CN102427804A - 降低胆固醇水平的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用能够进入细胞的脂质颗粒降低细胞胆固醇水平的方法。所述脂质颗粒可用于治疗或预防由细胞胆固醇水平增加引起的或与细胞胆固醇水平增加有关的疾病或病症，并且，所述脂质颗粒可用于治疗或预防由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症，所述病毒依赖细胞胆固醇进行复制。

Description

降低胆固醇水平的脂质体
相关申请
本申请要求2009年3月27日提交的美国临时申请第61/202,699号的优先权，在此将该美国临时申请的全部内容并入本文。
技术领域
本申请总体上涉及脂质颗粒(例如，脂质体)，所述脂质颗粒本身作为治疗剂是有用的或者所述脂质颗粒可用于递送药物和药物的递送方法，并且，具体而言，本申请涉及使用诸如脂质体之类的脂质颗粒递送药物的方法。
发明内容
本发明提供一种降低细胞胆固醇水平的方法，所述方法包括将含有诸如脂质体或胶束之类的脂质颗粒的组合物给药于有此需要的受治者，所述脂质颗粒能够进入细胞。
附图说明
图1表示a)甲羟戊酸途径和类异戊二烯的合成以及b)不同治疗剂对不同细胞靶标的影响。PP＝焦磷酸盐，FTI＝法呢基转移酶抑制剂，GGTI＝香叶基香叶基转移酶抑制剂，IPP＝异戊基焦磷酸盐。
图2是下列脂质的示意图，A)22:6PE；B)22:6PC；C)PI；D)PS；E)DOPE；F)CHEMS。
图3表示使用了抗肌动蛋白和抗HMGCS抗体的22:6ER脂质体处理的、JC-1-感染的Huh 7.5细胞(MOI＝0.5)的蛋白质印迹分析结果。
图4表示22:6PE:22:6PC:PI:PS处理的、JC1感染的Huh7.5细胞(MOI＝0.5)中游离胆固醇和总胆固醇的定量结果。
图5表示用22:6脂质体处理的PHA刺激的PBMC的定量结果。
图6(A)至图6(E)表示与用22:6ER脂质体处理了16天的JC-1-感染的Huh 7.5细胞(MOI＝0.02)有关的数据。(A)整个处理过程中Huh 7.5细胞中JC-1 HCVcc感染水平。(B)JC-1 HCVcc分泌。(C)分泌的JC-1 HCVcc颗粒的感染性。(D)细胞中游离的胆固醇水平。(E)细胞中酯化的胆固醇。数据代表来自两个独立的实验的一式三份样品的平均值。
图7表示22:6 ER脂质体处理的JC-1 HCVcc、PEG化的22:6 ER脂质体处理的JC-1 HCVcc以及未处理的JC-1 HCVcc的感染性数据，所述JC-1 HCVcc用外源性胆固醇处理(胆固醇的最终浓度为15μg/ml和150μg/ml)。
图8表示在用JC-1 HCVcc感染(MOI＝0.5)之前用22:6 ER脂质体处理了4天的未感染的Huh 7.5细胞的定量结果。
图9(A)显示用22:6 ER脂质体处理4天的过程中HIV-1的三种基因不同的初级分离物(LAI，93UG067和93RW024)的平均分泌。图9(B)显示22:6 ER脂质体处理的PBMC分泌的HIV-1的感染性。
图10显示未感染的Huh 7.5细胞的实验结果，所述细胞在存在用于上调和下调脂蛋白受体表达的药物(分别为SQ和25-HC)的条件下在无血清完全DMEM中培养24小时。
图11显示在Huh 7.5细胞感染1小时的过程中，将22:6 puER脂质体加至HCVcc病毒原液中的实验结果。
具体实施方式
术语的定义
除非另有说明，单数形式(“a”或“an”)是指一个(一种)或一个以上(一种以上)。
如本文使用的术语“病毒感染”描述了疾病状态，在所述疾病状态中，病毒入侵健康细胞，使用所述细胞的再生机制以繁殖或复制并且最终溶解所述细胞，导致细胞死亡，释放病毒颗粒并且通过新产生的子代病毒感染其他细胞。一些病毒的潜在性感染也可能是由病毒感染引起的。
如本文使用的术语“治疗或预防病毒感染”是指抑制特定病毒的复制，抑制病毒传播或防止病毒定居于其宿主中，以及改善或缓解由病毒感染引起的疾病的症状。如果病毒载荷降低，死亡率和/或发病率降低，那么认为所述治疗是治疗性的。
术语“治疗剂”是指药剂，例如，分子或化合物，所述药剂可有助于治疗生理病症，例如病毒感染或由此引起的疾病。
术语“脂质体”可被定义为含有脂质的双层结构的颗粒，所述脂质体通常是球形双层结构。术语“脂质体”包括单层脂质体和多层脂质体。本文所讨论的脂质体可包括由下列缩写所表示的一种或一种以上脂质。
CHEMS代表琥珀酸胆固醇单酯脂质。
DOPE代表二油酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。
DOPC代表二油酰基磷脂酰基胆碱脂质。
PE代表磷脂酰基乙醇胺脂质或其衍生物。
PEG-PE代表与聚乙二醇(PEG)结合的PE脂质。PEG-PE的一个实例可以是聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。PEG的PEG组分的分子量可不同。
Rh-PE代表丽丝胺若丹明B-磷脂酰基乙醇胺脂质。
MCC-PE代表1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺]脂质。
PI代表磷脂酰肌醇脂质。
PS代表磷脂酰丝氨酸脂质。
术语“细胞内递送”是指将包封的物质从脂质体递送进入任何细胞内腔室。
IC50或IC90(抑制浓度50或90)是指用于达到使病毒感染分别降低50％或90％的治疗剂的浓度。
PBMC代表外周血单核细胞。
sCD4代表可溶的CD4分子。“可溶的CD4”或“sCD4”或“D1D2”是指CD4分子或其片段，如本领域普通技术人员所理解的，所述CD4分子或其片段在水溶液中并且可通过改变HIV Env的构型来模拟天然的膜锚定的CD4的活性。可溶的CD4的一个实例是在如Salzwedel等人，J.Virol.74：326 333，2000中描述的双结构域可溶CD4(sCD4或D1D2)。
MAb代表单克隆抗体。
DNJ代表脱氧野尻霉素。
NB-DNJ代表N-丁基脱氧野尻霉素。
NN-DNJ代表N-壬基脱氧野尻霉素。
BVDV代表牛病毒性腹泻病毒。
HBV代表乙型肝炎病毒。
HCV代表丙型肝炎病毒。
HIV代表人免疫缺陷病毒。
Ncp代表非细胞病变。
Cp代表细胞病变。
ER代表内质网。
CHO代表中国仓鼠卵巢细胞。
MDBK代表马达氏牛肾细胞。
PCR代表聚合酶链反应。
FOS代表游离寡糖。
HPLC代表高效液相色谱。
PHA代表植物红血球凝集素。
FBS代表胎牛血清。
TCID50代表50％组织培养物感染剂量。
ELISA代表酶联免疫吸附分析。
IgG代表免疫球蛋白。
DAPI代表4’，6-二脒基-2-苯基吲哚。
PBS代表磷酸盐缓冲盐水。
LD代表脂质小滴。
NS代表非结构性。
“MOI”是指感染复数。
DMEM是指Dulbecco改良的Eagle培养基。
相关文件
本申请公开的内容通过引用合并了美国专利公开第20080138351号、第20090252785号和第20030124160号的全部内容。
巨噬细胞和胆固醇代谢：
巨噬细胞像其他细胞(除了肝细胞)一样不能将胆固醇降解至任何可检测的程度。因此，细胞胆固醇含量基本上会是胆固醇摄入和胆固醇流出之间的平衡。将胆固醇递送至细胞的两个主要机制可以是受体介导的摄取血浆低密度脂蛋白(LDL)和细胞内胆固醇的生物合成。递送胆固醇的这两个主要途径中的每一个可完全满足在缺乏胆固醇的情况下细胞的需要，并且可被高度调节(Brown and Goldstein 1999，完全引用内容请参见下面参考文献部分的内容)。然而，在一些病理生理学条件下，例如炎症、高血浆LDL浓度和氧化应激可导致形成修饰的(大多数是氧化的)LDL(Steiberg，Parthasarathy等人，1989)。修饰的LDL可与在若干细胞类型(包括巨噬细胞)上表达的清道夫受体(SR)相互作用。修饰的脂蛋白的摄取不以响应细胞胆固醇含量的方式被调节并且可导致过量的胆固醇不受控制地递送至巨噬细胞(Hajjarand Haberland 1997；Dhaliwal and Steinbrecher 2000)。如果不通过增加胆固醇的流出来补偿，那么这可导致胆固醇积累并且形成富脂泡沫细胞，随后在动脉壁形成脂肪纹，这是动脉粥样硬化斑块形成中最早期的步骤之一。富胆固醇巨噬细胞也可以是动脉粥样硬化发病机制的其他要素的可能的起因，所述其他要素例如，炎症长期存在，平滑肌细胞的表型修饰以及细胞外基质蛋白的过量产生(Lusis 2000)。过量胆固醇可通过下调胆固醇生物合成以及LDL受体的表达来补偿。然而，细胞通过降低LDL摄取和胆固醇生物合成来补偿由修饰的LDL递送的严重过量的胆固醇的能力可受到限制。补偿过量的游离胆固醇的两种其他机制可以是合成胆固醇酯和胆固醇流出。虽然合成胆固醇酯可提供暂时的缓解，但是胆固醇酯的连续产生可导致细胞内脂质小滴的过量积累。巨噬细胞过量负载胆固醇可导致所述巨噬细胞凋亡和坏死，这促使晚期动脉粥样硬化斑块的核心坏死和钙化(Tabas 2002；Tabas 2002)。
细胞中胆固醇生物合成的甲羟戊酸途径：
甲羟戊酸-类异戊二烯途径的第一步可包括通过HMG-CoA合成酶(HMGCS)的作用从乙酰基-CoA通过乙酰乙酰基CoA合成3-羟基-3-甲基戊二酰基(HMG)-CoA。HMG-CoA还原酶(HMGCR)本质上是最高度调节的酶之一，HMG-CoA还原酶(HMGCR)可催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸(Goldsteinand Brown 1990)。已广泛研究了通过他汀类药物和双膦酸盐对甲羟戊酸途径和下游类异戊二烯生物合成途径进行合理的治疗剂控制并且已发现上述合理的治疗剂控制在多种疾病中是令人关注的且是革命性的选择(Buhaescu andIzzedine 2007)。图1表示甲羟戊酸途径和类异戊二烯生物合成。也表示了一些关键治疗剂对其不同的细胞靶标的作用。
胆固醇和病毒复制：
许多病毒可依赖胆固醇进行病毒复制。这些病毒包括但不限于：属于疱疹病毒科家族的病毒，例如，单纯疱疹病毒(参见，例如，Itzhaki and Wozniak2006)和艾伯斯坦-巴尔病毒(参见，例如，Katzman and Longnecker 2003)，所述单纯疱疹病毒可以是HSV1病毒或HSV2病毒；属于正黏液病毒科家族的病毒，例如流感病毒(参见，例如，Sun and Whittaker 2003)，所述流感病毒可以是流感病毒A、流感病毒B或流感病毒C；逆转录酶病毒，例如，鼠白血病病毒(参见，例如，Beer，Pedersen等人，2005)和人类免疫缺陷病毒(HIV)(参见，例如，
Figure BPA00001463702200061
