수 있다. 몇몇 엔벨로프된 바이러스, 예를 들어 HIV (문헌[Campbell, Crowe et al. 2001]), 에볼라 및 마버그 바이러스 (문헌[Bavari, Bosio et al. 2002]), 홍역 바이러스 (문헌[Vincent, Gerlier et al. 2000]), 및 인플루엔자 바이러스 (문헌[Scheiffele, Rietveld et al. 1999; Leser and Lamb 2005])는 바이러스 조립을 위한 플랫폼 (platform)으로서 래프트-유사 도메인을 이용할 수 있다. 지질 래프트는 인플루엔자 바이러스에 대하여 제안된 바와 같이, 바이러스 감염 동안의 진입점으로서 또한 이용될 수 있으며, 이는 지질 래프트에서 헤마글루티닌이 농축된다는 발견에 기초한다 (문헌[Takeda, Leser et al. 2003]).
HIV에 대한 콜레스테롤 고갈의 영향:
HIV 복제에 대한 콜레스테롤 고갈의 영향은 또한 간접적일 수 있으며, 이는 세포 콜레스테롤 함량 및/또는 콜레스테롤 생합성 속도의 변화에 응답하는 세포 대사의 다수의 변화에서 생긴다. 예를 들어, 스타틴에 의한 콜레스테롤 생합성의 저해는 단백질 프레닐화에 연루된 것들을 포함하는, HMG-CoA 리덕타아제의 상류의 모든 중간체의 정상상태 농도 (steady concentration)을 감소시킬 수 있다 (문헌[Buhaescu and Izzedine 2007]). 소형 G-단백질의 프레닐화의 감소는 Rho-A 활성화 및 Rho-구아노신트리포스파타제 (Rho-guanosinetriphosphatase, GTPase)의 저해에 이르게 될 수 있으며, 이것에 의해 바이러스 진입이 감소된다 (문헌[del Real, Jimenez-Baranda et al. 2004]). 게다가, 스타틴은 콜레스테롤 생합성에 대한 그의 영향에 관계없이 다면적인 유익한 효과를 가질 수 있으며, 이는 HIV 감염을 감소시킬 수 있다. 이들 효과는 내피 및 백혈구 상에서 ICAM-1 및 LFA-1과 같은 수용체-리간드 쌍의 상호작용 (문헌[Nishibori, K. Takahashi et al. 2003]) 또는 유착 분자의 발현 (문헌[Jain and Ridker 2005])을 저해하는 스타틴의 능력에서 생기는 소염 특성을 포함할 수 있다. 스타틴에 의한 ICAM-1과 LFA-1의 상호작용의 저해는 세포에의 HIV의 부착을 감소시킬 수 있다 (문헌[Giguere and Tremblay 2004]).
다수의 연구에서 HIV의 생명 주기에서의 콜레스테롤의 역할이 조사되었다. 숙주 세포로부터의 HIV-1 버딩 (budding)이 지질 래프트에서 일어나며, 이는 바이러스 엔벨로프의 높은 콜레스테롤:인지질 몰비 (>1.0)를 생성한다 (문헌[Aloia, Tian et al. 1993]; [Nguyen and Hildreth 2000]). 래프트에 대한 이러한 친화성은 Gag 전구체에 의해 결정될 수 있는데, 상기 전구체는 이들 막 도메인과 특정적으로 회합될 수 있다 (문헌[Ono and Freed 2001]; [Ding, Derdowski et al. 2003]; [Holm, Weclewicz et al. 2003]). 지질-래프트 결합은 Gag의 N-말단에 의해 매개될 수도 있으며, Gag-Gag 상호작용 도메인에 의해 크게 향상될 수 있다. 세포 콜레스테롤의 고갈 및 래프트 수의 감소는 HIV-1 입자 생성을 현저하게 그리고 특정적으로 감소시킬 수 있다 (문헌[Ono and Freed 2001]).
상기에 기재된 HIV 진입에 대한 콜레스테롤-저하 약물의 간접적인 영향에 더하여, 몇몇 연구에서는 HIV의 진입점으로서의 지질 래프트의 역할이 제안되었다. 이 모델은 HIV 진입 부위에서의 케모카인 수용체, 및 HIV 세포 수용체, CD4의 동시캡핑 (cocapping)의 현상에 의존하며 (문헌[Alfano, Schmidtmayerova et al. 1999]), 이는 또한 콜레스테롤에 의존적일 수도 있다 (문헌[Nguyen, Giri et al. 2005]). 비아드 (Viard) 및 다른 이들에 의한 연구 (문헌[Viard, Parolini et al. 2002])에 의하면, 콜레스테롤-고갈된 세포는 바이러스-세포 융합에 필요한 CXCR4 (또는 CCR5) 및 CD4의 클러스터를 형성할 수 없을 수도 있음이 입증되었다. 유사한 관찰이 마네스 (Manes) 등에 의해 보고되었으며 (문헌[Manes, del Real et al. 2000]), 이들은 래프트의 gp120-유도된 측면 재편성이 CD4-gp120 복합체를 래프트-회합된 케모카인 수용체와 접촉시키는 역할을 제안하였다. 그러나, 이후의 보고서에 의하면 CD4 및 케모카인 수용체와 래프트의 회합이 HIV 감염에 필요하지 않을 수 있음이 입증되었다 (문헌[Percherancier, Lagane et al. 2003]; [Popik and Alce 2004]). 이들 발견의 일반적인 통고는 상기 발견들 중 다수가 HIV 수용체를 과다발현하는 세포를 사용하여 행해졌다는 것일 수 있다. 흔히 그러한 세포는 케모카인 수용체로부터의 시그날링에 대하여 이전에 입증된 바와 같이 일차 세포와 상이하게 거동할 수 있는데, 상기 시그날링은 HIV가 일차 세포 내로 진입하는 데 필수적인 것일 수 있다 (문헌[Alfano, Schmidtmayerova et al. 1999]). 모든 이들 논문의 의견이 일치되는 것은 표적 세포막에서의 콜레스테롤에 대한 HIV 진입의 의존성이며, 그 이유는 콜레스테롤이 래프트-회합된 그리고 래프트-배제된 CD4에 의해 매개되는 HIV 진입을 저해하였기 때문이다 (문헌[Popik and Alce 2004]).
HIV 비리온의 감염성에 있어서의 콜레스테롤의 중요성은 실험에 의해 입증되었으며, 여기서 콜레스테롤 격리 약물, 예컨대 MβCD를 이용한 콜레스테롤-HIV 입자의 처리가 바이러스를 세포 진입에 대하여 부적격성이 되도록 하였다 (문헌[Campbell, Crowe et al. 2002]; [Guyader, Kiyokawa et al. 2002]). 콜레스테롤-고갈 HIV-1 비리온은 비리온 지질 이중층의 파괴를 나타낼 수 있지만 (문헌[Campbell, Crowe et al. 2002]) 정상 수준의 gp120 Env를 디스플레이할 수 있다 (문헌[Guyader, Kiyokawa et al. 2002]). 한 연구는 MβCD가 바이러스막을 투과하여, Env 당단백질의 손실 없이 성숙 Gag 단백질 (캡시드 매트릭스 (capsid matrix) 및 p6)을 손실시킬 수 있음을 입증하였다 (문헌[Graham, Chertova et al. 2003]). 전자 현미경법에 의하면 콜레스테롤-고갈 비리온의 바이러스 막에서의 구멍 및 바이러스 코어 구조의 동요가 나타났다 (문헌[Graham, Chertova et al. 2003]).
HIV 및 아테롬성동맥경화증
HIV 감염은 아테롬성동맥경화증 발명의 위험성 증가 (문헌[Hsue, Lo et al. 2004]; [van Wijk, de Koning et al. 2006]) 및 관상동맥 질환 (coronary artery disease, CAD)의 3배 이상의 위험성 증가 (문헌[Hsue and Waters 2005])와 일관되게 결부될 수 있다. 이러한 결부는 이전에는 배타적으로 항레트로바이러스 요법의 역효과 덕분이었다. 콜레스테롤 대사에서의 다수의 변화, 예컨대 CD36 발현의 유도를 통한 콜레스테롤 흡수 증가 (문헌[Allred, Smart et al. 2006]) 및 LDL의 상승 (문헌[El-Sadr, Mullin et al. 2005])은 항레트로바이러스 요법에 의해 야기될 가능성이 있을 수 있지만 (문헌[Carpentier, Patterson et al. 2005]), 콜레스테롤 대사에 있어서 HIV 감염 그 자체 및 요법의 상대적인 기여가 여전히 결정되어야 할 것으로 남아있을 수 있다. 예비 연구는 HIV 감염 그 자체가 CAD 위험성의 증가에서 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낼 수 있다. HIV는 대식세포를 감염시켜 이들 세포에서의 콜레스테롤 역수송에 손상을 줄 수 있다. 대식세포로부터의 콜레스테롤 유출의 손상은 세포내 콜레스테롤 축적 (문헌[Feng and Tabas 2002])과, 동물 모델 (문헌[Aiello, Brees et al. 2002) 및 인간 (문헌[Oram 2000])에서의 아테롬성동맥경화증의 발병에 이르게 될 수 있다. 이 과정은 이상 지질혈증과 결부될 때 특히 빨라질 수 있다. HIV에 의한 대식세포의 감염은, 항레트로바이러스 요법에 의해 야기되는 이상 지질혈증과 결부될 때, 대식세포에서의 콜레스테롤의 축적 및 아테롬성동맥경화증의 급속한 발병을 야기할 수 있음이 제안될 수 있다.
세포 콜레스테롤 및 HCV:
HCV 감염은 간세포에 주로 제한되는데 (문헌[Chisari 2005]), 상기 간세포는 포유류 콜레스테롤 항상성에서 중대한 역할을 할 수 있다. 콜레스테롤-풍부 원형질막 마이크로도메인 (또는 지질 래프트)에의 국소화가 세포 내로의 HCV 진입에 필요한 두 세포 수용체인 CD81 (문헌[Soldaini, Wack et al. 2003]; [Cherukuri, Shoham et al. 2004]) 및 SR-BI (문헌[Rhainds, Bourgeois et al. 2004]) 둘 모두에 대하여 입증되었다. SR-BI는 카베올라로 칭해지는 콜레스테롤-풍부 원형질막 마이크로도메인과 결부될 수 있다 (문헌[Babitt, Trigatti et al. 1997]; [Graf, Connell et al. 1999]). CD81은 콜레스테롤과 물리적으로 상호작용하는 것으로 입증되었다 (문헌[Charrin, Manie et al. 2003]). 세포 콜레스테롤에 대한 HCV 감염의 의존성은 현재 알려져 있지 않을 수 있지만, 리포좀과의 HCVpp의 융합은 표적 막에서의 콜레스테롤의 존재에 의해 향상될 수 있다 (문헌[Lavillette, Bartosch et al. 2006]). 이들 데이터는 원형질막 콜레스테롤이 HCV 진입에 필요할 수 있음을 강하게 제안할 수 있다. HCV 감염은 CD81과 SR-BI 사이의 협동적 상호작용에 의존적일 수 있으며 세포 콜레스테롤 함량은 아마도 CD81의 세포 표면 발현 및 국소화의 조절에 의해 HCV 진입에 상당한 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다 (문헌[Kapadia, Barth et al. 2007]).
