JPS61180713A - 脂質小胞の製法およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に脂質小胞すなわちリポソームの製造に
関し、さらに詳しくは、その小胞を治療または診断的用
途に適当なものとするような成分を含有し該成分は膜内
に組込まれていても、またはカプセル化されていてもよ
いものとする、かかる小胞の製造に関する。

脂質小胞は、それが単室構造にせよ多室構造にせよ、連
続膜状の脂質、特に少くとも一種のリン脂質を含む脂質
混合物から構成された壁を有している。脂質小胞の製造
、性質および用途全般に関しては、ＰａｐａｈａｄｊＯ
ｐＯｕ’１０８ら（編）、［リポソームＪ　（Ａ！ｉｎ
、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、第３０８巻（１９
７８年）〕、Ｔｏｍう（編）、［リポソームと免疫生物
学Ｊ（エルゼビア・ノース・ホランド社にューヨーク州
）（１９３０年）〕、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら（ｍ）
、ｒ生物学的系におけるリポソーム」〔ジョン・ウイリ
ーアンドサンズ社にューヨーク州）（１９８０年）〕、
Ｋｎｉｇｈｔ　（Ｉ！　）、「す゛−ソーム：物理的構
造から治療的応用まで」〔エルゼビア・ノース・ホラン
ド社にューヨーク州）（１９８１年）〕およびＧｒｅｇ
ｏｒｉａｄｉｓ　（編）、「リポソーム技法」、第−巻
（ｃＲａ　７’レス社、（ポカ・レートン、フロリダ州
）（１９８４年）〕ヲ参照されたい。これらの文献に論
じられている通り、従来手脂は非常に多くの方法によっ
て製造されてき九が、それらの製法にはそれぞれ利点と
欠点とがある。

これらの方法のうち最も古いものは、適当な有機溶媒中
に溶解した膜成分をガラス容器の内壁上に被覆膜として
、例えば蒸発により、沈積させて多重小胞（ＭＬＶ）を
構造するという皮膜形成法を使用するものである。カプ
セル化すべき材料の水溶液を水和性混合物として容器内
に導入する。容器をある時間摂と５または回転し□て脂
質被覆の個々の層をはがし、水和性混合物をカプセル化
または捕捉した小胞を形成させる。得られる小胞の太さ
は数分の１ミクロンから数ミクロンまで変化し得る。満
足な捕捉結果を得るには通常長い水利時間（１０〜２０
時間）が必要である。捕捉の程度は、脂質被覆が沈積す
る表面の性質、かくはんの方法、沈積被覆の厚さ等の物
理的および機械的因子に左右される。また、得られる小
胞の太さも、例えば０゛、１ミクロンから数ミクロンま
で広範囲に変化し得る。生成する脂質小胞の数は容器の
有効面積の関数であるので、この方法で実地生産規模に
までスケールアップするとすれば極めて大きな容器が必
要となるであろう。

別の方法として、上記皮膜形成法によって製造した脂質
混を物またはＭＬＶを超音波処理することにより、小粒
の単層ント胞（ＢＵＹ）が製造された。

ＳＶＶの代表的な太さは通常２０〜１００　ｎｍの範囲
で、粒度分布は通常Ｍ’ＶＬよりも狭い。８ＵＶは低分
子量材料、例えば医薬のカプセル化には有用であるが、
タンパク質例えば酵素または抗体、核酸およびその他の
高分子量ポリマーを効率良くカプセル化するには小さ過
ぎる。この目的のためには、ＳＵＶを水和性媒質中でア
ルカリ金属イオンの存在において一連の凍結融解サイク
ルを行うことにより大型化して大粒単層小胞（ＬＵＶ）
　’ｉ影形成せることができる。この方法は、超音波処
理および凍結融解という余分の工程が必要な点で、前記
皮膜形成法よりもさらに時間のかかる方法である。

