DE2818655C2 - Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, durch dieses Verfahren erhaltenes Gemisch sowie Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, durch dieses Verfahren erhaltenes Gemisch sowie Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf Liposome und insbesondere auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Liposomen.
  • Liposome sind in der Literatur vielfach beschrieben, und ihre Struktur ist allgemein bekannt. Üblicherweise besitzen sie eine multilamellare Struktur aus einer Vielzahl von Phospholipid-Bischichten, die voneinander durch ein wäßriges Material getrennt sind.
  • Eine andere bekannte Liposomtype besteht aus einer einzigen Phospholipid-Bischicht, die ein wäßriges Material einschließt; diese unilamellaren Formen werden manchmal als "Vesikel" bezeichnet. In den letzten Jahren ergab sich ein wachsendes Interesse an der Verwendung von Liposomen als Träger für Verbindungen, die wegen der einen oder anderen biologischen Eigenschaft von Interesse sind, wie z. B. Medikamente, Proteine, Enzyme, Hormone, Vitamine und Markierungsverbindungen. Es wird darauf hingewiesen, daß für diese breite Gruppe von biologisch interessierenden Verbindungen, die Medikamente (menschliche und veterinäre) umfaßt, aber nicht darauf beschränkt ist, in dieser Beschreibung die Bezeichnung " biologisch aktive Verbindungen" verwendet wird.
  • Die Einkapselung von biologisch aktiven Verbindungen in Liposome kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Bei dem Verfahren, das am üblichsten ist, wird ein Phospholipidfilm (mit oder ohne einem geladenen Lipid) durch Eindampfen einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, hergestellt und anschließend in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert. Im Falle von lipidlöslichen biologisch aktiven Verbindungen, d. s. also solche, die sich mit den Lipidschichten und nicht mit der wäßrigen Phase der Liposome assoziieren, wird die Verbindung üblicherweise als Film zusammen mit einem Phospholipid unter Verwendung eines üblichen organischen Lösungsmittels gegossen. Im Falle von wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindungen wird die Verbindung üblicherweise in Liposome durch Dispergieren eines gegossenen Phospholipidfilms mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung eingekapselt. Die eingekapselte Verbindung wird dann von der freien Verbindung durch Zentrifugieren, Chromatografie oder ein anderes geeignetes Verfahren abgetrennt. In dem Fall, daß die biologisch aktiven Verbindungen, welche sich mit der Lipidphase von Liposomen assoziieren, in einer Menge vorliegen, die unter der maximalen Lipidlöslichkeit oder unter der maximalen Menge, die durch das Lipid gebunden werden kann, liegt, enthalten Liposome, die durch das obige Verfahren hergestellt worden sind, üblicherweise den größten Teil der Verbindung in den Lipid-Bischichten gebunden, weshalb die Abtrennung der freien Verbindung nicht so kritisch ist wie im Falle von wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindungen, die sich nicht an das Lipid binden.
  • Das obenerwähnte Verfahren eignet sich nicht für die Anwendung im technischen Maßstab. Außerdem besitzen wäßrige Liposomdispersionen nur eine beschränkte Stabilität, weshalb ihre Lagerfähigkeit beschränkt ist. Darüber hinaus können Liposome Aggregate bilden und als Sediment ausfallen. Zwar können solche Sedimente üblicherweise wieder dispergiert werden, jedoch kann die Struktur und die Größenverteilung der ursprünglichen Dispersion verändert werden. Die Aggregation und Sedimentation kann durch die Einverleibung von geladenen Lipiden in die Liposome verringert werden, aber dies garantiert keine zufriedenstellende Lagerfähigkeit. Der Verlust der biologisch aktiven Verbindung aus den Liposomen in das äußere wäßrige Medium ist ein weiterer Faktor, der die Anwendungsmöglichkeit dieser Präparate als praktische Dosierungsformen beschränkt. Dies gilt insbesondere für niedrigmolekulare wasserlösliche Verbindungen, jedoch können auch lipidlösliche Verbindungen teilweise in das äußere wäßrige Medium gehen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Wenn der Gehalt an Verbindung klein ist und/oder wenn das Volumen des äußeren wäßrigen Mediums groß ist, dann kann dieser Verlust einen beträchtlichen Anteil des Gesamtgehalts der biologisch aktiven Verbindung in den Liposomen ausmachen.
