DK141082B - Fremgangsmåde til fremstilling af liposomer indeholdende biologisk aktivt stof dispergeret i et vandigt medium. - Google Patents

Description

i 4 i υ o i 2 mindst ét biologisk aktivt stof, og har i regelen form af en kol-loid dispersion i et vandigt flydende medium, såsom en saltopløsning, især en 0,9 vægtpct. natriumchloridopløsning (fysiologisk saltopløsning).

Fremstilling af liposomer udgør en meget praktisk og meget effektiv måde til indkapsling af et vandigt medium og er særligt nyttig med henblik på indgivelse af biologisk aktive stoffer i levende organismer, især indgivelse af lægemidler, idet man undgår nedbrydning af de aktive stoffer i organismen (f.eks. under indvirkning af mave- eller tarmsaft), før stofferne når det organ, hvor de skal udøve deres virkning.

Ved et passende valg af forbindelsen med formlen X-Y, der anvendes til dannelse af liposomernes væg, er det faktisk muligt at fremstille liposomer, hvis vægge modstår indvirkning af visse af organismens medier og kun angribes i nærværelse af de medier, der eksisterer i de organer, hvor det biologisk aktive stof skal frigives .

Man kender flere fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.

En af disse fremgangsmåder består i at bringe et lipid i nærværelse af det vandige medium, som man ønsker at indkapsle, og at opvarme den således opnåede heterogene blanding til en temperatur, der er lidt over omgivelsestemperaturen, og derpå sætte blandingen ud for en kraftig omrøring efterfulgt af en vibrationsbehandling ved ultralydfrekvens.

En anden fremgangsmåde består i at opløse en forbindelse med formlen X-Y, hvor X og Y har den ovenfor angivne betydning, f.eks. et lipid, i et flygtigt opløsningsmiddel, danne en film af denne forbindelse på væggene af en beholder og afdampe opløsningsmidlet fra den således opnåede opløsning, og i den samme beholder at indføre den væske, som man ønsker at indkapsle i liposomerne og endelig i beholderen underkaste væsken en vibrationsbehandling ved ultralydfrekvens.

I tysk offentliggørelsesskrift nr. 2 249 552 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer, hvor der under indvirkning <4 I if dέ - 3 af en vibration med ultralydfrekvens dispergeres en vandig opløsning af det produkt, der ønskes indkapslet, i nærværelse af et stof med den almene formel X-Y, hvor X betegner en hydrophil polær gruppe og Y betegner en hydrophob ikke-polær gruppe, til dannelse af en kolloid dispersion af kugler af den vandige væske, som derved indkapsles i stoffet X-Y i form af liposomer. De dannede liposomer kan separeres fra den vandige væske, hvori de befinder sig, ved centrifugering. Ved denne fremgangsmåde opnår man imidlertid ikke direkte en liposomopløsning i den ønskede vandige fase, men er nødsaget til efter centrifugeringen at re-dispergere bundfaldet i en ny vandig fase og eventuelt gentage rensningen. En anden væsentlig ulempe er, at man opnår et udbytte på maksimalt 20%, idet de 80% ikke-indkapslet væske tjener som dispersionsmedium. Herved bliver det ikke muligt at indkapsle meget små mængder vandig opløsning.

Disse fremgangsmåder nødvendiggør således at man disponerer over et totalvolumen af den væske, som man ønsker at indkapsle, der er væsentligt større end voluminet af den væske, som til sidst indeholdes i de opnåede liposomer. Ved disse fremgangsmåder dannes liposomerne faktisk i form af en kolloid dispersion af kugler i en væskefase, der består af den fraktion af væske, der skal indkapsles, som ikke tilbageholdes i liposomernes indre. Forholdet mellem voluminet af den indkapslede væske inden i liposomerne og det totale volumen af væsken er i reglen af størrelsesordenen 1-10%.

Hvis derfor den væske, der skal indkapsles, er af stor værdi, hvilket i reglen er tilfældet, når væsken er en opløsning af et biologisk aktivt stof, er det nødvendigt at genvinde den væskefraktion, der ikke er indkapslet, for at anvende den til andre operationer til dannelse af liposomer. Denne udvinding indebærer en separering af liposomerne fra væsken og derpå en rensning af væsken, og i reglen en genindstilling af koncentrationen af aktivt stof. (Faktisk medfører de ovennævnte separerings- og rensningsoperationer anvendelsen af større eller mindre rumfang opløsningsmiddel, og følgelig en modificering af koncentrationen af den væske , der indeholder det aktive stof).

