DE2946601C2 - Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen - Google Patents
Verfahren zum extemporierten Herstellen von LiposomenInfo
- Publication number
- DE2946601C2 DE2946601C2 DE2946601A DE2946601A DE2946601C2 DE 2946601 C2 DE2946601 C2 DE 2946601C2 DE 2946601 A DE2946601 A DE 2946601A DE 2946601 A DE2946601 A DE 2946601A DE 2946601 C2 DE2946601 C2 DE 2946601C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- phospholipid
- liposomes
- extract
- solution
- syringe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
- Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
- Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen, in die Wirkstoffe eingearbeitet
sind.
Liposomtn sind bekanntlich künstliche Kügelchen aus Phospholipiden, die aus einer Reihe von konzentrischen
Schichten, weiche mit wäßrigen Abteilen abwechseln, zusammengesetzt sind. Substanzen verschiedener
Art können in den wäßrigen Abteilen oder den konzentrischen Schichten »eingefangen« sein.
Liposome, die erstmals von Bangham (»J. Mol. Biol.« 13 (1), 238 bis 259, 1965) hergestellt und später von
Sessa und Weissmann (»J. Lipid Res.«, 1968 9 (3), 310 bis 318) so benannt wurden, wurden als erste als künstliehe
Modelle zur Untersuchung der Eigenschaften von biologischen Membranen verwendet Tatsächlich wurde
rasch festgestellt, daß die Pho^holipidwände von Liposomen Eigenschaften haben, die denjenigen von Erythrozyten,
Lisosomen und Mitochondrien im Vergleich zu verschiedenen Artetr von Substanzen, wie Steroiden,
Toxinen, Antibiotika und Arzneimitteln, perfekt analog sind.
Das praktische Potential der Liposomen liegt in der Tatsache, daß von diesen festgestellt wurde, daß sie nicht
jo nur dazu imstande sind, die meisten Substanzen zu überziehen, sondern auch sie vor Abbauprozessen zu schützen
und sie \z Richtung auf spezielle Zielorgane zu orientieren.
Nachteiligerweise hai die Kcmplexizität der Herstellungsprozesse für Lipsome, die therapeutisch aktive Substanzen
enthalten, bislang noch nicht den Erhalt von gewerblich anwendbaren Produktionsmethoden gestattet.
Dazu kommt noch, daß bei den Verbindungen, die hergestellt werden konnten, schwerwiegende Stabilitätsprobleme
auftreten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben genannten Probleme zu überwinden und insbesondere
ein billiges und einfaches Verfahren zum Herstellen von Liposomen, die Wirkstoffe enthalten, zur Verfügung zu
stellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Art daaurch gelöst, daß
man den Wirkstoff einarbeitet, indem man eine in Wasser oder physiologischer Lösung vorliegende Phospholipidemulsion
mittels einer Spritze aufsaugt und in einen Behälter drückt, in dem der therapeutische Wirkstoffals
trockenes Pulver oder als Lyophilisat zugegen ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man
das wie oben erhaltene Gemisch zur Vervollständigung seiner Auflösung im Behälter schüttelt und - gegebe-■»5
nenfalls mehrmals - mit der Spritze ansaugt und in den Behälter zurückdrückt.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun Liposome, die therapeutische Wirkstoffe enthalten,
durch einfache Auflösung zum Zeitpunkt des Gebrauchs des Wirkstoffs in einer Phospholipidemulsion in Wasser
oder einer physiologischen Lösung oder einer Pufferlösung und durch anschließendes Rühren hergestellt
werden.
w Bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet man die Technik, die normalerweise für die Auflösung eines
trockenen Pulvers oder eines Lyophilisats mit einem Lösungsmittel angewendet wird, nämlich
- Ansaugen der Phospholipidemulsion mit einer Spritze;
- Abgabe des Spritzeninhalts in einen Behälter (Gläschen oder Fläschchen), der den therapeutischen Wirk-..
stoff in trockenem oder lyophilisierten Zustand enthält;
- Durchschüttlung des Gläschens oder des Fläschchens, um die Auflösung zu verbessern;
- Ansaugen der Lösung mit einer Spritze und gegebenenfalls erneute Abgabe in den Behälter, um sie von
neuem anzusaugen.
Zu diesem Punkt enthält die Spritze eine feine Suspension von Liposomen in einer wäßrigen Umgebung, die
öo in ihrer Struktur den therapeutischen Wirkstoff einschließen.
W Als Phospholipidemulsion können beispielsweise alle beliebigen wäßrigen Emulsionen von Phospholipiden
[;':■ von Sojabohnen, Hirnrinde, Eiern etc. verwendet werden.
V' Eine bevorzugt verwendete Emulsion wird ausgehend vom Eigelb bzw. Dotter von frischen Eiern nach dem
|- Verfahren gemäß der italienischen Patentschrift 9 89 501 hergestellt.
