DE2946601C2 - Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen, in die Wirkstoffe eingearbeitet sind.

Liposomtn sind bekanntlich künstliche Kügelchen aus Phospholipiden, die aus einer Reihe von konzentrischen Schichten, weiche mit wäßrigen Abteilen abwechseln, zusammengesetzt sind. Substanzen verschiedener Art können in den wäßrigen Abteilen oder den konzentrischen Schichten »eingefangen« sein.

Liposome, die erstmals von Bangham (»J. Mol. Biol.« 13 (1), 238 bis 259, 1965) hergestellt und später von Sessa und Weissmann (»J. Lipid Res.«, 1968 9 (3), 310 bis 318) so benannt wurden, wurden als erste als künstliehe Modelle zur Untersuchung der Eigenschaften von biologischen Membranen verwendet Tatsächlich wurde rasch festgestellt, daß die Pho^holipidwände von Liposomen Eigenschaften haben, die denjenigen von Erythrozyten, Lisosomen und Mitochondrien im Vergleich zu verschiedenen Artetr von Substanzen, wie Steroiden, Toxinen, Antibiotika und Arzneimitteln, perfekt analog sind.

Das praktische Potential der Liposomen liegt in der Tatsache, daß von diesen festgestellt wurde, daß sie nicht jo nur dazu imstande sind, die meisten Substanzen zu überziehen, sondern auch sie vor Abbauprozessen zu schützen und sie \z Richtung auf spezielle Zielorgane zu orientieren.

Nachteiligerweise hai die Kcmplexizität der Herstellungsprozesse für Lipsome, die therapeutisch aktive Substanzen enthalten, bislang noch nicht den Erhalt von gewerblich anwendbaren Produktionsmethoden gestattet. Dazu kommt noch, daß bei den Verbindungen, die hergestellt werden konnten, schwerwiegende Stabilitätsprobleme auftreten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben genannten Probleme zu überwinden und insbesondere ein billiges und einfaches Verfahren zum Herstellen von Liposomen, die Wirkstoffe enthalten, zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Art daaurch gelöst, daß man den Wirkstoff einarbeitet, indem man eine in Wasser oder physiologischer Lösung vorliegende Phospholipidemulsion mittels einer Spritze aufsaugt und in einen Behälter drückt, in dem der therapeutische Wirkstoffals trockenes Pulver oder als Lyophilisat zugegen ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man das wie oben erhaltene Gemisch zur Vervollständigung seiner Auflösung im Behälter schüttelt und - gegebe-■»5 nenfalls mehrmals - mit der Spritze ansaugt und in den Behälter zurückdrückt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun Liposome, die therapeutische Wirkstoffe enthalten, durch einfache Auflösung zum Zeitpunkt des Gebrauchs des Wirkstoffs in einer Phospholipidemulsion in Wasser oder einer physiologischen Lösung oder einer Pufferlösung und durch anschließendes Rühren hergestellt werden.

w Bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet man die Technik, die normalerweise für die Auflösung eines trockenen Pulvers oder eines Lyophilisats mit einem Lösungsmittel angewendet wird, nämlich

- Ansaugen der Phospholipidemulsion mit einer Spritze;

- Abgabe des Spritzeninhalts in einen Behälter (Gläschen oder Fläschchen), der den therapeutischen Wirk-.. stoff in trockenem oder lyophilisierten Zustand enthält;

- Durchschüttlung des Gläschens oder des Fläschchens, um die Auflösung zu verbessern;

- Ansaugen der Lösung mit einer Spritze und gegebenenfalls erneute Abgabe in den Behälter, um sie von neuem anzusaugen.

Zu diesem Punkt enthält die Spritze eine feine Suspension von Liposomen in einer wäßrigen Umgebung, die

öo in ihrer Struktur den therapeutischen Wirkstoff einschließen.

W Als Phospholipidemulsion können beispielsweise alle beliebigen wäßrigen Emulsionen von Phospholipiden

[;':■ von Sojabohnen, Hirnrinde, Eiern etc. verwendet werden.