del Real等人，2000；Campbell，Crowe等人，2001)(HIV1或HIV2病毒)；属于痘病毒科家族的病毒，例如，牛痘病毒(参见，例如，Chung，Huang等人，2005)；多瘤病毒(参见，例如，Kaur，Gopalakrishna等人，2004)；属于披膜病毒科家族的病毒，例如西门利克(Semiliki)森林病毒(参见，例如，Chatterjee，Eng等人，2002)；属于丝状病毒科家族的病毒，例如，埃博拉病毒(参见，例如，Empig and Goldsmith 2002)和马尔堡病毒(参见，例如，Bavari，Bosio等人，2002)；属于黄病毒科家族的病毒，包括属于黄病毒属的病毒(例如，登革病毒(参见，例如，Reyes-del Valle，Chavez-Salinas等人，2005))和属于丙型肝炎病毒属的病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)(参见，例如，Aizaki，Morikawa等人，2008))；属于副粘病毒科家族的病毒，例如，麻疹病毒(参见，例如，Manie，Debreyne等人，2000)；以及属于肝脱氧核糖核酸病毒科家族的病毒，例如，乙型肝炎病毒(HBV)(参见，例如，Bremer，Bung等人，2009)。不是所有这些病毒可感染巨噬细胞，这说明胆固醇需求不限于特定细胞类型的感染。尽管普遍认为胆固醇可以是包装病毒的膜的重要成分，但是令人惊讶的是，几乎不知道为什么胆固醇参与病毒复制以及胆固醇如何参与病毒复制。对胆固醇在病毒复制中的作用的大多数认识可限于质膜中的脂筏、富含神经鞘脂的微结构域和富含胆固醇的微结构域的作用。若干包装的病毒可使用类筏结构域作为病毒组装的平台，例如，HIV(Campbell，Crowe等人，2001)，埃博拉病毒和马尔堡病毒(Bavari，Bosio等人，2002)，麻疹病毒(Vincent，Gerlier等人，2000)以及流感病毒(Scheiffele，Rietveld等人，1999；Leser and Lamb 2005)。基于发现了红血球凝集素在脂筏中聚集，脂筏也可用作病毒感染过程中的进入点，如流感病毒所表现的(Takeda，Leser等人，2003)。
胆固醇耗竭对HIV的作用：
胆固醇耗竭对HIV复制的作用也可以是间接的，由响应细胞胆固醇含量变化和/或胆固醇合成速度变化的细胞代谢的多种变化引起。例如，通过他汀类药物抑制胆固醇生物合成可降低HMG-CoA还原酶的所有上游中间体的固定浓度，包括那些蛋白质异戊二烯化作用中所涉及的中间体(Buhaescu andIzzedine 2007)。小G蛋白的异戊二烯化作用的降低可导致抑制Rho-鸟苷三磷酸酶(GTPase)和Rho-A活化，这使得病毒进入减少(del Real，Jimenez-Baranda等人，2004)。此外，他汀类药物可具有不依赖于其对胆固醇生物合成的作用的多重有益作用，所述多重有益作用可降低HIV感染。这些作用可包括由他汀类药物抑制粘附分子表达的能力(Jain and Ridker 2005)或抑制诸如ICAM-1和LFA-1之类的受体-配体对在内皮细胞和白细胞上的相互作用(Nishibori，K.Takahashi等人，2003)的能力而产生的抗炎性质。通过他汀类药物抑制ICAM-1和LFA-1的相互作用可减少HIV粘附至细胞(Giguere and Tremblay 2004)。许多研究已调查了胆固醇在HIV生命周期中的作用。在脂筏处出现HIV-1从宿主细胞中出芽，这导致较高的病毒包膜的胆固醇与磷脂的摩尔比例(＞1.0)(Aloia，Tian等人，1993；Nguyen and Hildreth，2000)。与筏的这种亲和性可由Gag前体确定，所述亲和性尤其可与这些膜的结构域相关(Ono and Freed 2001；Ding，Derdowski等人，2003；Holm，Weclewicz等人2003)。脂筏结合可由Gag的N-末端介导并且可通过Gag-Gag相互作用结构域显著增强。细胞胆固醇的耗竭和筏数量的减少可显著地并且特异性地降低HIV-1颗粒的产量(Ono andFreed 2001)。除了上述降低胆固醇的药物对HIV进入的间接作用之外，一些研究还提出脂筏作为HIV进入点的作用。该模型依赖于CD4、HIV细胞受体以及趋化因子受体在HIV进入位点的共帽现象(Alfano，Schmidtmayerova等人，1999)，所述模型也可依赖于胆固醇(Nguyen，Giri等人，2005)。Viard和其他人的研究(Viard，Parolini等人，2002)说明胆固醇耗竭的细胞不能形成病毒-细胞融合必需的CD4和CXCR4(或CCR5)簇。Manes等人也报道了类似的观察结果(
Figure BPA00001463702200081
del Real等人，2000)，Manes等人提出了对gp-120诱导的筏的横向重组作用，该作用使CD4-gp120复合物与筏相关趋化因子受体集中在一起。然而，后来的报道显示CD4和趋化因子受体与筏的结合可能不是HIV感染所必需的(Percherancier，Lagane等人，2003；Popik and Alce 2004)。对这些发现结果的一般解释可能是许多研究使用过表达HIV受体的细胞来进行。这些细胞通常可具有与原代细胞不同的行为，如先前对从趋化因子受体发出的信号所证明的，这些细胞可以是HIV进入原代细胞所必需的(Alfano，Schmidtmayerova等人1999)。所有这些文章在以下方面意见一致：HIV进入依赖于靶细胞膜中的胆固醇，因为胆固醇耗竭抑制了由筏相关CD4以及筏排除CD4介导的HIV进入(Popik and Alce 2004)。
胆固醇在HIV病毒粒子的感染性方面的重要性通过实验来证明，在实验中，用螯合胆固醇的药物(例如，MβCD)处理HIV颗粒使得病毒不能进入细胞(Campbell，Crowe等人2002；Guyader，Kiyokawa等人2002)。胆固醇耗竭的HIV-1病毒粒子可显示出病毒粒子脂质双层的瓦解(Campbell，Crowe等人2002)，还可显示出正常水平的gp120Env(Guyader，Kiyokawa等人2002)。一个研究表明MβCD可渗透病毒膜，导致成熟的Gag蛋白(衣壳基质和p6)损失而不损失Env糖蛋白(Graham，Chertova等人2003)。电子显微镜揭示了胆固醇耗竭的病毒粒子的病毒膜内的孔以及病毒核心结构的扰动(Graham，Chertova等人2003)。
HIV和动脉粥样硬化：
HIV感染可持续地与形成动脉粥样硬化的风险增加有关(Hsue，Lo等人2004；van Wijk，de Koning等人2006)并且与冠状动脉疾病(CAD)的风险增加至少三倍有关(Hsue and Waters 2005)。这种相关性先前仅归因于抗逆转录病毒疗法的不良作用。虽然胆固醇代谢产生的许多变化(例如LDL提高(El-Sadr，Mulli等人2005)以及通过CD36表达诱导胆固醇摄入增加(Allred，Smart等人2006))可能是由抗逆转录病毒疗法引起的(Carpentier，Patterson等人2005)，但是所述疗法和HIV感染本身对胆固醇代谢变化的相对贡献还有待确定。初期研究可说明HIV感染本身可对CAD风险的增加起关键作用。HIV可感染巨噬细胞并且减少这些细胞中的逆向胆固醇输送。减少胆固醇从巨噬细胞中流出可导致细胞内胆固醇积累(Feng and Tabas 2002)并且在动物模型(Aiello，Brees等人2002)和人体内(Oram 2000)形成动脉粥样硬化。当与血脂异常相关时，该过程可以是特别快速的。这可说明当与抗逆转录病毒疗法引起的血脂异常相关时，HIV感染巨噬细胞可导致胆固醇在巨噬细胞内积累并且快速形成动脉粥样硬化。
细胞胆固醇和HCV：
HCV感染主要限于肝细胞(Chisari 2005)，肝细胞可能在哺乳动物胆固醇体内平衡方面起到重要作用。已表明CD81(Soldaini，Wack等人2003；Cherukuri，Shoham等人2004)和SR-BI(Rhainds，Bourgeois等人2004)定位于富含胆固醇的质膜微结构域(或脂筏)，这两个细胞受体是HCV进入细胞所必需的。SR-BI可与称为小凹(caveolae)的富含胆固醇的质膜微结构域结合(Babitt，Trigatti等人，1997；Graf，Connell等人，1999)。已表明CD81与胆固醇相互作用(Charrin，Manié等人2003)，该作用为物理作用。虽然目前还不知道HCV感染对细胞胆固醇的依赖，但是HCVpp与脂质体的融合可通过目标膜中胆固醇的存在来提高(Lavillette，Bartosch et al.2006)。这些数据可有力地说明质膜胆固醇可以是HCV进入所必需的。已表明HCV感染可依赖于CD81和SR-BI之间的协作相互作用以及细胞胆固醇含量可对HCV进入产生非常大的影响，可能通过调节细胞表面表达和CD81定位来影响(Kapadia，Barthet al.2007)。
目前的研究已表明胆固醇和神经鞘脂在HCV感染和病毒粒子成熟方面的重要作用。具体而言，成熟的HCV颗粒可富含胆固醇(Aizaki，Morikawa等人2008)。HCV耗竭或病毒粒子相关SM的水解导致感染性损失(Aizaki，Morikawa等人2008)。而且，加入外源性胆固醇可恢复感染性。此外，部分结构蛋白质可位于细胞内脂筏样膜结构(Aizaki，Lee等人2004)。
公开的内容
本发明的发明人发现诸如脂质体之类的脂质颗粒可通过下调胆固醇的生物合成途径中所涉及的第一批酶中的一个(HMGCS)来抑制胆固醇的生物合成，所述脂质颗粒能够进入细胞和/或细胞内递送包封在该颗粒内部的物质。
在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包含至少一种PE脂质和/或其衍生物。PE脂质衍生物的例子包括DOPE和结合的PE脂质。所述结合的PE脂质可包括与诸如聚乙二醇之类的亲水性聚合物结合的PE脂质和与诸如荧光标记物之类的标记物结合的PE脂质。所述PE脂质可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包括一种或一种以上PI脂质、PS脂质、PC脂质和CHEMS脂质，其中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包含一种或一种以上与诸如聚乙二醇之类的亲水性聚合物结合的脂质。亲水性聚合物的分子量可不同。结合的亲水性聚合物的使用可增加脂质颗粒的体内稳定性和循环时间。
在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有PE脂质和/或其衍生物以及CHEMS脂质的脂质颗粒，例如美国专利公开第20080138351号中公开的pH敏感脂质体。例如，这样的脂质颗粒可以是摩尔比为6∶4或6∶3的DOPE-CHEMS脂质体或摩尔比为6∶3∶0.1的DOPE∶CHEMS∶PEG-PE。
在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有PE脂质和/或其衍生物以及PI和/或PS脂质的脂质颗粒。这些脂质颗粒的例子包括2009年3月25日提交的美国专利申请第12/410,750号中公开的靶定ER的脂质体。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可以是包括PE脂质、PI脂质、PS脂质和PC脂质的脂质颗粒，PE脂质、PI脂质、PS脂质和PC脂质中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是多不饱和脂质颗粒，即，包括至少一种多不饱和脂质的脂质颗粒。本文使用的术语“多不饱和脂质”是指疏水尾端中含有一个以上不饱和化学键的脂质，所述不饱和化学键例如双键或三键。在一些实施方式中，所述多不饱和脂质在其疏水尾端中可具有2个至8个或3个至7个或4个至6个双键。多不饱和脂质颗粒在美国专利公开第20090252785号中公开。多不饱和脂质的例子在美国专利公开第20090252785号的图2A至图2B以及图22A至图22D中显示。