pV "5 Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
L-: Beispiel 1
jv; Eine ex-ovo-Phospholipidemulsion wurde gemäß der italienischen Patentschrift 9 89 50 t auf folgende Weise
hergestellt: 1000 frische Eier wurden zerbrochen und die Dotter bzw. das Eigelb wurden von dem Albumin
abgetrennt. Die Dotter wurden aufgespalten und in einen Extraktor eingegossen, der 70 1 Äthylalkohol 90,5° von
Raumtemperatur (22 bis 25°C) enthielt. Nach 24stündiger Infusion, während welcher Zeit die koagulierte Masse
häufig gerührt wurde, um die Extraktion der Lipide zu erleichtem, wurde der alkoholische Extrakt erst durch
eine Gazeschicht, die auf die Basis des Extraktors aufgebracht worden war, und sodann durch ein gefaltetes FiI-terpapier
filtriert. Das Filtrait, das mit einem zweiten alkoholischen Extrakt vereinigt worden war, welcher in der
Weise erhalten worden war, daß der Rückstand der ersten Extraktion 4 h lang mit 501 Äthylalkohol der Infusion
unterworfen wurde, wurde in einen doppelwandigen Kolben gegeben, wobei heißes Wasser in dem Zwischenraum
zirkulierte. Die AbdestUIation des Alkohols wurde unter Vakuum (20 bis 30 mm Hg) begonnen. Der
Destillationsvorgang wurde weitergeführt, bis ein Alkoholgehalt von ungefähr 25% erhalten wurde. Zu diesem
Zeitpunkt wurden 12,5 1 sterile physiologische Lösung in den Kolben gegossen und die Destillation wurde weitergeführt,
bis der Alkohol vollständig entfernt war.
Das in dem Kolben zurückgebliebene Produkt wurde in 11 sterile 5-1-Kolben verteilt, von denen jeder 2,5 1 sterile
physiologische Lösung bzw. sterile physiologische Kochsalzlösung enthielt. Die Kolben wurden etwa 12 h
lang stehen gelassen, um die Abscheidung der Phospholipide zu gestatten. Am Ende dieses Zeitraums wurde die
überstehende physiologische Lösung abdekantiert. Das sedimentierte Produkt stellte eine stabile Emulsion dar,
die nach geeigneter Verdünnung direkt in Gläschen eingeführt werden kann.
Die durch Dünnschichtchromatographie durchgeführte Analyse der dispergierten Phase der Emulsion ergab
die folgende prozentuale Zusammensetzung:
20
Phosphatidylcholin (Lecithin) | 71,4 |
Phosphatidyläthanolamin (Cephalin) | 15,4 |
Lysochcsphaiidyicho! in | 7,3 |
Sphyngomyelin | 4,1 |
Phosphatidinsäure | 0,4 |
andere nicht-identifizierte Phosphoiipide | 1,4 |
Unter Verwendung der auf die obige Weise hergestellten Phospholipidemulsion wurden fünf verschiedene
Suspensionen nach folgenden Techniken erhalten: m
1) Beschallung. Das Phospholipidgemisch wurde in Wasser (~50 mg/ml) suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
mit einer Ultratip-Vorrichtung (Wellenenergiesystem) mit einer Energie, die zwischen 40 und
60 W variierte, unterworfen. Die Temperatur wurde für die gesamte Dauer des Prozesses zwischen 4 und
6°C gehalten. Nach einer mehrminütigen Beschallung wurde eine Suspension von transparenten Liposomen
(SUV) mit klarer gelber Farbe erhalten. Diese wurde auf einer Säule mit Sephadex G 50 eluiert, um iJ
gegebenenfalls vorhandene Mizellen mit größeren Abmessungen abzutrennen.
2) Wirbelrührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde 1 h lang einer Wirbelrührung unterworfen und
ohne weitere Behandlung verwendet.
3) Manuelle Rührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach 5minütigem manuellen Rühren verwendet.
4) Drehbewegung mit einer Spritze. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach aufeinanderfolgenden
Ansaugungen und Ausdrückungen in bzw. aus einer Spritz» für die intramuskuläre Injektion verwendet.
5) Es wurde die gleiche Technik, wie unter 4) beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch das Ausdrücken und
das Ansaugen der Flüssigkeit aus bzw. in ein Gläschen erfolgte, das einen lyophilisierten Adrenocorticalextrakt
mit folgender prozentualer Zusammensetzung enthielt:
Aluosteron | 5,5% |
Corticosteron | 26,4% |
Cortison | 13,7% |
Hydrocortison | 17,0% |
11 -Dehydrocorticosteron | 17,6% |
17-Hydroxy-11 -desoxycorticosteron | 5,1% |
anüere | 14,7% |
Die fünf verschiedenen Suspensionen wurden durch Infrarot- (IR-), Ultraviolett-(UV-), kernmagnetische ^
Resonanz- (NMR-) und elektronenmikroskopische Verfahren bei folgenden Versuchsbedingungen unterricht:
a) IR- und UV-Messungen:
Das Infrarotspektrum des Phospholipidgemisches allein und in Gegenwart des Aürenocorticalextrakts
wurde mit einem Perkin-Elmer-577-Spektrophotometer mit einer Abtastze.it von 15 min. aufgezeichnet.
Die entsprechenden Ultraviolettspektren (Lösungsmittel: Petroläther 30 bis 50) wurden mit einem Beckman*DK..2«Spektrophotometer
unter Verwendung einer Quarzzelle mit einer Kantenlänge von 1 cm aufgezeichnet.
b) NMR-Messungen:
Die nC-Spektren (in D3O und in CDCI1) wurden mit einem Bruker-WH-90-Spektropholometer, das bei b5
22,63 MHz in einer Fourier-Anordnung arbeitet, aufgezeichnet.
