SE440725B - Sett att framstella en frystorkad blandning av potentiella liposomer - Google Patents

Description

' 7805276-8 1 form, och därefter dispergerar filmen i ett lämpligt vattenhaltígt medium. Vid förekomst av lipid-lösliga biologiskt aktiva bestånds- delar, dvs. sådana som förekommer tillsammans med lipidskikten snarare än med den vattenhaltiga liposomfasen, formas föreningen vanligen som en film tillsammans med en fosfolipid med användning av ett vanligt organiskt lösningsmedel. Vid förekomst av vatten- lösliga biologiskt aktiva föreningar inkapslas föreningen van- ligen i liposomerna genom att man dispergerar en formad fosfo- lipidfilm med en vattenlösning av föreningen. Den inkapslade föreningen avskiljes därefter från den fria föreningen genom centrifugering, kromatografi eller någon annan lämplig metod.

Beträffande biologiskt aktiva beståndsdelar, som förekommer till- sammans med liposomernas lipidfas, innehåller liposomer, som framställts enligt ovanstående förfarande, vanligtvis största delen av föreningen bunden i de lipída dubbelskikten, och av- skiljning av den fria föreningen är inte så kritisk som vid förekomsten av vattenlösliga biologiskt aktiva beståndsdelar, som icke_bindes till lipiden, förutsatt att desamma förekommer i mängder, som understiger deras maximala lipidlöslighet eller understiger den maximala mängd, som kan bindas av lipiden.

Det ovan nämnda förfaringssättet lämpar sig inte att använda i stor skala. Dessutom har vattenhaltiga liposomdispersioner endast begränsad stabilitet och lagringstidenär därför begränsad.

Vidare kan liposomerna bilda aggregat och falla ut som sediment. Även om sedimenten vanligen kan dispergeras på nytt kan den ur- sprungliga dispersionens struktur och storleksfördelning för- ändras. Man kan reducera aggregation och-sedimentering genom att införa laddade lipider i liposomerna, men detta utgör inte någon garanti för tillfredsställande lagringstid. Förlust av den biologiskt aktiva föreningen från liposomerna till det om- givande vattenhaltiga mediet utgör en.annan faktor, som begrän- sar möjligheten för preparaten som praktisk doseringsform. Detta är särskilt allvarligt för vattenlösliga föreningar med låg mole- kylvikt men även lipidlösliga föreningar kan fördelas till det omgivande vattenhaltiga mediet tills ett jämviktsförhållande upp- nåtts. Om föreningen förekommer i ringa mängd och/eller det om- givande vattenhaltiga mediet i stor mängd kan förlusten utgöra en betydande proportion av det totala innehållet av den biologiska aktiva föreningen i liposomerna.

...J \ i i så , riío ip 3 7805276-a Samtliga dessa faktorer begränsar användningen av liposomer som praktiska bärare av biologiskt aktiva beståndsdelar, särskilt inom läkemedelsterapin. En lösning kan vara att framställa och lagra filmen med lipid och biologiskt aktiv förening, varefter filmen dispergeras för bildning av liposomer allt efter behov omedelbart före användningen. Framställning av film i enhets- doser och lagring uppvisar emellertid stora praktiska svårigheter och detta förslag utgör inte någon praktisk lösning till de ovan angivna problemen.

Föreliggande uppfinning är inriktad på ett förfaringssätt, som utgör en praktisk lösning. I korthet kännetecknas förfarings- sättet av att man l) löser de nödvändiga substanserna i ett lämpligt lösningsmedel och därefter frystorkar lösningen, var- efter den bildade frystorkade blandningen lagras och vid behov 2) dispergeras i ett lämpligt vattenhaltígt medium, t.ex. en isotomisk saltlösning, varvid man erhåller en vattenhaltig liposomberedning.

Man kan använda vilken frystorkníngsmctod som htlrt vid utförandet av sättet enligt uppfinningen. Som förkortning kommer nedan ut- trycket "frystorkade blandningar av potentiella lšposomer" att användas för de frystorkade blandningar (liposom-förstadier) man framställer enligt föreliggande uppfinning och som, då de dispergeras i ett lämpligt vattenhaltigt medium, ger de önskade liposomberedningarna. Då en frystorkad blandning av potentiella liposomer dispergeras på nytt i ett lämpligt vattennaltigt me- dium, t.ex. en isotonisk saltlösning, bildas oväntat liposomer, som liknar sådana, som man framställt enligt det kända sättet att dispergera film. Beträffande en lipidlöslig eller lipidbun- den biologiskt aktiv förening inkorporeras denna åter i liposo- merna i stor omfattning. Å andra sidan, såsom förklaras nedan, är sättet enligt uppfinningen inte så lämpligt för de vatten- lösliga biologiskt aktiva föreningar, som icke bindes till lipi- der. De frystorkade blandningarna dispergerar lätt, då de om- skakas med ett vattenhaltigt medium och det tycks, som om de leder till liposomberedningar med en snävare storleksfördelning än motsvarande preparat, som man framställt genom att disperge- ra en formad film. Detta kan vara fördelaktigt med tanke på re- producerbarhet av liposompreparatens effekt. "šöcnaçuuunwv e vsoszvs-a 4 Enligt uppfinningen åstadkommes ett sätt att framställa en frystorkad blandning av potentiella liposomer, vilket sätt i huvudsak kännetecknas av att man upplöser alla beståndsdelar- na i ett lösningsmedel och därefter frystorkar den resulterande lösningen, varvid lösningsmedlet förblir fast under frystork- ningsprocessen.