V' Eine bevorzugt verwendete Emulsion wird ausgehend vom Eigelb bzw. Dotter von frischen Eiern nach dem

|- Verfahren gemäß der italienischen Patentschrift 9 89 501 hergestellt.

pV "5 Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

L-: Beispiel 1

jv; Eine ex-ovo-Phospholipidemulsion wurde gemäß der italienischen Patentschrift 9 89 50 t auf folgende Weise

hergestellt: 1000 frische Eier wurden zerbrochen und die Dotter bzw. das Eigelb wurden von dem Albumin abgetrennt. Die Dotter wurden aufgespalten und in einen Extraktor eingegossen, der 70 1 Äthylalkohol 90,5° von Raumtemperatur (22 bis 25°C) enthielt. Nach 24stündiger Infusion, während welcher Zeit die koagulierte Masse häufig gerührt wurde, um die Extraktion der Lipide zu erleichtem, wurde der alkoholische Extrakt erst durch eine Gazeschicht, die auf die Basis des Extraktors aufgebracht worden war, und sodann durch ein gefaltetes FiI-terpapier filtriert. Das Filtrait, das mit einem zweiten alkoholischen Extrakt vereinigt worden war, welcher in der Weise erhalten worden war, daß der Rückstand der ersten Extraktion 4 h lang mit 501 Äthylalkohol der Infusion unterworfen wurde, wurde in einen doppelwandigen Kolben gegeben, wobei heißes Wasser in dem Zwischenraum zirkulierte. Die AbdestUIation des Alkohols wurde unter Vakuum (20 bis 30 mm Hg) begonnen. Der Destillationsvorgang wurde weitergeführt, bis ein Alkoholgehalt von ungefähr 25% erhalten wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden 12,5 1 sterile physiologische Lösung in den Kolben gegossen und die Destillation wurde weitergeführt, bis der Alkohol vollständig entfernt war.

Das in dem Kolben zurückgebliebene Produkt wurde in 11 sterile 5-1-Kolben verteilt, von denen jeder 2,5 1 sterile physiologische Lösung bzw. sterile physiologische Kochsalzlösung enthielt. Die Kolben wurden etwa 12 h lang stehen gelassen, um die Abscheidung der Phospholipide zu gestatten. Am Ende dieses Zeitraums wurde die überstehende physiologische Lösung abdekantiert. Das sedimentierte Produkt stellte eine stabile Emulsion dar, die nach geeigneter Verdünnung direkt in Gläschen eingeführt werden kann.

Die durch Dünnschichtchromatographie durchgeführte Analyse der dispergierten Phase der Emulsion ergab die folgende prozentuale Zusammensetzung:

20

Phosphatidylcholin (Lecithin)	71,4
Phosphatidyläthanolamin (Cephalin)	15,4
Lysochcsphaiidyicho! in	7,3
Sphyngomyelin	4,1
Phosphatidinsäure	0,4
andere nicht-identifizierte Phosphoiipide	1,4

Unter Verwendung der auf die obige Weise hergestellten Phospholipidemulsion wurden fünf verschiedene Suspensionen nach folgenden Techniken erhalten: m

1) Beschallung. Das Phospholipidgemisch wurde in Wasser (~50 mg/ml) suspendiert und einer Ultraschallbehandlung mit einer Ultratip-Vorrichtung (Wellenenergiesystem) mit einer Energie, die zwischen 40 und 60 W variierte, unterworfen. Die Temperatur wurde für die gesamte Dauer des Prozesses zwischen 4 und 6°C gehalten. Nach einer mehrminütigen Beschallung wurde eine Suspension von transparenten Liposomen (SUV) mit klarer gelber Farbe erhalten. Diese wurde auf einer Säule mit Sephadex G 50 eluiert, um ^iJ gegebenenfalls vorhandene Mizellen mit größeren Abmessungen abzutrennen.

2) Wirbelrührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde 1 h lang einer Wirbelrührung unterworfen und ohne weitere Behandlung verwendet.

3) Manuelle Rührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach 5minütigem manuellen Rühren verwendet.

4) Drehbewegung mit einer Spritze. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach aufeinanderfolgenden Ansaugungen und Ausdrückungen in bzw. aus einer Spritz» für die intramuskuläre Injektion verwendet.