  • Alle diese Faktoren beschränken die Verwendung von Liposomen als praktische Träger für biologisch aktive Verbindungen, insbesondere in der medikamentösen Therapie. Eine Lösung könnte darin liegen, den Film aus Lipid und biologisch aktiver Verbindung herzustellen und zu lagern und dann bei Bedarf erst kurz vor der Anwendung unter Bildung von Liposomen zu dispergieren. Jedoch macht die Herstellung und Lagerung eines Films in einer Einheitsdosis ernsthafte praktische Schwierigkeiten, weshalb diese Idee keine praktische Lösung der oben aufgeführten Probleme liefert.
    •
  • Die vorliegende Erfindung befaßt sich nunmehr mit zwei alternativen, jedoch eng verwandten Verfahren, die eine praktische Lösung ergeben. Kurz gesagt, die Verfahren bestehen darin, daß man entweder (1) die nötigen Substanzen in einem geeigneten Lösungsmittel auflöst, die Lösung einer Gefriertrocknung unterwirft, das gefriergetrocknete Gemisch lagert und bei Bedarf in ein wäßriges Liposompräparat verarbeitet oder (2) ein wäßriges Liposompräparat durch irgendein bekanntes Verfahren herstellt, das Präparat gefriertrocknet, das gefriergetrocknete Gemisch lagert und bei Bedarf in ein wäßriges Liposompräparat verarbeitet. Bei beiden Gefriertrocknungsmethoden gemäß der Erfindung kann jedes geeignete Gefriertrocknungsverfahren verwendet werden. Der Kürze wegen wird in der Folge der Ausdruck "gefriergetrocknete Gemische von potentiellen Liposomen" für die gefriergetrockneten Gemische verwendet, die gemäß der Erfindung erhältlich sind und die bei Dispergierung in einem geeigneten wäßrigen Medium die gewünschten Liposompräparate liefern. Unerwarteterweise wurde festgestellt, daß Liposome gebildet werden, die denjenigen ähnlich sind, die durch das bekannte Filmdispergierungsverfahren erhalten werden, wenn man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen gemäß der Erfindung wieder in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert. Im Falle einer lipidlöslichen oder lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindung wird diese Verbindung weitgehend wieder in die Liposome inkorporiert. Andererseits sind die erfindungsgemäßen Verfahren, wie weiter unten erörtert, nicht so für solche wasserlösliche biologisch aktive Verbindungen geeignet, die sich nicht an das Lipid binden. Die gefriergetrockneten Gemische dispergieren sich leicht, wenn sie mit einem wäßrigen Medium geschüttelt werden, und es scheint, daß sie zu Liposompräparaten führen, die eine engere Größenverteilung aufweisen als entsprechende Präparate, die durch Dispergieren eines gegossenen Films erhalten werden. Dies kann hinsichtlich der Reproduzierbarkeit des Effekts der Liposompräparierungen von Vorteil sein.
  • Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man mindestens ein liposombildendes amphipathisches Lipid, mindestens eine biologisch aktive Verbindung und ggf. mindestens ein Hilfsmittel in einem Lösungsmittel auflöst und hierauf die Lösung gefriergetrocknet, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes amphipathische Lipid verwendet werden, von dem bekannt ist, daß es sich für die Herstellung von Liposomen durch an sich bekannte Verfahren eignet. So kann gemäß der Erfindung eine große Reihe von Lipiden verwendet werden, aber solche, die nicht-immunogen und biologisch abbaubar sind, werden bevorzugt. Beispiele für geeignete Lipide sind die Phospholipide, wie z. B. die natürlichen Lecithine, z. B. Eilecithin oder Sojabohnenlecithin, oder synthetische Lecithine, wie z. B. gesättigte synthetische Licithine, z. B. Dimyristoyl-phosphatidyl-cholin, Dipalmitoyl-phosphatidyl-cholin oder Distearoyl-phosphatidyl- cholin, oder ungesättigte synthetische Lecithine, wie z. B. Dioleyl-phosphatidyl-cholin oder Dilinoleyl-phosphatidyl- cholin. Es kann entweder ein einziges Phospholipid oder ein Gemisch von Phospholipiden verwendet werden.