최근의 연구에 의하면 HCV 감염 및 비리온 성숙화에서의 콜레스테롤 및 스핑고지질의 중요한 역할이 밝혀졌다. 구체적으로, 성숙 HCV 입자는 콜레스테롤이 풍부할 수 있다 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]). 비리온-결부된 SM의 가수분해 또는 HCV로부터의 고갈에 의해 감염성이 상실된다 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]). 게다가, 외인성 콜레스테롤의 첨가는 감염성을 복구시킬 수 있다. 게다가, 구조 단백질의 부분들은 세포 내의 지질-래프트-유사 막 구조체에 국소화될 수 있다 (문헌[Aizaki, Lee et al. 2004]).
개시내용
본 발명자는 내부에 캡슐화된 물질의 세포 진입 및/또는 세포내 전달이 가능할 수 있는 지질 입자, 예컨대 리포좀이 콜레스테롤 생합성을 저해할 수 있으며, 이는 이 경로에 연루된 첫 번째 효소들 중 하나인 HMGCS를 하향조절함에 의한 것임을 발견하였다.
일부 실시양태에서, 지질 입자는 적어도 하나의 PE 지질 및/또는 그의 유도체를 함유할 수 있다. 유도체형 PE 지질의 예는 DOPE 및 콘쥬게이션된 PE 지질을 포함한다. 콘쥬게이션된 PE 지질은 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 콘쥬게이션된 PE 지질 및 표지체, 예컨대 형광 표지체와 콘쥬세이션된 PE 지질을 포함할 수 있다. PE 지질은 단일포화 또는 다중포화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 입자는 하나 이상의 PI, PS, PC 및 CHEMS 지질을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 단일포화 또는 다중포화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 입자는 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 콘쥬게이션된 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 친수성 중합체의 분자량은 다양할 수 있다. 콘쥬게이션된 친수성 중합체의 사용은 지질 입자의 생체내 안정성 및 순환 시간을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜레스테롤 저해가 가능한 지질 입자는 PE 지질 및/또는 그의 유도체 및 CHEMS 지질을 포함하는 지질 입자, 예컨대 미국 특허 출원 공개 제20080138351호에 개시된 pH-민감성 리포좀일 수 있다. 예를 들어, 그러한 지질 입자는 몰비가 6:4 또는 6:3인 DOPE-CHEMS 리포좀 또는 몰비가 6:3:0.1인 DOPE:CHEMS:PEG-PE일 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜레스테롤 저해가 가능한 지질 입자는 PE 지질 및/또는 그의 유도체, 및 PI 및/또는 PS 지질을 포함하는 지질 입자일 수 있다. 그러한 지질 입자의 예는 2009년 3월 25일에 출원된 미국 특허 출원 제12/410,750호에 개시된 ER-표적화 리포좀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 입자는 각각이 단일포화 또는 다중포화될 수 있는 PE, PI, PS 및 PC 지질을 포함하는 지질 입자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜레스테롤 저해가 가능한 지질 입자는 다중불포화 지질 입자, 즉, 적어도 하나의 다중불포화 지질을 포함하는 지질 입자일 수 있다. 본원에 사용될 때, "다중불포화 지질"이라는 용어는 하나 초과의 불포화 화학 결합, 예컨대 이중 또는 삼중 결합을 그의 소수성 테일 (tail) 내에 포함하는 지질을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다중불포화 지질은 그의 소수성 테일 내에 2 내지 8개 또는 3 내지 7개 또는 4 내지 6개의 이중 결합을 가질 수 있다. 다중불포화 지질 입자는 미국 특허 출원 공개 제20090252785호에 개시되어 있다. 다중불포화 지질의 예가 미국 특허 출원 공개 제20090252785호의 도 22A 내지 도 22D뿐만 아니라 도 2A 내지 도 2B에 제시되어 있다.
표적화 모이어티
일부 실시양태에서, 지질 입자를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 지질 입자와 콘쥬게이션되거나 입자의 지질 층 또는 이중층 내로 인터칼레이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 리간드일 수 있으며, 이는 바이러스의 엔벨로프 단백질, 또는 바이러스의 엔벨로프 단백질에 대한 항체일 수 있는 항체의 리간드일 수 있다. 그러한 모이어티는 바이러스로 감염된 세포에 상기 입자를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 또한 그러한 표적화 모이어티는 바이러스와 결부되거나 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염에 대한 살균 면역성을 성취하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 gp120/gp41 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 그러한 경우, 지질 입자를 포함하는 조성물은 HIV-1 감염의 치료 및/또는 예방에 바람직할 수 있다. gp120/gp41 표적화 모이어티는 sCD4 분자 또는 단클론 항체, 예컨대 IgG 2F5 또는 IgG b12 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 E1 또는 E2 표적화 모이어티, 예컨대 HCV 유래의 E1 또는 E2 단백질을 포함할 수 있다. 그러한 경우, 지질 입자를 포함하는 조성물은 HCV 감염의 치료 및/또는 예방에 바람직할 수 있다. 일부의 경우, 표적화 모이어티는 또한 E1 및/또는 E2 단백질을 표적화할 수 있는 분자, 예컨대 이들 단백질에 대한 특이적 항체, 및 세포 수용체의 가용성 부분, 예컨대 가용성 CD81 또는 SR-BI 분자일 수 있다.
활성제
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 에이전트, 예컨대 치료제 또는 영상화제가 지질 입자 내부에 캡슐화될 수 있다. 그러한 에이전트는 예를 들어 수용성 분자, 펩티드 또는 아미노산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 입자 내부에 캡슐화된 에이전트는 α-글루코시다제 저해제일 수 있다. 일부 실시양태에서, α-글루코시다제 저해제는 ER α-글루코시다제 저해제일 수 있으며, 이는 ER α-글루코시다제 I 저해제 또는 ER α-글루코시다제 II 저해제일 수 있다. 일반적으로, 바이러스 엔벨로프 당단백질의 적당한 폴딩 (folding)에 있어서 칼넥신 및/또는 칼레티쿨린과의 상호작용에 의존하는 임의의 바이러스가 ER α-글루코시다제 저해제의 표적이 될 수 있다.
알파-글루코시다제 저해제는 이 에이전트의 부재 하에서의 알파-글루코시다제의 효소 활성과 비교하여 숙주 알파-글루코시다제 효소 활성을 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상만큼 또는 그보다 많이 저해하는 에이전트일 수 있다. "알파-글루코시다제 저해제"라는 용어는 숙주 알파-글루코시다제 활성을 저해하는 천연 및 합성 에이전트 둘 모두를 포함한다.
적합한 알파-글루코시다제 저해제는 데옥시노지리마이신 및 N-치환 데옥시노지리마이신, 예컨대 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다:
<화학식 I>
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상기 식 중,
R1은 분지쇄 또는 직쇄 알킬기일 수 있는 치환 또는 비치환 알킬기; 치환 또는 비치환 시클로알킬기; 치환 또는 비치환 아릴기, 치환 또는 비치환 옥사알킬기, 치환 또는 비치환 아릴알킬, 시클로알킬알킬로부터 선택되며, W, X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 알카노일기, 아로일기 및 할로알카노일기로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, R1은 C1-C20 알킬기 또는 C3-C12 알킬기로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, R1은 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 이소펜틸, n-헥실, 헵틸, n-옥틸, n-노닐 및 n-데실로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, R1은 부틸 또는 노닐일 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 옥스알킬일 수 있으며, 이는 C1-C20 알킬기 또는 C3-C12 알킬기일 수 있고 이는 또한 1 내지 5개 또는 1 내지 3개 또는 1 내지 2개의 산소 원자를 포함할 수 있다. 옥스알킬기의 예는 -(CH2)2O(CH2)5CH3, -(CH2)2O(CH2)6CH3, -(CH2)6OCH2CH3, 및 -(CH2)2OCH2CH2CH3을 포함한다.
일부 실시양태에서, R1은 아릴알킬기일 수 있다. 아릴알킬기의 예는 C1-C12-Ph 기, 예컨대 C3-Ph, C4-Ph, C5-Ph, C6-Ph 및 C7-Ph를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 N-(n-헥실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-헵틸-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-옥틸-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-옥틸-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-노닐-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-운데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-노닐-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-운데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-도데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(2-에틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(4-에틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(5-메틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(3-프로필헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(1-펜틸펜틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(1-부틸부틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(7-메틸옥틸-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(8-메틸노닐)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(9-메틸데실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(10-메틸운데실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(6-시클로헥실헥실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(4-시클로헥실부틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(2-시클로헥실에틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(1-시클로헥실메틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(1-페닐메틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(3-페닐프로필)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(3-(4-메틸)-페닐프로필)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(6-페닐헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨; N-(n-노닐-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-운데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(n-도데실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(2-에틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(4-에틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(5-메틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(3-프로필헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(1-펜틸펜틸헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(1-부틸부틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(7-메틸옥틸-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(8-메틸노닐)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(9-메틸데실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(10-메틸운데실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(6-시클로헥실헥실-)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(4-시클로헥실부틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(2-시클로헥실에틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(1-시클로헥실메틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(1-페닐메틸)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(3-페닐프로필)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(3-(4-메틸)-페닐프로필)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; N-(6-페닐헥실)-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨, 테트라부티레이트; 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의의 둘 이상의 그의 혼합물로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. N-치환 데옥시노지리마이신류가 효과적일 수 있는 질환 및 상태가 미국 특허 제4,849,430호; 미국 특허 제4,876,268호; 미국 특허 제5,411,970호; 미국 특허 제5,472,969호; 미국 특허 제5,643,888호; 미국 특허 제6,225,325호; 미국 특허 제6,465,487호; 미국 특허 제6,465,488호; 미국 특허 제6,515,028호; 미국 특허 제6,689,759호; 미국 특허 제6,809,083호; 미국 특허 제6,583,158호; 미국 특허 제6589,964호; 미국 특허 제6,599,919호; 미국 특허 제6,916,829호; 미국 특허 제7,141,582호, 2010년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제12/656,993호, 2010년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제12/656,992호; 2010년 2월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/282,507호, 2009년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/272,253호, 2009년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/272,252호, 2009년 6월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/186,614호, 2009년 2월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/282,508호; 2009년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/272,254호에 개시되어 있다. N-치환 데옥시노지리마이신류가 효과적일 수 있는 질환 및 상태는 HIV 감염; C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스 감염을 비롯한 간염 바이러스 감염; 테이-삭스병 (Tay-Sachs disease), 고셔병 (Gaucher disease), 크라베병 (Krabbe disease) 및 파브리병 (Fabry disease)을 비롯한 리소좀 지질 저장 질환; 및 낭포성 섬유증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. N-치환 데옥시노지리마이신류가 효과적일 수 있는 질환 및 상태는 뎅기 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 아레나바이러스과 (Arenaviridae family)에 속하는 것, 예컨대 피킨데 (Pichinde) 바이러스 또는 주닌 (Junin) 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 폭스바이러스과에 속하는 것, 예컨대 백시니아 (Vaccinia) 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 필로바이러스과에 속하는 것, 예컨대 에볼라 바이러스 및 마버그 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 분야바이러스과 (Bunyaviridae family)에 속하는 것, 예컨대 리프트 밸리열 (Rift Valley fever) 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 토가바이러스과 (Togaviridae family)에 속하는 것, 예컨대 치쿤군야 (Chikungunya) 바이러스 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 (Venezuelan equine encephalitis virus)에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염; 오르토믹소바이러스과에 속하는 것, 예컨대 H1N1 및 H3N2 아형을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 바이러스 감염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, α-글루코시다제 저해제는 N-옥사알킬화 데옥시노지리마이신류 또는 N-알킬옥시 데옥시노지리마이신, 예컨대 미국 특허 제4,639,436호에 기술된 N-히드록시에틸 DNJ (미글리톨 (Miglitol) 또는 글리셋 (Glyset)®)일 수 있다.