靶定部分
在一些实施方式中，含有所述脂质颗粒的组合物可包含至少一种靶定部分，所述靶定部分可与脂质颗粒结合或插入所述颗粒的脂质层或脂质双层。在一些实施方式中，所述靶定部分可以是配体或抗体，所述配体可以是病毒包膜蛋白的配体，所述抗体可以是抗病毒包膜蛋白的抗体。这样的部分可用于将所述颗粒靶定至受病毒感染的细胞。这样的靶定部分也可用于实现抗与病毒相关或由病毒引起的病毒感染的消除性免疫。在一些实施方式中，所述靶定部分可包含gp120/gp41靶定部分。在这种情况下，含有所述脂质颗粒的组合物可优选地用于治疗和/或预防HIV-1感染。所述gp120/gp41靶定部分可包含sCD4分子或单克隆抗体，例如IgG 2F5或IgG b12抗体。在一些实施方式中，所述靶定部分可包含E1或E2靶定部分，例如来自HCV的E1或E2蛋白。在这种情况下，含有所述脂质颗粒的组合物可优选地用于治疗和/或预防HCV感染。在一些情况下，靶定部分也可以是可靶定E1和/或E2蛋白的分子(例如这些蛋白质的特异性抗体)以及细胞受体的可溶性部分(例如可溶性CD81或SR-BI分子)。
活性剂
在一些实施方式中，诸如治疗剂或显像剂之类的至少一种药剂可被包封在所述脂质颗粒的内部。这样的药剂可以是例如水溶性分子、肽或氨基酸。
在一些实施方式中，包封在所述脂质颗粒内部的药剂可以是α-葡糖苷酶抑制剂。在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是ER α-葡糖苷酶抑制剂，所述ER α-葡糖苷酶抑制剂可以是I型ER α-葡糖苷酶抑制剂或II型ER α-葡糖苷酶抑制剂。一般来说，依赖于与钙联结蛋白和/或钙网织蛋白的相互作用进行病毒的包膜糖蛋白的正确折叠的任何病毒可被ER α-葡糖苷酶抑制剂靶定。
所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是抑制宿主α-葡糖苷酶的酶活性的药剂，与不存在所述药剂的条件下的α-葡糖苷酶的酶活性相比，所述α-葡糖苷酶抑制剂抑制至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高的酶活性。术语“α-葡糖苷酶抑制剂”包含天然生成的抑制宿主α-葡糖苷酶活性的药剂和合成的抑制宿主α-葡糖苷酶活性的药剂。
合适的α-葡糖苷酶抑制剂可包括但不限于：脱氧野尻霉素和N-取代脱氧野尻霉素，例如式I的化合物及其药学上可接受的盐：
Figure BPA00001463702200121
其中，R1选自：取代或未取代的烷基，所述烷基可以是支链或直链烷基；取代或未取代的环烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的氧杂烷基；取代或未取代的芳基烷基，环烷基烷基，并且，其中，W、X、Y、Z分别独立地选自氢、烷酰基、芳酰基和卤代烷酰基。
在一些实施方式中，R1可选自：C1-C20烷基或C3-C20烷基。
在一些实施方式中，R1可选自：乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、异戊基、n-己基、庚基、n-辛基、n-壬基和n-癸基。在一些实施方式中，R1可以是丁基或壬基。
在一些实施方式中，R1可以是烷氧基(oxalkyl)，R1可以是C1-C20烷基或C3-C12烷基，R1还可包括1至5个或1至3个或1至2个氧原子。烷氧基的例子包括-(CH2)2O(CH2)5CH3、-(CH2)2O(CH2)6CH3、-(CH2)6OCH2CH3和-(CH2)2OCH2CH2CH3。
在一些实施方式中，R1可以是芳基烷基。芳基烷基的例子包括C1-C12-Ph基团，例如，C3-Ph、C4-Ph、C5-Ph、C6-Ph和C7-Ph。
在一些实施方式中，式I的化合物可选自但不限于：N-(n-己基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-庚基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-壬基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-十一烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-壬基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-十一烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-十二烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(2-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(4-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(5-甲基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-丙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-丁基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(7-甲基辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(8-甲基壬基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(9-甲基癸基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(6-环己基己基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(4-环己基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(2-环己基乙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-环己基甲基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-苯基甲基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(6-苯基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(n-壬基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-癸基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-十一烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(n-十二烷基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(2-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(4-乙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(5-甲基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(3-丙基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(1-丁基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(7-甲基辛基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(8-甲基壬基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(9-甲基癸基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(6-环己基己基-)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(4-环己基丁基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(2-环己基乙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(1-环己基甲基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(1-苯基甲基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(3-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；N-(6-苯基己基)-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇四丁酸酯；其药学上可接受的盐；及其任何两个或两个以上的混合物。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症在下列专利文献中公开，美国专利第4,849,430号、第4,876,268号、第5,411,970号、第5,472,969号、第5,643,888号、第6,225,325号、第6,465,487号、第6,465,488号、第6,515,028号、第6,689,759号、第6,809,083号、第6,583,158号、第6589,964号、第6,599,919号、第6,916,829号、第7,141,582号、2010年2月22日提交的美国专利申请第12/656,993号、2010年2月22日提交的美国专利申请第12/656,992号、2010年2月22日提交的美国临时专利申请第61/282,507号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第61/272,253号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第61/272,252号、2009年6月12日提交的美国临时专利申请第61/186,614号、2010年2月22日提交的美国临时专利申请第61/282,508号、2009年9月4日提交的美国临时专利申请第61/272,254号。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症包括但不限于：HIV感染、包括丙型肝炎感染和乙型肝炎感染在内的肝炎感染、包括泰-萨氏病、戈谢病、克拉伯病和法布里病在内的溶酶体脂质储存疾病以及囊性纤维化。N-取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症还包括由登革病毒引起的或与登革病毒有关的病毒感染，由属于砂粒病毒科家族的病毒(例如皮钦德病毒或胡宁病毒)引起的或与属于砂粒病毒科家族的病毒(例如皮钦德病毒或胡宁病毒)有关的病毒感染，由属于痘病毒科家族的病毒(例如牛痘病毒)引起的或与属于痘病毒科家族的病毒(例如牛痘病毒)有关的病毒感染，由属于丝状病毒科家族的病毒(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)引起的或与属于丝状病毒科家族的病毒(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)有关的病毒感染，由属于本扬病毒科家族的病毒(例如裂谷热病毒)引起的或与属于本扬病毒科家族的病毒(例如裂谷热病毒)有关的病毒感染，由属于披膜病毒科家族的病毒(例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒)引起的或与属于披膜病毒科家族的病毒(例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒)有关的病毒感染，由属于正黏液病毒科家族的病毒(例如A型流感病毒)引起的或与属于正黏液病毒科家族的病毒(例如A型流感病毒)有关的病毒感染，所述A型流感病毒包括H1N1和H3N2亚型。