Die Versuchsbeuingungen waren: Impulsbreite 30°, Anzahl der Impulse zwischen 20 000 und 30 000,16 K
des Gedächtnisses, SW von 6000 Hz. Umgebungstemperatur, innerer Verschluß auf dem Deuterium des
Lösungsmittels (CDCl, oder D2O). Die chemischen Verschiebungswerte wurden im Vergleich zuTetramelhylsilan
(TMS) bestimmt, das als interne Referenz für die Lösungen in CDCI, und extern für die Suspensionen
in DjO verwendet wurde. Die Protonenspektren wurden bei 90 MHz mit einem Brukcr-HX90-Instrument,
das mit einer kontinuierlichen Welle arbeitet, aufgezeichnet. DSS wurde als interne Referenz
■> und als Verschluß verwendet. Die Proben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken 4)
und 5) hergestellt,
c) Elektronenmikroskopische Messungen:
c) Elektronenmikroskopische Messungen:
Die Elektronenmikrophotographien wurden unter Verwendung eines Siemens-Elmiskop-102-Instruments
erhalten. Die Beobachtungen erfolgten unter negativem Kontrast mit 2% Phosphorwolframsäure.
Ergebnisse
IR und UV
IR und UV
Das IR-Spektrum des Phospholipidgemisches, das Zuordnungen der darin vorhandenen Signale gestattet, ist
Ii in Tabelle I dargestellt.
Aus dem UV-Spektrum kann nur die Anwesenheit von Fettsäuren mit Doppelbindungen, die an die Seitenketten
von verestertem oder freiem Glycerin gebunden sind, hergeleitet werden. Die Zugabe des Corticosteroidextrakts
bewirkte keine nennenswerte Veränderung der in den Spektren vorhandenen Signale.
,0 Elektronenmikroskopie
Die Mikrophotographien der Fig. 1 bis 5 zeigen die Ergebnisse, die mit den folgenden Proben erhalten wurden:
1) 5minütige manuelle Rührung
Fig. IAX 15 000
Fig. IB X 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >5000 A
Fig. IB X 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >5000 A
2) einstündige Wirbelrührung
Fig. 2AX 15 000
,,, Fig. 2Bx 60000
,,, Fig. 2Bx 60000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 10 000 A
3) 15minütige Beschallung
Fig. 3AX 15 000
Fig. 3 B X 60 000
j. scheinbarer Durchmesser der Bläschen >300 bis 1000 A
Fig. 3 B X 60 000
j. scheinbarer Durchmesser der Bläschen >300 bis 1000 A
4) Rühren mit der Spritze
F i g. 4 A X i 5 000
Fig.4Bx60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2500 A
Fig.4Bx60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2500 A
5) Rühren mit der Spritze (die Illustrationen beziehen sich auf das Phospholipidgemisch in Gegenwart des
Corticosteroidextrakts)
Fig.5Ax 15 000
Fig. 5Bx 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2000 A.
Fig. 5Bx 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2000 A.
Die Untersuchung der Mikrophotographien zeigt, daß die Herstellungsmethode der Phospholipidsuspensionen
die Struktur der gebildeten Bläschen bestimmt. Tatsächlich zeigen Suspensionen, die durch eine einfache
mehr oder weniger verlängerte Rührung erhalten worden sind, Bläschen, die im allgemeinen größer sind, einen
nicht-gleichförmigen Durchmesser haben und strukturell dem MLV-Typ ähnlich sind. Im Gegensatz dazu zei-■)ii
gen Suspensionen, die durch Verwendung der Spritze erhalten worden sind, Bläschen, die im Durchmesser eindeutig
kleiner sind als im vorliegenden Falle, deren Durchmesser homogener sind und die vom gleichen Typ
sind, wie sie nach der Beschallungsmethode (SUV) hergestellt werden können.
NMR
5; Die Protonen-NMR- und die 13C-Spektren des Phospholipidgemisches in CDCl3 zeigen die chemischen Ver
schiebungswerte (bezogen auf TMS) der verschiedenen Resonanzbanden, die in den Tabellen II und III angege
ben sind, zusammen mit einigen Zuordnungen.
Die 1H- und l3C-Spektren des gleichen Gemisches in D2O ergeben die chemischen Verschiebungswerte um
die Zuordnungen, die in den Tabellen IV bzw. V angegeben sind.
co Im allgemeinen zeigen diese Spektren erheblich größere Linienbreiten im Vergleich zu den entsprechendei
Spektren in CDClj-Lösungen.
Im 13C-Spektrum werden jedoch eindeutig mehrere Linien, die bei 19,6,60,26 und 63,58 ppm zentriert sini
und die erheblich enger und in der Breite mit den Spektren in Chloroform vergleichbar sind, festgestellt.
Das !3C-Spektrum des Phosphoiipidgemisches in Gegenwart des Adrenocorticalextrakts in D2O und in CDCl
h5 ist im wesentlichen mit demjenigen identisch, das in Abwesenheit des lyophiüsierten Extrakts erhalten wire
Beispiel 2
Um den Grad zu bestimmen, mit dem ein Adrenocorticalextrakt innerhalb einer Phospholipidemulsion unte
Um den Grad zu bestimmen, mit dem ein Adrenocorticalextrakt innerhalb einer Phospholipidemulsion unte
Bildung von Liposomen gemäß der Erfindung umhüllt wird, wurde der tolgende Versuch durchgeführt, wobei
lyophilisierte Gläschen verwendet wurden, die jeweils 390 Mikrogramm Conicoid mit folgender
prozentualer Zusammensetzung (berechnet als Hydrocortison) enthielten:
Tetrahydrocortison | 0,20% |
Aldosteron | 5,28% |
I I-Dehydrocorticosteron | !7,58% |
Corticosteron | 26,38% |
Cortison | 13,78% |
Hydrocortison | 17,00% |
n-Hydroxy-ll-desoxycorticosteron | 5,13% |
andere Fraktionen | 14,65% |
100,00%
Um den Adrenocorticalextrakt in der Phospholipidemuision freizusetzen, wurde die in Stufe 5 des Beispiels 1
beschriebene Technik verwendet.