일부 실시양태에서, α-글루코시다제 저해제는 카스타노스퍼민류 및/또는 카스타노스퍼민 유도체, 예컨대 미국 특허 출원 제2006/0194835호에 개시된 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염 - 6-O-부타노일 카스타노스퍼민 (셀고시비르)을 포함함 - 및 국제 특허 공개 제WO01054692호에 개시된 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다.
카스타노스퍼민 및 그의 유도체가 효과적일 수 있는 질환 및 상태가 미국 특허 제4,792,558호; 미국 특허 제4,837,237호; 미국 특허 제4,925,796호; 미국 특허 제4,952,585호; 미국 특허 제5,004,746호; 미국 특허 제5,214,050호; 미국 특허 제5,264,356호; 미국 특허 제5,385,911호; 미국 특허 제5,643,888호; 미국 특허 제5,691,346호; 미국 특허 제5,750,648호; 미국 특허 제5,837,709호; 미국 특허 제5,908,867호; 미국 특허 제6,136,820호; 미국 특허 제6,583,158호; 미국 특허 제6,589,964호; 미국 특허 제6,656,912호 및 미국 특허 출원 공개 제20020006909호; 미국 특허 출원 공개 제20020188011호; 미국 특허 출원 공개 제20060093577호; 미국 특허 출원 공개 제20060194835호; 미국 특허 출원 공개 제20080131398호에 개시되어 있다. 카스타노스퍼민 및 그의 유도체가 효과적일 수 있는 질환 및 상태는 HIV 감염을 포함하는 레트로바이러스 감염; 뇌 말라리아; B형 간염 바이러스 감염 및 C형 간염 바이러스 감염을 포함하는 간염 바이러스 감염; 당뇨병 및 리소좀 저장 장애를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 알파 글루코시다제 저해제는 아카보스 (O-4,6-디데옥시-4-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-트리히드록시-3-(히드록시메틸)-2-시클로헥센-1-일]아미노]-α-D-글루코피라노실-(1→4)-O-→-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코스), 또는 프레코스 (Precose)®일 수 있다. 아카보스는 미국 특허 제4,904,769호에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 알파 글루코시다제 저해제는 고도로 정제된 형태의 아카보스일 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,904,769호 참조).
일부 실시양태에서, 리포좀 내부에 캡슐화된 에이전트는 이온 채널 저해제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 저해제는 HCV p7 단백질의 활성을 저해하는 에이전트일 수 있다. 이온 채널 저해제 및 그의 동정 방법이 미국 특허 출원 공개 제2004/0110795호에 상술되어 있다. 적합한 이온 채널 저해제는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 이는 N-(7-옥사-노닐)-1,5,6-트리데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-7-옥사-노닐 6-MeDGJ 또는 UT231B) 및 N-10-옥사운데쿨-6-MeDGJ를 포함한다. 적합한 이온 채널 저해제는 또한 N-노닐 데옥시노지리마이신, N-노닐 데옥시노갈락토노지리마이신 및 N-옥사노닐 데옥시노갈락토노지리마이신을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 리포좀 내부에 캡슐화된 에이전트는 이미노당 (iminosugar)일 수 있다. 적합한 이미노당은 천연 이미노당 및 합성 이미노당 둘 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 데옥시노지리마이신 또는 N-치환 데옥시노지리마이신 유도체일 수 있다. 적합한 N-치환 데옥시노지리마이신 유도체의 예는 본 출원의 화학식 II의 화합물, 미국 특허 제6,545,021호의 화학식 I의 화합물 및 N-옥사알킬화 데옥시노지리마이신류, 예컨대 미국 특허 제4,639,436호에 기술된 N-히드록시에틸 DNJ (미글리톨 또는 글리셋®)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 카스타노스퍼민 또는 카스타노스퍼민 유도체일 수 있다. 적합한 카스타노스퍼민 유도체는 미국 특허 출원 제2006/0194835호에 개시된 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염과, 국 특허 공개 제WO01054692호에 개시된 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 데옥시노갈락토지리마이신 또는 그의 N-치환 유도체, 예컨대 국제 특허 공개 제WO99/24401호 및 국제 특허 공개 제WO01/10429호에 개시된 것일 수 있다. 적합한 N-치환 데옥시노갈락토지리마이신 유도체의 예는 N-알킬화 데옥시노갈락토지리마이신류 (N-알킬-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨류), 예컨대 N-노닐 데옥시노갈락토지리마이신, 및 N-옥사-알킬화 데옥시노갈락토지리마이신류 (N-옥사-알킬-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨류), 예컨대 N-7-옥사노닐 데옥시노갈락토지리마이신을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 하기 화학식 II의 화합물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 N-치환 1,5,6-트리데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-치환 MeDGJ)일 수 있다:
<화학식 II>
Figure pct00002
상기 식 중, R은 치환 또는 비치환 알킬기, 치환 또는 비치환 시클로알킬기, 치환 또는 비치환 헤테로시클릴기 또는 치환 또는 비치환 옥사알킬기로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 비치환 알킬기 및/또는 치환 또는 비치환 옥사알킬기는 1 내지 16개의 탄소 원자, 또는 4 내지 12개의 탄소 원자 또는 8 내지 10개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 비치환 알킬기 및/또는 치환 또는 비치환 옥사알킬기는 1 내지 4개의 산소 원자를 포함하며, 다른 실시양태에서는 1 내지 2개의 산소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 비치환 알킬기 및/또는 치환 또는 비치환 옥사알킬기는 1 내지 16개의 탄소 원자 및 1 내지 4개의 산소 원자를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서 R은 -(CH2)6OCH3, -(CH2)6OCH2CH3, -(CH2)6O(CH2)2CH3, -(CH2)6O(CH2)3CH3, -(CH2)2O(CH2)5CH3, -(CH2)2O(CH2)6CH3 및 -(CH2)2O(CH2)7CH3으로부터 선택되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. N-치환 MeDGJ류는 예를 들어 국제 특허 공개 제WO01/10429호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 리포좀 내부에 캡슐화된 에이전트는 하기 화학식 III의 질소-함유 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다:
<화학식 III>
Figure pct00003
상기 식 중, R12는 알킬, 예컨대 C1-C20, 또는 C1-C6 또는 C7-C12 또는 C8-C16이며 또한 1 내지 5개 또는 1 내지 3개 또는 1 내지 2개의 산소를 포함할 수 있고, R12는 옥사-치환 알킬 유도체일 수 있다. 옥사-치환 알킬 유도체의 예는 3-옥사노닐, 3-옥사데실, 7-옥사노닐 및 7-옥사데실을 포함한다.
R2는 수소이고 R3은 카르복시 또는 C1-C4 알콕시카르보닐이거나, R2 및 R3은 함께
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
이며, 여기서, n은 3 또는 4이고, 각각의 X는 독립적으로 수소, 히드록시, 아미노, 카르복시, C1-C4 알킬카르복시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 히드록시알킬, C1-C6 아실옥시 또는 아로일옥시이며, 각각의 Y는 독립적으로 수소, 히드록시, 아미노, 카르복시, C1-C4 알킬카르복시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 히드록시알킬, C1-C6 아실옥시, 아로일옥시이거나 결실되고 (즉, 존재하지 않음);
R4는 수소이거나 결실되며 (즉, 존재하지 않음);
R5는 수소, 히드록시, 아미노, 치환 아미노, 카르복시, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬, 아릴, 아르알킬, 알콕시, 히드록시알킬, 아실옥시 또는 아로일옥시이거나, 또는 R3 및 R5는 함께 페닐을 형성하고 R4는 결실된다 (즉, 존재하지 않음).
일부 실시양태에서, 질소-함유 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00006
상기 식 중, R6-R10 각각은 독립적으로 수소, 히드록시, 아미노, 카르복시, C1-C4 알킬카르복시, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 히드록시알킬, C1-C4 아실옥시 및 아로일옥시로 이루어진 군으로부터 선택되며; R11은 수소 또는 C1-C6 알킬이다.
질소-함유 화합물은 N-알킬화 피페리딘, N-옥사-알킬화 피페리딘, N-알킬화 피롤리딘, N-옥사-알킬화 피롤리딘, N-알킬화 페닐아민, N-옥사-알킬화 페닐아민, N-알킬화 피리딘, N-옥사-알킬화 피리딘, N-알킬화 피롤, N-옥사-알킬화 피롤, N-알킬화 아미노산 또는 N-옥사-알킬화 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, N-알킬화 피페리딘, N-옥사-알킬화 피페리딘, N-알킬화 피롤리딘 또는 N-옥사-알킬화 피롤리딘 화합물은 이미노당일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 질소-함유 화합물은 하기 화학식:
Figure pct00007
을 갖는 N-알킬-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-알킬-DGJ) 또는 N-옥사-알킬-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-옥사-알킬-DGJ), 또는 하기 화학식:
Figure pct00008
을 갖는 N-알킬-1,5,6-트리데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-알킬-MeDGJ) 또는 N-옥사-알킬-1,5,6-트리데옥시-1,5-이미노-D-갈락티톨 (N-옥사-알킬-MeDGJ)일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 탄소 원자수가 달리 특정되지 않으면 기는 하기 특징을 갖는다. 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지며, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환 기이다. 알콕시기는 1 내지 16개의 탄소 원자를 가지며, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환 기이다. 알콕시카르보닐기는 2 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 에스테르기이다. 알케닐옥시기는 2 내지 16개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 이중 결합을 가지며, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환 기이다. 알키닐옥시기는 2 내지 16개의 탄소 원자, 1 내지 3개의 삼중 결합을 가지며, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환 기이다. 아릴기는 6 내지 14개의 탄소 원자를 가지며 (예를 들어, 페닐기) 치환 또는 비치환된다. 아르알킬옥시 (예를 들어, 벤질옥시) 및 아로일옥시 (예를 들어, 벤조일옥시) 기는 7 내지 15개의 탄소 원자를 가지며 치환 또는 비치환된다.