5) Es wurde die gleiche Technik, wie unter 4) beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch das Ausdrücken und das Ansaugen der Flüssigkeit aus bzw. in ein Gläschen erfolgte, das einen lyophilisierten Adrenocorticalextrakt mit folgender prozentualer Zusammensetzung enthielt:

Aluosteron	5,5%
Corticosteron	26,4%
Cortison	13,7%
Hydrocortison	17,0%
11 -Dehydrocorticosteron	17,6%
17-Hydroxy-11 -desoxycorticosteron	5,1%
anüere	14,7%

Die fünf verschiedenen Suspensionen wurden durch Infrarot- (IR-), Ultraviolett-(UV-), kernmagnetische ^ Resonanz- (NMR-) und elektronenmikroskopische Verfahren bei folgenden Versuchsbedingungen unterricht:

a) IR- und UV-Messungen:

Das Infrarotspektrum des Phospholipidgemisches allein und in Gegenwart des Aürenocorticalextrakts wurde mit einem Perkin-Elmer-577-Spektrophotometer mit einer Abtastze.it von 15 min. aufgezeichnet. Die entsprechenden Ultraviolettspektren (Lösungsmittel: Petroläther 30 bis 50) wurden mit einem Beckman*DK..2«Spektrophotometer unter Verwendung einer Quarzzelle mit einer Kantenlänge von 1 cm aufgezeichnet.

b) NMR-Messungen:

Die ⁿC-Spektren (in D₃O und in CDCI₁) wurden mit einem Bruker-WH-90-Spektropholometer, das bei b5 22,63 MHz in einer Fourier-Anordnung arbeitet, aufgezeichnet.

Die Versuchsbeuingungen waren: Impulsbreite 30°, Anzahl der Impulse zwischen 20 000 und 30 000,16 K des Gedächtnisses, SW von 6000 Hz. Umgebungstemperatur, innerer Verschluß auf dem Deuterium des

Lösungsmittels (CDCl, oder D₂O). Die chemischen Verschiebungswerte wurden im Vergleich zuTetramelhylsilan (TMS) bestimmt, das als interne Referenz für die Lösungen in CDCI, und extern für die Suspensionen in DjO verwendet wurde. Die Protonenspektren wurden bei 90 MHz mit einem Brukcr-HX90-Instrument, das mit einer kontinuierlichen Welle arbeitet, aufgezeichnet. DSS wurde als interne Referenz ■> und als Verschluß verwendet. Die Proben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken 4)

und 5) hergestellt,
c) Elektronenmikroskopische Messungen:

Die Elektronenmikrophotographien wurden unter Verwendung eines Siemens-Elmiskop-102-Instruments erhalten. Die Beobachtungen erfolgten unter negativem Kontrast mit 2% Phosphorwolframsäure.

Ergebnisse
IR und UV

Das IR-Spektrum des Phospholipidgemisches, das Zuordnungen der darin vorhandenen Signale gestattet, ist Ii in Tabelle I dargestellt.

Aus dem UV-Spektrum kann nur die Anwesenheit von Fettsäuren mit Doppelbindungen, die an die Seitenketten von verestertem oder freiem Glycerin gebunden sind, hergeleitet werden. Die Zugabe des Corticosteroidextrakts bewirkte keine nennenswerte Veränderung der in den Spektren vorhandenen Signale.

,₀ Elektronenmikroskopie

Die Mikrophotographien der Fig. 1 bis 5 zeigen die Ergebnisse, die mit den folgenden Proben erhalten wurden:

1) 5minütige manuelle Rührung

Fig. IAX 15 000
Fig. IB X 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >5000 A

2) einstündige Wirbelrührung

Fig. 2AX 15 000
,,, Fig. 2Bx 60000

scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 10 000 A

3) 15minütige Beschallung

Fig. 3AX 15 000
Fig. 3 B X 60 000
j. scheinbarer Durchmesser der Bläschen >300 bis 1000 A

4) Rühren mit der Spritze

F i g. 4 A X i 5 000
Fig.4Bx60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2500 A

5) Rühren mit der Spritze (die Illustrationen beziehen sich auf das Phospholipidgemisch in Gegenwart des Corticosteroidextrakts)

Fig.5Ax 15 000
Fig. 5Bx 60 000
scheinbarer Durchmesser der Bläschen >1000 bis 2000 A.

Die Untersuchung der Mikrophotographien zeigt, daß die Herstellungsmethode der Phospholipidsuspensionen die Struktur der gebildeten Bläschen bestimmt. Tatsächlich zeigen Suspensionen, die durch eine einfache mehr oder weniger verlängerte Rührung erhalten worden sind, Bläschen, die im allgemeinen größer sind, einen nicht-gleichförmigen Durchmesser haben und strukturell dem MLV-Typ ähnlich sind. Im Gegensatz dazu zei-■)ii gen Suspensionen, die durch Verwendung der Spritze erhalten worden sind, Bläschen, die im Durchmesser eindeutig kleiner sind als im vorliegenden Falle, deren Durchmesser homogener sind und die vom gleichen Typ sind, wie sie nach der Beschallungsmethode (SUV) hergestellt werden können.

