JPS6153568A - リポソーム適合性界面活性剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は臨床的に重壁な物質の測定のための特異的結合
検定、特に免疫検定の分野に関する。特異的結合検定は
リガンド、すなわち測定すべき結合可能な被分析物と、
それに対する結合性パートナ−すなわち受容体との間の
特異的相互作用に基いている。リガンドおよびその結合
パートナ−の一方がハプテンまたは抗原であり他方が対
応する抗体である場合この検定は免役検定として知られ
ている。

天然の細胞膜の多くの性質はリポソームと呼ばれる簡単
な脂質二層膜系によって再現することができる。これら
の性質の一つにリンス（＃１胞浴％￥）がある。小胞の
、例えばリポソームの、膜に外部から接近し得る抗原が
含まれていると、これは対応する抗体と反応し凝集を起
す。抗原感作リポソームが補体の存在で対応する抗体と
反応すると膜は不可逆的に損傷され、もはや無傷の選択
的透過性障壁としては機能し得なくなる。こわがイムノ
リシス（免疫溶解）である。

免疫溶解の程度は従来、免疫溶解によって放出されるよ
うな種々の標識分子のいずれかを内部に捕捉含存してい
る抗原感作リポソームを使用して測定されてきた。Ｈｉ
ｘｂｙら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ。

Ｅｉｃｉ．＋　６　４　：　２　９　０　−　２　９　
５　（　１　９　６　９　）、Ｋｉｎａｋｙら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒ７，　８　：　Ａ１４９　−　４１　
５８（１９６９）、Ｋｉｎｓｋｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，　９　：１０４８（１９７０）参照。また、
Ｓｉｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　１　３：４０
　５　０　（　１　９　７　ｄ　）、ウニムラら、Ｉ．
　Ｅｉｏｃｈｅｍ．、　８　７　：　１　２　２　１（
１９８０）、およびウニムラら、 Ｊ，　工ｍｍｕｎｏｌ．　　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　　５　
　３　　：　　２　　２　　１　　−　　２　　３　　
２（１　９８２）も参照のこと。

多層脂質膜小胞をあらかじめ調製または処理して表面に
結合｛−たりがンｒまたはリガンド類似体を有するよう
にし、かつ小胞内に閉じ込められた標識物質または試薬
物質を有するようにしたものを使用する特異的結合検定
系が提案されている。

検定のためのその他の試薬には（１）リガンドに対する
結合パートナ−例えば抗体、および［２ｌ　Ｎｉ体が含
まれ、結合性パートナ−が表面結合リガンドと結合する
と小胞の溶解を引きおこす。全般に関しては、ＭｃＣｏ
ｎｎｅｌの米国特許＊　３，８　５　０．５　７　８号
、ＭｃＣｏｎｎｅｌらの米国特許ｇ　３，８　ｓ　７．
６　９　ｓ号およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら著、１一
生物学的系におけるリポソーム」〔ジョン●ウイリーア
ンドサンズ（ニューヨーク）発行〕、特に「診断手段と
してのリポソーム」と題する第１２′ｘ参照。酵素をカ
プセル化した小胞の使用を示役したイムノリシス系が開
示されている。Ｈθ１ａらの米国特許 第４．２３５，７９２号には標識を内部に有する抗原感
作１７　ｚｊ？ソームのイムツリシスを使用する競争的
均質系免疫検定法が記載されている。開示された標識の
中には酵紫がある（６梱、２４〜２８行）非常に多くの
文献において、リポソームの化学的リンスを達成するた
めに槙々の界面活性剤が使用されている。これは、か〜
る界面活性剤が脂質および脂質含存膜の完全性に対して
持つ一般に認められた効呆に基いている。界面活性剤は
就中、上述したような免疫検定の開発および特性化にお
いて、リポソームを俗解するのに使用されてきた。

例えばＣｏ１θの米国特許第ａ、３　ｉ！ｌ　２，８３
６号およびそこに引用された文献を参照されたい。別の
、実質的に異った種類のリポソーム免疫検定が１９８６
年９月１日出願の、太細と同−譲受人の同時係属出願米
国出ａ番号ｍ　５２８，４９６号に記載されている。こ
れも界面活性剤を使用するリポソームの崩壊について記
載している。

多くの自動分析装置は、連続流型のものを含へこれに使
用する試薬組成物中に界面活性剤が存在して被検液に適
当な流体力学的および元学的性仙を与えることが必要で
ある。しかし従来公知の技術では、リポソーム特異的結
合検定におけるこれらの相反する制約および自動分析系
に関する要求をうまく満足する方法が無かった。

リポソーム特異的結合検定は生体外診断の新しい手法を
提供するものである。均質系免疫検定を自動化臨床化学
に適合させることは特に魅力あるものとなった。特に、
均質系免疫検定の方法を連続流の系に利用することは極
めて望ましいことである。従来の技術と異り、本発明は
連続流系を含む自動分析装置＃に利用し得るリボンーム
含有試桑組成物を提供するものである。この組成物の配
合中で特に重要な成分はリポソームと適合し得る（すな
わちリポソームに俗解およびその他の変化を加えない）
界面活性剤である。