아미노기는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아미노기 (즉, 치환된 아미노기)일 수 있다. 아미노카르보닐기는 1개 내지 32개의 탄소 원자를 갖는 아미도기 (예를 들어, 치환된 아미도기)이다. 치환된 기는 할로겐, 히드록시, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐, C1 -10 아실, 또는 C1 -10 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기를 포함할 수 있다.
N-알킬화 아미노산은 N-알킬화 α-아미노산과 같은, N-알킬화 천연 아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 20개의 일반 α-아미노산 (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Asp, Asn, Lys, Glu, Gln, Arg, His, Phe, Cys, Trp, Tyr, Met, 및 Pro) 중 하나, 및 노르루이신, 에틸글리신, 오르니틴, 메틸부테닐-메틸트레오닌, 및 페닐글리신과 같은 천연 생성물인 기타 아미노산이다. 아미노산 측쇄 (예를 들어, R5)의 예는 H (글리신), 메틸 (알라닌), -CH2C(O)NH2 (아스파라긴), -CH2-SH (시스테인), 및 -CH(OH)CH3 (트레오닌)을 포함한다.
N-알킬화 화합물은 아미노 (또는 이미노) 화합물의 환원적 알킬화에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 아미노 또는 이미노 화합물은 아민을 N-알킬화하기 위해 환원제 (예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드)와 함께 알데히드에 노출될 수 있다. 이와 유사하게, N-옥사-알킬화 화합물은 아미노 (또는 이미노) 화합물의 환원적 알킬화에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노 또는 이미노 화합물은 아민을 N-옥사-알킬화하기 위해 환원제 (예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드)와 함께 옥사-알데히드에 노출될 수 있다.
질소-함유 화합물은 하나 이상의 보호기를 포함할 수 있다. 다양한 보호기가 잘 알려져 있다. 일반적으로, 보호기의 화학종은 그것이 화합물의 다른 위치 상에서의 임의의 후속 반응(들)의 조건에 안정하며 분자의 나머지에 해로운 영향을 주지 않고 적절한 시점에서 제거될 수 있다면 중요하지 않다. 게다가, 보호기는 실질적인 합성 변환이 완료된 후 다른 것으로 치환될 수 있다. 명백하게, 화합물이 개시된 화합물의 하나 이상의 보호기가 상이한 보호기로 치환된 점에서만 본원에서 개시된 화합물과 상이한 경우에는, 그 화합물은 본 발명의 범위 이내이다. 추가의 예와 조건은 문헌[Greene, Protective Groups in Organic Chemistry, (1st Ed., 1981, Greene & Wuts, 2nd Ed., 1991)]에서 찾을 수 있다.
질소-함유 화합물은 예를 들어, 결정화 또는 크로마토그래피법에 의해 정제될 수 있다. 화합물은 입체특이적 아미노 또는 이미노 화합물을 출발 물질로 이용하여 입체특이적으로 제조될 수 있다.
장쇄 N-알킬화 화합물의 제조에서 출발 물질로 사용되는 아미노 및 이미노 화합물은 구매가능하거나 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 (Sigma); 영국 체셔 노르위치 소재의 캠브리지 리서치 바이오케미칼스 (Cambridge Research Biochemicals); 캐나다 온타리오 소재의 토론토 리서치 케미칼스 (Toronto Research Chemicals)) 또는 공지의 합성법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 N-알킬화 이미노당 화합물 또는 그의 옥사-치환된 유도체일 수 있다. 이미노 당은 예를 들어, 데옥시갈락토노지르마이신(DGJ), 1-메틸-데옥시갈락토노지리마이신 (MeDGJ), 데옥시노르지리마이신 (DNJ), 알트로스타틴, 2R,5R-디히드록시메틸-3R,4R-디히드록시피롤리딘 (DMDP), 또는 그의 유도체, 거울상 이성질체, 또는 입체 이성질체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 입자 내부에 캡슐화되는 에이전트는 하기 화학식 IV 또는 V의 화합물일 수 있다:
<화학식 IV>
Figure pct00009
<화학식 V>
Figure pct00010
상기 식 중, R은
Figure pct00011
이며,
R'은
Figure pct00012
이고,
R1은 치환 또는 비치환 알킬기이며; R2는 치환 또는 비치환 알킬기이고, W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환 알킬기, 치환 또는 비치환 할로알킬기, 치환 또는 비치환 알카노일기, 치환 또는 비치환 아로일기, 또는 치환 또는 비치환 할로알카노일기로부터 독립적으로 선택되며; X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고; Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐 이외의 치환 또는 비치환 C1-알킬기이며; Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며; 단 Z가 결합이면, Y는 존재하지 않고, Z가 NH이면, Y는 카르보닐 이외의 치환 또는 비치환 C1-알킬기이며; Z'은 결합 또는 NH이다. 화학식 IV 및 V의 화합물 및 그들의 합성 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0275998호에 개시된다. 화학식 IV 및 V의 화합물의 비제한적인 예는 N-(N'-{4'아지도-2'-니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신 (NAP-DNJ) 및 N-(N'-{2,4-디니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신 (NDP-DNJ)를 포함한다. 다양한 이미노당 화합물의 합성은 개시되어 왔다. 예를 들어, DNJ 유도체를 합성하는 방법은 알려져 있으며 예를 들어, 미국 특허 제5,622,972호, 미국 특허 제5,401,645호, 미국 특허 제5,200,523호, 미국 특허 제5,043,273호, 미국 특허 제4,994,572호, 미국 특허 제4,246,345호, 미국 특허 제4,266,025호, 미국 특허 제4,405,714호, 및 미국 특허 제4,806,650호에 개시되어 있다. 다른 이미노당 유도체의 합성 방법이 알려져 있으며 예를 들어, 미국 특허 제4,861,892호, 미국 특허 제4,894,388호, 미국 특허 제4,910,310호, 미국 특허 제4,996,329호, 미국 특허 제5,011,929호, 미국 특허 제5,013,842호, 미국 특허 제5,017,704호, 미국 특허 제5,580,884호, 미국 특허 제5,286,877호, 및 미국 특허 제5,100,797호 및 국제 특허 공개 제WO01/10429호에 개시되어 있다. 2R, 5R-디히드록시메틸-3R,4R-디히드록시피롤리딘 (DMDP)의 거울상특이적 합성은 문헌[Fleet and Smith, Tetrahedron Lett. 26:1469-1472, 1985]에 의해 개시되어 있다.
영상화제는 칼세인과 같은, 태그되거나 형광인 수성 물질, 또는 siRNA, 항체, 또는 기타 소분자 저해제와 같은 형광 표지된 분자일 수 있다. 태그된 친유성 물질, 예컨대 세포에서 리포좀을 가시화하기 위해 사용되는 rh-PE 지질 및 가시화 또는 정제를 위한 태그를 갖는 기타 유사한 지질이 또한 세포막 내로의 혼입을 위하여 지질 입자 내로 혼입될 수 있다. 이것은 또한 태그된 친유성 단백질 또는 형광 모이어티를 갖는 약물 또는 가시화 또는 정제를 위한 기타 태그를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 캡슐화된 활성제는 레트로바이러스 에이전트일 수 있으며, 이것은 예를 들어, 뉴클레오시드 역전사효소(Reverse Transcriptase) (RT) 저해제, 예를 들어, (-)-2'-데옥시-3'-티오시티딘-5'-트리포스페이트 (3TC); (-)-시스-5-플루오로-1-[2-(히드록시-메틸)-[1,3-옥사티올란-5-일]시토신 (FTC); 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 (AZT) 및 디데옥시-이노신 (ddI); 비(non)-뉴클레오시드 RT 저해제, 예를 들어, N11-시클로프로필-4-메틸-5,11-디히드로-6H-디피리도[3,2-b:2'3'-e]-[1,4]디아제핀-6-온 (네비파린 (Neviparine)), 프로테아제 저해제 또는 그의 조합일 수 있다.
인터칼레이팅된 모이어티
일부 실시양태에서, 지질 입자는 그 지질 층 또는 이중층 내로 인터칼레이팅된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 인터칼레이팅된 모이어티의 예는 막관통 단백질, 단백질 지질 콘쥬게이트, 표지된 지질, 친유성 화합물 또는 임의의 그의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 인터칼레이팅된 모이어티는 지질-PEG 콘쥬게이트를 포함할 수 있다. 그러한 콘쥬게이트는 지질 입자의 생체내 안정성을 증가시키고/시키거나 그것의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 인터칼레이팅된 모이어티는 긴 알킬쇄 이미노당, 예를 들어, C7-C16 알킬 또는 옥사알킬 치환된 N-데옥시노지리마이신 (DNJ) 또는 C7-C16 알킬 또는 옥사알킬 치환된 데옥시갈락토노지리마이신 (DGJ)을 포함할 수 있다. 긴 알킬쇄 이미노당의 비제한적인 예는 N-노닐 DNJ 및 N-노닐 DGJ를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인터칼레이팅된 모이어티는 형광단-지질 콘쥬게이트를 포함할 수 있으며, 이것은 지질 이중층 입자와 접촉되는 세포의 ER 막을 표지하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 표지는 진핵 세포에서 살아있는 세포 및/또는 고정된 세포의 영상화에 유용할 수 있다. 지질 입자의 사용은 인터칼레이팅된 모이어티를 세포의 ER 막 내로 전달시킬 수 있다.
응용
콜레스테롤을 저해할 수 있는 지질 입자는 콜레스테롤 수준 증가에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태를 치료하고/하거나 예방하기 위해 직접 사용될 수 있다. 그러한 질환/상태의 예는 아테롬성동맥경화증 및 관상동맥 질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤을 저해할 수 있는 지질 입자는 HIV로 감염된 인간일 수 있는, 면역결핍 바이러스로 감염된 대상체에서 콜레스테롤 수준 증가에 의해 야기되거나 그와 결부된 것을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 대상체에서 콜레스테롤 수준 증가는 감염의 결과일 수 있다. 면역결핍 감염은 세포 콜레스테롤의 축적과 결부될 수 있으며, 따라서 아테롬성동맥경화증 및/또는 CAD의 발생을 야기할 수 있기 때문에, 지질 입자는 표적화 분자를 통해 면역결핍 바이러스 감염된 세포를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지질 입자는 하나 이상의 항레트로바이러스제를 캡슐화할 수 있다. 그러한 지질 입자는 항레트로바이러스제를 면역결핍 바이러스 감염된 세포에 전달하고 이와 동시에 세포 콜레스테롤의 수준을 낮추어 아테롬성동맥경화증 및/또는 CAD를 예방할 수 있다.