  • Wie oben bereits angedeutet, kann die biologisch aktive Verbindung irgendeine Verbindung mit einer Eigenschaft von biologischem Interesse sein. So kann die Verbindung ein Medikament, ein Protein, ein Enzym, ein Hormon, ein Vitamin oder eine Markierungsverbindung sein. Es wird darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäßen Verfahren sich besonders im Falle von lipidlöslichen oder lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindungen (welche einige wasserlösliche Verbindungen umfassen, wie z. B. Proteine) eignen. Die erwähnten Verfahren sind nicht so geeignet für wasserlösliche, nicht lipidgebundene biologisch aktive Verbindungen, da in diesen Fällen nur ein verhältnismäßig kleiner Anteil der Verbindung bei der Dispergierung des gefriergetrockneten Gemischs wieder in die Liposome inkorporiert wird. Aber trotzdem kann dieser Nachteil hingenommen werden, wenn ein geeigneter Überschuß der wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindung in das gefriergetrocknete Gemisch einverleibt wird. Wenn die Anwesenheit von freier biologisch aktiver Verbindung im äußeren wäßrigen Medium von Nachteil ist, dann muß bei der Herstellung von Liposomen aus einem solchen Gemisch die freie Verbindung durch eines der oben erwähnten Verfahren entfernt werden. Somit hängt die Eignung der erfindungsgemäßen Verfahren im Falle von wasserlöslichen, nicht lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindungen vor allem von den relevanten Tatsachen ab, wie z. B. (1) der Natur der Aktivität der Verbindung, (2) der Wirkungsstärke der Verbindung, (3) der Menge der Verbindung, die beim erfindungsgemäßen Verfahren in das Liposompräparat einverleibt wird, und (4) der Erwünschtheit von freier Verbindung im äußeren wäßrigen Medium.
  • Beispiele für fakultative Hilfsstoffe sind Substanzen, die eine negative Ladung liefern, wie z. B. Ei-Phosphatidinsäure, Dipalmitoyl-phosphatidinsäure, Dicetylphosphat oder Rinderhirngangliosid, oder Substanzen, die eine positive Ladung liefern, wie z. B. Stearylamin oder Stearylaminacetat, oder Substanzen, die die physikalischen Eigenschaften der Lipidbischichten in den Liposomen in erwünschter Weise beeinflussen, sie beispielsweise nach Bedarf flüssiger oder fester machen, wie z. B. Cholesterin.
  • Wie oben bereits angedeutet, besitzen geeignete Lösungsmittel die Eigenschaft, daß sie das obenerwähnte Gemisch von Bestandteilen auflösen. Das Lösungsmittel kann aus ein oder mehreren Substanzen bestehen. Bevorzugte Lösungsmittel bleiben während des Gefriertrocknungsverfahrens fest. Besonders bevorzugte Lösungsmittel besitzen einen Schmelzpunkt in der Nähe von Raumtemperatur. Beispiele für solche Lösungsmittel sind t-Butanol, n-Butanol, Dioxan, Essigsäure, Pyridin oder Piperidin. Gegebenenfalls können ein oder mehrere Flüssigkeiten zusätzlich anwesend sein, welche die Dispergierung der Bestandteile unterstützen, wie z. B. Wasser oder Chloroform.
  • Gemäß der Erfindung wird weiterhin ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen vorgeschlagen, welches durch das weiter oben beschriebene Verfahren erhalten wird.
  • Gemäß der Erfindung wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, das durch ein weiter oben beschriebenes Verfahren erhältlich ist, in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert.
  • Ein geeignetes wäßriges Medium ist beispielsweise destilliertes Wasser, isotonische Kochsalzlösung oder eine sterile oder nicht-sterile Pufferlösung.
  • Gemäß der Erfindung wird schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man durch irgendein bekanntes Verfahren eine wäßrige Liposomzusammensetzung, die mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, herstellt und hierauf die wäßrige Liposomzusammensetzung gefriertrocknet, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.