１゜ 従って本発明は、（ａ）試料中のリガンドに対する　　
　１結合性パートナー１（ｂ）表面に結合したリガンド
またけリガンド類似体を督する選択的に接近可能な小胞
、（Ｃ）表面に結合し、たリガンドまたはリガンド類似
体と結合性パートナ−との結合に応答して小胞の接近性
を変化させる物質、（ｄｉ小胞の接近性の変化に対応し
て検出可能な応答を生ずる検出系、および（ｅｌ小胞の
接近可能性を変化させない少くとも一種の界面活性剤を
含有して成る、試料中のリガンド到達用の特異的結合検
定ｍ放物を提供するものである。か〜る界面活性剤の数
種の態様を開示するが、それぞれポリオキシエチレン成
分ヲ有することを特徴としている。

本発明はさらに、独得の連続流特異的結合検定法を含む
特異的結合検定法を提供する。この方法は、前記試料を
、前記リガン「に対する結合性パートナ−１第一および
第二の構成成分を有する検出系、表面に結合されたりガ
ンげまたはリガンド類似体ど、小胞内部に、前記第二の
成分と反応して検出可能な応答を生じ得る前記検出系の
第一の成分とを有するユち択的に接近可能な小ｊ泡、表
面に結合されたりガンｐまたはリガンド類似体と結合性
パートナ−との結合に応答して小胞の接近可能性を変化
させる物質、および小胞の接近可能性を変化させない少
くとも−イｌの界面活性剤を含有して成る組成物と反応
させ、これによって生ずる検出可能な応答を観測するこ
とから成る。広範囲の被分析物の免疫検定による測定を
、操作者の介在なしにまた試料−試料間のキャリオーバ
ーのおそれなしに行うことが可能となる。

本発明の好ましい態様には％異的結合検定試薬組成物な
らびにこの検定用組成物を使用する方法が含まれる。以
下の説明において特定の態様のみ忙関して使用した特定
の用語は、特記しない限りすべての態様に適用し得るも
のである。

試験の対象となる試料液とし７ては生物学的、生理学的
、工業用、環境関係、およびその他の種類の液が挙げら
れる。特に興味があるのは生物学的液、例えば血清、血
漿、尿、１ｉＡ叡、ｌ！！ｉ！ｌα、ミルク、肉汁その
他の培警液および以上のいずれかの上精液ならびに画分
である。従来の方法によって試験されるその他の種類の
試料液もこ〜で使用する用語の意義の範囲内にあると考
えられ、同様に木発明の方法に従って検定することがで
きる。

「リガンＰ」なる語は、試料液、例えば上記したような
試料液中における存在を定性的または定量的に測定すべ
き任意の物質、または一群の関連物質を指す。本検定は
ｌ（キ異的結合性パートナ−の存在するりがンｒの検出
、および逆に、あるｆホ状媒質がリガンドと（通常、試
料中にリガンドに対する結合性パートナ−が存在するこ
とにより）結合する卵力の検出に適用することができる
。リガンＶは通常ベラ０チド、タンパク質、炭水化物、
糖タンパク質、ステロイド、またはその他の、それに対
する特異的結合性パートナ−が存在するか、これを免疫
学的または合成的手段で提供することのできる有接分子
である。、機能面からす、ｈば、リガンドは通常、抗原
およびそれに対する抗体、ノ・ブテンおよびそれに対す
る抗体、およびホルモン、ビタミン、中間代謝物、薬物
およびそれらの受容体、結合性物質、および正常血清成
分、疾病標識物から選ばれる。

「結合性パートナ−」または「受容体」なる語は、リガ
ンドに対１．て他の物質より優先して特異的に結合する
親和性を有する任意の物質、または一群の物質を指す。

本発明はその態様の大部分において、試料中のリガンド
またはその結合性エフェクターと免疫化学的に相互作用
を行う特異的結合検定試薬を組込んでいる６−ｆ′なわ
ち、試料中の試薬および（または）リガンドまたはその
結合性エフェクターとの間には抗原−抗体またはノ１ブ
テンー抗体関係が存在する。従ってこのような検定は免
疫検定と呼ばれ、リガンドとその受容体、または結合性
パートナ−との闇の特異的相互作用は免疫化学的結合で
ある。しかしリガンドと結合性パートナ−との間のその
他の結合相互作用も、ホルモン、ビタミン、中間代謝物
および薬物、とそれラソれぞれの受容体および結合性物
質との間の結合相互作用を含め、特異的結合検犀の基礎
として役立つことは当朶界においてよく知られているこ
とである。例えば結合性剤ないしパートナ−としてのポ
リペプチドホルモン受容体はＬａｎｇａｎら（編）、「
リガンＶ検定」、マッソン出版Ｕ−Ｂ−Ａ・社にューヨ
ーク）、２１１ページ以降 （１９８１年）に論じられている。