小胞を形成するための今一つの方法は逆転相蒸発法を使
用するものである。この方法では脂質を、水和性混合物
と比重が同一の適当な有機溶媒または溶媒混合物に溶解
する。この脂質溶液を超音波処理または激しいかくはん
によって水和性混合物中に十分分散し乳濁液を生成させ
る。次で有機溶媒を逆ミセルが生成する段階まで蒸発す
る。さらに蒸発を行い残った溶液を振と５するとＬＵＶ
が生成する。この方法の欠点は乳化過程に伴う技術上の
困難性、および敏感な分子、例えばタンパク質や核酸が
乳化工程中に有機溶媒との長時間の接触によって変性す
る危険があることである。

また逆転相蒸発法に類似した注入法も使用された。この
方法では脂質を最初に有機溶媒・例えばエーテル、エタ
ノール等に溶解する。得られた溶液を微小流の形で温い
水和性混合物中に注入し、溶媒を溶解または蒸発させる
。その結果脂質は水和性混合物中に分散して小胞を形成
する。エタノールまたはエーテル注入法によって生ずる
小胞はいずれも比較的小型で（０，４ミクロン以下）、
膜面積に対して捕捉容積の比が大きいことが必要な用途
、例えば免疫診断には不適当である。エタノール注入法
により生成する小胞はエーテル注入法によるものに比ベ
カプセル化効率が悪い。溶媒の蒸発を促進するため減圧
または加熱を行うことができる。しかし、敏感な分子が
熱または有機溶媒との接触により変性される危険はやは
り存在する。

さらに別の方法においては界面活性剤除去法を使用する
。この方法においては、脂質を界面活性剤を含む水性媒
質中に導入すると脂質が可溶化される。次に徹底的に透
析して界面活性剤を除去すると脂質は水性媒質に不溶と
なり、小胞を形成するようになる。界面活性剤を完全に
除去するにはｍＲ間の透析が必要である。極めて少量の
界面活性剤が媒質中に残存しても小胞の最終的な透過性
に影響し、従つ・て診断または治療用試薬としてのその
有用性に影響を与える。

治療または診断用の小胞の商業的生産方法を考える場合
多くの要件が存在する。優れた方法としては、迅速で、
実生産量へのスケールアップが容易であり、水和性混合
物中に存在する溶質の小胞内へのカプセル化または捕捉
が最大でなければならない。さらにこの方法は小胞形成
過程に含まれる成分の化学的安定性に悪影響を与えては
ならない。

以上に述べた従来の方法にはそれぞれ一つまたはそれ以
上の欠点がある。通常、小胞の製造および精製のための
合計時間は何時間ものオーダーである。スケールアップ
については、容器の表面におけるリポソーム生成に依存
する方法、例えば皮膜形成法または界面活性剤除去法に
よるような方法はスケールアップが困難な恐れが大きい
。球形容器の表面積は直径の自乗で増加するのに対し容
積は三乗で増加する。その結果商業生産には大型で扱い
にくい装置が必要となるであろう。前述の方法のいくつ
かにおいては、小型でカプセル化効率の不良な小胞が生
成する。生物学的分子の変性を起すような条件、例えば
有機溶媒との接触、乳化、加熱等を伴う小胞形成法は好
ましくない。

以上に論じた各種従来法の欠陥と対照的に、本発明の方
法は小胞の製造を大幅に簡単化し、商業生産へのスケー
ルアップへの適応が容易であり、かつタンパク質その他
の敏感な分子が水利工程中に変性される可能性金なくす
るものである。

本発明では先ず脂質の被覆または皮膜を変形可能な基体
表面上に形成する。好ましい方法においては、かかる表
面は、水膨潤性で、水性水和性媒質にさらされた場合に
その太さを増し従ってその表面が変形するような粒子に
よって与えられる。

微細に分割された基体上に脂質被覆を形成することによ
り、小胞調造の容積効率が高く、大規模のバッチを通常
の実験室的装置で生産することができる。脂質を被覆し
た粒子は水性水和性媒質中に導入する。これに伴う粒子
の膨潤により液体層は細片化され、粒子表面から分離さ
れる。水和性媒質中に分散した脂質細片は熱力学的に不
安定で、本質的に、水和性媒質の一部をカプセル化した
ｌト胞を形成しようとする傾向がある。