  • Die oben angegebenen Einzelheiten über geeignete Lipide, biologisch aktive Verbindungen und Hilfsstoffe gelten auch für das unmittelbar vorstehend beschriebene Verfahren.
  • Schließlich wird gemäß der Erfindung auch ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen vorgeschlagen, das durch das unmittelbar vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist.
  • Endlich wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, daß man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, welches durch das unmittelbar vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist, in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert.
  • Geeignete wäßrige Medien wurden oben bereits erwähnt.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
    •  Beispiel 1
  • 59,6 mg Dipalmitoyl-phosphatidyl-cholin (in der Folge mit "DPPC" abgekürzt), 6,54 mg 3H-Cortisol-21-palmitat (in der Folge mit "³H-CP" abgekürzt) und 3,81 mg Stearylaminacetat wurden in 3 ml umdestilliertem t-Butanol bei 60°C aufgelöst.
  • Die Lösung wurde in einem 250 ml fassenden Rundkolben eingebracht und als dünner Film dadurch gefroren, daß der Kolben in ein Gefriergemisch aus Methanol und Trockeneis eingetaucht und darin geschwenkt wurde. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt, wobei ein herkömmlicher Gefriertrockner verwendet wurde. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen in Form eines Pulvers erhalten, das bis zum Gebrauch in verschlossenen Behältern gelagert werden konnte.
  • 10 ml destilliertes Wasser wurden dem gefriergetrockneten Pulver zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde auf einem Wasserbad auf ungefähr 70°C erhitzt. Leichtes Schütteln des Kolbens hatte zur Folge, daß sich das Pulver dispergierte, wobei eine milchige Suspension entstand, von der bei mikroskopischer Untersuchung festgestellt wurde, daß sie Liposome enthielt. Duplikatproben von jeweils 50 µl der Suspension wurden für Szintillationszählung entnommen, um vor einem Waschen den Steroidgehalt zu bestimmen. Der Rest der Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 25 ml verdünnt und 30 min bei 120 000 g ultrazentrifugiert. Aus dem Liposompfropfen wurde mit destilliertem Waser eine Dispersion mit einem Volumen von 10 ml hergestellt, und Duplikatproben von jeweils 50 µl der gewaschenen Suspension wurden für Szintillationszählung entnommen. Ein Vergleich der Zählungen vor und nach dem Waschen zeigte, daß 90% des Steroids, das im gefriergetrockneten Pulver vorhanden war, in die gewaschenen Liposome einverleibt wurden.
    • Beispiel 2
  • 49 mg DPPC und 7 g 3H-CP wurden in 5,05 ml umdestilliertem t-Butanol bei 60°C aufgelöst. Duplikatoren von 5 µl wurden für Szintillationszählung entnommen, und die verbleibende Lösung wurde unmittelbar auf der Wandung eines 250 ml-Rundkolbens gefroren, indem der Kolben in ein Ge riergemisch ( Methanol/Trockeneis) eingetaucht wurde. Das t-Butanol wurde dann in einem herkömmlichen Gefriertrockner entfernt. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten. Das Gemisch wurde dann von der Kolbenwandung abgeschabt, und drei Proben von 10, 11 bzw. 12,7 mg wurden in Phiolen eingewogen. 2,5 ml destilliertes Wasser wurden in eine jede Phiole eingebracht, und die Gemische wurden auf einem Wasserbad auf 50°C erhitzt. Das Gemisch wurde dann zur Bildung von Liposomen durch heftiges Schütteln dispergiert. Duplikatproben von jeweils 50 µl von jedem Liposompräparat wurden für Szintillationszählung entnommen. Die Liposompräparate wurden in trockene gewogene Ultrazentrifugenröhrchen eingebracht, mit 10 ml destilliertem Wasser verdünnt und 40 min bei 4°C mit 120 000 g ultrazentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden von den Lipidpfropfen entfernt, und zwei der drei Pfropfen wurden in einem Vakuumofen bis zu einem Gewicht entsprechend 50 Gew.-% Wassergehalt getrocknet. Der dritte Pfropfen wurde wieder in 2,5 ml Wasser suspendiert, worauf Duplikatproben von jeweils 50 µl für Szintillationszählung entnommen wurden.