\ί*\ΟϋΔ 4 Nødvendigheden af at foretage sådanne rensnings- og genindstillingsoperationer af koncentrationen af den væske, der indeholder det aktive stof, gør de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til fremstilling af liposomer vanskelige at udøve i industriel skala.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at råde bod på denne ulempe ved at muliggøre en fremstilling af liposomer, hvor man ved hver liposom-fremstilling anvender den totale mængde væske, der skal indkapsles, og dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Den omhandlede fremgangsmåde består således af to trin. Under det første trin danner man under indvirkning af ultralydvibrationen en dispersion af kugler af den væske, der skal indkapsles, idet disse kugler har kolloide dimensioner, d.v.s. en diameter af størrelsesordenen 200 - 1 000 Å, i en organisk væske, der er uopløselig i vand. Disse kugler er afgrænset af en monomolekylær hinde af forbindelsen X-Y, hvor de hydrophile grupper X vender ind mod kuglernes indre, der er optaget af den vandige væske, og de hydrophobe grupper Y modsætningsvis vender mod kuglens ydre, der består af en ikke-vandig fase. Disse kugler kan, selv om de ikke udgør liposomer i ordets egentlige betydning, eftersom de ikke er begrænset af et bimolekylært lag af forbindelsen X-Y, men kun af en monomolekylær hinde af forbindelsen, ikke desto mindre betragtes som et liposomt forstadium, idet hver af disse kugler indeholder det samme rumfang væske, der skal indkapsles, som de endelige liposomer. I den følgende beskrivelse vil disse kugler blive benævnt "liposomprækursorer".

Ved på passende måde at indstille de respektive mængder af den vandige væske, der skal indkapsles, den uopløselige organiske væske og forbindelsen med formlen X-Y, i løbet af denne første del af processen, er det muligt at opnå en indkapsling af den totale anvendte mængde væske, der skal indkapsles, i liposomprækur-sorerne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør således, at man undgår de genvindings-, rensnings- og genindstillingsoperationer af væsken, der skal indkapsles, der som angivet ovenfor ér nødvendige under de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.

i

A

I Μ I ΟΟ Δ 5

Man vil ligeledes forstå, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør indkapsling af væsker, som man kun disponerer over i meget små mængder, f.eks. af størrelsesordenen 0,05 - 0,1 ml, som ville være utilstrækkelige til gennemførelse af de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan således finde anvendelse indenfor områder, såsom visse arbejder på forsknings- eller analyselaboratorier, hvor de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer ville være uanvendelige.

Det andet trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i en dannelse af selve liposomerne. Det må formodes, at denne dannelse resulterer af det forhold, at hver liposomprækursor ved passagen gennem den monomolekylære ende af forbindelsen X-Y, der er beliggende i grænsefladen mellem det øvre dispersionsvæskelag og det nedre vandige væskelag medriver en del af denne hinde, der kombineres med den monomolekylære hinde af forbindelse X-Y, der afgrænser prækursoreri under dannelse af en bimolekylær hinde af forbindelser, der er karakteristisk for liposomer. (Dannelsen af den nævnte monomolekylære hinde er på i og for sig kendt måde forårsaget af denne forbindelses egenskaber: De hydrophile grupper X tiltrækkes således af det vandige væskelag, mens de hydrophobe grupper Y forbliver i et ikke-vandigt væskelag).

Som forbindelse med formlen X-Y anvendes en forbindelse, hvori den hydrophile gruppe X er en af følgende grupper: phosphato, carboxyl, sulfato, amino, hydroxyl og cholin, mens den hydrophobe gruppe Y er en af følgende grupper: En mættet eller umættet alifatisk carbonhydridgruppe, f.eks. alkyl eller alkylen, eller en alifatisk carbonhydridgruppe, der er substitueret med mindst én aromatisk eller cycloalifatisk gruppe.

