DE2249552A1

DE2249552A1 - Verfahren zur inkapsulation von insbesondere wasserloeslichen verbindungen

Info

Publication number: DE2249552A1
Application number: DE2249552A
Authority: DE
Inventors: auf Nichtnennung BOId 15 04 Antrag
Original assignee: Inchema S A
Current assignee: Inchema S A
Priority date: 1971-10-12
Filing date: 1972-10-10
Publication date: 1973-05-30
Also published as: BE796610A; ES412916A1; FR2221122A1; FR2221122B1; AU5310773A; IL41888A0; NL7304133A; ZA731850B; AR196758A1; JPS49118826A

Description

Dr. E. VORWERK j>j f.k·.. 1 72

PATENTANWALT \

GRÖBEMZELL/MÖNCHEN

INCHEMA S.A., Oberdorfstrasse 32,. 8Θ20 Wädenswil

(Schweiz)

Verfahren zur Inkapsulation von insbesondere wasserlöslichen

Verbindungen . -

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung

und die Verwendung von Liposomen mit einem maximalen Durchmes-

ö a

ser von 1000 A, vorzugsweise 200 bis 500 A. Die Wände dieser Liposome bestehen aus mono-, bi- oder multimolekularen Schichten, vorzugsweise jedoch aus bimolekularen Schichten mit einer

ungefähren Dicke.von 30 bis 100 A*

Substanzen, die zur Herstellung der Liposome verwendet werden, besitzen die allgemeine Formel:

in welcher X eine polare hydrophile Gruppe und Y eine unpolare hydrophobe Gruppe darstellt. Beispielsweise bedeutet X einen Phosphat-, Carboxyl-, Sulfat-, Amino-, Hydroxyl- oder

Cholinrest und
Y einen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest,

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z.B. einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alinylrest, der gegebenenfalls z.B. mit einem aromatischen oder cycloaliphatischen Rest substituiert sein kann.

Dies sind jedoch nur einige Beispiele besonders bevorzugter Bedeutungen von X und Y.

Zur Einkapselung von Medikamenten und dergleichen eignen sich unter anderem Phospholipoide, wie Lezithin, Phosphatidyl-äthanolamin, Phosphatidyl-serin, Phosphatidsäure,' usw.

Zur Herstellung von Liposomen eignen sich vor allem zwei einfache Verfahren. Nach dem ersten Verfahren wird ein Lipid zu einer wässerigen Phase gegeben und leicht erwärmt, dann heftig geschüttelt und nachher mit Ultraschall behandelt, bis sich die Liposome gebildet haben. Dies wird an einer teilweisen Aufhellung und dem Auftreten einer leichten bläulichen Opaleszenz sichtbar.

Nach dem zweiten Verfahren wird ein disperses System, vorzugswßise ein Lineärkolloid, hergestellt, das auf einfachste Weise dann entsteht, wenn eine in einem Lösungsmittel gelöste disperse Phase durch Verdampfen des Lösungsmittels in dünne Filme übergeführt und im folgenden unter starker Agitation mit einer geschlossenen wässerigen oder nicht-wässerigen Phase in Berührung gebracht wird. Das so erzeugte System wird anschliessend über längere Zeit mit Ultraschall behandelt; dabei richten sich die Moleküle der dispersen Phase zu einer ganz bestimmten Ordnung, deren Struktur in Fig. 1 skizziert ist. Solche Gebilde stellen

einen thermodynamisch be- ΓΎγ*#

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sonders günstigen Zustand

dar und sind darum von , O

grosser Stabilität und über \ '«if' I

Monate haltbar. _v ./

Fig. 1 : Die Bedeutung von X und Y ist die gleiche wie oben

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Bei beiden oben beschriebenen Verfahren lassen sich die gebildeten Liposome, z.B. durch Ultrazentrifugieren, Chromatographieren, usw., aus dem Reaktionsgemisch abtrennen.

Die Anwendung der beschriebenen Verfahren ist von besonderem Interesse zur Inkapsulation von,Medikamenten oder kosmetischen Wirkstoffen, wobei die Dimension der erhaltenen Liposome mit einem Durchmesser von maximal 1000 A einen wesentlichen Fortschritt gegenüber den gebräuchlichen Mikrokapseln bedeutet.

Insbesondere sind es folgende drei Eigenschaften, die für solche Liposome als neuartige Anwendungsformen für pharmazeutische oder kosmetische Wirkstoffe von besonderem Wert sind.

1) Die ausgebildeten Liposome sind ausserordentlich stabil und können dadurch eingeschlossene Lösungen von chemischen Substanzen (z.B. Medikamente, Eiweissstoffe, Enzyme, Hormone, Vitamine, usw.) gegen extreme oder schädliche Umweltbedingungen schützen (z.B. während der Passage durch den fYla.geri-Darm-Trakt) und so auch für empfindliche Medikamente eine perorale Applikation ermöglichen.