「選択的に接近し得る小胞」なる語は、ある内部容積を
包みこみ、一種以上の成分から成り上記内部’８４’ｆ
ｔを構成する一個以上の内部区画を形成している壁を有
する爪−または多数に区画された袋をいう。かへる小胞
の一例は、細胞膜を開き細胞内容成分を取除いた後再び
ｊ摸を封じることによって形成されるノ圃胞ゴーストで
ある。今一つの例はリポソームであり、これは脂質、７
）′：「に少くとも一種のリン脂質を含む脂質混合物か
ら成る１件−または多数に区画された小胞であって脂質
により連続壁または脂質二層膜が形成されている。これ
らＪｌｋｒ質混合物のこれ以外の通線の取分はコレスチ
ロールおよび長５ｕ　ＩＪン脂質である。リポソームは
拙々の技法によって製造することができる。例えば多層
小胞（ＭＬＶ　）はフィルム蒸発とｆｌｉｔ　’Ｊｊフ
ィルムの水オロによって製造することができる。逆相蒸
発小胞（ＲＥＶ　）も製造することができる。これらは
有用な小胞を与える技法の例である。リポソームおよび
その生成の概説については、 Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏａら（編）、１−リポソ
ーム」、（Ａｎｎ、　ｋＪ、Ｘ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｉ
、、　３０８巻（１９７８年）〕、Ｔｏｍら（編）、「
リポソームと免疫生物学」、〔エルゼビアノースホラン
ド社、ニューヨーク州（１９８０年）］、およびＧｒｅ
ｇｏｒｉａｄｉｓら、「生物学的系におけるリポソーム
」、〔ジョンウイリーアンドサンズ社、ニューヨーク州
（１９８０年）Ｊを参照さ゛れたい。

リポソームは表面に結合されたりがンげまたはリガンド
類似体部分を有するようにすることができる。このよう
なリポソームはりガンーー両親媒性物質複合体を使用し
て形成され、この根合体は通常リガンＰ−カップラーー
両親媒性物質分子の形をとっている。両親媒性物質は水
浴性部分と水に不溶性の部分との両方を営む物質である
。その最も良い例としては脂質両親媒性物質、例えばホ
スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン
、ホス７アチジルイノシトール、スフィンゴミエリンセ
レブロシド、ホスファチジン酸、プラスマロデン、カル
シオリピン、および脂肪酸が挙げられる。

別の方法として、リガンーは予め形成されたりｒＪｅソ
ームの表面に共有結合的に結合するか、吸着することが
できる。リポソームが予め形成される場合、その外表面
に抗原が共復結合的に結合し得るいくつかの化学的官能
性を持つことができる。

このような結合に適用し得る適当な反応はＷｉｌｌｉａ
ｍθら、「免疫学および免疫化学における方法」、第−
巻、〔アカデミツクブレス社、ニューヨーク（１９６７
年）〕に記載されている。ある場合には、ウニムラおよ
びＫ１ｎ５ｋｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　　１
１　：　４０８５−　Ａ　０９４（１９７２Ｌ）によっ
て示されたように、抗原をリポソーム表面に吸着するこ
とができる。

本発明の組成物はさらに、表面に結合したリガンドまた
はリガンド類似体と結合性パートナ−との結合に応答し
て小胞の接近可能性を変化させる物質を含む。この物質
の主要な例は総合的に補体と呼ばれる一群の化合物であ
る。補体および七の効果の概説については、Ｒａｐｐら
、［補体作用の分子的基礎Ｊ、（アップルトン−センチ
ユリー−クロフツ社（１９７０年）］参照。また、補体
の役割は先に挙げた、他のリポソーム免疫検定を扱った
文献類の多（に論じられている。

本組成物には、上に引用した文献類に記載されているも
のを始めとする、この種の目的用に従来から認められて
きた任意のｔＪｔＭの検出系を使用することができる。

さらに本組成物は、１９８３年９月１日出願の本譲受人
と同じ譲受人である同時係属出願米国出願番号線５２８
，４９６号に記載されているような検出系をそなえるこ
とができる。

本発明によれば、本組成物はさらに、小胞の接近可能性
を変化させたり、特異的結合検定の基礎となる免疫学的
相互作用を妨害したりしない、少くとも一種の界面活性
剤を含んでいる。このような界面活性剤の、免疫検定試
薬組成物全体中の儂度は約０．１〜約１．０憾の範囲で
ある。　　　　　　　　ｉ′本発明の一態様には、少く
とも約２６個のエチレンオキシドモノマー単位を有する
ポリオキシエチレンポリマーが含まれる。このポリマー
はさらに、芳香族および脂肪族の成分を含む約ｃ８〜（
’１７の疎水性基を有してもよい。この）用様の例とし
ては、少くとも２６個のエチレンオキシド単位を存する
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（フリッジ（Ｂｒ
１ｊ）−３５、米国工Ｃ工社、ウイルミントン、プラウ
エア州）、少くとも３０個のエチレンオキシドモノマー
単位を有するノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（イブパール（Ｉｇθｐａｌ　）ｃｏ−８８０、ＧａＰ
社、ニューヨーク、ニューヨーク州）、および少くとも
３０個のエチレンオキシドモノマー単位を有するオクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ　）Ｘ　３　［３５、ロームアンドハース社、
フィラデルフィア、ペンシルバニア州）が拳げられる。

本発明の別の態様には、式 ％式％） （本式においてｂは少くとも１５であり、ａとＣとの和
は約１１ないし約７６である） で表わされる界面活性剤を含仲する。ａとＣとの和が１
１．１８．３４．４１．４６．４９．５１および７３か
らなる群から選ばれるものが好ましい。このような界面
活性剤はＢＡＢＦ−ワイアンドット社（パルジッパニー
、ニューシャーシー州）からゾルロニツク（ＰＬＵＲＯ
ＮＩＣ）の登録商標で入手できる。