콜레스테롤을 저해할 수 있는 지질 입자는 복제에 있어서 콜레스테롤에 의존하는 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태를 치료하고/하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 바이러스 감염일 수 있다. 그러한 바이러스의 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus), 인플루엔자 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오마 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스, 세미리키 포레스트 바이러스, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스, 뎅기 바이러스, 홍역 바이러스, HIV, C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태에 사용될 경우, 지질 입자는 바이러스에 대한 항바이러스제 하나 이상을 함유할 수 있다. 대안적으로, 지질 입자는 HCV와 같은 바이러스의 형태발생 저해제로 작용함으로써 약물 또는 전구약으로서 직접 사용될 수 있다.
투여
지질 입자를 포함하는 조성물은 대상체에서 세포 콜레스테롤을 감소시키는 목적으로 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 투여 이전에 콜레스테롤의 초기 수준은 정상이거나 증가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 세포일 수 있다. 지질 입자를 포함하는 조성물은 대식세포를 비롯한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 및 Huh7.5 세포와 같은 인간 간암 세포주를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 세포 유형에서 세포 콜레스테롤 수준을 낮출 수 있다.
일부 경우에, 세포는 복제에 있어서 콜레스테롤에 의존하는 바이러스일 수 있는 바이러스로 감염된 세포일 수 있다. 그러한 경우에 지질 입자에 의한 콜레스테롤 저해는 바이러스 복제의 저해, 바이러스 조립 및 분비의 저해, 바이러스 엔벨로프 내의 콜레스테롤 수준이 감소된 비감염 바이러스 입자의 생성 및/또는 바이러스 진입을 위한 세포 표면상의 세포 수용체의 잘못된 국소화 (mis-localization)에 이르게 될 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 입자를 포함하는 조성물은 온혈 동물, 예를 들어, 포유류 또는 조류에게 투여될 수 있다. 많은 경우에, 대상체는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지질 입자를 포함하는 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 일부 실시양태에서는 지질 입자를 포함하는 조성물은 정맥내 주사 이외의 비경구 경로, 예를 들어, 복강내, 피하, 피내, 표피내, 근육내 또는 경피 경로를 통해 투여될 수 있다. 그러나 일부 실시양태에서는 지질 입자를 포함하는 조성물은 점막 표면, 예를 들어, 안구, 비강내, 폐, 장, 직장 및 요로 표면을 통해 투여될 수 있다. 리포좀 조성물과 같은 지질 함유 조성물을 위한 투여 경로는 예를 들어, 문헌[A. S. Ulrich, Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles, Bioscience Reports, Volume 22, Issue 2, Apr 2002, 129 - 150]에 개시되어 있다.
일부 경우에, 지질 입자의 피하 주사는 그러한 투여가 대식세포 내의 지질 입자의 축적을 유도하여 거품 세포의 발생 및 그에 따른 초기 상태의 아테롬성동맥경화증을 예방할 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가로 예시되지만 어떠한 방식으로든 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
표적 세포의 세포내 구획 내로의 작은 수용성 분자의 효율적인 캐리어인 리포좀으로 처리된 세포의 단백체 분석은 그러한 처리가 세포 콜레스테롤 생합성에 연루된 주요 효소인 3-히드록시-3-메틸글루타릴(HMG)-CoA 신타제를 하향조절함을 보여주었다. 추가 실험은 이러한 하향조절이 처리된 세포 내에서 유리 및 에스테르화 콜레스테롤 둘 모두의 수준을 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 아테롬성동맥경화증과 관상동맥 질환의 초기 단계는 콜레스테롤-축적 대식세포인 거품 세포의 형성으로 시작되기 때문에, 그리고 리포좀은 예를 들어, 피하 주사 후에 대식 세포 내에 축적되기 때문에, 리포좀 처리는 이들 질환에 대한 새로운, 표적화된 치료일 수 있다.
또한, 많은 바이러스는 정상 내지 증가된 세포 콜레스테롤 수준에 의존하는 것으로 나타나서, 표적 세포로의 항바이러스 약물의 효율적인 전달에 더하여 콜레스테롤 수준의 감소가 조합되면 새로운, 보다 효과적인 항바이러스 요법이 될 수 있다.
1. 리포좀 제조
1.1 리포좀 제조 방법
리포좀은 개시된 모든 분석을 위해 신선하게 제조하였다. 지질의 클로로포름 용액을 유리 튜브 내에 두고 용매를 질소 가스 스트림 하에서 증발시켰다. 달리 명시되지 않으면, 지질 필름은 1x PBS 완충액에서 5 mM의 최종 지질 농도로 와동시켜 수화시켰다. 생성된 다중라멜라형 소낭을 미니-엑스트루더(Mini-Extruder) 장치를 이용하여 100 nm 기공 직경의 폴리카르보네이트 필터를 통해 11회 압출시켰다. 리포좀을 0.22 ㎛ 필터 유닛을 이용하여 필터 살균하였다. 도 2A 내지 도 2F는 이들 연구에 사용된 지질을 보여준다: A. 22:6 PE; B. 22:6 PC; C. PI; D. PS; E. DOPE; F. CHEMS.
2. 다중불포화 ER 리포좀으로 처리한 세포에서 HMG CoA 신타제(HMGCS) 단백질의 감소
pH 민감성 (즉, PE 및 CHEMS 지질을 포함하지만 PI 또는 PS 지질을 함유하지 않는 리포좀) 및 ER 리포좀 (즉, PE 지질 및 PI 또는 PS 지질 중 적어도 하나를 포함하는 리포좀) 둘 모두로 5일 동안 처리한 세포를 단백체 분석에 사용하여 세포 내의 모든 검출가능한 단백질의 증가 또는 감소를 결정하였다. pH-민감성 및 ER-표적화 리포좀 처리의 결과로서 감소된 한 가지 단백질은 효소 HMG-CoA 신타제 (HMGCS)였다. HMGCS는 아세틸-CoA로부터 아세토아세틸CoA를 통해 HMG-CoA가 합성되는, 메발로네이트-이소프레노이드 경로의 첫 번째 단계를 촉매한다. Huh7.5 세포의 22:6 다중불포화(pu) ER 리포좀-처리가 이 효소에서 유사한 감소를 유도하는지를 결정하기 위하여, 세포를 4일 동안 다양한 농도의 리포좀으로 처리한 후 전체 세포 용해 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하여 HMGCS를 특이적으로 확인하였다.
2.1 웨스턴 블롯에 의한 HMGCS 및 액틴의 확인 방법
1 μM 내지 100 μM 범위의 배지중 최종 농도의 puER 리포좀(22:6 PE: 22:6 PC:PI:PS, 1.5:1.5:1:1)을 이용한 처리 후, Huh7.5 세포를 1 x PBS에서 2회 세척하고, 1 mg/ml의 최종 단백질 농도로 1x PBS/1% 트리톤 X-100에 재현탁시켰다. 단백질 농도는 BSA 표준을 이용하여 브래드포드 (Bradford) 분석 (바이오-라드 (Bio-Rad))에 의해 결정하였다. 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 젤 (인비트로겐 (Invitrogen))에 웰 당 10 ㎍의 단백질을 로딩하여 SDS-PAGE를 실시하고, 제조사의 권장사항에 따라 NuPAGE MES SDS 완충액을 이용하여 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 제조사의 프로토콜에 따라, 1:100 희석 일차 염소 항-인간 HMGCoA 신타제 및 항-인간 액틴 항체 (산타 크루즈 (Santa Cruz))를 이용하여 웨스턴브리즈 (WesternBreeze)® 항-염소 AP 화학발광 키트 (인비트로겐)를 이용하여 면역블로팅을 실시하였다.
2.2 puER 리포좀 처리를 이용한 HMGCS의 하향조절
주로 18:1 지질 (18:1 PE: 18:1 PC:PI:PS, 1.5:1.7:1.5:0.3)로 구성된 ER 리포좀에서 밝혀진 바와 같이, 22:6 ER 리포좀을 이용한 처리가 또한 용량-의존적 방식으로 HMGCoA-신타제의 양을 감소시켰다 (도 3).
도 3은 항-액틴 및 항-HMGCS 항체 둘 모두를 이용한 22:6 ER 리포좀-처리된 JC-1-감염 Huh7.5 세포(MOI=0.5)의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. 세포를 4일 동안 다양한 농도의 22:6 ER 리포좀으로 처리하고, 이 시점에서 세포를 수확하여 1% 트리톤 X-100/1xPBS에 재현탁시켜 파괴시켰다. 세포 용해물을 단백질 함량에 대해 분석하였으며, 30 ㎍의 총 단백질을 웰 당 로딩한 후 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 단일 실험으로부터의 대표적인 이미지가 예시되어 있다. 실험은 독립적으로 3회 반복하였다.
3. puER 리포좀으로 세포를 처리하면 세포 콜레스테롤 수준이 감소된다
리포좀 처리가 세포에서 HMGCS의 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이들 세포에서 유리 및 에스테르화 콜레스테롤 수준 둘 모두를 결정하기 위한 분석을 실시하여 콜레스테롤 생합성의 저해 면에서 이 저해를 정량하였다. 총 콜레스테롤과 유리 콜레스테롤 수준을 22:6 ER 리포좀 및 22:6 PEG-ER 리포좀-처리 Huh7.5 세포에서 정량화하였다. 에스테르화 콜레스테롤은 전체 및 유리 콜레스테롤 값 사이의 차이를 계산하여 결정하였다.
3.1 세포에서 전체 및 유리 콜레스테롤 수준의 정량 방법
처리 후, Huh7.5 세포 또는 PBMC를 1x PBS에서 2회 세척하고, 1 mg/ml의 최종 단백질 농도로 1x PBS/1% 트리톤 X-100에 재현탁시켰다. 단백질 농도는 BSA 표준을 이용하여 브래드포드 분석(바이오-라드)에 의해 결정하였다. 콜레스테롤 분석은 10 ㎍ 전체 단백질에 해당하는 세포 용해물에서 실시하였다. 전체 콜레스테롤 및 유리 콜레스테롤 수준은 제조사의 프로토콜에 따라, 각각 콜레스테롤 에스테라제의 존재 또는 부재 하에서 암플렉스 (Amplex)® 레드 콜레스테롤 분석 키트 (인비트로겐)를 이용하여 정량화하였다.
3.2 puER 및 페길화된 puER 리포좀을 이용한 처리 후 Huh7.5 세포와 PBMC 둘 모두에서 전체 및 유리 콜레스테롤 수준의 정량
전체 콜레스테롤 및 유리 콜레스테롤 수준을 22:6 ER 리포좀 및 22:6 PEG-ER 리포좀-처리 Huh7.5 세포에서 정량화하였다. 에스테르화 콜레스테롤은 전체 및 유리 콜레스테롤 값 사이의 차이를 계산하여 결정하였다. 결과는 전체 콜레스테롤 수준에서의 용량-의존적 감소를 입증하며 (도 4), PEG-ER 리포좀 처리가 비-페길화 조성물과 유사한 효과를 가져, 페길화가 ER 리포좀에 의한 콜레스테롤 생합성 저해에 영향을 주지 않음을 증명하였다. 전체 콜레스테롤 수준은 미처리 대조군에 비교하여 50 μM 22:6 ER 리포좀 처리 샘플에서 유의하게 더 낮으며 (56%, SD=2.7%), 이러한 감소의 대부분은 세포 내의 에스테르화 콜레스테롤 (미처리 값의 75%, SD=1.1%)에 비하여 더 낮은 수준의 유리 콜레스테롤 (미처리 값의 47%, SD=2.5%)로 인한 것일 수 있다.