Som forbindelse med formel X-Y anvendes fortrinsvis et phospholipid eller en forbindelse, der er beslægtet med phospholipider, især en af følgende forbindelser: lecithin, phosphatidyl-ethanol-amin, lysolecithin, lysophosphatidyl-ethanolamin, phosphatidyl-serin, phosphatidyl-inositol, sphingomyelin, cardiolipin, phos-phatidinsyre og cerebrosider.

i · « ^ *, m, . i *4 i u « «- 6

Man kan ligeledes som forbindelse X-Y anvende en blanding af mindst ét phospholipid og mindst ét andet lipoid, der hører til en kategori forskellig fra phospholipider. Til dette formål kan man især anvende en af følgende forbindelser: stearylamin, dice ty lphosphat, cholesterol og topopherol.

Som væske, der er uopløselig i vand og har en massefylde, der er lavere end vands, udvælger man fortrinsvis en organisk væske, især valgt blandt: benzen, halogen- eller alkylderivater af benzen, alifatiske etheroxider, alifatiske ketoner, alifatiske aldehyder, alifatiske estere, alifatiske eller cycloalifatiske car-bonhydrider eller en blanding af flere forbindelser, der har en massefylde, der er lavere end vands.

Valget af den primære vandige væske, d.v.s. den væske, der skal indkapsle s i liposomeme, kan foretages praktisk taget uden begrænsning, bortset fra de, der er dikteret af den påtænkte anvendelse af liposomerne.

Fortrinsvis anvendes som vandig væske en opløsning af mindst ét biologisk aktivt stof, især et enzym, et lægemiddel, såsom et antibiotikum, etc.

Som den sekundære vandige væske kan man anvende rent vand eller en anden passende vandig væske. Fortrinsvis anvendes en væske, der er beregnet til at tjene som det endelige dispersionsmedium for liposomerne under disses anvendelse, f.eks. en vandig natrium-chloridopløsning. Især kan man anvende den vandige natriumchlorid-opløsning, der benævnes fysiologisk saltopløsning, og som har en koncentration på 0,15 mol NaCl pr. 1 (0,9 vægtpct.), med henblik på direkte under den anden fase af fremgangsmåden at opnå en lipo-somdispersion i et medium, der er injicerbart i den menneskelige organisme. Der opnås således en yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen over for de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer, idet den muliggør en direkte opnåelse af en liposomdispersion i et vandigt medium valgt som funktion af den endelige anvendelse af liposomerne.

Naturligvis er det også muligt at separere liposomerne fra den sekundære vandige væske, f.eks. hvis man ønsker at undgå til- i 7

A · 4 ^ ^ A

« *1 i w g «.

stedeværelsen af ethvert spor af ikke-indkapslet aktivt stof under den endelige anvendelse af liposomeme. Denne separering kan let foretages på enhver i sig selv kendt måde, f.eks. ved gelchromatografi.

Opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1

Man indkapsler en vandig opløsning af amyloglucosidase indeholdende 10 mg amyloglucosidase pr. ml opløsning i en vandig natrium-chloridopløsning indeholdende 0,15 mol/l, idet man går frem på følgende måde:

Man tilsætter 54 mg lecithin og 0,1 ml af den vandige amyloglu-cosidase-opløsning til 3 ml dibutylether og underkaster den således opnåede heterogene blanding en ultralydbehandling (frekvens: 17 kHz, udgangseffekt: 70 Wj i to minutter, alt imens man holder temperaturen under 30°C ved hjælp af et kølebad.

Man opnår således en transparent væske med homogent udseende, der udviser blålige reflekser. Man anbringer et lag af denne væske i et centrifugeringsrør på et lag af 1,5 ml af en vandig natrium-chloridopløsning indeholdende 0,15 mol/l. Man opnår således en tofaset blanding sammensat af et nedre lag bestående af en vandig fase (natriumchloridopløsning) og et øvre lag bestående af den organiske fase dannet ved ultralydbehandling af blandingen af dibutylether, lecithin og amyloglucosidaseopløsning.

Denne tofaseblanding underkastes en centrifugering ved 30 000 o/min. i 30 minutter. Herefter udtager man det øvre lag (den organiske fase) og underkaster det nedre lag (den vandige fase) en ny centrifugering ved 30 000 o/min. i 30 minutter. Man opnår således en klar væske, der er svagt blålig og et "bundfald" med et lille rumfang, som består af ikke-dispergeret lipid (lecithin), som man bortkaster. Den klare væske består af en suspension af liposomer med kolloidale dimensioner, indeholdende den vandige amyloglucosidaseopløsning i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og væsken indeholder ligeledes en ringe mængde ikke-indkapslet amyloglucosidase.