脂質被覆を形成するためには、好ましくは、乾燥した水
膨潤性の粒子全脂質の有機溶媒溶液中に導入する。場合
により、小胞の膜内に取込まれるべき追加的成分、例え
ば医薬、脂質複合体または複合体前駆体等を有機溶媒に
添加する。有機溶媒を蒸発して脂質および（あれば）追
加的成分を粒・　　子表面上の複合被覆または皮膜とし
て沈積させる。

被覆された水膨潤性粒子を水性水和性媒質例えば緩衝剤
水溶液と一諸にすると、粒子は急速に膨潤して「破裂」
し、粒子上の脂質被覆が細片化される。脂質被覆の細片
化は非常に急速に起る。脂質被覆の細片は表面から分離
し、水和性媒質によって完全に囲まれ、小胞を形成しよ
うとする。従って、水利が例えば前記従来法である皮膜
形成法における如く「単一方向的」すなわち単一表面に
限定されることがないので、水利速度が非常に増大する
。かかる従来法においては、水利過程によって、結局、
表面に耐着している脂質被覆の各層が遂次けがされ、各
層が順次水和性媒体にさらされることになる。本発明の
水利過程にはこのような限定がなく、むしろ、水利が脂
質細片のいくつかの表面で同時に起るという点で多方向
的である。

かかる多方向的水利により、小胞を形成すべき細片の個
々の層の分離が促進される。かくして形成された小胞は
水和性相から回収し、次で精製し粒度を揃える工程にか
けることができる。

従って、本発明は最初に、変形可能な表面上に、他の成
分を含むまたは含まない脂質被覆または皮膜を形成する
ものである。脂質被覆を水和性媒質に浸すと表面は変形
され、被覆に応力を加えひびを生じさせる。その結果被
覆は細片化され表面から分離する。この脂質被覆の細片
はもはや表面上に拘束されていないので、多方向的水利
を受け、これによりこの細片の個々の脂質層は急速に分
離する。これらの細片化された脂質層は、「閉じていな
い」形では熱力学的に不安定であり、「閉じた」すなわ
ち小胞の形が脂質層として熱力学的により安雉であるた
め、自然に小胞を形成しようとする傾向がある。

脂質被覆の細片化と分離とは、脂質を沈積すべき表面の
特性全適正に選択することにより助長される。脂質沈積
の際は、この表面は沈積した脂質被覆となじむ様十分に
疎水性でなければならない。

しかし、水利および細片化に際しては、この表面は脂質
被覆細片を排除するよう゛に親水性を示すことが好まし
い。水性媒質中で膨潤する材料を使用することが好まし
い。何故ならかかる材料は水和された場合一般ＶＣ親水
性を示すからである。しかしかかる特性は絶対的なもの
ではない。というのは、小胞の生成は脂質被覆の細片が
表面から排゛除され多方向的水和作用を受けるような如
何なる技法によっても促進されるからモある。

手脂形成のための本発明の好ましい態様においては、変
形可能な表面、例えば水膨潤性粒子の表面を脂質を沈積
すべぎ基体として使用する。この沈積は液相から、例え
ば蒸発によって行われる。。

脂質被覆は、形成される小胞の膜内に取込まれるべき他
の成分を含んでもよい。基体表面は乾燥時に、は７．些
積中に脂質被覆となじみ得る′十分なだけ疎水性である
ことが好ましい。また基体表面、は、水和された時は、
脂質被覆に対して親水性を示すことが好ま、しい。従っ
て、水利過程中の基体表面の変形例えば粒子の膨潤によ
る脂質層の細片化、およびこれに伴って生ずる表面特性
の変化が、かかる表面からの脂質細片の解放と水和性媒
質中における小胞の形成とを促進する。