Die Versuche wurden entsprechend dem folgenden Plan durchgeführt:
Die Versuche wurden entsprechend dem folgenden Plan durchgeführt:
1) 390 ug lyophilisierter Adrenocorticalextrakt in einem Gläschen wurden in 15 ml H2O (Kontrolle) aufgelöst,
16 h lang bei 10°C gehalten und dann zu der gleichen Zeit wie die anderen Lösungen analysiert.
2) Vier lyophilisierte Gläschen, die die gleiche Menge Adrenocorticalextrakt enthielten, wurden in 20 ml exovo-Phospholipidemulsion,
5% in physiologischer Lösung, aufgelöst.
2a) 10 ml der Corticosteroidlösung in Phospholipidemuision wurden 16 h bei ca. 100C absetzen gelassen. Fast
alle Phospholipide blieben am Boden des Behälters. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch 5minütiges
Zentrifugieren bei 1000 Upm geklärt. 5 ml der zentrifugierten Flüssigkeit wurden mit H2O auf 15 ml verdünnt.
2b) 5 ml Lösung 2), d. h. einer Lösung, die Corticosteroide und Phospholipide, die weder durch Stehenlassen
noch durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, enthielt, wurden auf 15 ml mit H,0 verdünnt.
3) Zur gleichen Zeit wie die 20 ml Phospholipidemuision ohne Corticosteroide wurden zwei Lösungen nach
der gleichen Verfahrensweise hergestellt, die für die Lösungen 2a) und 2b) angewendet worden war. Auf
diese Weise wurden zwei Lösungen, ämlich die Lösung 3a), die als Kontrolle für die Analyse der Lösung
2a) verwendet wurde, und die Lösung 3 b), die als Kontrolle für die Lösung 2 b) verwendet wurde, erhalten.
Analysen aller Lösungen wurden durchgeführt, indem jeweils 15 ml mit 4 x 10 ml Chloroform extrahiert
wurden. Die Chloroformextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und im Vakuum getrocknet.
Der Rückstand wurde mit 10 ml 95° Äthanol gesammelt und (bei 1 ml alkoholischer Lösung) einer kolorimetrischen
Reaktion mit Tetrazoliumblau unterworfen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Corticosteroidbestimmungen^g/lS ml)
Lösung I
Corticosteroide
2a) überstehendes 2b) Gesamtmenge 3a) überstehendes
3 b) Gesamtmenge
345
Aus der Gleichung
57
141
345-57 345
x 100 = 83,5% wird abgeleitet, daß dies die Prozentmenge Corticosteroide ist, die
von den Phospholipiden zurückgehalten wird. Als Kontrolle ergibt die Gleichung
(410-141)-57
x 100 den Wert von 79%, der in guter Übereinstimmung mit
410-141
dem vorstehenden Wert steht. (Es sollte festgestellt werden, daß die Phospholipide alleine gleichfalls eine Reaktion
mit dem Tetrazoliumblau ergeben. Diese Tatsache sollte im Gedächtnis behalten werden).
Aus den oben beschriebenen Versuchen kann hergeleitet werden, daß die Phospholipide in Form von Liposomen
den größten Teil (ca. 80%) der in der Lösung vorhandenen Corticosteroide zurückhalten.
Pharmakologischer Test
Unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Suspension der Corticosteroide enthaltenden Liposome
wurde ein pharmakologischer Test des Überlebens von adrenalektomisierten Mäusen durchgeführt, der in
folgender Weise ausgeführt wurde:
Die Versuche wurden mit Schweizer Mäusen vom Morini-Stamm durchgeführt, die unter Äthernarkose transabdominal
adrenalektomisiert worden waren. Die Mäuse wurden unmittelbar nach dem Entwöhnen (durchschnittliches
Gewicht 10 ± 1 g) adrenalektomisiert.
Die adrenalektomisierten Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: Eine Gruppe diente als Kontrollgruppe,
die anderen drei Gruppen erhielten eine einzige Injektion des lyophiiisierten Adrenalsteroidgemisches mit folgender
Zusammensetzung: ll-Desoxy-n-hydroxycorticosteron 6%; ll-Dehydrocorticosteron 11,5%; Hydrocortison
31%; Aldosteron 2,9%; Corticosteron 18,22%; andere Fraktionen 4,6%. Das Gemisch wurde in destillier-
tem Wasser, Sesamöl oder in dem Phospholipidgemisch, erhalten aus einer 5%igen Eidotteremulsion in physiologischer
Lösung gemäß Beispiel 1, dispergiert, wobei die Technik der Stufe 5) des gleichen Beispiels angewendet
wurde.
Die Injektion erfolgte unter die Dorsalhaut in den interskapulären Bereich 5 minvorder Adrenalektomie. Die
injizierten Gesamtvolumina betrugen 0,4 ml pro Tier. Die Tiere wurden bei einer Temperatur von 22 ± I0C und
einer relativen Feuchtigkeit von 60% mit einem 24stündigen Nacht- und Tagesrhythmus (12h Licht/24) über die
gesamte Versuchsdauer gehalten.
Die Mortalität pro h wurde sowohl bei den behandelten als auch bei der Kontrollgruppe über einen Zeitraum
von 66 h aufgezeichnet. Die Werte wurden auf Differenzen nach Student »t« und Dunnet »t« für Globalität der
Versuche umgerechnet, wobei die faktorielle Methode von R. A. Fisher zum »Vergleich der Verhältnisse« während
verschiedenen h der Beobachtung angewendet wurde.
