JPS5919527B2 - リポソ−ムの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は合成リポソームの調製に関する。

リポソームは細胞質に生ずる薄状又は油状の小球体であ
る。

合成リポソームという表現は、ｉ ｏ、ｏｏｏ人のオー
ダーの最大直径、好ましくは３００〜２．０００人の直
径を有し、一般式ＸＹ（式中、Ｘは親水性の極性基を示
し、Ｙは疎水性の非極性を示す）の化合物の少くとも一
つの２分子層（３，２００人のオーダーの厚さをもつ）
によって構成された壁によって境界を構成された、即ち
包まれた微小球体を言う。

この微小球体は、水性液体、たとえば少くとも一つの生
物学的に活性な物質の水溶液を含み、そして一般に、食
塩水溶液、特に０．９重量％の塩化ナトリウム溶液のよ
うな水性媒質中に分散したコロイド状分散体の形で存在
する。

リポソームの調整により、水性液体にとって非常に実際
的でかつ効果的な被嚢法が提供され、この被嚢法は生物
学的に活性な物質、特に薬物の生活有機体中への投与に
特に有用であり、これによって投与物質が作用すべき位
置に到達する前に、たとえば胃液又は腸液によって有機
体中で前記活性物質が破壊又は不活性化されるのが防止
される。

リポソームの壁を構成する為に使用する弐ＸＹの化合物
を選定することによって、有機体のある領域の活性に抗
し、そしてこの生物学的に活性な物質を遊離すべき器官
にのみ存在する特定の物質の存在下にのみ攻撃される壁
を有するＩＪ ｒソームを調製することが可能である。

リポソームを調製する二つの方法が知られている。

これらの方法のうちの一つは、被嚢すべき水性液体と脂
質とを接触させ、次にこのようにして得られた不均一混
合物を室温よりわずかに高い温度で加温し、そしてこの
混合物を超音波振動させて激しく撹拌することからなる
。

他の方法は、式ＸＹ（Ｘ及びＹは前述の通り）の化合物
、たとえば脂質を揮発性溶媒に溶解させ、このようにし
て得られた溶液から溶媒を蒸発させることによって容器
（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ ）の壁土に前記化合物の皮膜
を形成させ、リポソーム中に被嚢されることが望まれる
液体を同じ容器中に導入し、そして最後にこの容器中の
液体に超音波振動を受けさせることから成る。

このようにこの二つの方法は、この方法により調製され
るリポソーム中に最終的に含まれる液体の容積より非常
に大きい容積の、被嚢すべき液体を用いることを必要と
する。

これらの方法に従えば、リポソームは、事実上、リポソ
ームの内部に保持されなかった、被嚢すべき液体の画分
から成る液相中に小球体がコロイド状に分散した分散体
の状態で生成する。

リポソームの内部に被嚢された液体の容積のまわりの液
体の総容積に対する比は、一般に、１〜１０％のオーダ
ーである。

それ故、被嚢すべき液体が生物学的活性物質の溶液であ
る場合に最も一般的にみられるように、この液体が高価
なものである場合には、被嚢されなかった液体の両分を
、更にリポソームの調製操作に用いる前に回収すること
が必要である。