本発明の第三の態様は式 ％式％） （本式においてｂは少くとも５、好ましくは約５〜１５
であり、ａとＣとのオ０は約３０ないし１１３である） で表わされる界面活性剤を含有する。これらのうちで好
ましいのは、ａとＣとの和が３０．５０．６８．７５．
９５および１１３からなる群から選ばれる化合物である
。このような界面活性剤はＢＡＩ３Ｆ−ワイアンドット
社（上山）からテトロニック（ＴＫＴＲＯＭＩＣ）の登
録商標で入手できる。

本発明はさらに、％異的結合検定法を提供する。

この方法は、前記試料を、前記リガンドに対する結合性
パートナ−１第一および第二の構成成分を有する検出系
、表面に結合されたリガンドまたはりガンーＤ’ｌ似体
と、小胞の内部に、前記第二の成分と反応して検出可能
な応答を生じイ＃る前記検出系の８４−の成分とを有す
る選択的に接近可能な小胞、表面に結合されたりガンｒ
またはりがンげ類似体と結合性パートナ−との結合に応
答して小胞の接近可能性を変化させる物質、および小胞
の接近可能性を変化させない少くとも一種の界面活性剤
を含有して成る組成物と反応させ、これにより生ずる検
出可能な応答な観６１１１することから成る。

好ましい一純様においては、試料を（１）リガンドに対
する結合性パートナ−１（Ｉｌｌｆｉ−および第二の４
１９成成分を有する検出系の第二の成分、および（１１
１１本発明の界面活性剤中から独立に選ばれた第一の界
面活性剤を含有して成る第一の組成物と反応させる。こ
れにより生じた反応生成物は、ｈｌ　’）ガントまたは
リガンドＭ似体の結合した；Ｊｅ面と、小胞の内部に、
第二の成分と反応（２て検出可能な応答を生じ得る検出
系の駆−の成分とを有する選択的に接近可能な小胞、（
ｖ１表面に結合されたリガンドまたはリガンド類似体と
結合性パートナ−との結合に応答して小胞の接近可能性
を変化させる物質、および（ｖｌ）本発明の界面活性剤
中から独立に選ばれた第二の界面活性剤を含有して成る
第二の組成物と反応させる。次に、これによって生ずる
検出可能な応答を検出する。

特に好ましい一態様においては、試料を（１）リガンド
に対する抗体、（旧酵素基質と、基質に対する酵素と基
質との相互作用によって検出可能な変化を受ける物質と
から成る検出系の成分、および（ｆｉｌｌ上述の界面活
性剤を含有して成る第一の組成物と反応させて反応混合
物を生成させる。次にこの反応混合物を、（Ｍ　リガン
ドまたはリガンド類似体の結合した表面と、リポソーム
の内部に、その基質と反応して上記検出可能な変化を生
じ得る物質を変化させることのできる酵素とを有するリ
ポソーム、（Ｖ）補体、および（ｖｌｌ上述の界面ｔａ
性剤を含有して成る第二の組成物と反応させろ。検出し
得ろ応答としては比色またはルミネセンスによるものが
好ましい。

上述の辿り、本発明の組成物は連続がｔの系において特
に有用である。このような組成物が特に升ｇｔｘこの釉
の系の一つは、本願と６餞受入が同一で１９８２年１１
月１５日出願の同時係属出願米国出願番号ｇ、ｉ４１，
８８１号に記載されている。具体的な例とり、で、本発
明による特異的結合検定はリガンド検出用のこのような
連続流系につ−いて、逐次連続するＩｒ−１車二および
第三の区分を有する単一の導管内を流れる、ガス部分と
散体部分とが逐次父替する流れの中の選ばれた液体部分
中において行うことができる。か〜る系において本発明
の方法を実施する場合、リガンドを含有する疑いのある
試料のか−の液体部分と、（１）そのリガンドに対する
結合性パートナ−１ｆｉ１１第一および第二の構成成分
を■する検出系の第二の成分、および（ｆｉｌｌ既述し
た中から選ばれる界面活性剤を含有して成る第一の試薬
組成物とを導管に導入する。次に第一の導１１！？区分
内に閉塞される第一の空気ｆｌｌｓ分を尋人する。次で
、（ｌｖｌ　ｌ）ガントまたはリガンド万１似体の結合
また表面と、小胞内に、第二の成分と反応して検出可能
な応答を生じ得る検出系の第一の成分とを有する選択的
に接近可能な小胞、（Ｖ）表面に結合されたりガンｒま
たはリガンド類似体と結合性パートナ−との結合に応答
して小胞の接近可能性を変化させる物質、および（ｖｌ
）前述したもの五中から遡ばれた界面活性剤を含有して
成る第二の試薬組成物の第二の液体部分をみ入する。次
に第一の導管区分内に閉塞され得る第二の空気部分を導
入する。これらの部分は第一の専管区分にある間は分離
しておく。腓−の専管区分で分離状態に保たれたこれら
の部分は次に、前記第一のガス部分が第二導管区分で非
閑塞性となるに十分なだけ前記第一の導管区分よりも大
きな直径を有する第二導管区分に通す。第二の専管区分
内におし・て、第一および第二の液体部分は合一され、
第一および第二のガス部分も合一される。この合一され
た液体部分は、第二および躯三の導・ら′区分を合一し
たガス部分で閉基することによって他の液体部分から分
離された状態に保ち、第三の専管区分内で完全に混合さ
れる。次に、完全に混合された合一成体部分が第三の導
管区分を通過する間に、その検出可能な応答を分析する
。