この明細書で使用する「小胞」なる用語は、脂質また。

は脂質様材料から構成された膜を含有して成り、かかる
膜によってかこまれた少くとも一個の水性の隔室を有す
る合成の細胞様構造を指す。

「脂質」なる用語は、好ましくは１０ないし２０個の炭
素原子を有する長い脂肪酸銀を含有して成る任意の物質
を指す。「脂質様」なる用語は脂質と同様の物理的また
は化学的性質の緘水性部分を有する物質、例えばポリハ
ロヶ９ンｒヒ炭素鎖ヲ有する分子を指す。小胞形成に使
用される脂質または脂質様材料は分子の一端に極性基を
他端に疎水性部分を有する。かかる材料は「両親媒性物
質」とも呼ばれ、例としてホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、
スフィンゴミエリン、カルシオリピン、プラスマロゲン
、およびセレブロシドが挙げられる。

さらに、他の材料例えば充填剤および液化剤も、膜形成
の際に脂質と併用することができる。コレステロールお
よび他のステロール、または類似の構造および物理的性
質を有する化合物をかかる目的に使用することができる
。充填剤および（または）′ｅ、化剤の量は、当業界で
周知の通り、小胞に所望の安定性と透過性とを与えるよ
うに変化することができる。

また、当業界で周知の通り、脂質に他の材料例えばポリ
フッ化炭化水素を併用して、別個の相の形成により意図
的に膜の連続性を破壊し、これによって膜の透過性を改
変し、診断用または治療用として必要に応じカプセル化
される材料の放出を調節することができる。さらに膜の
配合に重合性モノマーを加えることもできる。膜の生成
後、これらのモノマーを化学的または物理的方法によっ
て１合して膜上架橋し、これにより膜の機械的強度が増
し透過性が減少する。可逆的に解重合し得るモノマーを
膜の配合に添加して重合し、貯蔵安定性を改善すること
もできる。解重合によって膜は元の性質を回復する。

小胞の形成に適当な別の部類の材料は荷電した脂質また
は他の両親媒性物質であって、これにより膜には正味の
電荷が与えられる。その結果、小胞は静電的反撥力によ
って溶液内で個別に分離した状態金保とうとする。従っ
てかかる小胞は液体試料媒質内において凝集せずに分散
を保つ傾向があり、試料内に存在する他の溶質との反応
が助長される。

また、膜の配合にはしばしば化学的安定剤が使用される
。例えば、酸化防止剤例えばアルファトコフェロールが
、ある種の脂質内（（見いだされる二重結合の酸化防止
のためにしばしば使用される。

か−る二重結合の酸化は、膜の化学的、物理的性質に好
ましくない変化を与えることがある。

一般に、使用に際し、試薬類は小胞内にカプセル化する
か、模本体内に組込むかのいずれかの方法によって小胞
と緊密に結合され、これらの小胞を診断または治療用途
に適当なものとする。試薬が小胞内にカプセル化される
か膜内に組込まれるかは小胞の使用目的および試薬の性
質によって定まる。例えば診断用、例えばリポソームを
（資）用する免疫検定においては、酵素の如き試薬は小
胞内にカプセル化され、また抗原は小胞膜の外部表面に
複合、または外部表面から露出するようにされる。Ｆｒ
ａｎｃｉｓ　Ｘ、Ｃｏ１ｅの米国特許第４．３４２．８
２６号明細書およびＲ８Ｈ０Ａｄｏｌｆｓｅｎらの米国
特許出願筒６７８．５３１号明細書（１９８４年１２月
５日出願）を参照されたい。ある容積の試料内の被分析
物は限られた量の抗体に対してかかる抗原と競争する。

抗原−抗体複合体が、細胞溶解剤例えば補体の存在にお
い工小胞上に形成されると免疫溶解が起り、それによっ
て、カプセル化された試薬は試料媒質内に存在した、ま
たはその中に導入された成分（基質）と反応可能となる
。免疫溶解の量は反応した試薬の量によって示され、被
分析物濃度の指標となる。代表的な脂質−抗原複合体は
コレステロールをベースとするものまたはホスファチツ
ルエタノールアミンをベースとするものである。複合体
は膜形成の際に存在する必要はない。

例えば別の方法として、複合体前！一体が膜配合、膜内
に存在して、公知の方法により膜の形成後に複合化の拠
点として使用されてもよい。Ｈｅａｔｈら、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙａ、、Ａｃｔａ　６４０　、６６　
（１９８１）参照のこと。また標識性材料、例えばスぎ
ン標識物、放射性同立体標識化化合物等を小胞内にカプ
セル化して免疫溶解の量すなわち試料一度の指示に使用
することもできる。