NMR

5; Die Protonen-NMR- und die ¹³C-Spektren des Phospholipidgemisches in CDCl₃ zeigen die chemischen Ver schiebungswerte (bezogen auf TMS) der verschiedenen Resonanzbanden, die in den Tabellen II und III angege ben sind, zusammen mit einigen Zuordnungen.

Die ¹H- und ^l3C-Spektren des gleichen Gemisches in D₂O ergeben die chemischen Verschiebungswerte um die Zuordnungen, die in den Tabellen IV bzw. V angegeben sind.

co Im allgemeinen zeigen diese Spektren erheblich größere Linienbreiten im Vergleich zu den entsprechendei Spektren in CDClj-Lösungen.

Im ¹³C-Spektrum werden jedoch eindeutig mehrere Linien, die bei 19,6,60,26 und 63,58 ppm zentriert sini und die erheblich enger und in der Breite mit den Spektren in Chloroform vergleichbar sind, festgestellt.

Das ^!3C-Spektrum des Phosphoiipidgemisches in Gegenwart des Adrenocorticalextrakts in D₂O und in CDCl h5 ist im wesentlichen mit demjenigen identisch, das in Abwesenheit des lyophiüsierten Extrakts erhalten wire

Beispiel 2
Um den Grad zu bestimmen, mit dem ein Adrenocorticalextrakt innerhalb einer Phospholipidemulsion unte

Bildung von Liposomen gemäß der Erfindung umhüllt wird, wurde der tolgende Versuch durchgeführt, wobei lyophilisierte Gläschen verwendet wurden, die jeweils 390 Mikrogramm Conicoid mit folgender prozentualer Zusammensetzung (berechnet als Hydrocortison) enthielten:

Tetrahydrocortison	0,20%
Aldosteron	5,28%
I I-Dehydrocorticosteron	!7,58%
Corticosteron	26,38%
Cortison	13,78%
Hydrocortison	17,00%
n-Hydroxy-ll-desoxycorticosteron	5,13%
andere Fraktionen	14,65%

100,00%

Um den Adrenocorticalextrakt in der Phospholipidemuision freizusetzen, wurde die in Stufe 5 des Beispiels 1 beschriebene Technik verwendet.
Die Versuche wurden entsprechend dem folgenden Plan durchgeführt:

1) 390 ug lyophilisierter Adrenocorticalextrakt in einem Gläschen wurden in 15 ml H₂O (Kontrolle) aufgelöst, 16 h lang bei 10°C gehalten und dann zu der gleichen Zeit wie die anderen Lösungen analysiert.

2) Vier lyophilisierte Gläschen, die die gleiche Menge Adrenocorticalextrakt enthielten, wurden in 20 ml exovo-Phospholipidemulsion, 5% in physiologischer Lösung, aufgelöst.

2a) 10 ml der Corticosteroidlösung in Phospholipidemuision wurden 16 h bei ca. 10⁰C absetzen gelassen. Fast alle Phospholipide blieben am Boden des Behälters. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch 5minütiges Zentrifugieren bei 1000 Upm geklärt. 5 ml der zentrifugierten Flüssigkeit wurden mit H₂O auf 15 ml verdünnt.

2b) 5 ml Lösung 2), d. h. einer Lösung, die Corticosteroide und Phospholipide, die weder durch Stehenlassen noch durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, enthielt, wurden auf 15 ml mit H,0 verdünnt.

3) Zur gleichen Zeit wie die 20 ml Phospholipidemuision ohne Corticosteroide wurden zwei Lösungen nach der gleichen Verfahrensweise hergestellt, die für die Lösungen 2a) und 2b) angewendet worden war. Auf diese Weise wurden zwei Lösungen, ämlich die Lösung 3a), die als Kontrolle für die Analyse der Lösung 2a) verwendet wurde, und die Lösung 3 b), die als Kontrolle für die Lösung 2 b) verwendet wurde, erhalten.