Vilken känd amfifil lipíd som helst, som man vet är lämplig för framställning av liposomer på känt sätt kan användas vid utövandet av sättet enligt uppfinningen. Sålunda kan en mångfald lipider användas enligt uppfinningen, men man föredrager sådana, som är icke-immunogena och biologiskt nedbrytbara. Exempel på lämpliga lipider utgör fosfolipiderna, t.ex. naturliga lecitiner, som lecitin från ägg eller från sojabönor, eller syntetiska lecitiner, t.ex. mättade syntetiska lecitiner, som dimyristoyl- fosfatidylkolin, dipalmitoyl-fosfatidylkolin eller distearoyl- fosfatidylkolin, eller omättade syntetiska lecitiner, som exempel- vis dioleyl-fosfatidylkolin eller dilinoleyl-fosfatidylkolin.

Man kan använda antingen en enstaka fosfolipid eller en blandning av fosfolipioer.

Som ovan nämnts, kan den biologiskt aktiva beståndsdelen utgöras av vilken förening som helst, som uppvisar en biologiskt intres- sant egenskap. Sålunda kan föreningen utgöras av ett läkemedel, protein, enzym, hormon, vitamin eller en märkförening. Det inses härvid att sättet enligt uppfinningen är särskilt värdefullt med avseende på lipidlösliga eller lipidbundna biologiskt aktiva föreningar (som inkluderar vissa vattenlösliga föreningar, t.ex. en del proteiner). Det ovan nämnda sättet är icke så lämpligt för vattenlösliga, icke lipidbundna biologiskt aktiva föreningar, eftersom i dylika fall endast en relativt ringa fraktion av föreningen inkorporeras i liposomerna vid dispergering av den frystorkade blandningen. Icke desto mindre är denna olägenhet godtagbar under förutsättning att ett lämpligt överskott av den vattenlösliga biologiskt aktiva föreningen inkorporeras i den frystorkade blandningen. Då liposomer framställes från en dylik blandning måste även den fria föreningen, om närvaro av en fri biologiskt aktiv förening i det yttre vattenhaltiga mediet är till nackdel, avlägsnas genom någon av de ovan angivna me- toderna. Om sättet enligt uppfinningen är lämpligt med avseende 'ÉQQR QÜÅLXTY 7805276~8 LH på en vatten-löslig, icke lipidbunden, biologiskt aktiv förening beror sålunda på samtliga relevanta omständigheter, inkluderande l) beskaffenheten av föreningens verkan, 2) föreningens styrka, 3) den mängd av föreningen, som inkorporerats i liposombered- ningen och H) önskvärdheten att den fria föreningen förekommer i det yttre vattenhaltiga mediet eller ej.

Eventuella hjälpmedel inkluderar ett ämne, som åstadkommer en negativ laddning, t.ex. fosfatidsyra från ägg, dipalmitoyl-fos- fatidsyra, dicetylfosfat eller gangliosid från hjärna av nöt- kreatur, eller ett ämne, som åstadkommer positiv laddning, t.ex. stearylamin eller stearylaminacetat, eller ett ämne, som påverkar de fysikaliska egenskaperna i de lipida dubbelskikten i liposo- merna på ett önskvärt sätt genom att t.ex. överföra dem till en mer flytande eller mer fast form allt efter önskan, t.ex. koles- terol.

Som ovan nämnts har lämpliga lösningsmedel den egenskapen, att de löser den ovan nämnda blandningen av beståndsdelar. Lös- ningsmedlet kan bestå av ett eller flera ämnen. Föredragna lös- ningsmedel förblir i fast form under frystorkningsförfarandet, utan att det är nödvändigt med yttre kylning (yttre kylning sker givetvis vid igângsättande av frystorkningsförfarandet). Särskilt föredragna föreningar har en smältpunkt, som ligger nära rums- temperatur, t.ex. t-butanol, n-butanol, dioxan, ättiksyra, pyridin eller piperidin. Eventuellt kan dessutom även en eller flera andra vätskor, som medverkar till att beståndsdelarna löses, t.ex. vatten eller kloroform, vara närvarande.