治療目的に対しては、水浴性医薬を小胞内にカプセル化
することができ、また水に不溶性の医薬を小胞の膜内に
組込むことができる。小胞は患者の特定の器官を目標物
としており、この場合かかる医薬をその器官に送達する
ための運搬手段とし′ｃ使用される。水に不溶の材料を
カプセル化する場合には水と混合し得る共溶媒を水和性
混合物に加えてこれを可溶化することができる。添加す
る共磐媒の量は小胞の安定性に悪影響を与えるものであ
ってはならない。水和性混合物に添加し得るその他の成
分には、小胞形成中に一定のＰＨおよび、イオン強度を
維持するための緩衝剤、また安定剤、例えば水和性混合
物内の微生物繁殖を阻止するための剤、酵素の反応性を
維持するのに必要なコファクター、および酸化防止剤が
ある。

液体皮膜が沈積される水膨潤性材料粒子は、表面が平滑
で粒度が１０ないし１０００ミクロンで粒度分布の狭い
ものが好ましい。この表面は乾燥時には沈積した脂質被
覆となじみ得るよう十分な疎水性を示し水利時は親水性
を示すことが必要である。従って、乾燥粒子は脂質を含
有する有・機溶媒内に入れた場合に凝集しないで分散し
なければならず、また脂質被覆はこれら粒子の表面に付
着しなければならない。しかし、水性媒質の存在におい
ては、粒子は周囲の極性物質によって水和されて脂質層
を排除しようとする。かかる性質を持つ材料は有機ポリ
マー例えばポリアミドまたは多機、および無機ポリマー
例えばシリカまたは゛ビオライトである。

また、これらの粒子は水和された場合に粒子上・　　の
脂質被覆を細片化するに十分な程度に膨潤しなければな
らない。膨潤の程度は粒子を形成する材料の三次元的構
造によって定まり、この構造の架橋度と逆に変化する。

また膨潤は材料の化学的性質に依存し、極性が強く親水
性の官能基は膨潤を強める傾向がある。従って、本発明
の好ましい粒子は構造中のかかる官能基の割合が大きい
。一方かかる粒子は、水利に際して水和性媒質中に存在
する水や緩衝塩のみが粒子内に浸透し小胞内にカプセル
化されるべき分子量の大きな材料例えばタンパク質、核
酸等は排除されるよう、十分に架橋・さ、れている。従
って、粒子の急速な膨潤のため、カゾセク化されるべき
大分子量の材料は脂質被覆とｊ！囲の水相性媒質との界
面に績縮される傾向となり、これにより小胞形成中のカ
プセル化効率が壜進される。連続表面でなく粒子を使用
することにより手脂形成過程において高い容積効率が得
られる。

従って、本発明によるリポソームの形成法は、少くとも
、二つの別例の工程、すなわち変形可能な表面（すなわ
ち水膨潤性粒子）上へ脂質被覆を形成することと、水利
に際しかかる表面を変形して沈積された脂質被覆を分離
し、これにより分離した脂質被覆が多方向的水和作用を
受け、小胞形成が促進されることとを含有して成るもの
である。

小胞の膜となるべき脂質または脂質様混合物は最初に、
粒子と化学的に適合性のある適当な有機溶媒中に溶解さ
れる。次に乾燥した、水膨潤性の粒子をこの有機溶液に
加える。有機溶液を回転または振とうして十分に粒子懸
濁液を混合する。次に有機溶媒を蒸発すると、残った脂
質または脂質様材料は粒子の表面上に被覆を形成する。

粒子の脂質被覆を形成するのに、その他の方法を使用す
ることもできる。例えば相転移温度以上に保って流体状
態とした脂質混合物中に粒子を加えてもよい。次にこの
混合物を絶えず回転または振とりすると粒子上に薄い脂
質被覆が形成される。関係する材料にいかなる化学変化
も生じないだめまた粒子の物理的劣化が起きないために
、温度を上げ過ぎぬよう注意を払わねばならない。所望
ならば混合過程に際し超酔波処理を用いて粒子表面上に
均一な脂質被覆を得るようにすることができる。従って
、本発明は、脂質または脂質様混合物を変形可能な基体
すなわち水膨潤性粒子の表面上に被覆として沈積し得る
任意の技法を意図するものである。