  • Die Radioaktivitätszählungen zeigten, daß nach der Dispergierung der drei gefriergetrockneten Proben in Wasser 86 ± 4% des ursprünglichen Steroids in den Dispersionen vorlagen. Der Radioaktivitätsverlust hatte seinen Grund im Verlust eines kleinen Anteils des Gemischs von potentiellen Liposomen während der Gefriertrocknung. Nachdem die dritte Probe gewaschen worden war, blieben 73% des gesamten Steroids mit Liposomen asszoziiert.
  • Duplikatproben von 6 mg beider gefriergetrockneter Liposompfropfen wurden dann in Probenhalter für Differentialabtastkalorimetrie (in der Folge mit "DSC" abgekürzt) eingewogen. Die DSC-Spektren der Gemische zwischen 0 und 50°C wurden auf einem Perkin Elmer-Differentialabtastkalorimeter ermittelt. Vergleichsproben für DSC wurden ebenfalls hergestellt, indem die gleichen Gewichte an DPPC und 3H-CP wie im ursprünglichen Gemisch gemischt wurden und hierauf 50 Gew.-% Wasser eingemischt wurden. Sie dienten als "liposomfreie" Vergleichsgemische. Die DSC-Spektren dieser Vergleichsgemische wurden wie oben beschrieben gemessen.
  • Das DSC-Spektrum von DPPC alleine besteht aus einer Hauptübergangsendotherme bei 41°C und einer Vorübergangsendotherme bei 35°C. Die Breite einer Linie in halber Spitzenhöhe der Hauptendotherme beträgt annähernd 3°C. Die oben beschriebenen Experimente zeigten, daß in den liposomfreien Vergleichsgemischen beide Spitzen in den DSC-Spektren der Gemische zu beobachten waren und die Linienbreite bei ungefähr 3°C blieb. Dies zeigt vermutlich, daß in einfachen Gemischen (d. h. liposomfreien Gemischen) das Steroid das DSC-Spektrum des Lipids nicht verändert. Die Spektren der Duplikatliposompräparate zeigten nur einen Übergang (der Hauptendotherme), und die durchschnittliche Linienbreite dieser Präparate war 5,8°C, was eine beträchtliche Verbreiterung im Vergleich zu den Vergleichsgemischen bedeutet. Diese Verbreiterung ergibt sich aus der molekularen Wechselwirkung des Lipids und des Steroids in den Liposomen, die durch das obige Verfahren hergestellt worden sind. Deshalb besteht kein Zweifel, daß die durch das obige Verfahren hergestellten Liposome das Steroid in den Liposomen enthielten.
    • Beispiel 3
  • 16,1 mg Eilecithin, 2 mg Ei-Phosphatidinsäure und 1,66 mg 3H-CP wurden in 5 ml Chloroform aufgelöst, und die Lösung wurde in einen 250 ml fassenden Rundkolben gegossen. Das Lösungsmittel wurde bei Raumtemperatur durch Drehen des Kolbens und Einblasen eines trockenen Stickstoffstroms entfernt. Der dabei erhaltene Lipidfilm wurde dann bei Raumtemperatur in 5 ml Wasser dispergiert, wobei ein Liposompräparat entstand. Duplikatproben von jeweils 50 µl wurden für Szintillationszählung entnommen. Der Rest des Liposompräparats wurde in einem Ultrazentrifugenröhrchen mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt und 30 min bei 120 000 g ultrazentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde vom Liposompfropfen entfernt, und der Pfropfen wurde in 5 ml destilliertem Wasser dispergiert. Duplikatproben von 50 µl dieser Dispersion wurden genommen, und die Steroidinkorporation wurde durch Szintillationszählung gemessen. Der Rest der Liposomdispersion wurde gefroren, wobei ein Methanol/Trockeneis- Gemisch verwendet wurde, und das Lösungsmitel wurde auf einem üblichen Gefriertrockner entfernt. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten.