Analysen aller Lösungen wurden durchgeführt, indem jeweils 15 ml mit 4 x 10 ml Chloroform extrahiert wurden. Die Chloroformextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mit 10 ml 95° Äthanol gesammelt und (bei 1 ml alkoholischer Lösung) einer kolorimetrischen Reaktion mit Tetrazoliumblau unterworfen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Corticosteroidbestimmungen^g/lS ml)

Lösung I

Corticosteroide

Lösung 2 Lösung 3 Phospholipide + Corticosteroide nur Phospholipide

2a) überstehendes 2b) Gesamtmenge 3a) überstehendes

Produkt Produkt

3 b) Gesamtmenge

345

Aus der Gleichung

57

141

345-57 345

x 100 = 83,5% wird abgeleitet, daß dies die Prozentmenge Corticosteroide ist, die

von den Phospholipiden zurückgehalten wird. Als Kontrolle ergibt die Gleichung

(410-141)-57

x 100 den Wert von 79%, der in guter Übereinstimmung mit

410-141

dem vorstehenden Wert steht. (Es sollte festgestellt werden, daß die Phospholipide alleine gleichfalls eine Reaktion mit dem Tetrazoliumblau ergeben. Diese Tatsache sollte im Gedächtnis behalten werden).

Aus den oben beschriebenen Versuchen kann hergeleitet werden, daß die Phospholipide in Form von Liposomen den größten Teil (ca. 80%) der in der Lösung vorhandenen Corticosteroide zurückhalten.

Pharmakologischer Test

Unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Suspension der Corticosteroide enthaltenden Liposome wurde ein pharmakologischer Test des Überlebens von adrenalektomisierten Mäusen durchgeführt, der in folgender Weise ausgeführt wurde:

Die Versuche wurden mit Schweizer Mäusen vom Morini-Stamm durchgeführt, die unter Äthernarkose transabdominal adrenalektomisiert worden waren. Die Mäuse wurden unmittelbar nach dem Entwöhnen (durchschnittliches Gewicht 10 ± 1 g) adrenalektomisiert.

Die adrenalektomisierten Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: Eine Gruppe diente als Kontrollgruppe, die anderen drei Gruppen erhielten eine einzige Injektion des lyophiiisierten Adrenalsteroidgemisches mit folgender Zusammensetzung: ll-Desoxy-n-hydroxycorticosteron 6%; ll-Dehydrocorticosteron 11,5%; Hydrocortison 31%; Aldosteron 2,9%; Corticosteron 18,22%; andere Fraktionen 4,6%. Das Gemisch wurde in destillier-

tem Wasser, Sesamöl oder in dem Phospholipidgemisch, erhalten aus einer 5%igen Eidotteremulsion in physiologischer Lösung gemäß Beispiel 1, dispergiert, wobei die Technik der Stufe 5) des gleichen Beispiels angewendet wurde.

Die Injektion erfolgte unter die Dorsalhaut in den interskapulären Bereich 5 minvorder Adrenalektomie. Die injizierten Gesamtvolumina betrugen 0,4 ml pro Tier. Die Tiere wurden bei einer Temperatur von 22 ± I⁰C und einer relativen Feuchtigkeit von 60% mit einem 24stündigen Nacht- und Tagesrhythmus (12h Licht/24) über die gesamte Versuchsdauer gehalten.

Die Mortalität pro h wurde sowohl bei den behandelten als auch bei der Kontrollgruppe über einen Zeitraum von 66 h aufgezeichnet. Die Werte wurden auf Differenzen nach Student »t« und Dunnet »t« für Globalität der Versuche umgerechnet, wobei die faktorielle Methode von R. A. Fisher zum »Vergleich der Verhältnisse« während verschiedenen h der Beobachtung angewendet wurde.

Ergebnisse

Die Analyse des Vergleiches der Verhältnisse, die auch nach der Fisher-Methode auf alle Zeitintervalle der Beobachtungen angewendet wurde, zeigte, wie erwartet, eine statistisch signifikante Differenz des Überlebens der Tiere, die mit dem Adrenalhormongemisch im Vergleich zu den unbehandelten Tieren (Tabellen VI und VlI) behandelt worden waren. Im Falle des wäßrigen Trägers war jedoch das Überleben bis zu der 18. h begrenzt. Über diese Grenze hinaus besteht praktisch kein Schutz auf den Teil einer Dosis von Corticoiden, die verwendet wird, wenn ais Träger Wasser verwendet wird.