この回収は、前記液体からのリポソームの分離、次にそ
の液体自身の精製、そして通常活性物質濃度の再調製を
必要とする。

実際には、前記分離及び精製工程は、大量の溶媒の使用
を必要とし、その結果、活性物質を含む液体の濃度を調
製しなければならない。

前記活性物質を含む液体の精製及びその液体濃度の再調
製の工程を行うことが必要なために、これら従来の二つ
の方法を工業的規模で行うのは困難となる。

本発明は、被嚢すべき液体の容積のみを各調製に用いる
、リポソームの改良調製方法を目的とする。

本発明に従えば、一般式ＸＹ（式中Ｘは親水性極性基を
示し、そしてＹは疎水性非極性基を示し、前記親水性極
性基Ｘはリン酸塩基、カルボン酸基、硫酸塩基、アミン
基、水酸基及びコリン基から選ばれたものであり、そし
て前記疎水性非極性基Ｙは飽和もしくは不飽和の疎水性
脂肪族炭化水素基及び少なくとも一つの芳香族もしくは
環式脂肪族基により置換された脂肪族炭化水素基から選
ばれたものである）で表わされる、リン脂質及び脂質状
物質の群から選ばれた少なくとも一種の化合物の存在下
に、水に不溶性であるか又は水に極く僅かしか溶けずか
つ水より密度の低い担体液体に第一の水性液体を超音波
振動により分散せしめて分散相小球体が前記一般式ＸＹ
の化合物の単分子皮膜で包まれる前記第一の水性液体の
前記担体液体コロイド分散液を生成せしめ、 （１１）この分散液を第二の水性液体と合せて、分散液
から成る上部液層、第二の水性液体から成る下部液層及
びこれら二層を分離する前記式ＸＹの化合物の単分子皮
膜から成る不均一二層系を生成せしめ、次いで （曲 この二層系を前記第一の水性液体の分散小球体が
重力によって前記第二の水性液体の下層中へ前記式ＸＹ
の化合物の単分子分離皮膜を通って移行するに十分な角
速度で遠心分離することから成る合成リポソームの製造
方法が提供される。

このように本方法は二つの工程から成る。

最初の工程では、被嚢すべき液体法の分散体を、超音波
振動作用のもとで生成させる。

これらの球体は、水に不溶性か又は極く僅かしか溶けな
い液体中でコロイド状の寸法（即ち、２００〜１０００
人のオーダーの直径）をもつ。

これらの球は化合物ＸＹの単分子皮膜によって包まれ、
皮膜の親水性基Ｘは、水性液によって占められる球体の
内部方向に向き、そして疎水性基Ｙは非水性相と接触す
る球体の外側方向を向く。

これらの球体は化合物ＸＹの二分子層によってではなく
、該化合物の単分子皮膜によってのみ包まれるので、こ
れらの球体は、正しくは、リポソームを構成しないけれ
ども、それぞれが最終的に得られるリポソームと同一の
容積の被嚢すべき液体を含む、原型リポソームと見なす
ことができる。

以下の記載では、これらの球体はリポソーム前駆体と呼
ぶ。

本発明方法の第一の部分において、被嚢すべき水性液体
と、液体担体と式ＸＹの化合物との相対的割合を適当に
選定することにより、被嚢すべき全液体を、リポソーム
前駆体中に被嚢することが可能となる。

本発明に従った方法は、このようにして、前述のように
、公知方法の操作に必要な回収、精製又は濃度の再調整
の必要性を排除する。

本発明に従った方法により、前述の従来方法に使用する
のには不十分な、たとえば０．０５〜０．１ミリリツト
ルのオーダーの、非常の少量しか得られない液体を、リ
ポソームの形成により被嚢可能であることも理解されよ
う。

即ち、本発明に従った方法は、その他の方法が適用でき
ない、研究室での研究又は分析操作のような分野に適用
できる。

本発明方法の第二の工程は、リポソーム前、駆体からリ
ポソームそのものを生成させることから成る。

このリポソームの生成は、上部液と下部液との間の中間
相の化合物ＸＹの単分子皮膜を通過する際に、それぞれ
のリポソーム前駆体が前記皮膜の一部を同伴し、この皮
膜の一部が前駆体を包む化合物ＸＹの単分子皮膜と一緒
になり、そしてこのようにしてリポソームに特徴的な化
合物ＸＹの二分子皮膜が生成するという事実に起因する
ものと思われる。

化合物ＸＹの単分子皮膜は、疎水性基ＸＹが非水性層に
埋め込まれたままの状態にあるのに、親水性基Ｘが水性
液層へ引きつけられるという事実の故に、上部液体説下
部液体との間の界面に存在する。

式ＸＹの化合物は、たとえば、親水性基Ｘが、リン酸塩
基、カルボン酸基、硫酸塩基、アミン基、水酸基及びコ
リン基の一つであり、そして疎水性基Ｙが、飽和又は不
飽和の脂肪族炭化水素基（たとえば、アルキル又はアル
キレン基）及び少くとも一つの芳香族又は脂環族基によ
り置換された脂肪族炭化水素基の一つである化合物から
成る。