水和は、形成される小１泡内にカプセル化されるべき材
料の水溶液中に、脂質で被覆した粒子を導入することに
よって行われる。水和は温度を適当に選定することによ
って促進または減速することができるが、その温度はｈ
脂質被覆の相転移温度より高いことが好ましい。

水和性混合物中の個体と小胞との分離を行なう分離、精
製工程は好ましくは濾過によって行なわれる。小胞を含
む水和性混合物を、小胞のみを通し、＃τ関した種子を
通さない孔を持った濾過器を通過させる。その他の公知
の分離方法としては、小胞の沈殿または逆に、浮選およ
び粒子クロマトグラフィがある。従って本発明は、小胞
な分離することのできる任意の方法の使用を意図するも
のである。

所望の場合はこの段階において、懸濁液を所望の直径の
滑らかで一様な孔を有する膜を通して「押出す」公知の
技法により、小胞の粒度均一化を行なうことがでをる。

このような孔を通すと大きな小胞は粒度の調整されたよ
り小粒の小胞に改造される。

小胞の精製工程は、当業界で周知の如き、速度を調整し
た一連の遠心分離によって達成することができる。小胞
の懸濁液を遠心し上澄液は煩潟する。次に分離された小
胞を洗浄し、緩衝液に再懸濁する。得られた懸濁液を遠
心し、この過程を十分な精製が達成されるまで繰返えす
。別の方法として、精製は公知のカラムクロマトグラフ
ィ法によって行なうこともできる。従って本発明は小胞
精製のための任意の適当な公知技術による方法の使用を
意図するものである。

以下の実施例においては、可能な場合は常に標準の重板
薬品を陸用したが、本発明により脂質小り包を形成する
だめの好ましい方法を例示する。記載の薬品はすべて、
シグマケミカル社（セントルイス、ミズリー州）から購
入した。

例　　１ 本実施例は、本発明の方法による、ベータ　がラクトシ
ダーゼを含有しチロキシン変性リン脂質で感作されてい
る、チロキシンの非同位元素的免疫検定用の小泡の製造
について述べる。

クロロホルム４　Ｑ　ｒｎｌ中のホスファチゾルコリン
（ＰＣ）２２１）１５？、ジセチルホスフエート（Ｄａ
ｐ）５．２５■、コレステロール８．７“Ｑ、フルファ
トコフエロール０．６５１ｖ、およびチロキシン−ジニ
トロフェニル　ホスファチジル　エタノールアミン２．
２／ｎ９の混合物を１００属の沸騰フラスコ中で、水流
ポンプを使用して４０℃で１時間、次に真空ポンプを使
用して室温で１時間圧力０．９トルで排気して、ポリア
クリルアミド　ビーズ〔ビオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）　
ｐ　−２、−４００メツシユ）１，５ｆＩ上に蒸発乾固
した。脂質で被覆されたビーズを４°Ｃ（（冷却し、ベ
ータ　がラクトシダーゼ（グンードｖｌ）２９Ｉｎ＆（
１５，０００単位）をバルビタール緩衝液（ｐＨ８，５
、バルビタール０．０５　Ｍ　、　Ｎａ（ＪＯ，Ｉ　Ｍ
　’）　１０．５ｄに溶解した溶液を加えて水和した。