Dagegen ist das Verhältnis der Mäuse, die mit Adrenocorticalhormonen, die mit Phospholipiden getragen werden, im Vergleich zu Kontrolltieren überleben, sehr augenscheinlich (Tabelle Vl). Es ist bereits von der 12. h hoch signifikant (Tabelle VII). Wenn die Tiere mit Hormonen behandelt wurden, die in Öl getragen waren, dann ist das Verhältnis des Überlebens im Vergleich zu den Kontrolltieren statistisch signifikant (P 0,05) und beginnt mit der 18. und endet mit der 30. h.

Das prozentuale Überleben im Verhältnis zu dem Träger zeigt daher eine klargeschnittene Zunahme des hormonellen Schutzes bei dem Phospholipidträger (Tabelle Vl). Tatsächlich geht im Vergleich zu Tieren, die mit Adrenocorticalhormonen in Wasser behandelt worden waren, das Überleben über die 36. h hinaus und es ist fast bis zur 66. h ersichtlich (Tabelle VII). Selbst die Injektion der Adrenalhormone in Öl scheint das Überleben im Vergleich zu Hormonen in Wasser eindeutig zu verlängern, doch ist der erhaltene Schutz verhältnismäßig geringer als derjenige, der mit Adrenalhormonen und Phospholipidgemisch erhalten wird. 100% der Tiere, die mit Corticalhormonen in wäßrigem Träger behandelt worden waren, waren um die 13. h gestorben. Um die 16. h waren 100% der Tiere, die mit Corticalhormonen in dem öligen Träger behandelt worden waren, gestorben, während 25% der Tiere, denen die Corticalhormone mit den Phospholipiden injiziert worden waren, immer noch überlebten.

Tabelle 1

Eiphospholipidsuspension - IR-Spektrum

Wellenzahl (cm ')

Zuordnungen

2915 und 2845 mit Schulter bei 2948 1725

1460 und 1380 1235

1090 und 1050 970

Streckung der CH₂-Gruppen und CH_rTerminale Streckung der CO-Estergruppe Biegung der CH₂-Gruppen und CHj-Terminale

a) Hin- und Herbewegung der CH₂- und CH,-Gruppen

b) Streckung der PO-Gruppe

a) Schaukeln der Terminale der CH₃-Gruppe

b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch)

a) Herausdeformationen aus der Ebene der Gruppe -CH=CH- (trans) der Sphyngomyeline

b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch)

Tabelle II

NMR-Werte - Ή in CDCl₃

(5 (ppm von TMS)

Zuordnungen

0.89 1,27 2,03 2,30 2.83 3,37

CHrTerminale

-(CH₂)_n-Fettkelten

CH₂-AIIyI

CH₂CO

=CH CH₂ CH=

⁺N (CH₃),

T(NC I/Ii η μ PiMi- ...γ, γμ:>

4*33 I 5,36

ite Multipletts ^'"A','^

CH₂N voll, CH₂ OP -CH₂O Glycerin

CH = ;CH-0

Tabelle III

NMR-Werte - ^IJC in CDCl₃

(S (ppm von TMS)

Zuordnungen

11,66 !3,89 18,52 19,23 20,95 22,37 22,50 23,70 24,73 25,44 26,35 27,03 27,81 28,07 29,04 29,13 29,52 31,34 31,72 33,96 34,12 35,61 36.03 36,35 37,19 39,36 39,65 42,18 50,06 54,15 56,64

59,46 62,91 63,54 66,16 70,53 71,11 121,18 127.75

-CHj -CH-,-Terminals

CH₂ CH₃

CH, CH₂ CO = CH CH₂ CH

= CH₁ CH = -(CH₂)„-Fettketten

CH₂ CH₂ CH₃ CH₂CO CH,N Äthanolamin

N (CH₃)., Kohlenstoffatome des Glycerins und der Alkoholketten, die das Phosphat verestern

CH-O CH₂ = (Vinylgruppen)

η (ppm von TMS)

127,95 128,17 128,46 128,79 128,88 129,5 129,82 130,05 130,31 140,99 172,93 173,32

Zuordnungen

CH =CH

¹J-

C = (quatemäre Gruppe auf Doppelbindung) -CO-Ester

In der Position der Signale besteht beim Vorhandensein des Adrenocorticalextrakts keine Variierung.