以下の実施例は本発明の完成のために行った実験を記載
するものである。可能な場合は常に、標準の市販試薬級
薬品を使用した。

例　　１ ジランチンーリボンーム適合性界面活性剤本例に報告す
る実験においては、Ｂ−ガラクトシダーゼ、補体、シラ
ンチンに対する抗体、０−二トロフェニルＢ−Ｄガラク
トシド（色原体）、Ｘよび種々の界面活性剤を含葡して
成る免疫検定試薬組成物を使用して、リポソームの化学
的溶解または免疫溶解に対する糧々の界面活性剤の効果
引１１定の試験を行った。この試験では、最大の免疫溶
解を検出し得るよう、試料ないし遊離シランチンは加え
なかった。

リポソーム製造 シランチンとＢ−ガラクトシダーゼ酵素とを含有するリ
ポソームを次のようにして製造した。クロロホルム１０
０ｍ１中に卵レシチン（シグマケミカル社、セントルイ
ス、ミズーリ州）２２ｍノ、コレスチロール（玉出シグ
マ社）８．７〜、ジ−α−トコフェロール（玉出シグマ
社）　０．６５〜およびシランチン−両親媒性物質複合
体２．７６ｍ９を含む混合物を調製した。このプランチ
ン複合体は、Ｈａｇａら（Ｂｉｏａｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ、　９　Ｑ　：１８７−１
９２（１９８０））に記載の方法によって製造すること
ができる。趙製し７た混合物をロータリー蒸発装置の５
００Ｍフラスコに装入した。

フラスコを回転し、水流ポンプの真空下、ＩｉＯ℃でフ
ラスコ内壁上に乾燥フィルムが窮められるまテクロロホ
ルムノ蒸発を行った。その後、このフィルムを０−２５
　ｍｍＨｇのＪｃ窒下で１時間さらに乾燥した。このフ
ィルムを、Ｂ−ガラクトシダーゼ（玉出シグマ社）７．
８雫を含む後述トリス緩衝原ｇ７ｍにより、４℃でかき
まぜなから一液水利した。かくして製造したリポソーム
は、リポソームを形成しなかった混合物成分から、Ｒ８
−５５型　　　ｊベックマン超遠心装置を３２００Ｏｒ
ｐｍ、８℃で２５分間使用して分離した。

その他の調製 トリス緩衝原液（ｐｉ−１７，５）はトリス・ヒドロキ
シメチル・アミノメタン６０．５１／ｌを塩化ナトリウ
ム８．７　ｊＩ／ｌおよびアジ化ナトリウム１　ｇ／ｌ
と混合して調ジした。

抗シランチン抗体溶７夜は市販の抗シランチン泳兎抗血
（ｆｆ　（カッベル研究所、コクランビル、ペンシルバ
ニア州）から、ｆｆＭ　’ｌ！！　ｌ、た。カッペル抗
血清１００μｌを入れたアンプルにトリス緩衝原液９０
０μｅを加えて１　：　１０　（ｖ／ｖ　）の抗体原溶
液とした。

補体溶液は凍結乾燥したモルモット血６１゛（ベルフリ
ーズ社、ロジャーズ、アラスカ州）１！７をトリス緩衝
原液６Ｍで液状に戻して調製した。

比較用に選んだ界面活性剤隔液はそれぞれ、界面活性剤
１１をトリス緩衝原液１００属に溶解して１　％　（ｗ
／ｖ　）　ｉｂ液とすることにより調製した。

使用した界面活性剤はトリトン類（ロームアンドハース
社、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）、イブパー
ル’、’＋Ｉ　（ＧＡＦ社、ニューヨーク、二二一ヨー
り州）、ＰＥＧ　−４０００（ユニオンカーバイド社、
ニューヨーク、ニューヨーク州）、フリフジ−３５（米
国王Ｃ工社、ウイルミントン、プラウエア州）、プルロ
ニック＠　（ＢＡＳＦ−ワイアン団ット社、上記）およ
びテトロニックｉ　（ＢＡＳＦ　−’フイアンｒット社
、上Ｎｄ　）であった。これらを、それぞれの中のエチ
レンオキシ−（Ｅｔｏ　）分子の数と共に、算１表に示
す。

試薬調製 試薬Ｒ１は補体溶液１００μ１１抗シランチン抗体溶液
１００μｌＸ基佃としてのニトロフェノールＢ−Ｄ−ガ
ラクトシド１００μｌおよびトリス緩衝原液５０μｌを
混合してＦＪ、ｆｆ製した。

試薬Ｒ２はリポソーム訓製液５μｌ、ト＋）ス緩衝原液
２５５μｊ１および、それぞれのＲｌｆＪＮＡ−に対ｌ
−て選択された界面活性剤のｍへ７０μノを混合して調
製した。界面活性剤の最終濃度はそれぞれの場合０．１
％（ｖ／ｖ　）であった。