好ましくは、リン脂質又はリン脂質に非常に関連した物
質を式ＸＹの化合物として用いる。

特に、レシチン、フオスファチジルエタノールアミン・
リゾレシチン、リゾフオスファチジルエタノールアミン
、フオスファチジルセリン、フオスファチジルイノシト
ール、スフィンゴマイニリン、カルジオライピン、フオ
スファチド酸及びセレブ爾サイドが有用である。

式ＸＹの化合物として、少くとも一つのリン脂質と前記
リン脂質と異なる部類に属する。

少くとも一つの他の脂質との混合物を用いることも可能
である。

特に、ステアリルアミン、ジセチルフオスフエート、コ
レステロール及びトコフェロールを用いることができる
。

水に極く少ししか溶けないか又は不溶性の液体担体は、
水より密度の低い、有機液体特にベンゼン、ハロベンゼ
ン若しくはアルキルベンゼン、脂肪族エーテル、脂肪族
ケトン、脂肪族アルデヒド、脂肪族エステル、脂肪族炭
化水素、脂環族炭化水素又はそれらの混合物の一つとす
るのが好ましい。

第一の水性液、即ちリポソーム中に被嚢すべき液体の選
定は、そのリポソームに対して要求される用途にのみ限
定される。

特に１．酵素又は抗生物質のような薬物の溶液のような
少くとも一つの生物学的に活性な物質の溶液を使用する
ことができる。

第二の水性液は、純水か又は適当な任意の他の水性液と
することができる。

なるべくなら、第二の水性液は、リポソームを使用する
時、リポソームの分散の為の担体であることが要求され
る液体たとえば塩化ナトリウムの水溶液が好ましい。

特に、０．１５モル／リットル（０，９重量％）の塩化
ナトリウム濃度を有する、生理的血清又は生理的食塩と
して公知の塩化ナトリウム水溶液を、本発明方法の第二
工程で、人体に注入可能な媒質に分散させたリポソーム
分散体を直接得る為に用いることができる。

即ち、リポソームの最終的な使用に対して選定された水
性媒質中に懸濁させたリポソーム懸濁液を直接得るこ吉
が可能であることは、リポソームの従来公知の調製方法
と比較して、本発明方法の付加的特長である。

しかしながら、たとえばリポソームの最終的な使用の前
に、被嚢されなかった活性物質を残らず除く事が望まれ
るような場合には、リポソームを第二水性液体から分離
する事が従来と同様可能であることが理解されよう。

この分離は、たとえば、ゲルクロマトグラフィーによる
ような、任意の適当な公知方法によって容易に行うこと
ができる。

以下、本発明に従ったリポソームの製造方法の各工程に
ついて更に具体的に説明する。

第１工程 ２０ｍ１容のフラスコに有機溶媒さしてジブチルエーテ
ル４Ｖｌ！とクロロホルム１ｍｌの混合物を加え、これ
に一般式ＸＹの化合物としてホスファチジルエタノール
アミン（ＸＹ）１２モル、ステアリルアミン（ＸＹ）２
２モル及びコレステロール２モルを添加する。

かくしてフラスコ中に溶媒と脂質ＸＹを共存させる。

第２工程 第２工程においては、フラスコにベタメタソン（ｂｅｔ
ａ、ｍｅｔｈａｓｏｎｅ） １５０ｍ９／ ｌを含む水
溶液（Ａ）０．２５ｒｒＬｌを添加し、フラスコ内容物
に室温（水冷却）で２分間１７ＫＨｚの近超音波振動（
７０Ｗ）を与えた。