在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是N-氧杂烷基化的脱氧野尻霉素或N-烷氧基脱氧野尻霉素，例如，美国专利第4,639,436号中描述的N-羟基乙基DNJ(米格列醇(Miglitol)或Glyset
Figure BPA00001463702200151
)。
在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是栗精胺和/或栗精胺衍生物，例如美国专利申请第2006/0194835号中公开的式(I)的化合物及其药学上可接受的盐，包括6-O-丁酰基栗精胺(西戈斯韦)和PCT公开WO01054692中公开的式II的化合物及其药学上可接受的盐。
栗精胺及其衍生物对其有效的疾病和病症在下列专利文献中公开，美国专利第4,792,558号、第4,837,237号、第4,925,796号、第4,952,585号、第5,004,746号、第5,214,050号、第5,264,356号、第5,385,911号、第5,643,888号、第5,691,346号、第5,750,648号、第5,837,709号、第5,908,867号、第6,136,820号、第6,583,158号、第6,589,964号、第6,656,912号以及美国专利公开第20020006909号、第20020188011号、第20060093577号、第20060194835号、第20080131398号。栗精胺及其衍生物对其有效的疾病和病症包括但不限于：包括HIV感染在内的逆转录酶病毒感染；脑型疟疾；包括乙型肝炎感染和丙型肝炎感染在内的肝炎感染；糖尿病以及溶酶体储存疾病。
在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是阿卡波糖(O-4，6-双脱氧-4-[[(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟基甲基)-2-环己-1-基]氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-→-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-葡萄糖)或Precose
Figure BPA00001463702200152
阿卡波糖在美国专利第4,904,769号中公开。在一些实施方式中，所述α-葡糖苷酶抑制剂可以是阿卡波糖的高度纯化的形式(参见，例如，美国专利第4,904,769号)。
在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可以是离子通道抑制剂。在一些实施方式中，所述离子通道抑制剂可以是抑制HCVp7蛋白质活性的药剂。离子通道抑制剂及其识别方法在美国专利公开第2004/0110795中详细描述。合适的离子通道抑制剂包括式I的化合物及其药学上可接受的盐，包括N-(7-氧杂-壬基)-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-7-氧杂-壬基6-MeDGJ或UT231B)和N-10-氧杂十一烷基-6-MeDGJ。合适的离子通道抑制剂还包括但不限于：N-壬基脱氧野尻霉素、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素和N-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素。
在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可以是亚氨基糖。合适的亚氨基糖包括天然生成的亚氨基糖和合成的亚氨基糖。在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是脱氧野尻霉素或N-取代的脱氧野尻霉素的衍生物。合适的N-取代的脱氧野尻霉素的衍生物的例子包括但不限于本申请式II的化合物，美国专利第6,545,021号中的式I的化合物以及N-氧杂烷基化的脱氧野尻霉素，例如美国专利第4,639,436号中描述的N-羟基乙基DNJ(米格列醇或Glyset
Figure BPA00001463702200161
)。
在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是栗精胺或栗精胺的衍生物。合适的栗精胺衍生物包括但不限于：美国专利申请第2006/0194835号中公开的式(I)的化合物及其药学上可接受的盐以及PCT公开WO01054692中公开的式II的化合物及其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是脱氧半乳糖野尻霉素或其N-取代的衍生物，例如在PCT公开WO99/24401和WO01/10429中所公开的那些。合适的N-取代脱氧半乳糖野尻霉素衍生物的例子包括但不限于：N-烷基化的脱氧半乳糖野尻霉素(N-烷基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)(例如N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素)和N-氧杂-烷基化的脱氧半乳糖野尻霉素(N-氧杂-烷基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)(例如，N-7-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素)。
在一些实施方式中，所述亚氨基糖可以是N-取代的1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-取代的MeDGJ)，包括但不限于式II的化合物：
Figure BPA00001463702200162
其中，R选自：取代或未取代的烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的氧杂烷基。在一些实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至16个碳原子或4至12个碳原子或8至10个碳原子。在一些实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至4个氧原子，以及在其他实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至2个氧原子。在其他实施方式中，取代或未取代的烷基和/或取代或未取代的氧杂烷基包含1至16个碳原子和1至4个氧原子。因此，在一些实施方式中，R选自但不限于：-(CH2)6OCH3、-(CH2)6OCH2CH3、-(CH2)6O(CH2)2CH3、-(CH2)6O(CH2)3CH3、-(CH2)2O(CH2)5CH3、-(CH2)2O(CH2)6CH3和-(CH2)2O(CH2)7CH3。N-取代MeDGJ在例如PCT公开WO01/10429中公开。
在一些实施方式中，包封在脂质体内部的药剂可包括具有式III的含氮化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BPA00001463702200171
其中，R12是烷基，例如C1-C20或C1-C6或C7-C12或C8-C16并且还可含有1至5个或1至3个或1至2个氧，R12可以是氧取代的烷基衍生物。氧取代的烷基衍生物的例子包括3-氧杂壬基、3-氧杂癸基、7-氧杂壬基和7-氧杂癸基。
R2是氢，R3是羧基或C1-C4烷氧基羰基或R2和R3连在一起为
Figure BPA00001463702200172
或-(CXY)n-，其中，n为3或4，X分别独立地为氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C6酰氧基或芳酰氧基，以及，Y分别独立地为氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C6酰氧基、芳酰氧基或缺失(即，不存在)；
R4为氢或缺失(即，不存在)；并且
R5为氢、羟基、氨基、取代氨基、羧基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基、芳基、芳烷基、烷氧基、羟基烷基、酰氧基或芳酰氧基或者R3和R5连在一起形成苯基且R4缺失(即，不存在)。
在一些实施方式中，所述含氮化合物具有下列化学式：
Figure BPA00001463702200181
其中，R6-R10中的每一个独立地选自：氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C4酰氧基和芳酰氧基；并且R11是氢或C1-C6烷基。含氮化合物可以是N-烷基化的哌啶，N-氧杂-烷基化哌啶，N-烷基化吡咯烷，N-氧杂-烷基化吡咯烷，N-烷基化苯胺，N-氧杂-烷基化苯胺，N-烷基化吡啶，N-氧杂-烷基化吡啶，N-烷基化吡咯，N-氧杂-烷基化吡咯，N-烷基化氨基酸或N-氧杂-烷基化氨基酸。在一些实施方式中，N-烷基化哌啶，N-氧杂-烷基化哌啶，N-烷基化吡咯烷或N-氧杂-烷基化吡咯烷化合物可以是亚氨基糖。例如，在一些实施方式中，所述含氮化合物可以是具有如下化学式的N-烷基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-DGJ)或N-氧杂-烷基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-DGJ)；