도 4는 22:6 PE:22:6PC:PI:PS-처리된, JC1-감염 Huh7.5 세포(MOI=0.5)로부터의 유리 및 전체 콜레스테롤 둘 모두의 정량화 결과를 보여준다. 세포를 22:6 ER 리포좀의 페길화 버전을 비롯한, 다양한 농도의 리포좀으로 4일 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 1% 트리톤(등록상표) X-100/1x PBS로 파괴시키고, 각 샘플 10 ㎍을 콜레스테롤 에스테라제의 존재 및 부재 하에서 콜레스테롤 분석에 사용하여 각각 세포내 전체 및 유리 콜레스테롤을 정량하였다. 에스테르화 콜레스테롤은 두 값 사이의 차이로서 계산하였다. 결과는 3회 독립 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균 (및 SD)을 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군 (100%)에 관련하여 제시되며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
피토헤마글루티닌(PHA)-자극된 PBMC를 22:6 ER 리포좀과 함께 인큐베이션하고, 4일 인큐베이션 후 유리 및 에스테르화 콜레스테롤 수준 둘 모두를 정량화하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 미처리 PBMC는 78%(SD=5.9%) 유리 콜레스테롤과 22% (SD=3.8%) 에스테르화 콜레스테롤을 함유한다. 50 μM 22:6 ER 리포좀을 이용한 처리는 세포 콜레스테롤에서 28%(SD=6.5%)의 전체적인 감소를 유도하였다. 유리 콜레스테롤 수준은 33% (SD=6.3%, P<0.001)만큼 유의하게 낮아졌으나, 미처리 대조군에 비하여 이 농도에서 에스테르화 콜레스테롤의 유의한 감소는 없었다. 페길화 22:6 ER 리포좀은 또한 29% (SD=3.9, P<0.001)만큼 유리 콜레스테롤 수준을 감소시켰으나, 에스테르화 콜레스테롤 수준에 대한 유의한 효과는 없었다.
도 5는 4일 동안 22:6 ER 리포좀으로 처리한 PHA-자극 PBMC에 있어서의 실험 결과를 보여준다. 이어서 세포를 수확하고 1% 트리톤(등록상표) X-100/1x PBS에 재현탁하여 파괴시키고, 각 샘플 10 ㎍을 콜레스테롤 에스테라제의 존재 및 부재 하에서 콜레스테롤 분석에 사용하여 각각 세포내 전체 및 유리 콜레스테롤을 정량화하였다. 에스테르화 콜레스테롤은 두 값 사이의 차이로서 계산하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 세 평균 및 SD를 나타낸다. 모든 값은 미처리 대조군(100%)에 관련하여 백분율로 나타내며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
4. 감소된 세포내 콜레스테롤은 HCV에 대한 항바이러스 효과를 갖는다
HCV는 효율적인 바이러스 복제를 위해 세포 콜레스테롤의 수준에 의존하는 것으로 나타났다. 부가적으로, ER 리포좀은 세포 수용체에 대하여 바이러스와 경쟁함으로써 HCV에 대해 항바이러스성인 것으로 나타났다. HCV에 대한 puER 리포좀 및 페길화 puER 리포좀의 조합된 항바이러스 활성을 모니터링하기 위하여, 바이러스를 16일 동안 (4회의 4일간 처리) 리포좀의 존재 하에서 배양하였다. 항바이러스 활성은 세포에서의 바이러스 감염, 및 바이러스 분비 및 처리에 걸쳐 분비된 비리온의 감염성을 정량화하여 모니터링하였다. 세포 콜레스테롤의 수준을 또한 처리 세포 내에서 측정하였다.
4.1 HCV 세포 배양 및 바이러스 감염 및 분비의 정량화를 위한 방법
JC -1 HCV 세포 배양 ( HCV cell culture , HCVcc ): 개시된 모든 분석에서 공지된 감염 역가 (포커스 형성 유닛 (ffu)/ml)의 바이러스 원액을 이용하여 나이브 Huh7.5 세포를 감염시켰다. 리포좀 처리 분석을 위하여 JC1-감염 Huh7.5 세포를 웰 당 2 ml의 전체 부피로 리포좀이 있거나 없는 완전 DMEM/10% FBS 중 3x105개의 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트 내로 접종하고, 4일 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, HCV RNA 정량화를 위해 상청액을 수확하였다. 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 0.5% 트립신/EDTA (인비트로겐)에서 떼어내고, 계수하고, 추가 분석 전에 -20℃에서 동결시켰다. 다수의 계대를 이용한 분석의 경우, 트리판 블루로 세포 계수 후, 3x105개의 세포를 개시된 바와 같이 추가의 라운드의 처리를 위해 6웰 플레이트 내로 재접종하였다.
RT - PCR 에 의한 HCV 의 정량화: 제조사의 프로토콜에 따라, 퀴아젠 퀴아앰프 ( QIAGEN QIAamp)® 바이러스 RNA 정제 키트를 이용하여 500 ㎕의 상청액으로부터 추출된 바이러스 RNA에서 정량적 PCR에 의해 바이러스 분비 분석을 실시하였다. 500 ㎕의 상청액을 먼저 센트리콘 (Centricon)® 농축기 (10,000 KDa MW 컷오프, 밀리포어 (Millipore))를 이용하여 140 ㎕로 농축시켰다. 분비된 바이러스 RNA의 정량화는 먼저 단리된 RNA를 프라이머 RC21 (5'- CTCCCGGGGCACTCGCAAGC-3')을 이용한 역 전사효소 반응 (탁맨 (TaqMan)®, ABI)을 이용하여 cDNA로 바꾼 후 SyBr® 그린 믹스 (퀴아젠) 및 HCV cDNA에 대해 생성된 RC21 및 RC1 프라이머 (5'-ATGCCATGGCGTTAGTA-3') 둘 모두를 이용하여 실시간 PCR을 함으로써 행하였다. HCV 전사체 수준은 HCV JC-1 cDNA의 연속 희석물로 이루어진 표준 곡선에 대하여 결정하였다.
4.2 바이러스 감염성을 측정하기 위한 HCV 코어 면역형광
처리된 JC-1-감염 Huh7.5 세포의 상청액 내의 분비된 HCV 비리온의 감염성은, 나이브 Huh7.5 세포를 감염시켜 결정하였다. 나이브 Huh7.5 세포를 48웰 플레이트에 5 x 104개의 세포/웰 밀도로 접종하고, 하룻밤 유착시킨 후 샘플 상청액 200 ㎕로 배지를 대체하였다. 상청액을 1시간 동안 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키도록 둔 후 세포를 1x PBS로 2회 세척한 후 2일 동안 500 ㎕ 완전 DMEM/10% FCS에서 인큐베이션하였다. 2일 인큐베이션 후, 세포를 1x PBS로 2회 세척하고, 10분 동안 메탄올/아세톤(1:1, vol/vol)에서 고정시키고, 1xPBS/0.1% 트윈 (Tween)® -20에서 2회 세척하였다. 그 후 세포를 3 ㎍/ml 마우스 항-HCV 코어 항체 (어피니티 바이오리젠츠(Affinity BioReagents))를 함유한 1xPBS/0.1% 트윈®-20에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 1xPBS/0.1% 트윈®-20에서 2회 세척하고, 1xPBS/0.1% 트윈®-20/1:1000 FITC-표지 항-마우스 2차 항체 (시그마)에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 2회 더 세척하고, DAPI로 염색하였다.
형광 이미지는 니콘 이클립스 (Nikon Eclipse) TE2000-U 현미경으로 촬영하였다. 감염된 세포의 백분율은 HCV로 감염된 세포의 총수 (항-HCV 항체에 의해 검출됨)를 분석에서의 세포 총수 (DAPI 염색에 의해 검출됨)로 나누어 계산하였다.
4.3 puER 및 페길화 puER 리포좀을 이용한 HCVcc-감염 Huh7.5 세포의 장기 처리
JC-1 HCVcc-감염 Huh7.5 세포를 16일의 기간에 걸쳐 ER 리포좀으로 처리하였다 (4회 처리). 4일마다, 세포를 처리제를 함유한 신선한 배지 내로 계대하였으며 세포에서 바이러스 감염, HCVcc 분비, 및 분비된 입자의 감염성을 정량화하였다. 세포를 MOI=0.02로 감염시켰으며 처리는 세포에서의 감염 수준이 (코어 단백질 면역형광에 의해 결정할 때) 전체 세포의 30%-40%에 도달하면 시작하였다. 도 6A는 22:6 ER 리포좀의 상이한 처리를 이용한 16일 처리 기간에 걸친 세포의 HCVcc 감염 수준을 보여준다. 모든 리포좀 처리는 Huh7.5 세포 내의 바이러스 감염의 확산을 방지하였으며, 단지 4일의 처리 후에 감염된 세포의 총수에서 용량-의존적 감소를 유도하였다. 50 μM의 22:6 ER 리포좀을 이용한 16일 처리 후 배양물에서 감염된 세포는 관찰되지 않았다. 16일 처리에 걸친 HCV 분비의 결과 (도 6B)는 유사한 패턴을 나타내며, 여기서 HCV 분비는 미처리 샘플에 비하여 용량-의존적 방식으로 감소하였다. 1회의 처리 후, 22:6 ER 리포좀은 50 μM의 농도에서 27% (SD=11.3%)만큼 HCV 분비를 유의하게 감소시키는 것으로 나타났으며; 50 μM의 22:6 PEG-ER 리포좀-처리에서 유사한 감소가 관찰되었다 (23%, SD=6.6%). RT-PCR에 의해 정량화할 때 50 μM의 22:6 ER 리포좀-처리 세포로부터의 16일 상청액은 미처리 샘플에 비하여 1% 미만의 HCV RNA를 함유하였다. 본 발명은 어떤 이론에 의해서도 제한되지 않지만, 이러한 결과는 감염이 이 시점에서 제거되지 않았을 수도 있음을 제안할 수 있으나 (RNA 수준이 배경 수준보다 유의하게 높았음); 리포좀 처리는 2배가 넘는 양만큼 바이러스 분비를 성공적으로 감소시켰다. 분비된 바이러스 입자의 감염성을 각 계대에서 결정하였으며, 결과는 도 6C에 제시되어 있다. ER 리포좀의 최대 효과가 바이러스 감염성에 대해 나타났으며, 바이러스 감염성은 50 μM의 22:6 ER 리포좀의 16일 처리에 의해 0으로 (또는 임의의 검출 한계 미만으로) 감소하였다. 하지만, 단지 1회의 50 μM의 22:6 ER 리포좀의 처리 후에는 HCV 감염성은 91% (SD=2.2%) 감소하였다. 22:6 ER 리포좀의 최저 시험 농도인 1 μM도 감염성을 52% (SD=5.3%)만큼 감소시키며, 이는 ER 리포좀이 바이러스 감염성의 잠재적 저해제임을 제안한다.