2) Die einzelnen Liposome sind so klein, dass sie ein ausserordentliches Penetrationsvermögen aufweisen, das es ihnen erlaubt, biologische Membranen ohne weiteres zu durchdringen.

3) Durch geeignete Wahl der Substanzen zur Herstellung der Liposomwände kann man die Ladungsverhältnisse an der Oberfläche der Liposome beeinflussen und damit die Liposome mit dem Wirkstoff vorzugsweise in ein bestimmtes Organ dirigieren. So wird z.B. mit Lecithin-Stearylamin das Oberflächenpotential positiv, während z.B. Liposome, gebildet aus Phosphatidylinositol, ein negatives Oberflächenpotential aufweisen.

Die therapeutische Verwendung von vielen Medikamenten, vor allem von Proteohormonen, wie Insulin, Dxytoxin,

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Varopressin, achenocorticotropes Hormon, Calcitonins Secretin, Kallikrein, Kallikrein-Inhibitor, Relaxin-Chinine, Glucagon, aber auch andere leicht inaktivierbare Arzneimittel, wie Adrenalin, Tubocurarin oder schwer rcsorbierbare Drogen, wie Digitalis, im besonderen Strophantin oder Steroide, wie Oestrogene oder Testosteron war bisher auf subcutane oder intravenöse Applikation beschränkt, da diese Verbindungen entweder im Magen oder im Darm zu unwirksamen Produkten abgebaut oder aber im Darm nur schwer resorbiert werden.

In allen Fällen, in welchen ein solches Medikament über Jahre und regelmässig therapeutisch angewandt werden muss, bedeutet eine perorale Applikation einen grossen Fortschritt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung einer Verabreichungsform der oben genannten Medikamente, im speziellen auch von Insulin, die unbeschränkt peroral verabreicht werden kann, wobei dio eingekapselten Wirkstoffe erst an der gewünschten Stelle freigesetzt werden.

Im Tierversuch an weissen Mäusen konnte z.B.. ein hypoglykämischer Schock durch orale Verabreichung eines Liposom-Insulin-Präparates hervorgerufen werden mit der doppelten Dosis, die notwendig war den Schock subkutan hervorzurufen. An Vergleichstieren konnten auch mit einer zwanzigfachen Dosis von gewöhnlichem Insulin, peroral verabreicht/keine Symptome einer Insulinwirkung hervorgerufen werden. In einem weiteren Test für die Wirksamkeit der neuen Präparate wurde weissen Mäusen gewöhnliches Tubocurarin subkutan und die 3000-fache Dosis peroral verabreicht. Dabei starben alle subkutan behandelten Mäuse, während die grossen, peroral verabreichten Mengen keine Symptome hervorriefen. Sobald aber Tubocurarin in Lecithinliposome eingeschlossen verabreicht wurde, konnten die Mäuse mit der subkutan verwendeten Menge Tubocurarin durch perorale Applikation getötet werden.

Es hat sich gezeigt, dass zur Herstellung derartiger oral verabreichbarer Liposome die verwendete Menge an Ver-

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bindung X-Y (Lipide) kritisch ist und je nach Art des Lipides von 0,01 mg bis 50 mg pro ml Lösung des Medikamentes optimal ist.

Die erfindungsgemässen Liposome eignen sich, nicht nur als optimale Form für oral zu verabreichende Wirkstoffe, sondern ebenso für zahlreiche andere Anwendungen. So ermöglicht z.B. das ausgezeichnete Penetrationsvermögen der Liposome eine äusserst wirksame Anwendung von Heilmitteln und Kosmetika durch Aufbringen auf die Haut. Sie durchdringen mühelos Haut und Gewebe, so dass auf diese Weise wasserlösliche Substanzen am gewünschten Ort zur Einwirkung gebracht werden können* welche üblicherweise die Haut nicht zu durchdringen vermögen.

Ebenso ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung ausgezeichnet und gezielt wirkender Liposomen-Präparate zu Inhalationszwecken.

Beispiel 1;

Um 300 mg Theophyllin zu· inkapsulieren, werden 9 mg Lecithin in 10 ml Chloroform gelöst und in einem Rundkolben so eingedampft, dass das rückständige Lecithin möglichst gleichmässig an der Kolbenwand verteilt ist. Dann wird die Theophillinlösung (300 mg Thenphillin in 3 ml o,'1 molarem Trispuffer pH 8,5) in den Kolben . gegeben und für einige Minuten heftig geschüttelt. Nachdem sich eine weisse Emulsion gebildet hat, wird dieselbe mit Ultraschall während einer halben Stunde behandelt. Das disperse System hellt sich auf und die Suspension der gebildeten Liposomen stellt eine beinahe optisch klare Flüssigkeit dar. Die gebildeten Vesikel, die nun Theophillinlösung enthalten, können von dem nicht strukturierten Lecithin durch Ultrazentrifugation während einer Stunde und 100Ό00 g abgetrennt werden. Um die Liposome von. der nicht eingeschlossenen Theiphillinlösung zu trennen, wird eine Chromatographie an Sepharose durchgeführt. ■

Beispiel 2;

Um 100 mg Insulin zu inkapsulieren, werden 3 mg

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Phosphatidylinositol in 10 ml Chloroform gelost und in einem Rundkolben so eingedampft, dass sich auf der gesamten Innenfläche ein gleichmässiger Film von Phosphatidylinositol bildet. Dann wird eine Insulinlösung (100 mg Insulin in 3 ml 0,1 molareiji Phthalatpuffer pH 4,0) in den Kolben gegeben und im folgenden gleich behandelt wie in Beispiel 1.