ビーズは直ちに膨潤し、ビーズ上の脂質の剥離が直ちに
生じた。小胞は非常に高速度で生成し、系は２−３秒内
に安定化することが目視された。

フラスコの内容物を二、三分間振とう後膨潤したポリア
クリルアミＶ　ビーズを中程度の孔度の半融がラス濾過
器（孔の太さ１０〜１５ミクロン）を通して加圧濾過し
た。濾液をＬ８−５５型趨遠心器（ベックマン　インス
ツルメント社、パロアルト、カリホルニア州）中、８℃
で７０Ｍのポリカーボネート製管を使用して６０分間、
遠心速度それぞれ１５，０００．２０，０００．２０．
０００および２０．００　Ｏｒｐｍで遠心−洗浄サイク
ルに４回かけた。小胞沈殿物を回収しバルビタール緩衝
液１５−を使用して洗浄した。最終の洗浄後管壁に粘着
しているものは小胞を形成しなかった脂質でありこれは
廃棄した。最終沈殿物は緩衝液６７Ｉｌに再懸濁して全
容積約６．５コとした。小胞のベータがラクトシダーゼ
活性を検定するため、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ン（ＴＲ工Ｓ）緩衝液（ｐＨ７，５、ＴＲｌ８　Ｑ、Ｑ
　５　Ｍ、　ＮａＣＪ　Ｑ、１５　Ｍ、アジ化ナトリウ
ム０．１　％　）中に１：４０に希釈した小胞懸ｍ１３
０μｌをオルトニトロフェニル　ベータガラクトピラノ
シ）”６０＃％と塩化マグネシウム０．００１　Ｍとを
含有する溶液２７０μｌを入れた２本のガラス管に加え
た。ガラス管のうち１本はＴＲ工Ｓ緩衝液中トリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１０００，１％を含み、細胞溶
解剤として作用した。各ガラス管内に生成した色を４０
５　ｎｍで観測した。０．１チドリトン！−１００で溶
解された小胞の速度値は６６５　ｍＡ　７分であるのに
対し非溶解小胞の速度値は１１．５ｍＡ／分であった。

これら小胞はチロキシン検定法において免疫反応性であ
り、以上の様にして製造した材料の量は約２０．０００
回の検定に十分であった。本実施例は、本発明の方法に
よって製造した小胞が水和性媒質を効率良くカプセル化
していること、リポソーム免疫検定に使用するのに適当
であることを示すものである。

例　　２ クロロホルム５　ｍｌ中のホスファチツルコリン１１Ｆ
ｎ９、ジセチルホスフエート２．６　ｍｅおよびコレス
タノール４．５りの混合物を例１と同様にして２５ゴ丸
底フラスコ内でメリアクリルアミド粒子１１１上に蒸発
した。室温で０．５時間肌９トルで排気後フラスコを４
℃に冷却した。脂質で被覆された粒子を、わさびだいこ
んベルオキ７ダーゼＩ型３５７１！ｆ７をあらかじめ溶
解し４　’Ｏに予冷したＴＲ工Ｓ緩衝液（ｐＨ７，５、
ＴＲ工Ｓ　Ｑ、Ｑ　５　Ｍ、Ｎａ１ｌ　Ｏ，１５０Ｍ）
７ｍｌによって水和した。この場合も小胞は時間的に生
成した。生成混和物を１０ミクロン濾過器を通して加圧
濾過した。得られた小胞懸濁液を例１と同様にして遠心
し、小胞と捕捉されなかった酵素とを分離した。小胞調
製液の最終容積は４ｒｎｌに調整した。この小、＠調製
液を同じＴＲ工Ｓ緩衝液に１　：　４００に希釈しだ液
６０μｌを、ＴＲ工Ｓ緩１廚液１２０μｌを入れたもの
と濃度２％のトリトンＸ−１ｏｏを含むＴＲｌ５　緩衝
液１２０／ｊｊｆｆを入れたものとの２個の光学的キュ
ベツトにそれぞれ添加した。各キュベツトを３７℃で５
分間インキエベートした後、各キュベツトに３−（Ｎ−
エチル−アニリノ）ゾロぎルスルホン酸ナトリウムの０
．１Ｍ溶液５０μＪ、４−アミノアンチピレン０．２Ｍ
Ｂ液１００μｌおよび過酸化水素０．０１％溶液５０μ
ｊ（いずれもＴｒｉ工Ｓ緩衝液中の溶液）を加え、発色
速度を３７℃で５００　ｎｍで読み取った。界面活性剤
で溶解された小胞の速度値は１３５ｍＡ／分で、不溶解
小胞の速度値は２９ｍＡ／分であった。