かくして、化合物ＸＹの単層で包まれた溶液Ａの微小球
体が有機溶媒中に分散する。

各部（リポソーム前駆体）のシェル構造はＸＹであって
Ｙがシェルの外側に位置しそしてＸが各部の内部水溶液
の力を向いている。

第３工程 上記”前駆体″の有機溶媒懸濁液を、０．１ Ｍ塩化ナ
トリウム水溶液１．５ｍｌ含有８ｍｌ容遠沈管に上層と
して装入し、次いで遠沈管を３０．００ Ｏｒ、ｐ、ｍ
で３０分間遠心分離した。

過剰の化合物ＸＹを含む有機上層をサイホンで吸い取る
。

この工程では遠心分離の工程において界面バリヤを横切
る時最終的なリポソームが生成し、そして実質的にすべ
ての最初の溶液（５）がリポソーム中にカプセル化され
、はとんど純粋なＮ ａ Ｃｘ溶液中に懸濁したリポソ
ームが得られる。

第４工程 上で得たリポソームの水性懸濁液を”セファデックスＧ
５０′′カラム（溶離剤ニリン酸ナトリウム溶液１ミリ
モル／１１ ）に通す。

溶出液の非リポソーム部分の分析の結果、僅か約１０〜
１５％のベタメタソンがカプセルからはずれたに過ぎな
いことが確認された。

これは無視しうる値である。以下の実施例により本発明
を更に詳細に説明する。

実施例 １ 溶液１１ｒＬｌに対し１０■のアミログルコシダーゼを
含むアミログルコシダーゼ水溶液を次の方法で塩化ナト
リウム水溶液（０，１５モル／ｌ）中で被嚢した。

レシチン（５４〜）と上記アミログルコシダーゼ水溶液
（０，１ｍ１）をジブチルエーテル（３ｍｌ）中へ添加
した。

次にこのようにして得られた不均一混合物に超音波（又
は超音波に近い）振動（振動数１７ＫＨｚ：出カフ０ワ
ット）を２分間行い、その間温度を冷却浴により３０℃
未満に保持した。

見掛は上鉤−で青みがかった反射を有する透明液体が得
られた。

この液体の層を、遠心分離管内の、１．５ＴｒＬｌの塩
化ナトリウム水溶液（０，１５−Ｅ：／し／Ａ）の層上
に入れた。

このようにして、水性相（塩化すｌ−ＩＪウム溶液）に
よって構成される下層と、ジブチルエーテル、レシチン
及びアミログルコシダーゼ溶液の混合物を超音波振動さ
せることによって、本方法の第一段階で得た有機相によ
って構成される上層とから成る二相の混合物が得られた
。

との二相の混合物を３０．００ Ｏｒ、ｐ、ｍで３０分
間遠心分離した。

次に、上層（有機相）を除去し、そして下層（水性相）
を更に３０． ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離
した。

かすかに青みがかった澄んだ液体が、非分散脂質（レシ
チン）から成る非常に少量の残渣と共に得られた。

この残渣は捨てた。

この澄んだ液体は、０．１５モルの塩化ナトリウム溶液
中に懸濁したアミログルコシダーゼ溶液を含むリボゾー
ム（コロイド性の寸法を有する）の懸濁液から成り、そ
して亦た少量の被嚢されないアミログルコシダーゼを含
む。

懸濁液をいかに使用するかによって、この懸濁液を、そ
のまま又はゲルクロマトグラフィー（たとえば、セファ
ロース（デキストラン）ゲル上で）によって被嚢されて
いないアミログルコシダーゼを除去した後に、使用する
ことができる。

実施例 ２ １００〜／ｍｌのベニジルアミンを含む緩衝溶液（リン
酸バッファー １０ ｍＭ、 ｐＨ７，２） （０，０
５ｒＩ′ｔｌ）を、超音波振動を受けさせて有機相を生
成させる為に、レシチン（２７ｍ９）及びジブチルエー
テル（２，４ｍ１）とクロロホルム（０，６ｍ１）との
混合物を使用して、０．１５Ｍの塩化ナトリウムの水溶
液中で被嚢した。