Ergebnisse
Die Analyse des Vergleiches der Verhältnisse, die auch nach der Fisher-Methode auf alle Zeitintervalle der
Beobachtungen angewendet wurde, zeigte, wie erwartet, eine statistisch signifikante Differenz des Überlebens
der Tiere, die mit dem Adrenalhormongemisch im Vergleich zu den unbehandelten Tieren (Tabellen VI und
VlI) behandelt worden waren. Im Falle des wäßrigen Trägers war jedoch das Überleben bis zu der 18. h begrenzt.
Über diese Grenze hinaus besteht praktisch kein Schutz auf den Teil einer Dosis von Corticoiden, die verwendet
wird, wenn ais Träger Wasser verwendet wird.
Dagegen ist das Verhältnis der Mäuse, die mit Adrenocorticalhormonen, die mit Phospholipiden getragen
werden, im Vergleich zu Kontrolltieren überleben, sehr augenscheinlich (Tabelle Vl). Es ist bereits von der 12. h
hoch signifikant (Tabelle VII). Wenn die Tiere mit Hormonen behandelt wurden, die in Öl getragen waren, dann
ist das Verhältnis des Überlebens im Vergleich zu den Kontrolltieren statistisch signifikant (P 0,05) und beginnt
mit der 18. und endet mit der 30. h.
Das prozentuale Überleben im Verhältnis zu dem Träger zeigt daher eine klargeschnittene Zunahme des hormonellen
Schutzes bei dem Phospholipidträger (Tabelle Vl). Tatsächlich geht im Vergleich zu Tieren, die mit
Adrenocorticalhormonen in Wasser behandelt worden waren, das Überleben über die 36. h hinaus und es ist fast
bis zur 66. h ersichtlich (Tabelle VII). Selbst die Injektion der Adrenalhormone in Öl scheint das Überleben im
Vergleich zu Hormonen in Wasser eindeutig zu verlängern, doch ist der erhaltene Schutz verhältnismäßig geringer
als derjenige, der mit Adrenalhormonen und Phospholipidgemisch erhalten wird. 100% der Tiere, die mit
Corticalhormonen in wäßrigem Träger behandelt worden waren, waren um die 13. h gestorben. Um die 16. h
waren 100% der Tiere, die mit Corticalhormonen in dem öligen Träger behandelt worden waren, gestorben, während
25% der Tiere, denen die Corticalhormone mit den Phospholipiden injiziert worden waren, immer noch
überlebten.
Eiphospholipidsuspension - IR-Spektrum
Wellenzahl (cm ')
Zuordnungen
2915 und 2845 mit Schulter bei 2948 1725
1460 und 1380 1235
1090 und 1050 970
Streckung der CH2-Gruppen und CHrTerminale
Streckung der CO-Estergruppe Biegung der CH2-Gruppen und CHj-Terminale
a) Hin- und Herbewegung der CH2- und CH,-Gruppen
b) Streckung der PO-Gruppe
a) Schaukeln der Terminale der CH3-Gruppe
b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch)
a) Herausdeformationen aus der Ebene der Gruppe -CH=CH- (trans) der Sphyngomyeline
b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch)
NMR-Werte - Ή in CDCl3
(5 (ppm von TMS)
Zuordnungen
0.89 1,27 2,03 2,30 2.83 3,37
CHrTerminale
-(CH2)n-Fettkelten
CH2-AIIyI
CH2CO
=CH CH2 CH=
+N (CH3),
T(NC I/Ii η μ
PiMi- ...γ, γμ:>
4*33 I 5,36
ite Multipletts ^'"A','^
CH2N voll, CH2 OP
-CH2O Glycerin
CH = ;CH-0
NMR-Werte - IJC in CDCl3
(S (ppm von TMS)
11,66 !3,89 18,52 19,23 20,95
22,37 22,50 23,70 24,73 25,44 26,35 27,03 27,81 28,07 29,04 29,13 29,52
31,34 31,72 33,96 34,12 35,61 36.03 36,35 37,19 39,36
39,65 42,18 50,06 54,15 56,64
59,46 62,91 63,54 66,16 70,53 71,11 121,18 127.75
-CHj -CH-,-Terminals
CH2 CH3
CH, CH2 CO = CH CH2 CH
= CH1 CH = -(CH2)„-Fettketten
CH2 CH2 CH3
CH2CO CH,N Äthanolamin
N (CH3)., Kohlenstoffatome des Glycerins und der
Alkoholketten, die das Phosphat verestern
CH-O CH2 = (Vinylgruppen)
η (ppm von TMS)
127,95 128,17 128,46 128,79 128,88 129,5 129,82 130,05
130,31 140,99 172,93 173,32
Zuordnungen
CH =CH
1J-
C = (quatemäre Gruppe auf Doppelbindung) -CO-Ester
In der Position der Signale besteht beim Vorhandensein des Adrenocorticalextrakts keine Variierung.
NMR-Werte - 1H in D2O
ό (ppm von DSS)
0.93 1,33 2.11 3.29
Zuordnungen
CHj-Terminale -(CHj)„-Kette
CH2 Allylgruppen, CH2CO N(CHj)3
Es handelt sich um sehr breite Bänder. Das Signal für CH= wird von demjenigen des Wassers (4,79 ppm) versteckt.
NMR-Werte - 13C in D3O
(ppm von TMS)
Zuordnungen
16,6 | breit | -CHj-Terminale |
19,61*) | ||
25,34 | breit | CH2 CH3 |
31,72 35,44 | sehr breit | -(CH2)„-Fettketten |
56,35 \ 56,93 I |
weites Band | N(CH3), |
60,26*) | ||
65,38*) | ||
130.62 \ | ||
131.07 I | sehr breit | CH = |
*) Diese Signale sind eng, wobei Ay 1/2 mit demjenigen der Signale in Clilorolbrmlösung vergleichbar
ist.