8 4 , 4 Λ ^ Ί

Alt efter de påtænkte anvendelser kan man anvende denne liposom-suspension direkte eller efter eliminering af ikke-indkapslet amyloglucosidase ved gelchromatografi (f.eks. ved hjælp af en M?\ ?! "Sepharose w -gel).

EKSEMPEL 2

Man går frem på samme måde som i eksempel 1, idet man som indkapslingsopløsning anvender 0,05 ml af en vandig pufferopløsning (10 mM-phosphatpuffer, pH 7,2) indeholdende 100 mg/ml penicil-lamin opløst i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender 27 mg lecithin og en blanding af 2,4 ml dibutylether og 0,6 ml chloroform.

EKSEMPEL 5

Man går frem som i eksempel 1, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 500 mg/ml imipraminopløsning i en 0,15 M vandig natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender en blanding af 25 mg lecithin, 40 mg cholesterol og 5 ml dibutylether.

EKSEMPEL 4

Man går frem som i eksempel 1, idet man som indkapslingsopløsning anvender 0,05 ml af en 150 mg/ml opløsning af betamethason-di-natriumphosphat i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender en blanding af 15 mg lecithin og 12 mg phosphatidyl-ethanolamin og en blanding af 2,5 ml dibutylether og 0,5 ml chloroform.

EKSEMPEL 5 I en 10 ml pyrexkolbe anbringes 2 ml dibutylether og 1 ml cyclo-hexan. Derefter tilsættes 0,2 ml af en 10 mg/ml opløsning af insulin i en 0,9 % natriumchloridopløsning med pH 3,0 (indstillet ved hjælp af saltsyre). Der tilsættes 150 mg di-palmitoyl-phosphati- 9 14 \ύάΖ dylcholin (en lipophil-hydrophilforbindelse), hvorefter man ved omgivelsestemperatur underkaster den heterogene blanding en behandling med ultralyd i 1 min. ved hjælp af en Br'anson-gene-rator model B 12 (20 kH , 150 W). Efter denne behandling opnås en transparent opløsning, der indeholder mikroskopiske kugler af insulinopløsningen omgivet af et lag af overfladeaktivt stof, hvori molekylerne er orienteret således, at den hydrophile funktion (phosphatidylcholin) vender indad, medens de hydrophobe grupper vender ud mod den kolloide suspension i den organiske opløsning, der på opløst form indeholder det overskydende overfladeaktive stof.

Den organiske opløsning overføres til et reagensglas indeholdende 10 ml 0,9 % vandig natriumchloridopløsning, og reagensglasset underkastes en centrifugering ved 30 000 omdr./min. i 20 minutter. Den øverste fase hældes fra, og ved analyse af den ne-derste fase (2 ml opløsning, "Sephadex G-50, eluent 0,15 M

natriumchlorid plus phosphatpuffer, pH 7,5) konstaterer man, at denne vandige fase indeholder 55-60 % af den oprindelige insulinmængde indkapslet i lipidet. Denne opløsning kan anvendes direkte til terapeutiske formål, uden at der normalt kræves særlig rensning.

EKSEMPEL 6

En vandig opløsning af amyloglucosidase (10 mg/ml) indkapsles i en vandig opløsning af natriumchlorid (0,15 mol pr. 1) på følgende måde: 74 mg phosphatidylethanolamin og 0,1 ml af den vandige amylogluco-sidaseopløsning blandes med 3 ml diisopropylether, og den heterogene blanding udsættes for en ultralydsbehandling (frekvens: 20 kHz; udgangseffekt: 150 W) i 2 minutter, idet temperaturen holdes på under 30° C ved hjælp af et kølebad. Herved opnås en homogent udseende, transparent væske, der udviser blålige reflekser. Blandingen udhældes i 15 ml vandig natriumchlorid (0,15 mol pr. 1), og der centrifugeres i 45 min. som beskrevet i eksempel 5. Derefter fraskiller man den nederste fase, der er en klar væske. Denne består af en suspension af liposomer med kolloide dimensioner, der indeholder den vandige opløsning af amyloglucosidase. Liposomerne 10 141082 er suspenderet i en vandig opløsning af 0,15 M natriumchlorid, som indeholder en meget ringe mængde (af størrelsesordenen 5 %) ikke-indkapslet amyloglucosidase. Denne suspension af liposomer kan anvendes som den er, eller man kan fjerne den ikke-indkapslede amyloglucosidase ved gelchromatografi (f.eks. ved hjælp af en "Sepharose 09 "-gel).