或者是具有如下化学式的N-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-MeDGJ)或N-氧杂-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-MeDGJ)。
Figure BPA00001463702200192
除非明确指明碳原子的数目，本文所使用的基团具有如下特征。烷基具有1至20个碳原子并且为直链或支链的，取代或未取代的。烷氧基具有1至16个碳原子并且为直链或支链的，取代或未取代的。烷氧基羰基为具有2至16个碳原子的酯基。烯氧基具有2至16个碳原子，1至6个双键并且为直链或支链的，取代或未取代的。炔氧基具有2至16个碳原子，1至3个三键并且为直链或支链的，取代或未取代的。芳基具有6至14个碳原子(例如，苯基)并且为取代或未取代的。芳烷氧基(例如，苄氧基)和芳酰氧基(例如，苯甲酰氧基)具有7至15个碳原子并且为取代或未取代的。
氨基可以是一级氨基，二级氨基，三级氨基或季胺基(即，取代的氨基)。氨基羰基为具有1至32个碳原子的酰胺基(例如，取代的氨基)。取代的基团可包括选自卤素、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基、C1-10酰基或C1-10烷氧基的取代基。
N-烷基化的氨基酸可以是N-烷基化的天然生成的氨基酸，例如N-烷基化的α-氨基酸。天然生成的氨基酸是20种常见α-氨基酸(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Asp，Asn，Lys，Glu，Gln，Arg，His，Phe，Cys，Trp，Tyr，Met，和Pro)中的一种以及其他氨基酸，所述其他氨基酸是天然产物，例如，正亮氨酸，乙基甘氨酸，鸟氨酸，甲基丁烯基-甲基苏氨酸和苯基甘氨酸。氨基酸侧链(例如，R5)的例子包括H(甘氨酸)，甲基(丙氨酸)，-CH2C(O)NH2(天冬氨酸)，-CH2-SH(半胱氨酸)，以及-CH(OH)CH3(苏氨酸)。
N-烷基化的化合物可以通过氨基(或亚氨基)化合物的还原烷基化作用来制备。例如，氨基或亚氨基化合物可与还原剂(例如，氰基硼氢化钠)一同暴露于醛，从而对胺进行N-烷基化。类似地，N-氧杂-烷基化化合物可通过氨基(或亚氨基)化合物的还原烷基化作用来制备。例如，氨基或亚氨基化合物可与还原剂(例如，氰基硼氢化钠)一同暴露于氧杂-醛，从而对胺进行N-氧杂-烷基化。
所述含氮化合物可包括一种或一种以上保护基团。本领域技术人员熟知各种保护基团。一般来说，保护基团的种类并不是关键性的，只要保护基团对在化合物的其他位置上的任何后续反应的条件稳定并且可在合适的时间点除去，而不会不利地影响分子的其他部分。此外，保护基团可在实质性的合成转化完成之后被另一基团取代。明显地，如果化合物与本文公开的化合物的区别仅在于所公开的化合物的一个或一个以上保护基团已被不同的保护基团取代，那么化合物在本发明的范围内。在Greene，Protective Groups in OrganicChemistry，(1st Ed.，1981，Greene & Wuts，2nd Ed.，1991)中发现进一步的例子和条件。
所述含氮化合物可例如通过结晶或色谱法来纯化。所述化合物可使用立体特异性氨基或亚氨基化合物作为起始物质以立体特异性方式来合成。
在长链N-烷基化的化合物的制备中用作起始物质的氨基和亚氨基化合物是商售的(Sigma，圣路易斯，MO；剑桥研究生物化学品，诺维奇，柴郡，英国；多伦多研究化学品，安大略，加拿大)或可通过已知的合成方法制备。例如，所述化合物可以是N-烷基化的亚氨基糖化合物或其氧取代衍生物。例如，所述亚氨基糖可以是脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)，1-甲基-1-脱氧半乳糖野尻霉素(MeDGJ)，脱氧野尻霉素(DNJ)，altrostatin，2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)，或其衍生物，对映异构体或立体异构体。
在一些实施方式中，包封在脂质颗粒内部的药剂可以是式IV或式V的化合物：
Figure BPA00001463702200211
其中，R是：
Figure BPA00001463702200212
R’为：
Figure BPA00001463702200213
R1是取代或未取代的烷基；R2是取代或未取代的烷基；W1-4独立地选自：氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的卤代烷基，取代或未取代的烷酰基，取代或未取代的芳酰基，或者取代或未取代的卤代烷酰基；X1-5独立地选自：H，NO2，N3或NH2；Y缺失或为取代或未取代的C1-烷基(不同于羰基)，Z选自化学键或NH，条件是当Z为化学键时，Y缺失，当Z为NH时，Y为取代或未取代的C1-烷基(不同于羰基)；并且Z’为化学键或NH。
式IV和式V的化合物及其合成方法在例如美国专利公开US2007/0275998中公开。式IV和式V的化合物的非限定性的例子包括N-(N’-(4’叠氮-2’-硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NAP-DNJ)和N-(N’-(2，4-二硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NDP-DNJ)。
已描述了多种亚氨基糖化合物的合成方法。例如，已知DNJ衍生物的合成方法并且在美国专利第5,622,972号、第5,401,645号、第5,200,523号、第5,043,273号、第4,994,572号、第4,246,345号、第4,266,025号、第4,405,714号和第4,806,650号中描述了DNJ衍生物的合成方法。已知其他亚氨基糖衍生物的合成方法并且在美国专利第4,861,892号、第4,894,388号、第4,910,310号、第4,996,329号、第5,011,929号、第5,013,842号、第5,017,704号、第5,580,884号、第5,286,877号和第5,100,797号以及PCT公开WO 01/10429中描述了其他亚氨基糖衍生物的合成方法。2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)的光学异构体的合成在Fleet&Smith(Terahedron Lett.26：1469-1472，1985)中描述。
显像剂可以是标记的或荧光水性物质(例如，钙黄绿素)或者荧光标记的分子(例如siRNA，抗体)或者其他小分子抑制剂。标记的亲脂性物质也可加至掺入细胞膜中的脂质颗粒中，例如，用于使脂质体在细胞内显现的rh-PE脂质和其他具有用于显现作用或纯化作用的标签的类似脂质。这也可包括用荧光部分或用于显现作用和纯化作用的其他标签标记的亲脂性蛋白质或药物。
在一些实施方式中，包封的活性剂可以是逆转录酶病毒剂，所述逆转录酶病毒剂可以是例如，核苷逆转录酶(RT)抑制剂，非核苷RT抑制剂，蛋白酶抑制剂或其组合，所述核苷逆转录酶(RT)抑制剂例如，(-)-2’-脱氧-3’-巯基胞苷-5’-三膦酸盐(3TC)；(-)-顺式-5-氟代-1-[2-(羟基-甲基)-[1，3-氧杂四氢硫杂茂-5-基]胞嘧啶(FTC)；3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)和双脱氧-肌苷(ddI)；所述非核苷RT抑制剂例如N11-环丙基-4-甲基-5，11-二氢-6H-双吡啶并[3，2-b:2’3’-e]-[1，4]二氮杂卓-6-酮(Neviparine)、蛋白酶抑制剂或其组合。
插入的部分
在一些实施方式中，脂质颗粒可包括一个或一个以上插入所述脂质颗粒的脂质层或脂质双层中的部分。插入的部分的例子包括但不限于：跨膜蛋白，蛋白脂质结合物，标记的脂质，亲脂性化合物或其任何组合。在一些实施方式中，所述插入的部分可包括脂质-PEG结合物。这样的共轭物可增加脂质颗粒的体内稳定性和/或增加所述脂质颗粒的循环时间。在一些实施方式中，所述插入的部分可包括长烷基链亚氨基糖，例如，C7-C16烷基或氧杂烷基取代的N-脱氧野尻霉素(DNJ)或C7-C16烷基或氧杂烷基取代的脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)。长烷基链亚氨基糖的非限定性的例子包括N-壬基DNJ和N-壬基DGJ。在一些实施方式中，所述插入的部分可包括荧光体-脂质共轭物，所述荧光体-脂质共轭物可用于标记与脂质双层颗粒接触的细胞的ER膜。这种标记可有用于活细胞和/或被固定的细胞在真核细胞中成像。脂质颗粒的使用可导致将所述插入的部分递送进入细胞的ER膜。
应用
能够抑制胆固醇的脂质颗粒可直接用于治疗和/或预防由胆固醇水平增加引起的或与胆固醇水平增加有关的疾病或病症。这些疾病/病症的例子包括但不限于动脉粥样硬化和冠状动脉疾病。在一些实施方式中，能够抑制胆固醇的脂质颗粒可用于治疗或预防受免疫缺陷病毒感染的受治者中的由胆固醇水平增加引起的或与胆固醇水平增加有关的疾病或病症，所述受治者可以是感染了HIV的人类。在这样的受治者体内胆固醇水平的增加可以是由感染引起的。免疫缺陷感染可与细胞胆固醇累积有关，从而导致产生动脉粥样硬化和/或CAD，脂质颗粒可通过靶定分子靶定免疫缺陷病毒感染的细胞。在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包封一种或一种以上抗逆转录酶病毒剂。这些脂质颗粒可将抗逆转录酶病毒剂递送至免疫缺陷病毒感染的细胞并且同时降低细胞胆固醇水平，预防动脉粥样硬化和/或CAD。
能够抑制胆固醇的脂质颗粒可用于治疗和/或预防由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症，所述病毒依赖于胆固醇进行病毒复制。在一些情况下，所述疾病或病症可以是病毒感染。这些病毒的例子包括但不限于：单纯疱疹病毒，流感病毒，鼠白血病病毒，牛痘病毒，多瘤病毒，艾伯斯坦-巴尔病毒，西门利克森林病毒，埃博拉病毒，马尔堡病毒，登革病毒，麻疹病毒，HIV，丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。当所述脂质颗粒用于由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症时，所述脂质颗粒可包含一种或一种以上抗所述病毒的抗病毒剂。可选地，所述脂质颗粒可通过作为这些病毒(例如，HCV)的形态发生抑制剂起作用直接用作药物或前药。
给药
含有所述脂质颗粒的组合物可给药于受治者，目标是降低所述受治者体内的细胞胆固醇。在所述给药之前，胆固醇的起始水平可以是正常的或增加的。
在一些实施方式中，所述受治者可以是细胞。含有脂质颗粒的组合物可降低各种细胞类型中的细胞胆固醇水平，所述各种细胞类型包括但不限于：外周血单核细胞(PBMC)和人类肝细胞瘤细胞系，所述外周血单核细胞包括巨噬细胞，所述人类肝细胞瘤细胞系例如Huh 7.5细胞。