처리 기간 전체에 걸쳐, 유리 콜레스테롤 및 에스테르화 콜레스테롤의 수준을 처리된 Huh7.5 세포에서 또한 정량화하였다 (각각 도 6D 및 6E). 흥미롭게도, 유리 콜레스테롤의 수준은 단지 1라운드의 처리 후에 낮아지지만, 이 수준은 후속 처리에서 추가로 크게 감소하지는 않았다. 대신, 에스테르화 콜레스테롤의 점진적인 용량-의존적 감소가 처리의 4일에서 12일까지 관찰되었으며, 이 시점에서 수준은 모든 처리에서 평탄해지는 것으로 보였다. 미처리 세포에서 유리:에스테르화 콜레스테롤의 정상비는 이들 분석에 의해 검출할 때 대략 2:1이며, 50 μM의 22:6 ER 리포좀 처리가 이 비를 처리의 4일까지 1.3:1까지 낮게 감소시키지만, 2:1 비는 12일까지는 모든 처리된 샘플에서 복구된다.
도 6A 내지 도 6E는 JC-1-감염 Huh7.5 세포 (MOI=0.02)를 22:6 ER 리포좀으로 16일 동안 처리한 것에 관한 실험의 결과를 보여준다. (A) 처리 전체에 걸친 Huh7.5 세포에서의 JC-1 HCVcc 감염 수준. (B) JC-1 HCVcc 분비. (C) 분비된 JC-1 HCVcc 입자의 감염성. (D) 세포에서의 유리 콜레스테롤 수준. (E) 세포에서의 에스테르화 콜레스테롤. 데이터는 독립적인 두 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균을 나타낸다. 바이러스 감염성을 위해 높은 수준의 비리온-결부 콜레스테롤이 필요함이 이전에 입증되었다 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]). 따라서, ER 리포좀 처리 결과로서 바이러스 감염성의 감소 결과는 분비된 입자의 바이러스 막 내의 콜레스테롤 감소의 결과일 수 있다. 이 가능성을 시험하기 위하여, 바이러스 감염성을 복구하기 위한 시도로 50 μM의 22:6 ER 리포좀-처리, 50 μM의 22:6 PEG-ER 리포좀-처리 및 미처리 세포로부터 분비된 HCVcc를 유리 콜레스테롤과 함께 인큐베이션하였다.
4.4 유리 콜레스테롤을 HCVcc와 함께 인큐베이션하는 방법
4일 인큐베이션 기간 후 미처리 및 50 μM 리포좀-처리 Huh7.5 세포로부터 분비된 HCVcc 입자의 RNA를 이전에 개시된 바와 같이 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 완전 DMEM/10% FBS에서 최저 농도로 희석시켜 샘플을 정규화하였다. 이전에 개시된 바와 같이 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]) 37℃에서 1시간 동안 HCVcc를 유리 콜레스테롤 (시그마)과 함께 인큐베이션하고, 상기에 개시한 바와 같이 HCV 코어 단백질 면역형광 감염성 분석을 위해 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키기 위해 사용하였다.
4.5 puER 및 페길화 puER 리포좀-처리된 HCVcc를 유리 콜레스테롤과 함께 인큐베이션한 후 결과
50 μM의 22:6 ER 리포좀-처리, 50 μM의 22:6 PEG-ER 리포좀-처리 및 미처리 세포로부터 분비된 HCVcc를 RT-PCR에 의해 정량화하고 2x104 RNA 카피/ml로 정규화하였다. 정규화된 바이러스 상청액을 이전에 개시된 바와 같이 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]) 37℃에서 1시간 동안 15 ㎍/ml, 또는 150 ㎍/ml의 최종 농도의 콜레스테롤과 함께 사전인큐베이션하거나 미처리한후, 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 HCVcc 상청액은 외인성 콜레스테롤과 함께 사전인큐베이션할 때 증가된 감염성을 나타냈으나; 15 ㎍/ml 콜레스테롤의 농도에서는, ER 리포좀-처리 세포로부터의 HCVcc는 미처리 HCVcc와 비교할 때 바이러스 감염성이 더 크게 증가하였다 (각각 콜레스테롤 없는 대조군의 282% 및 138%). ER 리포좀-처리 HCVcc에 외인성 콜레스테롤을 첨가하는 것이 바이러스 감염성의 상당한 백분율을 복구시키지만, 그 수준은 미처리 비리온에서 관찰되는 것에 비견되지 않으며, 이는 바이러스 감염성을 감소시키는 추가적인 결함이 ER 리포좀-처리 세포로부터 분비된 HCVcc 입자 내에 있을 수 있음을 제안할 수 있다. 도 7은 외인성 콜레스테롤 (15 ㎍/ml, 및 150 ㎍/ml 콜레스테롤의 최종 농도)로 처리된 22:6 ER 리포좀-처리, 페길화 22:6 ER 리포좀-처리 및 미처리 JC-1 HCVcc의 감염성을 보여준다. 바이러스 샘플을 리포좀의 존재 하에서의 4일 인큐베이션으로부터 취하여, 최저 농도의 JC-1 RNA (정량적 PCR에 의해 결정함)로 정규화하고, 37℃에서 1시간 동안 콜레스테롤로 사전처리하였다. 콜레스테롤의 첨가 후, 바이러스 샘플을 이용하여 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키고 이들 샘플의 감염성을 이전에 개시된 바와 같이 정량하였다. 결과는 세 가지 독립적 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균 (및 SD)을 나타낸다.
연구는 또한 감소하는 수준의 세포 콜레스테롤이 HCVcc가 세포를 감염시키는 능력을 감소시킴을 보여주었다 (문헌[Aizaki, Morikawa et al. 2008]). 이러한 효과는 HCV의 두 가지 주요 세포 수용체인 CD81 및 SR-BI 둘 모두가 HCV 감염에 요구될 수 있는 과정 (Kapadia, Barth et al. 2007)인, 원형질 막에 국소화하기 위해 지질 래프트 형태의 콜레스테롤을 필요로 할 수 있다 (문헌[Soldaini, Wack et al. 2003]; [Cherukuri, Shoham et al. 2004]; [Rhainds, Bourgeois et al. 2004])는 사실에 기인할 가능성이 있을 수 있다. ER 리포좀이 세포 콜레스테롤의 수준을 감소시켜 HCVcc 감염을 방지할 수 있는지를 조사하기 위하여, 나이브 Huh7.5 세포를 4일 동안 22:6 ER 리포좀으로 사전처리한 후 미처리 JC-1 HCVcc로 감염시켰다.
4.6 puER 및 페길화 puER 리포좀을 이용한 Huh7.5 세포의 사전처리 및 HCVcc를 이용한 감염 후 결과
도 8은 ER 리포좀 사전처리가 HCVcc가 천연 세포를 감염시키는 능력을 용량-의존적으로 감소시킴을 확인하며; 최대 효과는 50 μM의 22:6 ER 리포좀-처리에서 나타나며, 여기서는 바이러스 감염이 89% 만큼 감소하였다 (SD=1.9%).
도 8은 JC-1 HCVcc (MOI=0.5)로 감염시키기 전에 4일 동안 22:6 ER 리포좀으로 처리한 미감염 Huh7.5 세포의 실험 결과를 보여준다. 바이러스 감염성은 이전에 개시된 바와 같이 정량화하였다. 결과는 세 가지 독립적 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균 (및 SD)을 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군 (100%)에 관련하여 제시되며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
5. 감소된 세포내 콜레스테롤은 HIV에 대해 항바이러스 효과를 갖는다.
HIV는 또한 적절한 조립과 감염성을 위해 각각 세포 콜레스테롤 (지질 래프트) 및 바이러스-결부 콜레스테롤에 의존하는 것으로 나타났다. ER 리포좀이 HIV-1 항바이러스성으로 작용할 수 있는지를 조사하기 위하여, PBMC를 3가지 HIV-1 일차 단리체 (LAI, 93UG067, 및 93RW024)로 TCID50=100으로 감염시켰으며, puER과 페길화 puER 리포좀의 처리는 감염 후 4일 동안 지속하였다. HIV 분비 및 감염성은 p24 ELISA에 의해 세포 상청액으로부터 정량화하였다.
5.1 puER과 페길화 puER 리포좀으로 처리한 후 HIV 분비 및 감염성의 정량화 방법
HIV -1 일차 단리체 세포 배양: 세포를 감염시키기 위하여, 4x105개의 PHA-활성화 PBMC 및 일차 단리물 원액의 100 TCID50 (조직 배양물 감염 용량 50%)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 16시간의 하룻밤 인큐베이션 후, 세포를 완전 RPMI 배지로 3회 세척하고, 리포좀이 있거나 없는 완전 RPMI/IL2에 재현탁시켰다. 5일에, 세포로부터 분비된 HIV 비리온을 함유한 상청액을 수집하고 p24 농도를 p24 포획 ELISA에 의해 각각에 대해 정량화하였다.
정량적 p24 ELISA: p24 분석 전에 1% 엠피젠 (Empigen)(vol/vol)으로 HIV 샘플을 불활성화시켰다. p24를 정량화하기 위한 ELISA를, 제조사의 프로토콜에 따라, 처리된 상청액으로부터 p24를 포획하기 위한 항-p24 D7320 항체 (영국 더블린 소재의 알토 바이오리젠츠 (Aalto Bioreagents))를 이용하여 실시하였으며, 항-p24 2차 항체인 BC1071-AP (알토 바이오리젠츠)를 이용하여 검출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 암팩 (AMPAK)™ ELISA 키트 (영국, 엘리 소재의 아코(Dako))를 이용하여 알카라인 포스파타제 활성을 측정하였다. 샘플을 재조합 p24 단백질 (알토 바이오리젠츠)을 이용하여 표준화시켰다.
HIV 감염성 분석: 리포좀으로 처리된 PBMC로부터 분비된 HIV 비리온의 감염성은 리포좀 처리 세포로부터 분비된 HIV 비리온을 함유한 상청액을 이용하여 결정하였다. 모든 상청액을 완전 RPMI/IL2에서 10 ng/ml의 최종 p24 농도로 희석하고, 100 ㎕를 100 ㎕의 배지 내의 4 x 105개의 PHA-활성화 PBMC에 5 ng/ml의 최종 p24 농도로 첨가하고 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날 세포를 개시한 바와 같이 세척하고, 신선한 RPMI/IL2 200 ㎕에 재현탁시키고, 4일 동안 인큐베이션 한 후, 상청액을 수집하여 포획 ELISA에 의해 p24 함량에 대해 분석하였다.