このプロセスは実施例１と同一の方法で行った。

実施例 ３ 実施例１と同様の方法で、３００〜／ｒｒＬｌのイミブ
ラミンを含む水溶液（０，１ｒｒＬｌ）を、ジブチルエ
ーテル（３ｒｒＬｌ）中に混合したレシチン（２５■）
とコレステロール（４０■）との混合物を使用して、０
．１５Ｍの塩化すｌ−ＩＪウム水溶液中で被嚢した。

実施例 ４ 実施例１と同様の方法によって、１５０〜／ｍｌのベタ
メクソンジナトリウムフオスフエート水溶液（０，０５
ｒｒＬｌ）を、ジブチルエーテル（２，５ｍ１）とクロ
ロホルム（０，５１１Ｌｌ）との混合物中に混合したレ
シチン（１５Ｔ１ｇ）とフオスファチジルエタノールア
ミン（１２■）との混合物を最初の段階に用いて、０．
１５Ｍの塩化すｌ−ＩＪウム水溶液中で被嚢した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （［）一般式ＸＹ（式中Ｘは親水性極性基を示し、
   そしてＹは疎水性非極性基を示し、前記親水性極性基Ｘ
   はリン酸塩基、カルボン酸基、硫酸塩基、アミノ基、水
   酸基及びコリン基から選ばれたものであり、そして前記
   疎水性非極性基Ｙは飽和もしくは不飽和の疎水性脂肪族
   炭化水素基及び少なくとも一つの芳香族もしくは環式脂
   肪族基により置換された脂肪族炭化水素基から選ばれた
   ものである）で表わされる、リン脂質及び脂質状物質の
   群から選ばれた少なくとも一種の化合物の存在下に、水
   に不溶性であるか又は水に極く僅かしか溶けずかつ水よ
   り密度の低い担体液体に第一の水性液体を超音波振動に
   より分散せしめて分散相小球体が前記一般式ＸＹの化合
   物の単分子皮膜で包まれる前記第一の水性液体の前記担
   体液体コロイド分散液を生成せしめ、 （１１）この分散液を第二の水性液体と合せて、分散液
   から成る上部液層、第二の水性液体から成る下部液層及
   びこれら二層を分離する前記式ＸＹの化合物の単分子皮
   膜から成る不均一二層系を生成せしめ、次いで （曲 この二層系を前記第一の水性液体の分散小球体が
   重力によって前記第二の水性液体の下層中へ前記式ＸＹ
   の化合物の単分子分離皮膜を通って移行するに十分な角
   速度で遠心分離することを特徴とする合成リポソームの
   製法。 ２ 一般式ＸＹの化合物がリン脂質である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ リン脂質が、レシチン、フオスファチジルエタノー
   ルアミン、リゾレシチン、リゾフオスファチジルエタノ
   ールアミン、フオスファチジルセリン、フオスファチジ
   ルイノシトール、スフィンゴマイニリン、カルジオライ
   ピン、フオスファチド酸及びセレブロサイドから成る群
   から選ばれたものである特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４ 一般式ＸＹの化合物が少なくとも一つのリン脂質と
   前記リン脂質と異なる部類に属する少なくとも一つの他
   の脂質とを含んで成る特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ５ 他の脂質が、ステアリルアミン、ジセチルフオスフ
   エート、コレステロール及びトコフェノールから成る群
   から選ばれたものである特許請求の範囲第４項、記載の
   方法。 ６ 担体液体が有機液体である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ７ 有機液体が、ベンゼン、ハロベンゼン又はアルキル
   ベンゼン、脂肪族エーテル、脂肪族ケトン、脂肪族アル
   デヒド、脂肪族エステル、脂肪族炭化水素及び環式脂肪
   炭化水素並びにこれらの混合物から成る群から選ばれた
   ものである特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 第一の水性液が少なくとも一つの生物学的活性物質
   の水溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ 生物学的活性物質が酵素である特許請求の範囲第８
   項記載の方法。 １０生物学的活性物質が抗生物質である特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 １１ 第二の水酸液が塩化ナトリウムの水溶液である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １２塩化ナトリウム溶液が１リツトルあたり０．１５モ
   ルの塩化すｌ−ＩＪウムを含む特許請求の範囲第１１項
   記載の方法。