検定操作 試薬Ｒ工およびＲ２それぞれ６５０μｌづつを混ぜ合せ
、２６０型キ゛ルフオ一ド分元光度計の流〕ＯＪ型キュ
ベツトにピペットで装入した。分光光度計はメーカー（
ギル７オードインストルメンツ社、オベルリン、オハイ
オ州）の取扱説明四に従って使用した。反応速度はｄ　
０５　ｎｍにおいて、観測された光学濃度の差を所定の
時間で除して記録した。第一の実験は界面活性剤が存在
しくＳ＋）シランチン抗体を省いた（　ＡＢ−）混合物
について実施した。第二の組の実験では界面活性剤（Ｓ
＋）および抗体（ＡＢ”　）のいずれも存在した。抗体
の存在または不在（ＡＢ”／ＡＢ−）の場合についての
Ｂ−ガラクトシＰ基質の加水分解速度の比は８ｒｆ１表
忙示す通りであった。これは、ある界面活性剤は抗体の
不在においてもリポソームを溶解すること、実験した界
面活性剤は免疫溶解を妨害しなかったことを示している
。

次の二つの実験においては、試薬Ｒ２の界面活性剤の代
りに等容のトリス緩衝原液を使用した。

このうち第一の実験には抗体を加え第二の実験には抗体
を加えなかった。これは界面Ｙ占性剤の不在の場合に免
疫溶解が起ったことを示すためとブランク試験にするた
めとで行ったものである。上記第一の実験およびブラン
ク試験から、界面活性剤の存在および不在（ｓ”／ｓ−
″）においてＢ−ガラクトシー加水分解速度の比を求め
、あわせて第−表に示した。

第１表 トリス緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　２．５　
　　１．０イデバールＣ０−６３０１０−１１２，６イ
デパール　Ｃ’０−７）０　　２０　　　　　　　　　
　　　６．０イデバールＣ’０−８８０　　３０　　　
　　　２．５　　　１．０トＩＪトｙ　　Ｘ−１ｒｌｌ
ｌ　　　　　　９−１０　　　　　　　　　　　４．０
トリ）ンＸ−１ｔＪ２　　　　１２−１３　　　　　　
　　　　４．０トリトン　ｘ−１６５１６４，０ ブリッジ−３５２３２，５１，０ トリトン　ｘ−３０５３０２，５１，０ＰＫＧ（４００
０）　　　　　　　９０　　　　　　　２．５　　　　
１．０プルロニツク　Ｌ−４３１１２，５１，０プルロ
ニツク　Ｌ−ｉ１４１８　　　　　　　２．５　　　１
．０フ０ルロニツク　Ｌ−６２９３，７ プルロニツク　Ｌ−６３１７２，５１，０ゾルロニツク
　Ｌ−６４２６２，５１，０プルロニツク　ｐ−７ｂ　
　　　４（Ｓ　　　　　　　　２．５　　　１．０プル
ロニツク　Ｐ−８１１３４２，５１，０ゾルロニツク　
Ｐ−８５，５１２，５１，０ゾルロニツク　ｐ−９４４
１２，５１，０２０ルロニツク　ｐ−１０４、ｉ９　　
　　　　　２．５　　　　１．０プルロニツク　Ｐ２Ｏ
３７５２，５１，０テトロニツク　５０４　　　３０　
　　　　　　２．５　　　　１．［］テトロニック　７
０４　　　５０　　　　　　　２．５　　　１．０テト
ロニツク　９０，１　　　７５　　　　　　　２．５　
　　　１．０テトロニツク　１１０４　　　９５　　　
　　　　２．５　　　１．０テトロニツク　１３０４　
　１１３　　　　　　　２．５　　　１．０テトロニツ
ク　１５（Ｍ　　　　４６　　　　　　　２．５　　　
１．０結　　論 イガパールおよびトリトン界面活性剤はそれぞれ、２６
個より少いｇｔｏ七ツマ一単位を有するノニルおよびオ
クチルフェノールであるが、Ｓ”／Ｓ−比で示される通
りリポソームを溶解し、従って免疫溶解に基く測定を有
効に妨げることがわが・りた。

しかし、Ｅｔａモノマ一単位２３個のブリッジ−３５界
面活注剤、ＥｔＯモノマー厖位６０個以上を有するイケ
９パール、トリトンおよびｐｘＧｄ口００口面０界 なかった。また３０個以上のＥｔＯモノマ一単位を有す
るテトロニック界面活性剤はリポソームを溶解せずまた
免疫反応を妨害しなかった。

さらに驚くべきことには、１１個という少倣のＥｉｔＯ
モノマ一単位しか持たないゾルロニック界面活性剤がリ
ポソームを溶解せずまた免疫反応を妨害しなかった。

例　　２ フエノバルビタールリポソームスＰ１合性界面活性剤木
実施例に述べる実験は、自動化されたランダムアクセス
式バッチ分析装置における免疫検定組成物にフェノバル
ビタールを表面に有するリポソームを使用した場合のこ
のリポソームに対する独々の界面活性剤の影響を検討す
るために行ったものである。

試薬Ｒ□およびＢ２の組成は次のコ１０りである：試薬
拘 １、基）Ｊｉ　　　　　　　　　　２３５μ１２、抗体
（１：１００）　　　　　　　２５　ｔｔ１３、補体（
１：２）　　　　　　　　４０μ１４、界面活性剤（１
係）　　　　　４０μｊ５、トリス緩衝液　　　　　　
　　３５μｌ試桑Ｒ２ １、リポソーム（１：２０）　　　　　１５ｔｔ１２、
トリス緩衝液　　　　　　　６０μ１５、界面活性剤（
１％）　　　　　　５μｌリポソームは、フェノバルビ
タール複合体を使用した以外は例１と同様にして調製し
た。他の原液の調製はすべて、カッペル研究θテ（前出
）の抗フエノバルビタール家兎抗血悄を使用した以外、
例１におけると同様である。