In Gegenwiirl des Adrcnucorticalcxtrakls ist das "C-Spektrum mit Ausnahme von drei engen und gut definierten
Signalen bei 66.06. 72.21 und 73,79 ppm identisch.
Überlebensstunden von Mäusen, die adrenalektömisiert und mit einem Ädrenöcorticalextrakt in einem wäßrigen, öligen und Phospholipidträger behandelt wurden.
χ+ SE
1) destilliertes Wasser (Kontrollen) 14 ± 4,671 1 vs 2 0,8 N. S.
2) Adrenocorticälextrakt in destilliertem 18 ± 7,441 1 vs 3 2,3 0,05 m
Wasser
3) Adrenocorticälextrakt in Sesamöl 29 ± 16,405 1 vs 4 4,9 0,01
2 vs 4 4,0 0,01
4) Adrenocorticalextrakt in Phospholipiden 40 ±20,674 2 vs 3 1,4 N. S. 15
Vergleich zwischen einer Kontrolle und drei Behandlungen, die zwischen der 6. und 66. h studiert wurden;
durchgeführt nach der »direkten oder faktoriellen Methode« von R. A. Fisher 20
% Probabilität
6 h 12 h 18 h 24 h 30 h 36 h 48 h 54 h 60 h 66 h
Kontrolle gegen 50 23,3 4,7*) 23,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
ACE + Wasser
Kontrolle gegen 23,9 3,2*) 0,1**) 0,2**) 0,7**) 0,7·*) 10,9 10,9 10,9 50,0
ACE + PhosphoHpid 3υ
Kontrolle gegen 38,6 12,8 0,9**) 3,6*) 3,6*) 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0
ACE + Öl
ACE+ H2O gegen 50,0 14,0 1,7**) 4,0*) 0,7**) 0,7**) 10,9 10,9 10,9 50,0
ACE + Phospholipid
ACE+ H2O gegen 63,2 29,8 22,9 19,9 3,6*) 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0 33
ACE + Öl
ACE + Phospholipid 100,0 49,1 19,9 30,0 35,0 12,8 39,7 39,7 36,8 63,2
gegen ACE + Öl
·) = signifikant bis zur 5%-Sicherheitsgrenze
**) = signifikant bis zur 1%-Sicherheitsgrcnze
ACE = Adrenocorticalextrakt
Hierzu 5 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
1. Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen, in die Wirkstoffe eingearbeitet sind, dadurchgekennzeichnet,
daß man den Wirkstoff einarbeitet, indem man eine in Wasser oder physiologischer
Lösung vorliegende Phospholipidemulsion mittels einer Spritze aufsaugt und in einen Behälter
drückt, in dem der therapeutische Wirkstoff als trockenes Pufver oder als Lyophilisat zugegen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das nach Anspruch 1 erhaltene Gemisch
zur Vervollständigung seiner Auflösung im Behälter schüttelt und - gegebenenfalls mehrmals - mit der
Spritze ansaugt und in den Behälter zurückdrückt.
ίο 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phospholipidemulsion eine Phospholipidemulsion
verwendet, die aus dem Dotter bzw. Eigelb von Hühnereiern hergestellt worden ist
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der therapeutische Wirkstoff ein Adrenocorticaiextrakt
ist.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT51947/78A IT1111367B (it) | 1978-11-17 | 1978-11-17 | Processo per la preparazione estemporanea di liposomi e liposomi cosi' ottenuti |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2946601A1 DE2946601A1 (de) | 1980-05-29 |
DE2946601C2 true DE2946601C2 (de) | 1990-05-31 |
Family
ID=11276064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2946601A Expired - Lifetime DE2946601C2 (de) | 1978-11-17 | 1979-11-19 | Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4308166A (de) |
AR (1) | AR219840A1 (de) |
CH (1) | CH643141A5 (de) |
DE (1) | DE2946601C2 (de) |
ES (1) | ES486055A1 (de) |
FR (1) | FR2441385A1 (de) |
GB (1) | GB2035947B (de) |
IL (1) | IL58584A (de) |
IT (1) | IT1111367B (de) |
SE (1) | SE440450B (de) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4394372A (en) * | 1980-12-22 | 1983-07-19 | The Procter & Gamble Company | Process for making lipid membrane structures |
US4551288A (en) * | 1982-08-16 | 1985-11-05 | Sandoz, Inc. | Processes for the preparation of liposome drug delivery systems |
GB2134869A (en) * | 1983-02-15 | 1984-08-22 | Squibb & Sons Inc | Method of preparing liposomes and products produced thereby |
GB2135647A (en) * | 1983-02-15 | 1984-09-05 | Squibb & Sons Inc | Method of preparing liposomes and products produced thereby |
FR2543018B1 (fr) * | 1983-03-22 | 1985-07-26 | Oreal | Procede de preparation de vesicules lipidiques par vaporisation de solvants |
US4622219A (en) * | 1983-06-17 | 1986-11-11 | Haynes Duncan H | Method of inducing local anesthesia using microdroplets of a general anesthetic |
FR2553002B1 (fr) * | 1983-10-06 | 1992-03-27 | Centre Nat Rech Scient | Procede perfectionne d'obtention de liposomes unilamellaires de diametres eleves, leur application pharmacologique pour l'encapsulage d'un principe actif en vue de son administration extemporanee et dispositif correspondant |
US5008050A (en) * | 1984-06-20 | 1991-04-16 | The Liposome Company, Inc. | Extrusion technique for producing unilamellar vesicles |
US5059421A (en) * | 1985-07-26 | 1991-10-22 | The Liposome Company, Inc. | Preparation of targeted liposome systems of a defined size distribution |