5.2 puER 및 페길화 puER 리포좀을 이용한 HIV-1-감염 PBMC의 처리 후 결과
4일 처리 후 p24 ELISA에 의해 세포 상청액으로부터 HIV 분비를 정량화하였으며 결과는 HIV 분비 및 분비된 입자의 감염성 둘 모두에서 용량-의존적 감소를 입증하였다 (각각 도 9A 및 9B). HCVcc에서 나타난 바와 같이, 항바이러스 활성의 주요 기작은 감염성 바리온의 형성을 감소시킴에 의한 것으로 보일 수 있다: 50 μM의 22:6 ER 리포좀 처리에서 분비된 HIV의 감염성의 50% (SD=4.6%) 감소가 관찰된 한편, 바이러스 분비에서는 단지 22% (SD=4.6%) 감소만이 있었다.
도 9A는 22:6 ER 리포좀으로 4일 처리 동안 HIV-1의 세 가지 유전적으로 다양한 일차 단리체 (LAI, 93UG067, 및 93RW024)의 평균 분비율을 보여준다. HIV-1 분비는 포획 ELISA를 이용하여 HIV-1 p24 매트릭스 단백질을 정량화하여 측정하였다. 도 9B는 22:6 ER 리포좀 처리 PBMC로부터 분비된 HIV-1의 감염성을 보여준다. 분비된 비리온의 감염성은 나이브 PBMC를 감염시키기 위하여 상청액을 이용하고, 이어서 감염 후 분비를 모니터링하기 위하여 p24 ELISA를 이용하여 결정하였다. 데이터는 세 가지 독립 실험의 세 평균 및 SD를 나타낸다. 모든 값은 미처리 대조군 (100%)에 관련하여 백분율로 나타나며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
6. 다중불포화 ER 리포좀은 세포 표면 리포단백질 수용체에의 결합에 대해 HCVcc와 경쟁한다:
저밀도 리포단백질 수용체 (LDLr)는 VLDL-유도된 리포단백질 입자의 클래트린-매개 엔도시토시스를 통해, 콜레스테롤이 세포에 들어가는 일차 경로를 조절할 수 있는 막 당단백질이다. LDLr은 또한 HCV 입자가 리포단백질과 회합되며 배양된 세포에 의한 바이러스 입자의 흡수는 LDLr의 발현과 상관된다는 발견에 기초하여 후보 HCV 수용체이다. 리포좀이 세포 내로의 흡수를 위해 LDLr을 이용하는지를 보기 위하여, Huh7 세포에서 LDLr의 발현을 상향- 및 하향-조절하는 것으로 각각 알려진 약물인 스쿠알레스타틴 및 25-히드록시콜레스테롤을 이용하여 JC-1 HCVcc 감염의 존재 하에서 Huh7.5 세포에서 ER 리포좀 흡수에 대한 임의의 영향을 관찰하였다.
6.1 Huh7.5 세포에서 LDLr 발현을 상향- 및 하향-조절하는 약물의 존재 하에서 리포좀 흡수의 모니터링 방법
미국 특허 출원 공개 제20090252785호에 개시된 바와 같이 리포좀을 제조하였으며 세포에서 그들의 흡수를 모니터링하기 위하여 rh-PE 1% (총 몰)를 포함하였다. JC-1-감염(MOI=0.5) 또는 미감염 Huh7.5 세포를 2 ml의 완전 DMEM/10% FCS 배지에서 3 x 105개의 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 무혈청 완전 DMEM에서 24시간 동안 1 μM 및 10 μM 스쿠알레스타틴 (SQ, 시그마) 또는 25-히드록시콜레스테롤 (25-HC, 시그마)로 사전처리하거나 사전처리하지 않았다. 24시간 사전 인큐베이션 후, rh-표지된 리포좀을 50 μM 의 최종 지질 농도로 첨가하고 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후, 세포를 1x PBS에서 2회 세척하고, 떼어내고, 계수하고, 200 ㎕ 1x PBS/1% 트리톤® X-100에 재현탁시킨 후 96웰 플레이트로 옮겨서 λex=550 nm, λem=590 nm에서 분광형광계에서 판독하였다.
6.2 스쿠알레스타틴 및 25-히드록시콜레스테롤의 존재 하에서 Huh7.5 세포내로의 리포좀 흡수 결과
세포를 SQ 또는 25-HC의 존재 하에서 24시간 동안 (둘 모두의 경우 10 μM 및 1 μM 의 최종 농도) 배양한 후 24시간 동안 로다민-표지된 22:6 ER 리포좀을 첨가하였다. 10 μM 25-HC로 세포를 처리하면 리포좀 흡수가 69% (SD=4.9%) 감소한 반면, 10 μM SQ는 리포좀 흡수를 117% (SD=10.7%)로 유의하게 증가시켜, ER 리포좀의 Huh7.5 세포 내로의 흡수에 있어서의 LDLr에의 의존성을 입증하였다 (도 10).
도 10은 무혈청 완전 DMEM에서 24시간 동안 리포단백질 수용체의 발현을 상향조절 및 하향조절하기 위해 사용된 약물(각각 SQ 및 25-HC)의 존재 하에서 인큐베이션된 미감염 Huh7.5 세포에 대한 실험 결과를 보여준다. 그 후 지질 이중층에서 1% rh-PE로 표지된 22:6 ER 리포좀 (50 μM 의 최종 지질 농도)을 세포에 첨가하고 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 수확하고, 계수하고, rh-PE 형광을 λex=550 nm, λem=590 nm에서 측정하였다. 모든 데이터는 세 가지 독립 실험으로부터의 세 평균과 SD를 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군 (100%)에 관하여 제시되며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
HCV는 세포 수용체로서 LDLr을 이용하는 것으로 생각될 수 있기 때문에, ER 리포좀은 또한 내부화에 필요한 세포 수용체에 대해 바이러스와 직접 경쟁함으로써 HCVcc의 감염성을 감소시킬 수 있다. 이 가설을 시험하기 위하여, 22:6 ER 리포좀을 JC-1 HCVcc와 혼합하여 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 결과는 ER 리포좀이 5 μM 초과의 지질 농도를 이용하여 50% 초과 만큼 Huh7.5의 HCVcc 감염을 중화시킬 수 있음을 입증한다 (도 11). 최대 효과는 50 μM의 최종 농도로 첨가된 ER 리포좀에서 나타났으며, 여기서는 바이러스 감염성이 87% (SD=2.9%)만큼 감소하였다. 이 실험을 바이러스와 리포좀의 1시간 사전인큐베이션 후 감염을 위해 나이브 세포에 첨가하여 반복하였으며, 결과는 제시된 것들과 실질적으로 동일하였다 (데이터는 도시되어 있지 않음). 본 발명이 어떤 이론에 의해서도 제한되지 않지만, 이 결과는 리포좀이 HCVcc 입자와 직접 상호작용하지 않으며 세포 수용체와만 상호작용함을 시사할 수 있다.
도 11은 Huh7.5 세포의 1시간 감염 동안 HCVcc 바이러스 원액에 22:6 puER 리포좀을 첨가한 실험 결과를 보여준다. 리포좀을 다양한 농도로 바이러스 원액에 첨가하고 나이브 Huh7.5 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. HCVcc 감염을 중화시키는 puER 리포좀의 능력은 HCV 코어 단백질 면역형광 분석을 이용하여 2일 인큐베이션 기간 후 감염된 세포의 수를 정량화하여 모니터링하였다. 모든 데이터는 세 가지 독립 실험으로부터의 세 평균과 SD를 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군 (100%)에 관하여 제시되며, 이 값으로부터의 유의한 차이는 * (P<0.05) 또는 ** (P<0.001)로 나타냈다.
참고문헌
Figure pct00013
Figure pct00014
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전술한 것이 특정한 바람직한 실시양태를 나타내지만, 본 발명은 그렇게 한정되지 않음이 이해된다. 개시된 실시양태에 대하여 다양한 변경이 행해질 수 있으며 그러한 변경은 본 발명의 범주 이내인 것으로 의도됨이 당업계의 숙련자에게 일어난다.
본 명세서에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF OXFORD <120> CHOLESTEROL LEVEL LOWERING LIPOSOMES <130> 080618-0746 <140> PCT/IB2010/000873 <141> 2010-03-26 <150> 61/202,699 <151> 2009-03-27 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 ctcccggggc actcgcaagc 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 atgccatggc gttagta 17

Claims (27)

  1. 세포 콜레스테롤 수준 감소를 필요로 하는 대상체에게 세포 진입이 가능한 지질 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 지질 입자가 적어도 하나의 포스파티딜에탄올아민 지질 또는 그의 유도체를 함유하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 지질 입자가 콜레스테릴 헤미숙시네이트 지질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 지질 입자가 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 또는 포스파티딜세린 지질 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 지질 입자가 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜세린 지질을 포함하는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 지질 입자가 디올레오일포스파티딜에탄올아민 지질을 포함하는 것인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 지질 입자가 PEG-PE 지질을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 지질 입자가 적어도 하나의 다중불포화 지질을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 지질 입자가 적어도 하나의 다중불포화 PE 지질을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 불포화 PE 지질이 22:6 PE 지질인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 지질 입자가 적어도 하나의 다중불포화 PC 지질을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 다중불포화 PC 지질이 22:6 PC 지질인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 지질 입자가 22:6 PE 지질, 22:6 PC 지질, PI 지질 및 PS 지질을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 지질 입자가 18:1 PE 지질, 18:1 PC 지질, PI 지질 및 PS 지질을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 대상체가 적어도 하나의 세포를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 투여 이전에, 적어도 세포는 바이러스로 감염된 적어도 하나의 세포를 포함하며, 상기 투여는 감염된 세포의 감염 능력을 감소시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 바이러스가 HCV 바이러스인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 대상체가 온혈 동물인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 투여로 인해 세포 콜레스테롤 수준 증가에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방 중 적어도 하나가 이루어지는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 질환 또는 상태가 아테롬성동맥경화증 또는 관상동맥 질환인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체가 면역결핍 바이러스로 감염된 대상체이며, 아테롬성동맥경화증 또는 관상동맥 질환이 면역결핍 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 투여로 인해 복제에 있어서 세포내 콜레스테롤에 의존적인 바이러스에 의해 야기되거나 그와 결부된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방이 이루어지는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 바이러스가 단순 포진 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 백시니아 (vaccinia) 바이러스, 폴리오마 (polyoma) 바이러스, 엡스타인 바르 (Epstein-Barr) 바이러스, 세미리키 포레스트 (Semiliki Forest) 바이러스, 에볼라 (Ebola) 바이러스, 마버그 (Marburg) 바이러스, 뎅기 바이러스, 홍역 바이러스, HIV, C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 조성물이 지질 입자 내부에 캡슐화된 항바이러스제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 투여를 피하로 수행하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 지질 입자가 리포좀인 방법.
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