在一些情况下，所述细胞可以是受病毒感染的细胞，所述病毒可以是依赖胆固醇进行病毒复制的病毒。在这种情况下，所述脂质颗粒对胆固醇的抑制作用可导致抑制病毒复制，抑制病毒组装和分泌，在病毒包膜中生成具有降低的胆固醇水平的非感染性病毒颗粒和/或在用于病毒进入的细胞表面上错误定位细胞受体。在一些实施方式中，含有脂质颗粒的组合物可给药于温血动物，例如，哺乳动物或鸟类。在许多情况下，所述受治者可以是人类。在一些实施方式中，含有脂质颗粒的组合物可通过静脉注射给药。而在一些实施方式中，含有脂质颗粒的组合物可通过不同于静脉注射的肠胃外途径给药，所述途径例如，腹膜内，皮下，皮肤内，表皮内，肌肉内或透皮途径。而在一些实施方式中，含有脂质颗粒的组合物可通过粘膜表面给药，所述粘膜表面例如，眼部，鼻内，肺部，肠部，直肠或尿道表面。含有脂质的组合物(例如，脂质体组合物)的给药途径在例如A.S.Ulrich，Biophysical Aspects of UsingLiposomes as Delivery Vehicles，Bioscience Reports，Volume 22，Issue 2，Apr2002，129-150中公开。
在一些情况下，脂质颗粒的皮下注射可以是优选的，因为这样的给药可导致脂质颗粒在巨噬细胞中累积，从而防止形成泡沫细胞，并且因此预防早期动脉粥样硬化。本发明通过下列实施例进一步举例说明，但不限于下面这些实施例。
实施例
用脂质体处理的细胞的蛋白质组分析已表现出该处理下调了细胞胆固醇生物合成中所涉及的一个关键酶(3-羟基-3-甲基戊二酰基(HMG)-CoA合成酶)，所述脂质体是水溶性小分子进入靶细胞的细胞内腔室的有效载体。进一步的实验已表明这种下调可导致处理过的细胞内的胆固醇(游离的或酯化的胆固醇)水平降低。因为早期的动脉粥样硬化和冠状动脉疾病由泡沫细胞的形成开始，所述泡沫细胞是富胆固醇巨噬细胞，并且因为在例如皮下注射之后脂质体在巨噬细胞中累积，脂质体治疗可以是用于这些疾病的新的靶向治疗方法。
而且，已显示出许多病毒依赖于正常至增加的细胞胆固醇水平，因此，除了有效递送抗病毒药物至靶细胞之外，降低胆固醇水平的组合会是新的、更加有效的抗病毒疗法。
1.脂质体制备
1.1脂质体制备方法
制备新鲜的脂质体用于所描述的所有分析。将脂质的氯仿溶液置于玻璃管内并且在氮气流下蒸发溶剂。除非另有说明，在1x PBS缓冲液中通过涡旋震荡使脂质膜水合至最终脂质浓度为5mM。使用Mini-Extruder设备通过孔径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤压得到的多层囊泡11次。使用0.22μm过滤器单元过滤灭菌脂质体。图2A至图2F举例说明了在这些研究中使用的脂质：A.22:6PE；B.22:6PC；C.PI；D.PS；E.DOPE；F.CHEMS。
2.用多不饱和ER脂质体处理的细胞中的HMG CoA合成酶(HMGCS)蛋白质降低
用pH敏感脂质体(即，含有PE和CHEMS脂质但不含PI或PS脂质的脂质体)和ER脂质体(即，含有PE脂质和PI或PS脂质中的至少一种的脂质体)处理5天的细胞用于蛋白质组分析以确定细胞中所有可检测的蛋白质的增加或减少。由pH敏感脂质体处理和靶定ER的脂质体处理导致一种蛋白质降低，所述蛋白质是酶HMG-CoA合成酶(HMGCS)。HMGCS催化甲羟戊酸-类异戊二烯途径中的第一步，所述第一步是从乙酰基-CoA通过乙酰乙酰基CoA合成HMG-CoA。为了确定22:6多不饱和(pu)ER脂质体处理的Huh 7.5细胞在HMG-CoA合成酶中是否导致类似的降低，在全部细胞溶解以及蛋白质印迹分析之前用各种浓度的脂质体处理细胞4天，所述蛋白质印迹用于特异性地识别HMGCS。
2.1通过蛋白质印迹识别HMGCS和肌动蛋白的方法
在用puER脂质体(22:6PE:22:6PC:PI:PS，1.5:1.5:1:1)处理之后，培养基中的最终浓度为1μM至100μM的条件下，在1x PBS中清洗Huh 7.5细胞两次，重悬于1x PBS/1％Triton X-100至最终蛋白质浓度为1mg/ml。通过Bradford分析(Bio-Rad)，使用BSA标准来确定蛋白质浓度。通过在4％至12％bis-tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)中装载10μg/孔的蛋白质进行SDS-PAGE，并且根据生产商的推荐使用NuPAGE MES SDS缓冲液进行分离。根据生产商的操作规程，将蛋白质转移至硝化纤维素膜并且使用WesternBreeze
Figure BPA00001463702200261
抗-山羊AP化学发光试剂盒(Invitrogen)进行免疫印迹法，所述试剂盒具有1∶100稀释的一级山羊抗-人HMGCoA合成酶和抗-人肌动蛋白抗体(Santa Cruz)。
2.2用puER脂质体处理的HMGCS的下调
如主要由18:1脂质(18:1PE:18:1PC:PI:PS，1.5:1.7:1.5:0.3)构成的ER脂质体所示，用22:6ER脂质体处理也使HMGCoA-合成酶的量以剂量依赖的方式降低(图3)。
图3表示使用抗肌动蛋白和抗-HMGCS抗体的22:6ER脂质体处理的、JC-1感染的Huh 7.5细胞(MOI＝0.5)的蛋白质印迹分析结果。在各种浓度条件下，用22:6ER脂质体处理细胞4天，在第四天时，收获细胞并通过在1％TritonX-100/1x PBS中重悬来破坏细胞。分析细胞溶解物的蛋白质含量，并每孔加载30μg总蛋白质，接着通过SDS-PAGE进行分离。显示了来自单个实验的代表性的图像。独立地重复实验三次。
3.用puER脂质体处理细胞使细胞胆固醇水平降低：
因为脂质体处理已表现出降低细胞内HMGCS的水平，就抑制胆固醇的生物合成而言，进行分析以确定这些细胞中游离胆固醇和酯化胆固醇的水平，从而对这种抑制作用进行定量。定量22:6ER脂质体和22:6PEG-ER脂质体处理的Huh 7.5细胞中的总胆固醇水平和游离胆固醇水平。通过计算总胆固醇值和游离胆固醇值之间的差值来确定酯化胆固醇。
3.1定量细胞中总胆固醇和游离胆固醇的方法：
处理之后，在1x PBS中清洗Huh 7.5细胞或PBMC两次，并且重悬于1xPBS/1％Triton X-100至最终蛋白质浓度为1mg/ml。通过Bradford分析(Bio-Rad)，使用BSA标准确定蛋白质浓度。在相当于10μg总蛋白质的细胞溶解产物上进行胆固醇分析。根据生产商的操作规程，使用Amplex
Figure BPA00001463702200271
Red胆固醇分析试剂盒(Invitrogen)在存在或不存在胆固醇酯酶的条件下，分别定量总胆固醇水平和游离胆固醇水平。
3.2定量用puER脂质体和PEG化的puER脂质体处理之后的Huh 7.5细胞和PBMC中的总胆固醇水平和游离胆固醇水平
定量22:6ER脂质体和22:6PEG-ER脂质体处理的Huh 7.5细胞中的总胆固醇水平和游离胆固醇水平。酯化胆固醇水平通过计算总胆固醇值和游离胆固醇值之间的差值来确定。结果表明总胆固醇水平以剂量依赖的方式降低(图4)，并且PEG-ER脂质体处理与非-PEG化的组合物具有类似的作用，这说明PEG化作用并不影响ER脂质体对胆固醇生物合成的抑制作用。与未处理的对照相比，在50μM 22:6ER脂质体处理的样品中总胆固醇水平显著降低(56％，SD＝2.7％)，并且大多数这种降低可能是由于细胞内游离胆固醇水平(47％的未处理值，SD＝2.5％)相对于酯化胆固醇(75％的未处理值，SD＝1.1％)降低。
图4显示了来自22:6PE:22:6PC:PI:PS处理的、JC 1-感染的Huh 7.5细胞(MOI＝0.5)的游离胆固醇和总胆固醇的定量结果。在各种浓度条件下，用脂质体处理细胞4天，所述脂质体包括PEG化的22:6ER脂质体。培养之后，收获细胞并用1％Triton
Figure BPA00001463702200272
X-100/1x PBS破坏细胞，10μg各个样品分别用于在存在和不存在胆固醇酯酶的条件下的胆固醇分析以定量细胞中的总胆固醇和游离胆固醇。酯化胆固醇计算为两个值的差值。结果代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值(和SD)。数据表示为相对于未处理的对照(100％)，并且该值的显著差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
植物红血球凝集素(PHA)-刺激的PBMC用22:6ER脂质体培养，并且在培养4天之后定量游离胆固醇水平和酯化胆固醇水平。如图5所示，未处理的PBMC含有78％(SD＝5.9％)游离胆固醇和22％(SD＝3.8％)酯化胆固醇。用50μM 22:6ER脂质体处理导致细胞胆固醇全部降低28％(SD＝6.5％)。游离胆固醇水平显著降低33％(SD＝6.3％，P＜0.001)，但是相对于未处理的对照，在该浓度下酯化胆固醇并没有显著降低。PEG化的22:6ER脂质体也使游离胆固醇水平降低了29％(SD＝3.9，P＜0.001)，但对酯化胆固醇水平没有显著作用。
图5显示了用22:6ER脂质体处理PHA-刺激的PBMC持续4天的实验结果。收获细胞并且通过重悬于1％Triton
Figure BPA00001463702200281
X-100/1x PBS破坏细胞，10μg各个样品分别用于在存在和不存在胆固醇酯酶的条件下的胆固醇分析以定量细胞中的总胆固醇和游离胆固醇。酯化胆固醇计算为两个值的差值。数据代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值和SD。所有值表示为相对于未处理的对照(100％)的百分数，并且该值的显著差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
4.降低的细胞内胆固醇对HCV具有抗病毒作用：
HCV已表现出依赖于细胞胆固醇水平进行有效的病毒复制。此外，ER脂质体通过与病毒竞争细胞受体已表现出对HCV是抗病毒的。为了监测puER脂质体和PEG化的puER脂质体对HCV的组合抗病毒活性，在存在脂质体的条件下培养病毒16天(4轮4天处理)。抗病毒活性通过定量细胞中的病毒感染以及整个处理中病毒的分泌和分泌的病毒粒子的感染性来监测。还测量处理的细胞中的细胞胆固醇水平。
4.1 HCV细胞培养的方法以及对病毒感染和分泌进行定量的方法
JC-1 HCV细胞培养(HCVcc)：已知感染滴定度(病灶形成单位(ffu)/ml)的病毒原液用于感染所述的所有分析中的原初Huh 7.5细胞。对于脂质体处理分析而言，JC1-感染的Huh 7.5细胞以在完全DMEM/10％FBS中3x 105个细胞/孔的密度接种于6孔平板中并静置培养4天，所述完全DMEM/10％FBS含有或不含有总体积为2ml/孔的脂质体。培养之后，收获上清液用于HCV RNA定量。用1x PBS清洗细胞一次，在0.5％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)中分离细胞，计数并冷冻在-20℃，待进一步分析。对于多路分析而言，用台盼蓝进行细胞计数之后，将3x 105个细胞再次接种在6孔平板内用于所描述的另一轮处理。
通过RT-PCR定量HCV：根据生产商的操作规程，使用QIAGEN QIAamp
Figure BPA00001463702200291
病毒RNA纯化试剂盒从500μl上清液中提取病毒RNA，通过对提取的病毒RNA进行定量PCR来进行病毒分泌分析。首先使用Centricon