US5230899A (en) * | 1985-08-07 | 1993-07-27 | Smithkline Beecham Corporation | Methods and compositions for making liposomes |
ATE71540T1 (de) * | 1985-10-21 | 1992-02-15 | Liposome Co Inc | In situ-herstellung und verabreichung von liposomen. |
US4812314A (en) * | 1986-02-24 | 1989-03-14 | Yissum Research & Dev. Co. Of The Hebrew Univ. Of Jerusalem And Hadassah Medical Organization | Lipid replacement therapy |
WO1988003797A1 (en) * | 1986-11-28 | 1988-06-02 | The Liposome Company, Inc. | Phospholipid composition |
US4950432A (en) * | 1987-10-16 | 1990-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Polyene microlide pre-liposomal powders |
US5269979A (en) * | 1988-06-08 | 1993-12-14 | Fountain Pharmaceuticals, Inc. | Method for making solvent dilution microcarriers |
US5133965A (en) * | 1988-06-08 | 1992-07-28 | Fountain Pharmaceuticals, Inc. | Dressing material having adsorbed thereon a solvent dilution microcarrier precursor solution |
US5073543A (en) * | 1988-07-21 | 1991-12-17 | G. D. Searle & Co. | Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle |
US6235308B1 (en) | 1994-06-10 | 2001-05-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method of treating hypertension |
US5622715A (en) * | 1994-06-10 | 1997-04-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method of improving renal function |
JP5038552B2 (ja) | 1995-10-17 | 2012-10-03 | オバン・エナジー・リミテッド | 不溶性薬物の送達 |
US6465016B2 (en) | 1996-08-22 | 2002-10-15 | Research Triangle Pharmaceuticals | Cyclosporiine particles |
US7255877B2 (en) | 1996-08-22 | 2007-08-14 | Jagotec Ag | Fenofibrate microparticles |
US5891467A (en) | 1997-01-31 | 1999-04-06 | Depotech Corporation | Method for utilizing neutral lipids to modify in vivo release from multivesicular liposomes |
ES2201673T3 (es) * | 1998-02-11 | 2004-03-16 | Rtp Pharma Corporation | Combinacion de esteroides y acidos grasos poiinsaturados para el tratamiento de estados inflamatorios. |
US6979456B1 (en) | 1998-04-01 | 2005-12-27 | Jagotec Ag | Anticancer compositions |
AU764001B2 (en) | 1998-05-29 | 2003-08-07 | Skyepharma Canada Inc. | Thermoprotected microparticle compositions and process for terminal steam sterilization thereof |
CN1221249C (zh) | 1998-08-19 | 2005-10-05 | 斯凯伊药品加拿大公司 | 普鲁泊福的可注射水分散体 |
AU767154B2 (en) | 1998-11-20 | 2003-10-30 | Skyepharma Canada Inc. | Dispersible phospholipid stabilized microparticles |
CA2407027C (en) | 2000-04-20 | 2011-02-15 | Rtp Pharma Inc. | Improved water-insoluble drug particle process |
CA2420597C (en) | 2000-08-31 | 2011-05-17 | Rtp Pharma Inc. | Milled particles |
US8586094B2 (en) | 2000-09-20 | 2013-11-19 | Jagotec Ag | Coated tablets |
BRPI0105509B8 (pt) | 2001-11-05 | 2021-05-25 | Univ Minas Gerais | formulações do peptídeo angiotensina-(1-7) usando as ciclodextrinas, lipossomas e o polímero plga |
EP2492278A1 (de) | 2006-09-18 | 2012-08-29 | Compugen Ltd. | Antikörper gegen einen Agonisten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und deren Verwendung in Diagnose und Therapie |
JP5355561B2 (ja) | 2007-07-12 | 2013-11-27 | コンピュゲン エルティーディー. | 生物活性ペプチドおよびその使用方法 |
ES2916498T3 (es) | 2007-12-06 | 2022-07-01 | Genalyte Inc | Método para identificar una secuencia de nucleótidos en una especie desconocida de ácido nucleico; y dispositivo para llevar a cabo el método |
EP3572796B8 (de) | 2008-10-27 | 2023-01-18 | Genalyte, Inc. | Biosensoren basierend auf optischer sondierung und abtastung |
CA2816995C (en) | 2010-11-05 | 2019-12-31 | THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ILLINOIS, a body corporate and politic | Optical analyte detection systems and methods of use |
JP2014510045A (ja) | 2011-02-08 | 2014-04-24 | ハロザイム インコーポレイテッド | ヒアルロナン分解酵素の組成物および脂質製剤ならびに良性前立腺肥大症の治療のためのその使用 |
EP2825885B1 (de) | 2012-03-12 | 2021-05-12 | The Board of Trustees of the University of Illinois | Optische analytdetektionssysteme mit magnetischer verstärkung |
PL3186281T3 (pl) | 2014-08-28 | 2019-10-31 | Halozyme Inc | Terapia skojarzona enzymem rozkładającym hialuronian i inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej |
US10429302B2 (en) | 2015-08-11 | 2019-10-01 | Scintillon Institute For Biomedical And Bioenergy Research | Optical analyses of particles and vesicles |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3009856A (en) * | 1954-12-14 | 1961-11-21 | Armour & Co | Adrenocorticotrophin and vitamin b compositions |
DE2249552A1 (de) * | 1971-10-12 | 1973-05-30 | Inchema S A | Verfahren zur inkapsulation von insbesondere wasserloeslichen verbindungen |
US3932657A (en) * | 1973-11-12 | 1976-01-13 | The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration | Liposome encapsulation of chelating agents |