  • Das gefriergetrocknete Gemisch wurde 5 Tage gelagert, worauf 5 ml einer 0,9%igen (G/V) Kochsalzlösung zugegeben wurden. Liposome wurden durch mäßiges Schütteln des Gemischs in einem Kolben bei Raumteperatur hergestellt. Mikroskopische Prüfung bestätigte die Anwesenheit von Liposomen. Zwei Tage später wurden die Liposome zweimal mit 0,9%iger (G/V) Kochsalzlösung durch das oben beschriebene Verfahren gewaschen, wobei jedoch Kochsalzlösung anstelle von Wasser verwendet wurde. Der Steroidgehalt der Liposome wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Ein Vergleich der Radioaktivität der Dispersionen vor und nach der Gefriertrocknung zeigte, daß 72% des im gewaschenen Präparat vor der Gefriertrocknung vorhandenen Steroids in den gewaschenen Liposomen, die nach der Gefriertrocknung hergestellt worden waren, zurückgehalten wurden.
    • Beispiel 4
  • 29,8 mg DPPC und 3,32 mg 3H-CP wurden in 5 ml Chloroform aufgelöst und als dünner Film auf die Wandung eines 250 ml fassenden Rundkolbens gegossen, indem das Lösungsmittel bei Raumtemperatur unter Verwendung eines trockenen Stickstoffstroms abgedampft wurde. 10 ml destilliertes Wasser wurden dann in den Kolben eingebracht, und das Gemisch wurde auf einem Wasserbad auf 70°C erhitzt. Liposome wurden durch Bewegen des heißen Gemischs auf einer Vibromischerbank gebildet. Duplikatproben von jeweils 50 µl der resultierenden Dispersion wurden für Szintillationszählung entnommen. Der Rest der Dispersion wurde 2mal durch Verdünnen auf 25 ml mit destilliertem Wasser gewaschen und dann 30 min bei 120 000 g ultrazentrifugiert. Der gewaschene Liposompfropfen wurde wieder in 10 ml destilliertem Wasser dispergiert, und Duplikatproben von jeweils 50 µl wurden für Szintillationszählung entnommen. 5 ml der Dispersion wurden in einem Gefriergemisch, das aus Methanol und Trockeneis bestand, gefroren, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum und unter Verwendung eines üblichen Gefriertrockners entfernt. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten, das gelagert wurde, bis es gebraucht wurde.
  • 5 ml destilliertes Wasser wurden dem gefriergetrockneten Gemisch zugegeben, und das resuliterende Gemisch wurde auf einem Wasserbad auf 70°C erhitzt und mäßig geschüttelt. Mikroskopische Prüfung der resultierenden milchigen Suspension zeigte, daß sie aus einer Liposomsuspension mit einer engen Größenverteilung bestand. Diese Suspension wurde 30 min bei 120 000 g ultrazentrifugiert, und der Liposompfropfen wurde dann wieder in 5 ml destilliertem Wasser dispergiert. Duplikatproben von jeweils 50 µl der resultierenden Suspension wurden zur Bestimmung des endgültigen Steroidgehalts der Liposome entnommen. Szintillationszählung zeigte, daß 78% des in der ursprünglichen gewaschenen Dispersion vorhandenen Steroids in dem fertigen gewaschenen Liposompräparat, das aus dem gefriergetrockneten Gemisch hergestellt worden war, vorlagen.
  • DSC (siehe Beispiel 2) an den Liposomen, die aus dem ursprünglichen Film hergestellt worden waren, und an den Liposomen, die aus dem gefriergetrockneten Gemisch hergestellt worden waren, zeigte, daß die Lipidübergangsendotherme durch das Steroid in den Liposomen verbreitert worden war und daß diese Verbreiterung auch noch vorlag, nachdem das gefriergetrocknete Gemisch in destilliertem Wasser dispergiert worden war. Dies bewies, daß das Steroid in die endgültigen Liposome einverleibt worden war, die aus dem gefriergetrockneten Gemisch hergestellt worden waren.
    • Beispiel 5
  • Alle in diesem Beispiel beschriebenen Maßnahmen wurden in einem sterilen Raum (sterilisiert mit Formaldehyd und dann gespült mit steriler Luft) ausgeführt, wobei die üblichen aseptischen Vorsichtsmaßnahmen angewendet wurden. Der Gefriertrockner (Edwards Speedivac Centrifugal Freeze-dryer, Model 5PS) wurde mit Formaldehyd sterilisiert und dann mit steriler Luft gespült. Die weiteren verwendeten Apparate wurden entweder durch trockene Wärme oder in einem Autoklaven sterilisiert.