EKSEMPEL 7

Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,05 ml af en vandig pufferopløsning (10 mM phosphatpuffer, pH 7,2) indeholdende 0,5 mg/ml cytosinarabinose opløst i 0,15 M vandig natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender 47 mg cardiolipin og en blanding af 2,4 ml dibutylether og 0,6 ml chloroform.

EKSEMPEL 8

Man går frem som i eksempel 5» idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 100 mg/ml opløsning af penicillamin i en 0,15 M vandig opløsning af natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der skal udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 105 mg lecithin, 35 mg cholesterol og 3 ml butylacetat.

EKSEMPEL 9

Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,05 ml af en 150 mg/ml betamethason-dinatriumphosphat i 0,15 M vandig natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 85 mg lecithin, 45 mg phosphatidyl-ethanolamin og 3 ml 3-hep-tanon.

EKSEMPEL 10

Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 1 mg/ml kompleks opløsning af polyinosinsyre og polycytidinsyre i en 0,15 M vandig natriumchloridopløsning og 11 ΐ 4 Mi d λ til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 60 mg lecithin, 20 mg stea-rylamin, 15 mg cholesterol og 3 ml af en 1:1 blanding af diiso-propylether og butylacetat.

EKSEMPEL 11

Til 20 ml diisopropylether tilsættes 1,5 g lecithin, 0,4 g phos-phatidylserin og 0,5 g cholesterol efterfulgt af en opløsning af 1,8 mg actinomycin D i 3 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7)* og blandingen udsættes for vibrationsbehandling som beskrevet i eksempel 5 i omkring 5 minutter. Derefter tilsættes 100 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7), og de to faser adskilles ved centrifugering som beskrevet i eksempel 5. Ved chromatografering på en "Sephadex'S'”-kolonne finder man, at 88% af den tilsatte actinomycin D er blevet indkapslet.

EKSEMPEL 12 1 g trypsin opløses i 30 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7), og opløsningen udhældes i 100 ml dipropylether, der indeholder 30 g phosphatidylinositol. Blandingen udsættes for vibrationsbehandling som beskrevet i de foregående eksempler, hvorefter der tilsættes 460 ml 0,5 % vandig natriumchloridopløsning. Der centrifugeres som beskrevet ovenfor og ved analyse af den vandige fase finder man, at mængden af indkapslet stof er omkring 70 %.

Claims (1)

12 141082 Patentkrav : Fremgangsmåde til fremstilling af liposomer, der indeholder biologisk aktivt stof og som er dispergeret i et vandigt medium, ved hvilken man anvender vibration med ultralydfrekvens i nærværelse af mindst én forbindelse med den almene formel X-Y, hvori X betegner en hydrophil polær gruppe valgt blandt phosphato, carboxyl, sulfato, amino, hydroxyl og cholin, og Y betegner en hydro-phob ikke-polær gruppe valgt blandt mættet eller umættet ali-fatisk carbonhydrid eller alifatisk carbonhydrid, der er substitueret med mindst én aromatisk eller cycloalifatisk gruppe, kendetegnet ved, at man under indvirkning af vibrationen dispergerer en vandig opløsning af det biologisk aktive stof i et organisk opløsningsmiddel, der er uopløseligt i vand, og som har en massefylde, der er lavere end vands, i nærværelse af forbindelsen med formlen X-Y, hvorpå man bringer denne dispersion i kontakt med en anden vandig væske til dannelse af to lag, hvoraf den øvre fase består af denne dispersion, og at man underkaster denne blanding en centrifugering, der bevirker, at kuglerne af opløsningen, der er dispergeret i overlaget, ved graviteten medrives til det nedre lag og ved at passere hinden af forbindelsen med formlen X-Y, der separerer de to lag, danner dispersionen af liposomer. Fremdragne publikationer: Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2249552. LangKiær København