Uppfinningen skall i det följande belysas närmare med hjälp av följande exenmel utan att dock vara begränsad till dessa. ëšempel l Dipalmitoyl-fosfatidylkolin (i det följande benämnt "DPPC", 59,6 mg), ä-korcisoi-zl-palmitat (i det följande benämns "BH-CP", 6,5N mg) och stearylacetat (3,81 mg)löstes i omdestílle- rad t-butanol (3 ml) vid 6006. Lösningen överfördes till en V50 un rund kolv och frystes som en tunn film genom att man sänkte ned och svängde om kolven i en frysblandning av metanol och koldi- oxid i fast form. Lösningsmedlet avlägsnades därefter i vakuum med en kommersiell frystorkningsapparat. Härvid erhöll man så- POOR QUALITÉ .7805276-8 lunda en frystorkad blandning med potentiella ljposomer som ett pulver, som kunde förvaras i slutna behållare tills man hude behov av detsamma.

Exempel 2 DPPC (H9 mg) och BH-CP (7 mg) löstes i omdestillerad t-butanol (5,05 ml) vid 60°C. Två prover (5/ul) tillvaratogs för scintilla- tionsräkning och den återstående lösningen nedfrystes omedelbart på väggen av en 250 ml rund kolv genom nedsänkning i en frys- blandning (metanol och koldioxid i fast form). T-butanolen av- lägsnades därefter med en kommersiell frystorkningsanordning.

Härvid erhöll man en frystorkad blandning av potentiella liposomer.

Exempel 3 Alla de i detta exempel beskrivna förfaringssätten utfördes i ett sterilt rum (steriliserat med formaldehyd, och därefter genomblâst med steril luft), med vidtagande av konventionella aseptiska försiktighetsmått. Frystorkningsanordningen (Edwards Speedivac Centrifugal freeze-dryer, modell 5 PS) steriliserades med flormaldehyd och genomblåstes därefter med steril luft. Den andra använda anordningen steriliserades antingen med torr värme eller genom autoklavering.

DPPC (697,2 mg) dipalmitoylfostatidsyra (99,6 mg) och kortisol- 21-palmitat (99,6 mg) löstes vid 6000 i omdestillerad t-butanol (60 ml). Den varma lösningen steriliserades omedelbart genom att man lät den passera genom ett 0,22/u "MF-millipor" filter (Millipore corporation, Bedford, MA, usA) och hölls vid 5o°c. Detta gjordes tvâ gånger. 2 ml prover av den sterila lösningen placerades i små sterila 5 ml flerdosflaskor. Flaskornas innehåll frystorkades med den ovan nämnda frystorkningsanordningen, varefter varje flaska tillslöts med en steril gummitillslutning och en flerdos- kapsyl av metall. På så sätt erhöll man tillslutna prover av en steril frystorkad blandning av potentiella liposomer. Framställ- ningen av en steril vattenhaltig liposomberedning från den frys- torkade blandningen kan utföras på följande sätt.

En steril 0,9 %-ig (vikt/volym) vattenlösning av natriumklorid infördes i en av de ovan nämnda tillslutna flaskorna, som där- efter upphettades till 50°C på ett vattenbad och kraftigt om- skakades. Härvid erhöll man en steril lysosomberedning, som var lämplig att administrera genom injicering.

Claims (5)

5* 7805276-8 Patentkrav

1. Sätt att framställa en frystorkad blandning av potentiella liposomer, vilken blandning innehåller minst en liposom- bildande fosfolipid, minst en lipidlöslig eller lipidbunden, biologiskt aktiv förening och valfritt minst ett adäuvans, valt från substanser som ger en negativ laddning, substanser som ger en positiv laddning och kolesterol, k ä n n e- t e c k n a t av att man upplöser alla beståndsdelarna i ett lösningsmedel och därefter frystorkar den resulterande lös- ningen, varvid lösningsmedlet förblir fast under frystork- ningsprocessen.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att lös- ningsmedlet har en smältpunkt som ligger nära rumstemperatur.

3. Sätt enligt krav 1 och/eller krav 2, k ä n n e t e c k- n a t av att hjälpmedlet utgöres av kolesterol.

4. Sätt enligt något eller några av kraven 1-3, k ä n n e- t e c k n a t av att lösningsmedlet utgöres av t-butanol, dioxan, ättiksyra, pyridin eller piperidin.

5. Sätt enligt något eller nâgra av kraven 1-4, k ä n n e- t e c k n a t av att även vatten eller kloroform förekommer i don ovan nämnda lösningen, som undorkastas frystorkninq.