例　　６ ２５０　＋ｎｔ丸底フラスコを使用して例２と同様の実
験を１０倍規模で実施した。得られた小胞懸濁液の容積
は４０ゴに調整した。例２と同様に、この小胞のトリト
ン！−１００で溶解した場合としない場合との酵素活性
を検定した。溶解小胞の速度値は１５８ｍＡ／分で非溶
解小胞の速度値は２５ｍＡ　７分であった。通常の免疫
検定に使用する場合、かかる調製液は５０万回の試験に
十分であり、しかも通常の実験室装置で容易に製造可能
でめる。

本発明において、明細書および請求範囲に示す本発明の
趣旨およびその範囲を逸脱することなく種々の改変が可
能であることは当業者の容易に理解し得る所であろう。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）脂質の被覆をある表面上に沈積し、ｂ）前記
   脂質被覆を水和性水性相と接触させ、そして ｃ）前記被覆を細片化して前記脂質被覆の細片を前記水
   性相中に分散し、前記細片を多方向的水和作用に付し、
   これにより前記水性層中に小胞を生成させる ことを特徴とする、小胞の製造方法。
2. （２）前記沈積工程が、脂質と有機溶媒とを含有して成
   る有機相を形成し、前記表面を前記有機相と接触させ、
   そして前記有機溶媒を蒸発させることから成り、ここで
   前記表面は前記有機相にさらされた場合に前記脂質被覆
   の沈積を可能とするに十分な疎水性を有する材料から形
   成されているものとする、前項（１）に記載の方法。
3. （３）前記沈積工程が、液体状態の脂質を含有して成る
   有機相を形成し、次に前記表面を前記有機相と接触させ
   ることから成る、前項（１）に記載の方法。
4. （４）前記被覆された粒子を前記表面を被覆しなかつた
   前記有機相の成分から分離する工程をさらに含有して成
   る、前項（２）または（３）に記載の方法。
5. （５）前記形成工程がリン脂質を前記有機相中に導入す
   ることを含有して成る、前項（２）または（３）に記載
   の方法。
6. （６）前記形成工程がコレステロールを前記有機相中に
   導入することを含有して成る、前項（２）または（３）
   に記載の方法。
7. （７）前記形成工程がコレスタノールを前記有機相中に
   導入することを含有して成る、前項（２）または（３）
   に記載の方法。
8. （８）前記形成工程がリガンド−脂質複合体を前記有機
   相中に導入することを含有して成る、前項（２）または
   （３）に記載の方法。
9. （９）前記形成工程が少くとも一種の治療的に有効な物
   質を前記有機相中に導入することを含有して成る、前項
   （２）または（３）に記載の方法。
10. （１０）標識物質を前記脂質被覆と接触前に前記水性相
    中に導入する工程をさらに含有して成り、前記標識物質
    は酵素、基質、けい光物質、スピン標識物質、発光物質
    および放射性同位体から成る群から選ばれるものとする
    、前項（１）に記載の方法。
11. （１１）治療的に有効な薬物を前記脂質被覆と接触前に
    前記水性相中に導入する工程をさらに含有して成る、前
    項（１）に記載の方法。
12. （１２）前記表面が変形可能であり、前記細片化工程が
    前記表面を変形させることを含む、前項（１）に記載の
    方法。
13. （１３）前記表面が、前記水性相にさらされた場合に膨
    潤する材料から成る、前項（１）に記載の方法。
14. （１４）前記沈積工程が前記脂質被覆を一つ以上の水に
    膨潤性の粒子の表面上に沈積することを含有して成る、
    前項（１）に記載の方法。
15. （１５）前記沈積工程が前記脂質被覆を一つ以上のポリ
    マー粒子の表面上に沈積することを含有して成る、前項
    （１４）に記載の方法。
16. （１６）前記沈積工程が前記脂質被覆をポリアミドおよ
    び多糖から成る群から選ばれる材料から成る一つ以上の
    粒子の表面上に沈積することを含有して成る、前項（１
    ５）に記載の方法。
17. （１７）前記（１）に記載の方法によつて形成される脂
    質小胞。