Beispiel 3:

1 g Trypsin wird in 30 ml 0,1 molaremPhosphatpuffer pH 7 gelöst und in einen 500 ml Rundkolben gegeben und mit 15 ml Chloroform, in dem 15 mg Lecithin gelost sind, unterschichtet. Dann wird der Kolben an einen Dünnschichtverdampfer angeschlossen und bei 30 C sehr schnell gedreht und bei einer halben Atmosphäre das Chloroform weggedampft. Die sich bildende Emulsion wird beschallt wie in Beispiel 1 und nachher auch chromatographisch die Liposome vom Rest getrennt,

Beispiel 4;

4 mg Lecithin werden pro ml einer Tubocurarin-

lösung von mg/ml zugegeben und die Lösung während einiger Zeit (10 bis 20 Minuten) unter ständigem Schütteln bei 3O⁰C gehalten. Nachher wird die gebildete Emulsion während 15 bis 30 Minuten mit Ultraschall behandelt, bis sich ein bläulich opaleszierendes Kolloid bildet, was ein Zeichen für die Bildung der Liposome ist. Nach dem Ultrazentrifugieren während 10 Minuten, wobei das nicht zu Liposomen ausgebildete Lipidmaterial sedimentiert, können die Liposome an einer Sephadex- oder Sepharose-Kolonne von der nicht in den Liposomen eingeschlossenen Lösung getrennt werden. Die erhaltenen Liposomen-Suspension kann direkt zur peroralen Applikation verwendet werden.

Beispiel 5;

Auf ähnliche Art wie in Beispiel 4 beschrieben wird Insulin mit reinstem Lecithin zu einem oral verabreichbaren Liposomenpräparat verarbeitet.

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Claims

2 2 A 9 5 5 2

Patentansprüche :

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1Λ[

^Chemische Verbindungen enthaltende Liposome, dadurch gekefmzeichnet, dass diese Verbindungen umhüllt sind .

von vorzugsweise bimolekularen Schichten, die zu ultrakleinen

Liposomen mit einem maximalen Durchmesser'von 100Q A ausgebildet sind, wobei diese Schichten aus Substanzen der allgemeinen Formel:

in welcher X eine polare hydrcpSile Gruppe und Y eine unpolare hydrophobe Gruppe darstellt, bestehen.

2. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposome erzeugt werden durch Behandeln eines .dispersen Systems mit Ultraschall, wobei die geschlossene Phase des Systems die zu inkapsulierende Verbindung gelöst enthält, während die disperse Phase die Liposörnensubstanz enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das behandelte disperse System ein linearkolloidales System ist, das erhalten wird, indem dünne Schichten der dispersen Phase unter starker Agitation mit der geschlossenen Phase in Berührung gebracht werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass für die disperse Phase Lipide oder Lipoide verwendet werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass für die disperse Phase Phospholipide verwendet werden.

B. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet,. dass Medikamente inkapsuliert werden.

_ 7 —

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7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Enzyme inkapsuliert werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Insulin inkapsuliert wird·

9. Verfahren zur Herstellung von peroral applizierbarem Insulin, dadurch gekennzeichnet, dass Insulin in Liposome eingeschlossen wird, die einen maximalen Durchmesser von BOO A, vorzugsweise 200 bis 500 A aufweisen, und das zur Herstellung von Liposomen verwendete Material besteht aus Substanzen der allgemeinen Formel:

wobei X eine polare hydrophile Gruppe darstellt und Y eine unpolare hydrophobe Gruppe ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposome durch Behandeln eines dispersen Systems mit Ultraschall erzeugt werden, wobei die geschlossene Phase des Systems Insulin gelöst enthält, während die disperse Phase das Liposomenmaterial enthält.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, d.ass das behandelte disperse System ein linearkolloidales System ist, das erhalten wird, indem dünne Schichten der dispersen Phase unter starker Agitation mit der geschlossenen Phase in Berührung kommen.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die disperse Phase, das heisst als Liposomenmaterial, Lipide oder Lipoide verwendet werden.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die disperse Phase Lecithine verwendet werden.

14. Liposomen, hergestellt nach dem Verfahren gernäss einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 13.

15. Peroral applizierbares Insulin, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 13.

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