測定はＲＡ−１０００分析システムをメーカー（デクニ
コンインストルメンツ社、タリタウン、ニューヨーク州
）の取扱説ｕＡ漬に従って使用して実施した。

例１と同様の比較を行って種々の界面活性剤の作用を検
討１−だ。結果を第２表に示す。

第２表 フエノバルビタールリポソーム に対する界面活性剤の影響 トリス緩衝液　　　　　　　　　　６．８１イデバール
　Ｃｏ−６５０６，８ イケゝバール　Ｃｏ−７）０６，８ イデノ々−ル　ｃｏ−８８０６，５１ トリトン　Ｘ−１００６，８ トリトン　Ｘ−１０２６，８ トリトン　Ｘ−３０５６，５１ ブリッジ−３５６，５１ プルロニツク　Ｌ−４３６，８１ ７°ルロニツク　Ｐ−８４６，８１ プルロニツク　Ｐ−８５６，８１ ゾルロニツク　Ｐ−１０４６，８１ プルロニツク　Ｐ−１０５６，８１ テトロニツク　５０４　　　　　　　６．４　　　　　
１テトロニツク　７０４　　　　　　　６．．１　　　
　　１テトロニツク　９０４　　　　　　　６．４　　
　　　１テトロニツク　１１０４　　　　　　６．４　
　　　　１テトロニツク　１３０４　　　　　　６．４
　　　　　１テトロニツク　１５０４　　　　　　６．
４　　　　　１結論 ＥｔＱモノマー滋位１０〜２０個を有するトリトンおよ
びイケ９パール界而活性剤はリポソームを浴解しく　８
”／Ｓ−−６，５〜６．８）、従って、免疫溶解に基く
測定を有効に妨げることがわかった。しかし、ブリッジ
−３５、トリトンＸ−３０５およびイタ９パールＣ’０
−８８０はリポソームを浴解しなかった。同様に、６０
個以上のＥｔＯモノマーを有するテトロニック界面活性
剤および１１〜７３１１１！ｌＩのｍｔｏモノマーを有
するゾルロニツク界面活性剤はリポソームを溶解しない
（ｓ＋／ｓ−＝　１　）。

例　　６ プルロニック１０５界面活性剤を使用するフエノバルビ
タール免反検定 本例に記載の実験は、本発明にかよる免疫検定用組成物
を自動氏臨床分析装置においてフエノバルビタールの測
定に使用した例を示すものである。

こ工で使用した試薬Ｒ１およびＲ２は、界面活性剤とし
てプルロニックＰ−１０５を使用した例２忙記載のもの
と全く同様である。実験はＲＡ−１０００システムをメ
ーカー（ナクニコン社、上田）の取扱説明１に従って使
用して実施した。

界面活性剤存りおよび無しで７エノバルビタールリポソ
ームを使用して用量・／応答関係を嵌祭した。フェノバ
ルビタール２３度口、５．１０．２０゜４０および８０
μ９／ｍｌのエミツトコントロール（シバ社、バロアル
ト、カリホルニア州）を「リガンド含有試料」として使
用して、用ｆＡ／応答関係をｉｉ−するデータを作成し
た。プルロニックＰ−１０５界面活性剤の存在および不
在のリポソーム溶解に対する影響を第３表に示す。

第３表 フエノバルビタールｍｌ＋定に対するプルロニック１０
５の影響フエノバルビタール　　　　　　溶解係８０　
　　　　　　　　　６　　　　　　　にれらのデータか
られかる通り、プルロニック１０５界面活性剤は免疫検
定反応に影響を与えずまた測定した全範囲にわたって得
られたリカ゛ンド濃度の精度に影響しない。

次に前述のＲＡ−１０００システムを使用し、プルロニ
ック１０５界 ニオいて、人血清試料中のフェノバルビタール測定の比
較検討を行った結果、相関係数は０．９　８　６、勾配
は０．９７であった。

以上の通り本発明によって、用量応答性であり、同じ方
法で界面活性剤不在の場合に得られる結果とよく相関す
る結果を与える免疫検定試薬および方法が提供されるこ
とが実証された。

例　　４ テトロニック７０４界面活性剤を使用するフエノバルビ
タール免疫検定 本例に記載の実験は、本発明による免疫検定用組成物の
自動式臨床分析装置におけるフエノバルビタール測定へ
の使用を例示するものである。

使用した試薬Ｒ□およびＲ２は、テトロニック７０４を
界面活性剤として使用した実施例２におけるものと全く
同様である。実験はＲＡ−　１　０　０　０システムを
メーロ−（テクニコン社、ｍｌ　出）の取扱説明書に従
って使用して行った。

界面活性剤を添加しまたは添加せずにフェノバルビター
ルリポソームを使用して用量／応答関係を調べた。フエ
ノバルビタールｔｌｔＯ１５、１　０、２０、４０およ
び８０μｍ１／ｍｌのエミツトコントロール（シバ社、
パロアルト、カリホルニア州）ヲ［リガンド含有試料Ｊ
として使用して用量／応答関係を立証するデータを作成
した。テトロニック７０４界面活性剤の有無のリポソー
ム溶解に対する影響を第４表に示す。