  • 697,2 mg DPPC, 99,6 mg Dipalmitoyl-phosphatidinsäure und 99,6 mg Cortisol-21-palmitat wurden bei 60°C in 60 ml umdestilliertem t-Butanol aufgelöst. Die heiße Lösung wurde unmittelbar darauf sterilisiert, indem sie durch ein 0,22 µm- "MF-Millipore"-Filter (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA), das auf einer Temperatur von 50°C gehalten worden war, hindurchgeführt wurde. Die heiße Lösung wurde 2mal auf diese Weise hindurchgeführt. Proben von 2 ml der sterilen Lösung wurden in 5 ml fassende sterile Multidosis-Phiolen eingebracht. Der Inhalt dieser Phiolen wurde unter Verwendung des oben erwähnten Gefriertrockners gefriergetrocknet, und jede Phiole wurde dann unter Verwendung eines sterilen Gummiverschlusses und einer metallenen Multidosis-Kappe verschlossen. Auf diese Weise wurden verschlossene Proben aus einem sterilen gefriergetrockneten Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten.
  • Eine sterile 0,9%ige (G/V) wäßrige Lösung von Natriumchlorid wurde in eine der oben erwähnten verschlossenen Phiolen eingeführt, worauf diese dann auf einem Wasserbad auf 50°C erhitzt und heftig geschüttelt wurde. Auf diese Weise wurde ein steriles Liposompräparat erhalten, das sich für Verabreichung durch Injektion eignete.
    • Beispiel 6
  • 15 mg Eilecithin, 2,09 mg Cholesterin und 1,55 mg Dicetylphosphat wurden in 5 ml Chloroform aufgelöst und als dünner Film auf die Wandungen eines Probenröhrchens gegossen. 0,1 mg 125 g J-Angiotensin-II in 1 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden in das Probenröhrchen eingebracht. Das Lipid wurde in dem wäßrigen Medium unter Zuhilfenahme einer Vibromixerbank dispergiert, wobei Liposome gebildet wurden. Die Liposomdispersion wurde dann 2mal gewaschen. Hierzu wurde sie zunächst mit 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) auf 26 ml verdünnt und dann 1 st bei 120 000 g einer Ultrazentrifugierung unterworfen. Dann wurde der gewaschene Liposompfropfen wieder in 5 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) dispiergiert. Duplikatproben von jeweils 0,25 ml wurden für Szintillationszählung entnommen. 4 ml der verbleibenden Suspension wurden in ein Probenröhrchen eingebracht, gefroren (Methanol/Trockeneis) und gefriergetrocknet. Das resultierende gefriergetrocknete Gemisch von potentiellen Liposomen wurden in 2 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert und zweimal wie oben gewaschen. Der gewaschene Liposompfropfen wurde erneut in 4 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert. Duplikatproben von jeweils 0,25 µl wurden für Szintillationszählung entnommen. 26% der anfänglichen Menge an Angiotensin-II lagen in den Liposomen nach der ersten Liposomherstellung und Waschung vor. 28% von diesen 26%, das sind 7%, der Anfangsmenge an Angiotensin-II, wurden in den Liposomen nach der Gefriertrocknung und Rekonstituierung festgehalten.
  • Der 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), der in diesem Beispiel und in Beispiel 7 verwendet worden war, wurde hergestellt durch Auflösen von 0,895 g Kalium-dihydrogen-phosphat und 4,765 g Dinatrium-hydrogen-phosphat-dihydrat in destilliertem Wasser und Auffüllen der Lösung auf 1 l mit destilliertem Wasser.