Figure BPA00001463702200292
浓缩器(切断10,000KDa MW，Millipore)将500μl上清液浓缩至140μl。通过下述步骤对分泌的病毒RNA进行定量：首先使用具有引物RC21(5’-CTCCCGGGGCACTCGCAAGC-3’)的逆转录酶反应(TaqMan
Figure BPA00001463702200293
ABI)将分离的RNA转化为cDNA，接着使用SyBr
Figure BPA00001463702200294
绿色混合物(QIAGEN)以及针对HCVcDNA的RC21和RC1引物(5’-ATGCCATGGCGTTAGTA-3’)进行实时PCR。确定相对于由HCV JC-1cDNA的连续稀释液构成的标准曲线的HCV转录水平。
4.2用于测量病毒感染性的HCV核心免疫荧光：
处理的JC-1感染的Huh 7.5细胞的上清液中分泌的HCV病毒粒子的感染性通过感染原初Huh 7.5细胞来测定。原初Huh 7.5细胞以5x 104个细胞/孔的密度接种在48孔平板上并静置以粘附过夜，接着用200μl样品上清液替换培养基。将上清液静置以感染原初Huh 7.5细胞1小时，接着用1x PBS清洗细胞两次，然后在500μl完全DMEM/10％FCS中培养两天。培养两天之后，用1x PBS清洗细胞两次，在甲醇/丙酮(1∶1，vol/vol)中固定10分钟，在1x PBS/0.1％Tween
Figure BPA00001463702200295
-20中清洗两次。然后在含有3μg/ml小鼠抗HCV核心抗体(亲和性生物试剂)的1x PBS/0.1％Tween
Figure BPA00001463702200296
-20中培养细胞1小时，在1x PBS/0.1％Tween
Figure BPA00001463702200297
-20中清洗两次，在1x PBS/0.1％Tween
Figure BPA00001463702200298
-20/1∶1000 FITC标记的抗小鼠二抗(Sigma)中培养，清洗两次以上，并用DAPI染色。
使用Nikon Eclipse TE2000-U显微镜拍摄荧光图像。感染的细胞的百分数通过计数的HCV感染的细胞总数(由抗-HCV抗体检测)除以分析中的细胞总数(由DAPI染色来检测)来计算。
4.3用puER脂质体和PEG化的puER脂质体长期处理HCVcc-感染的Huh 7.5细胞：
用ER脂质体处理JC-1HCVcc感染的Huh 7.5细胞持续16天的时间段(4轮处理)。每四天将细胞传代至含有处理物的新鲜培养基中，并且定量细胞中的病毒感染、HCVcc分泌以及分泌的颗粒的感染性。在MOI＝0.02的条件下感染细胞并且一旦细胞中的感染水平达到总细胞的30％至40％(通过核心蛋白质免疫荧光测定)就开始处理。图6a显示了22:6ER脂质体的不同处理的16天处理过程中细胞中的HCVcc感染水平。所有脂质体处理防止了Huh 7.5细胞中病毒感染的扩散并且导致在仅仅4天处理之后感染的细胞总数以剂量依赖的方式降低。在用50μM 22:6ER脂质体处理16天之后在培养基中没有观察到感染的细胞。在整个16天处理过程中的HCV分泌结果(图6b)说明了类似的趋势，其中，HCV分泌相对于未处理的样品以剂量依赖的方式降低。在一轮处理之后，浓度为50μM的22:6ER脂质体表现出使HCV分泌显著降低了27％(SD＝11.3％)；在用50μM的22:6PEG-ER脂质体处理中也观察到了类似的降低(23％，SD＝6.6％)。当通过RT-PCT定量时，与未处理的样品相比，50μM 22:6ER脂质体处理的细胞的第16天的上清液含有少于1％的HCV RNA。虽然本发明不受任何理论的限制，该结果可说明在该时间点感染可能还未清除(RNA水平显著高于背景水平)；然而，脂质体处理成功地使病毒分泌降低了两个数量级。在每个阶段测定分泌的病毒颗粒的感染性，并且结果在图6c中显示。ER脂质体对病毒感染性所起的作用最大，通过用50μM 22:6ER脂质体处理16天使所述病毒感染性降低至0(或低于任何检测限)。然而，在50μM 22:6ER脂质体仅仅一轮处理之后，HCV感染性降低了91％(SD＝2.2％)。甚至测试的最低浓度(1μM)的22:6ER脂质体也使感染性降低了52％(SD＝5.3％)，这说明ER脂质体是病毒感染性的有效抑制剂。
在整个处理过程中，还对处理的Huh 7.5细胞中的游离胆固醇水平和酯化胆固醇水平进行了定量(图6d和图6e)。有趣地是，虽然仅仅一轮处理之后游离胆固醇的水平降低，但是该水平在以后几轮处理中并没有显著降低。相反，在处理第4天至第12天观察到酯化胆固醇的水平以剂量依赖的方式逐渐降低，在处理的第4天至第12天的酯化胆固醇水平好像在整个处理中处于稳定水平。如在这些分析中所检测的，在未处理的细胞中游离胆固醇与酯化胆固醇的正常比例为约2∶1，并且虽然50μM 22:6ER脂质体处理4天使该比例降低至1.3∶1，但是，在处理的第12天，所有测试的样品中恢复了2∶1的比例。
图6A至图6E表示了用22:6ER脂质体处理JC-1感染的Huh 7.5细胞(MOI＝0.02)16天的实验结果。(A)整个处理中Huh 7.5细胞中JC-1 HCVcc感染水平。(B)JC-1 HCVcc分泌。(C)分泌的JC-1 HCVcc颗粒的感染性。(D)细胞中游离的胆固醇水平。(E)细胞中酯化的胆固醇水平。数据代表来自两个独立的实验的一式三份样品的平均值。先前已说明了病毒粒子相关胆固醇的高水平是病毒感染性必需的(Aizaki，Morikawa等人，2008)。因此，由ER脂质体处理引起病毒感染性降低可能是由分泌的颗粒的病毒膜中胆固醇降低引起的。为了测试这种可能性，用游离胆固醇培养50μM 22:6ER脂质体处理的、50μM 22:6PEG-ER脂质体处理的以及未处理的细胞中分泌的HCVcc，试图恢复病毒感染性。
4.4用游离胆固醇培养HCVcc的方法
如先前所描述的，通过RT-PCR对培养4天之后的未处理的和50μM脂质体处理的Huh 7.5细胞中分泌的HCVcc颗粒的RNA进行定量。通过在完全DMEM/10％FBS中稀释至最低浓度，将样品进行标准化。如先前所描述的(Aizaki，Morikawa等人，2008)，用游离胆固醇(Sigma)在37℃条件下培养HCVcc一小时，并且，将培养的HCVcc用于感染原初Huh 7.5细胞，用于上述HCV核心蛋白质免疫荧光感染性分析。
4.5用游离胆固醇培养puER脂质体和PEG化的puER脂质体处理的HCVcc之后的结果：
通过RT-PCR对50μM 22:6ER脂质体处理的、50μM 22:6PEG-ER脂质体处理的和未处理的细胞中分泌的HCVcc进行定量并且将定量结果标准化至2x104RNA拷贝数/ml。如先前所描述的(Aizaki，Morikawa等人，2008)，在37℃条件下，用最终浓度为15μg/ml或150μg/ml的胆固醇预培养标准化的病毒上清液或者静置未处理的病毒上清液1小时，然后，将病毒上清液用于感染原初Huh7.5细胞。
如图7所示，当与未处理的HCVcc比较时，用外源性胆固醇预培养时，所有HCVcc上清液表现出感染性增加；然而，在胆固醇浓度为15μg/ml条件下，ER脂质体处理的细胞中的HCVcc导致病毒感染性较大提高(分别为未由胆固醇处理的对照的282％和138％)。虽然向ER脂质体处理的HCVcc中添加外源性胆固醇恢复了很大百分比的病毒感染性，但是水平与那些未处理的病毒粒子中观察到的水平没有可比性，这可说明ER脂质体处理的细胞中分泌的HCVcc颗粒中可能存在额外的缺陷，所述缺陷降低病毒感染性。
图7表示用外源性胆固醇(胆固醇的最终浓度为15μg/ml和150μg/ml)处理的22:6ER脂质体处理的JC-1HCVcc、PEG化的22:6ER脂质体处理的JC-1HCVcc和未处理的JC-1HCVcc的感染性。从在存在脂质体的条件下培养4天的培养物中取出病毒样品，将该样品标准化至JC-1 RNA的最低浓度(通过定量PCR来测定)，并且在37℃下，用胆固醇预处理1小时。在加入胆固醇之后，将病毒样品用于感染原初Huh 7.5细胞并且如先前所描述的，对这些样品的感染性进行定量。结果代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值(和SD)。
研究已表明降低的细胞胆固醇水平降低了HCVcc感染细胞的能力(Aizaki，Morikawa等人，2008)。该作用可能是由于如下事实：HCV的两个主要细胞受体CD81和SR-BI会需要脂筏形式的胆固醇以定位于质膜(Soldaini，Wack等人2003；Cherukuri，Shoham等人2004；Rhainds，Bourgeois等人2004)，上述定位于质膜的过程是HCV感染必需的(Kapadia，Barth等人2007)。为了研究ER脂质体是否可通过降低细胞胆固醇水平来预防HCVcc感染，用22:6ER脂质体预处理原初Huh 7.5细胞4天，接着用未处理的JC-1HCVcc感染。
4.6用puER脂质体和PEG化的puER脂质体预处理Huh 7.5细胞并且用HCVcc感染之后的结果
图8确认了ER脂质体预处理导致HCVcc对原初细胞的感染能力以剂量依赖的方式降低；用50μM 22:6ER脂质体处理观察到了最大作用，病毒感染降低了89％(SD＝1.9％)。
图8表示了用22:6ER脂质体处理未感染的Huh 7.5细胞4天，接着用JC-1HCVcc(MOI＝0.5)感染的实验结果。如先前所述对病毒感染性进行定量。结果代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值(和SD)。数据表示为相对于未处理的对照(100％)并且该值中的显著性差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
5.降低的细胞内胆固醇对HIV具有抗病毒作用：
HIV的正确组装和感染性也已表现出分别依赖于细胞胆固醇(脂筏)和病毒相关胆固醇。为了研究ER脂质体是否可作为HIV-1抗病毒剂起作用，在TCID50＝100的条件下，用3HIV-1初级分离物(LAI，93UG067和93RW024)感染PBMC，并且在感染之后用puER脂质体和PEG化的puER脂质体处理4天。通过p24ELISA对细胞上清液中的HIV分泌和感染性进行定量。
5.1 puER脂质体和PEG化的puER脂质体处理之后定量HIV分泌和感染性的方法：
HIV-1初级分离物的细胞培养：为了感染细胞，将4x 105PHA活化的PBMC和TCID50(50％组织培养感染剂量)为100的初级分离物原液加至96孔平板的每个孔。16小时过夜培养之后，用完全RPMI培养基清洗细胞三次，并且重悬于具有或不具有脂质体的完全RPMI/IL2中。在第5天，收集含有细胞分泌的HIV病毒粒子的上清液并且通过p24捕获ELISA对每个上清液的p24浓度进行定量。
定量p24ELISA ：在p24分析之前，用1％Empigen(vol/vol)灭活HIV样品。使用抗-p24 D7320抗体(Aalto生物试剂，Dublin，U.K.)捕获处理的上清液中的p24进行ELISA以定量p24，并且，根据生产商的操作规程，使用抗p24的二抗BC1071-AP(Aalto生物试剂)检测ELISA以定量p24。根据生产商的操作规程，使用AMPAKTM ELISA试剂盒(Dako，Ely，U.K.)测量碱性磷酸酶活性。使用重组p24蛋白(Aalto生物试剂)标准化样品。