US3993754A (en) * | 1974-10-09 | 1976-11-23 | The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration | Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy |
JPS5186117A (en) * | 1975-01-27 | 1976-07-28 | Tanabe Seiyaku Co | Johoseibiryushiseizainoseiho |
DE2538678A1 (de) * | 1975-08-30 | 1977-03-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Injizierbare loesungen |
GB1523965A (en) * | 1976-03-19 | 1978-09-06 | Ici Ltd | Pharmaceutical compositions containing steroids |
GB1575343A (en) * | 1977-05-10 | 1980-09-17 | Ici Ltd | Method for preparing liposome compositions containing biologically active compounds |
CH624011A5 (de) * | 1977-08-05 | 1981-07-15 | Battelle Memorial Institute |
-
1978
- 1978-11-17 IT IT51947/78A patent/IT1111367B/it active
-
1979
- 1979-10-30 IL IL58584A patent/IL58584A/xx unknown
- 1979-10-30 US US06/089,386 patent/US4308166A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-11-09 SE SE7909282A patent/SE440450B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-11-16 AR AR278929A patent/AR219840A1/es active
- 1979-11-16 ES ES486055A patent/ES486055A1/es not_active Expired
- 1979-11-19 GB GB7939923A patent/GB2035947B/en not_active Expired
- 1979-11-19 DE DE2946601A patent/DE2946601C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1979-11-19 CH CH1030779A patent/CH643141A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-11-19 FR FR7928462A patent/FR2441385A1/fr active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2441385B1 (de) | 1983-04-08 |
GB2035947A (en) | 1980-06-25 |
CH643141A5 (de) | 1984-05-30 |
IT7851947A0 (it) | 1978-11-17 |
ES486055A1 (es) | 1980-09-01 |
SE7909282L (sv) | 1980-05-18 |
SE440450B (sv) | 1985-08-05 |
GB2035947B (en) | 1982-12-01 |
IL58584A (en) | 1982-08-31 |
FR2441385A1 (fr) | 1980-06-13 |
AR219840A1 (es) | 1980-09-15 |
IT1111367B (it) | 1986-01-13 |
DE2946601A1 (de) | 1980-05-29 |
US4308166A (en) | 1981-12-29 |
IL58584A0 (en) | 1980-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2946601C2 (de) | Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen | |
DE2818655C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, durch dieses Verfahren erhaltenes Gemisch sowie Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats | |
DE69318503T2 (de) | Ein definiertes lipidsystem enthaltende pharmazeutische zusammensetzung | |
DE3650302T2 (de) | Auf alpha-tocopherol basierte bläschen. | |
DE69535297T2 (de) | Zubereitung multivesikulärer liposomen zur gesteuerten freisetzung von wirkstoffen | |
EP0224837B1 (de) | Hautwirksame Pharmaka mit Liposomen als Wirkstoffträger | |
DE69815659T2 (de) | Zusammensetzung zur kontrollierten freisetzung | |
DE2747378A1 (de) | Liposomen, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel | |
DE3008082A1 (de) | Carcinostatisches und die immunreaktion stimulierendes mittel, enthaltend lysophospholipid und phospholipid, und verfahren zur herstellung desselben | |
DE2629100B2 (de) | Dispersion von Kügelchen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2907303A1 (de) | Verfahren zur einkapselung biologisch aktiver substanzen | |
DE2249552A1 (de) | Verfahren zur inkapsulation von insbesondere wasserloeslichen verbindungen | |
EP0707847A1 (de) | Ketoprofen Liposomen | |
EP1135193A1 (de) | Mittel zur tumortherapie auf liposomenbasis die tamoxifen enthalten | |
DE10141018A1 (de) | Verwendung von negativ geladenen Phospholipiden, sowie Zusammensetzungen umfassend Phospholipide zur Behandlung des Auges | |
DE2715286A1 (de) | Emulgatoren aus phosphatidylcholin und phosphatidyl-n,n-dimethyl-aethanolamin | |
DE69113036T2 (de) | Verzögerte arzneistoffabgabe durch topische anwendung bioadhäsiver liposomen. | |
DE3884945T2 (de) | Emulsion für parenterale verabreichung. | |
DE3309076C2 (de) | Liposome und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE1620629C3 (de) | Verwendung eines Salzes von 2-Merkaptoäthansulf onsäure zur Herstellung von Mukolytica | |
DE60123603T2 (de) | Lipide zur änderung des abwehrsystems | |
CH668005A5 (de) | Fusogene liposome und verfahren zu deren herstellung. | |
WO2001072289A2 (de) | Arzneimittel zur stimulierung der leukopoese, zur behandlung von tumor- und protozoenerkrankungen, von akarinosis, arthropodiasis und verfahren zu seiner herstellung | |
DE19522693A1 (de) | Zusammensetzung zur Herstellung feindisperser Systeme und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2756866C2 (de) | N-Oleoyl-Derivate von Phosphatidyläthanolaminen, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification |
Ipc: A61K 37/40 |
|
D2 | Grant after examination | ||
8363 | Opposition against the patent | ||
8366 | Restricted maintained after opposition proceedings | ||
8305 | Restricted maintenance of patent after opposition | ||
D4 | Patent maintained restricted |