    • Beispiel 7
  • 15 mg Eilecithin, 2,09 mg Cholesterin und 1,55 mg Dicetylphosphat wurden in 5 ml Chloroform aufgelöst und als dünner Film auf die Wandung eines Probenröhrchens gegossen. 5 mg 3-H-Inulin in 1 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden dem Röhrchen zugegeben. Das Lipid wurde in der Inulinlösung unter Hilfe einer Vibromixerbank dispergiert, um Liposome herzustellen. Die Liposomdispersion wurde 2mal dadurch gewaschen, daß sie zunächst mit 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) auf 26 ml verdünnt und dann 1 st bei 120 000 g ultrazentrifugiert wurde. Der gewaschene Liposompfropfen wurde dann wieder in 2,1 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (ph 7,4) dispergiert. Hierauf wurden Duplikatproben von jeweils 1 µl für Szintillationszählung entnommen. Die verbliebene Suspension wurde gefroren (Methanol/ Trockeneis-Gemisch) und in einem Probenröhrchen gefriergetrocknet. Das resultierende gefriergetrocknete Gemisch von potentiellen Liposomen wurde wieder in 1 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert, um Liposome herzustellen, und dann zweimal wie oben gewaschen. Der gewaschene Liposompfropfen wurde wieder in 2 ml 3,3 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert, und Duplikatproben von jeweils 1 µl wurden für Szintillationszählung entnommen. 21% der anfänglichen Menge an Inulin wurden in den Liposomen nach der ersten Liposomherstellung und Waschung zurückgehalten. 17% von diesen 21%, das sind also 4%, der Ausgangsmenge an Inulin wurden in den Liposomen nach der Gefriertrocknung und Rekonstituierung festgehalten.

Claims (35)

1. Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein liposombildendes amphipathisches Lipid, mindestens eine biologisch aktive Verbindung und ggf. mindestens einen Hilfsstoff in einem Lösungsmittel auflöst und hierauf die so erhaltene Lösung gefriertrocknet, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid ein Phospholipid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ein natürliches Lecithin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ein synthetisches Lecithin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lecithin Eilecithin oder Dipalmitoylphosphatidyl-cholin ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung eine lipidlösliche oder lipidgebundene Verbindung ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung eine wasserlösliche, nicht lipidgebundene Verbindung ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung ein Medikament ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hilfsstoff verwendet wird, der eine Substanz ist, die eine negative Ladung liefert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Eiphosphatidinsäure, Dipalmitoyl-phosphatidinsäure, Dicetylphosphat oder Rinderhirngangliosid ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hilfsstoff verwendet wird, der eine Substanz ist, die eine positive Ladung liefert.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Stearylamin oder Stearylaminacetat ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hilfsstoff Cholesterin ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel während des Gefriertrocknungsverfahrens fest bleibt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel einen Schmelzpunkt in der Nähe von Raumtemperatur aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel t-Butanol, n-Butanol, Dioxan, Essigsäure, Pyridin oder Piperidin ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß in der Lösung, die der Gefriertrocknung zugeführt wird, auch Wasser oder Chloroform vorliegt.
18. Gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 hergestellt worden ist.
19. Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, das nach Anspruch 18 erhalten worden ist, in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium destilliertes Wasser, isotonische Kochsalzlösung oder eine sterile oder nicht-sterile Pufferlösung ist.
21. Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, dadurch gekennzeichnet, daß man durch ein an sich bekanntes Verfahren eine wäßrige Liposomzusammensetzung, die mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, herstellt und hierauf die wäßrige Liposomzusammensetzung einer Gefriertrocknung unterwirft, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposome mindestens ein Phospholipid enthalten.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ein natürliches oder synthetisches Lecithin ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Lecithin Eilecithin oder Dipalmitoyl-phosphatidyl-cholin ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung eine lipidlösliche oder lipidgebundene Verbindung ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung eine wasserlösliche, nicht lipidgebundene Verbindung ist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung ein Medikament ist.
28. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hilfsstoff verwendet wird, der eine Substanz ist, die eine negative Ladung liefert.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Eiphosphatidinsäure, Dipalmitoylphosphatidinsäure, Dicetylphosphat oder Rinderhirngangliosid ist.
30. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hilfsstoff verwendet wird, der eine Substanz ist, die eine positive Ladung liefert.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Stearylamin oder Stearylaminacetat ist.
32. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterin als Hilfsstoff verwendet wird.
33. Gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 32 erhalten worden ist.
34. Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Liposompräparats, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen gemäß Anspruch 33 in einem geeigneten wäßrigen Medium dispergiert.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium destilliertes Wasser, isotonische Kochsalzlösung oder eine sterile oder nicht-sterile Pufferlösung ist.
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