HIV感染性分析：从用脂质体处理的PBMC中分泌的HIV病毒粒子的感染性使用含有从脂质体处理的细胞中分泌的HIV病毒粒子的上清液测定。所有上清液在完全RPMI/IL2中稀释至p24最终浓度为10ng/ml，并将100μl上清液加至4x 105PHA活化的PBMC中，并且在100μl培养基中稀释至p24最终浓度为5ng/ml，静置培养过夜。第二天如所述的清洗细胞，重悬于200μl新鲜的RPMI/IL2中，并且静置培养4天，接着收集上清液并且通过捕获ELISA分析p24的含量。
5.2用puER脂质体和PEG化的puER脂质体处理HIV-1感染的PBMC之后的结果：
4天处理之后，通过p24ELISA定量细胞上清液中的HIV分泌，并且结果表明HIV分泌和分泌的颗粒的感染性均以剂量依赖的方式降低(图9a和图9b)。如HCVcc所示，抗病毒活性的主要机制看起来是通过降低感染性病毒粒子的形成：观察到用50μM 22:6ER脂质体处理的分泌的HIV的感染性降低了50％(SD＝4.6％)，然而，病毒分泌仅仅降低了22％(SD＝4.6％)。
图9A显示了在用22:6ER脂质体处理4天的过程中HIV-1的三种基因上不同的初级分离物(LAI，93UG067和93RW024)的平均分泌。HIV-1分泌通过使用捕获ELISA定量HIV-1p24基质蛋白来测量。图9B显示了22:6ER脂质体处理的PBMC中分泌的HIV-1的感染性。通过使用上清液感染原初PBMC，接着通过p24ELISA监测感染后的分泌来测定分泌的病毒粒子的感染性。数据代表三个独立的实验的一式三份的平均值和SD。所有值表示为相对于未处理的对照(100％)的百分数，并且该值的显著差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
6.多不饱和ER脂质体与HCVcc竞争结合至细胞表面脂蛋白受体：
低密度脂蛋白受体(LDLr)是一种膜糖蛋白，所述膜糖蛋白可控制胆固醇进入细胞的主要途径，通过所述途径，胆固醇经由网格蛋白介导的VLDL衍生的脂蛋白颗粒的内吞作用，进入细胞。基于下述发现，LDLr也是候选的HCV受体：HCV与脂蛋白有关且所培养的细胞对病毒颗粒的摄取与LDLr表达有关。为了观察摄取脂质体进入细胞是否使用了LDLr，将已表现出分别上调和下调Huh 7细胞中的LDLr、角鲨抑素和25-羟基胆固醇的表达的药物用于观察在存在JC-1 HCVcc感染的条件下对Huh7.5细胞中的ER脂质体摄取的任何作用。
6.1在存在上调和下调Huh 7.5细胞中的LDLr表达的药物的条件下监测脂质体摄取的方法：
如美国专利公开第20090252785号中所描述的制备脂质体并且所述脂质体包括1％(总摩尔数)rh-PE用于监测细胞中这些脂质体的摄取。将JC-1感染的(MOI＝0.5)或未感染的Huh 7.5细胞以在2ml完全DMEM/10％FCS培养基中的3x 105个细胞/孔的密度接种在6孔平板中。细胞用1μM和10μM角鲨抑素(SQ，Sigma)或25-羟基胆固醇(25-HC，Sigma)在无血清完全DMEM中预处理24小时或不进行预处理。24小时预培养之后，加入rh-标记的脂质体以使最终脂质浓度为50μM，并且静置再培养24小时。培养时间之后，在1x PBS中清洗细胞两次，分离，计数并且重悬于200μl 1x PBS/1％TritonX-100中，接着转移至96孔平板以在荧光分光光度计中在λex＝550nm，λem＝590nm读数。
6.2在存在角鲨抑素和25-羟基胆固醇的条件下脂质体摄取进入Huh 7.5细胞中的结果：
在存在SQ或25-HC的条件下培养细胞24小时(两者的最终浓度为10μM和1μM)，接着加入若丹明标记的22:6ER脂质体持续24小时。用10μM 25-HC处理细胞导致脂质体摄取降低了69％(SD＝4.9％)，然而，10μM SQ使脂质体摄取显著提高至117％(SD＝10.7％)，这表明摄取ER脂质体进入Huh7.5细胞依赖于LDLr(图10)。
图10表示在存在用于上调和下调脂蛋白受体的表达的药物(分别是SQ和25-HC)的条件下在无血清完全DMEM中培养未感染的Huh 7.5细胞24小时的实验结果。将脂质双层中的1％rh-PE标记的22:6ER脂质体(最终脂质浓度50μM)加至细胞中并静置再培养24小时。然后，收获细胞，计数，在λex＝550nm，λem＝590nm测量rh-PE的荧光。所有数据代表来自三个独立的实验的一式三份的平均值和SD。数据表示为相对于未处理的对照(100％)并且该值的显著性差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
因为可认为HCV使用LDLr作为细胞受体，ER脂质体也可通过直接与病毒竞争内在化作用所必需的细胞受体来降低HCVcc的感染性。为了测试这个假设，将22:6ER脂质体与JC-1 HCVcc混合并用于感染原初Huh 7.5细胞。结果表明使用高于5μM的脂质浓度，ER脂质体可中和超过50％的Huh7.5的HCVcc感染(图11)。添加ER脂质体至最终浓度为50μM观察到了最大作用，其中，病毒感染性降低了87％(SD＝2.9％)。重复该实验，将病毒和脂质体预培养1小时，接着加至原初细胞中用于感染，结果与那些所显示的结果实际一致(未显示数据)。虽然本发明不受任何理论的限制，该结果可说明脂质体不直接与HCVcc颗粒相互作用，而仅仅与细胞受体相互作用。
图11显示了在感染Huh 7.5细胞的1小时过程中将22:6puER脂质体加至HCVcc病毒原液中的实验结果。在各种浓度条件下，将脂质体加至病毒原液中并用于感染原初Huh 7.5细胞。puER脂质体中和HCVcc感染的能力通过使用HCV核心蛋白免疫荧光分析，对培养两天之后的感染的细胞的数目进行定量来监测。所有数据代表来自三个独立的实验的一式三份的平均值和SD。数据表示为相对于未处理的对照(100％)并且该值的显著性差异表示为*(P＜0.05)或**(P＜0.001)。
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本发明中引用的所有公开出版物、专利申请和专利的全部内容通过引用并入本文。

Claims (27)

1.一种降低细胞胆固醇水平的方法，所述方法包括将含有能够进入细胞的脂质颗粒的组合物给药于有此需要的受治者。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有至少一种磷脂酰乙醇胺脂质或其衍生物。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒还包括琥珀酸胆固醇单酯脂质。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒还包括磷脂酰胆碱脂质、磷脂酰肌醇脂质或磷脂酰丝氨酸脂质中的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括磷脂酰胆碱脂质、磷脂酰肌醇脂质和磷脂酰丝氨酸脂质。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括二油酰基磷脂酰乙醇胺脂质。
7.如权利要求2所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括PEG-PE脂质。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和脂质。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和PE脂质。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述多不饱和PE脂质是22:6PE脂质。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括至少一种多不饱和PC脂质。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述多不饱和PC脂质是22:6PC脂质。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括22:6PE脂质、22:6PC脂质、PI脂质和PS脂质。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒包括18:1PE脂质、18:1PC脂质、PI脂质和PS脂质。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述受治者包括至少一种细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中，在所述给药之前，所述至少一种细胞包括至少一种受病毒感染的细胞，并且，其中，所述给药降低了受感染的细胞的感染能力。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述病毒是HCV病毒。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述受治者是温血动物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述受治者是人类。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述给药导致治疗疾病或病症或者预防疾病或病症中的至少一种，所述疾病或病症由细胞胆固醇水平增加引起或与细胞胆固醇水平增加有关。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述疾病或病症是动脉粥样硬化或冠状动脉疾病。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述受治者是受到免疫缺陷病毒感染的受治者，并且，其中，所述动脉粥样硬化或冠状动脉疾病由免疫缺陷病毒引起或与免疫缺陷病毒有关。
23.如权利要求18所述的方法，其中，所述给药导致治疗或预防由病毒引起的或与病毒有关的疾病或病症，所述病毒依赖细胞内胆固醇进行复制。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述病毒选自：单纯疱疹病毒、流感病毒、鼠白血病病毒、牛痘病毒、多瘤病毒、艾伯斯坦-巴尔病毒、西门利克森林病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、登革病毒、麻疹病毒、HIV、丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述组合物还包括包封在所述脂质颗粒内部的抗病毒剂。
26.如权利要求18所述的方法，其中，所述给药皮下进行。
27.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒为脂质体。
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