Tabelle IV

NMR-Werte - ¹H in D₂O

ό (ppm von DSS)

0.93 1,33 2.11 3.29

Zuordnungen

CHj-Terminale -(CHj)„-Kette CH₂ Allylgruppen, CH₂CO N(CHj)₃

Es handelt sich um sehr breite Bänder. Das Signal für CH= wird von demjenigen des Wassers (4,79 ppm) versteckt.

Tabelle V

NMR-Werte - ¹³C in D₃O

(ppm von TMS)

Zuordnungen

16,6	breit	-CHj-Terminale
19,61*)
25,34	breit	CH2 CH3
31,72 35,44	sehr breit	-(CH2)„-Fettketten
56,35 \ 56,93 I	weites Band	N(CH3),
60,26*)
65,38*)
130.62 \
131.07 I	sehr breit	CH =

*) Diese Signale sind eng, wobei Ay 1/2 mit demjenigen der Signale in Clilorolbrmlösung vergleichbar ist.

In Gegenwiirl des Adrcnucorticalcxtrakls ist das "C-Spektrum mit Ausnahme von drei engen und gut definierten Signalen bei 66.06. 72.21 und 73,79 ppm identisch.

Tabelle VI

Überlebensstunden von Mäusen, die adrenalektömisiert und mit einem Ädrenöcorticalextrakt in einem wäßrigen, öligen und Phospholipidträger behandelt wurden.

Behandlung Überlebensstünden Uunnel »l« Signifikanz

χ+ SE

1) destilliertes Wasser (Kontrollen) 14 ± 4,671 1 vs 2 0,8 N. S.

2) Adrenocorticälextrakt in destilliertem 18 ± 7,441 1 vs 3 2,3 0,05 ^m Wasser

3) Adrenocorticälextrakt in Sesamöl 29 ± 16,405 1 vs 4 4,9 0,01

2 vs 4 4,0 0,01

4) Adrenocorticalextrakt in Phospholipiden 40 ±20,674 2 vs 3 1,4 N. S. 15

Tabelle VlI

Vergleich zwischen einer Kontrolle und drei Behandlungen, die zwischen der 6. und 66. h studiert wurden; durchgeführt nach der »direkten oder faktoriellen Methode« von R. A. Fisher ²⁰

% Probabilität

6 h 12 h 18 h 24 h 30 h 36 h 48 h 54 h 60 h 66 h

Kontrolle gegen 50 23,3 4,7*) 23,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

ACE + Wasser

Kontrolle gegen 23,9 3,2*) 0,1**) 0,2**) 0,7**) 0,7·*) 10,9 10,9 10,9 50,0

ACE + PhosphoHpid _3υ

Kontrolle gegen 38,6 12,8 0,9**) 3,6*) 3,6*) 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0

ACE + Öl

ACE+ H₂O gegen 50,0 14,0 1,7**) 4,0*) 0,7**) 0,7**) 10,9 10,9 10,9 50,0

ACE + Phospholipid

ACE+ H₂O gegen 63,2 29,8 22,9 19,9 3,6*) 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0 ³³

ACE + Öl

ACE + Phospholipid 100,0 49,1 19,9 30,0 35,0 12,8 39,7 39,7 36,8 63,2

gegen ACE + Öl

·) = signifikant bis zur 5%-Sicherheitsgrenze **) = signifikant bis zur 1%-Sicherheitsgrcnze ACE = Adrenocorticalextrakt

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum extemporierten Herstellen von Liposomen, in die Wirkstoffe eingearbeitet sind, dadurchgekennzeichnet, daß man den Wirkstoff einarbeitet, indem man eine in Wasser oder physiologischer Lösung vorliegende Phospholipidemulsion mittels einer Spritze aufsaugt und in einen Behälter drückt, in dem der therapeutische Wirkstoff als trockenes Pufver oder als Lyophilisat zugegen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das nach Anspruch 1 erhaltene Gemisch zur Vervollständigung seiner Auflösung im Behälter schüttelt und - gegebenenfalls mehrmals - mit der Spritze ansaugt und in den Behälter zurückdrückt.

ίο 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phospholipidemulsion eine Phospholipidemulsion verwendet, die aus dem Dotter bzw. Eigelb von Hühnereiern hergestellt worden ist

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der therapeutische Wirkstoff ein Adrenocorticaiextrakt ist.