第４表 テトロニック７０４のフエノバルビタールδ１り定に対
する影響フエノバルビタール　　　　　　　俗解チ（μ
ｙ〜）　　　　　　界面活性斉Ｊなし　　　　あり０　
　　　　　　　　　　１　ＤＯ　　　　　　　　１　０
０これらのデータかられかる通り、テトロニック７０４
界面活性剤は免疫反応に影響を与えず、得られるリガン
Ｐａ度の精度に対し試験した全範囲にわたって影響しな
い。

次に前述のＲＡ−１　０［］０システムを使用しテトロ
ニック７０４界面活性剤の存在および不在において人血
清試料中のフエノバルビタール測定の比較検討を行った
結果、相関係数は０．９　６　０　、勾配は０．９６で
あった。

以上の通り本発明によって、用量応答性であり、同じ方
法で界面活性剤不在の場合に得られる結芽とよく相関す
る結果を与える免疫検定試薬および方法が提供されるこ
とが実証された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）試料中のリガンドに対する結合性パートナ
   ー。 （ｂ）少くとも２種の構成成分を有する検出系、（ｃ）
   表面に結合されたリガンドまたはリガンド類似体と、そ
   の内部に前記検出系の第一成分とを有する、選択的に接
   近可能な小胞、 （ｄ）表面に結合されたリガンドまたはリガンド類似体
   と結合性パートナーとの結合に応答して小胞の接近可能
   性を変化させる物質、 （ｅ）前記第一成分と反応して検出可能な応答を生じ得
   る、前記検出系の少くとも一つの別の成分、および （ｆ）小胞の接近可能性を変化させない少くとも一種の
   界面活性剤 を含有して成ることを特徴とする、試料中のリガンド測
   定用組成物。 （２）前記小胞が脂質膜から成る前項（１）に記載の組
   成物。 （３）脂質膜がリン脂質を含有して成る前項（２）に記
   載の組成物。 （４）脂質膜にスチロールが結合されている前項（２）
   に記載の組成物。 （５）脂質膜が、リガンドまたはリガンド類似体が結合
   する両親媒性物質を含んでいる前項（２）に記載の組成
   物。 （６）界面活性剤が、少くとも釣２３個のエチレンオキ
   シドモノマー単位を有するポリオキシエチレンポリマー
   である前項（１）に記載の組成物。 （７）界面活性剤がさらにＣ＿８−Ｃ＿１＿７の疎水性
   基を含有して成る前項（６）に記載の組成物。 （８）界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテ
   ルである前項（７）に記載の組成物。 （９）界面活性剤が少くとも３０個のエチレンオキシド
   モノマー単位を有するノニルフェノキシポリエトキシエ
   タノールである前項（７）に記載の組成物。 （１０）界面活性剤が少くとも６０回のエチレンオキシ
   ドモノマー単位を有するオクチルフェノキシポリエトキ
   シエタノールである前項（７）に記載の組成物。 （１１１界面活性剤が式 ＨＯ（Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（
   Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ｃＨ（本式においてｂは少くとも１
   ５であり、ａとｃとの和は約１１ないし７３である） で表わされる前項（１）に記載の組成物。 （１２）ａとｃとの和が１１、１８、３４、４１、４６
   、４９、５１および７３から選ばれる前項（１１）に記
   載の組成物。 （１３）界面活性剤が式 〔Ｈ（Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ〕
   ＿２ＮＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｎ〔（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（
   Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ｃＨ〕＿２（本式においてｂは少く
   とも５であり、ａとｃとの和は約６０ないし１１３であ
   る） で表わされる前項（１）に記載の組成物。 （１４）ａとｃとの和が５０および７５から選ばれる前
   項（１３）に記載の組成物。 （１５）（ａ）試料中のリガンドに対する抗体、（ｂ）
   その表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体およ
   びＢ−ガラクトシダーゼを内部に有するリポソーム、 （ｃ）補体、 （ｄ）前記Ｂ−ガラクトシダーゼに対する基質、（ｅ）
   Ｂ−ガラクトシダーゼとその基質との相互作用によつて
   検出可能な変化を受ける物質、および （ｆ）小胞の接近可能性を変化させない少くとも一種の
   界面活性剤 を含有して成ることを特徴とする、試料中のリガンド測
   定用組成物。 （１６）界面活性剤が少くとも２３個のエチレンオキシ
   ドモノマー単位を有するポリオキシエチレンポリマーで
   ある前項（１５）に記載の組成物。 （１７）界面活性剤がさらにＣ＿８〜Ｃ＿１＿７の親水
   性基を含有して成る前項（１６）に記載の組成物。 （１８）界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエー
   テルである前項（１７）に記載の組成物。 （１９）界面活性剤が少くとも３０個のエチレンオキシ
   ドモノマー単位を有するノニルフェノキシポリエトキシ
   エタノールである前項（１７）に記載の組成物。 （２０）界面活性剤が少くとも３０個のエチレンオキシ
   ドモノマー単位を有するオクチルフェノキシポリエトキ
   シエタノールである前項（１７）に記載の組成物。 （２１）界面活性剤が式 ＨＯ（Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（
   Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ｃＨ（本式においてｂは少くとも１
   ５であり、ａとｃとの和は約１１ないし７６である） で表わされる前項（１５）に記載の組成物。 （２２）ａとｃとの和が１１、１８、３４、４１、４６
   、４９、５１および７６から選ばれる前項（２１）に記
   載の組成物。 （２３）界面活性剤が式 〔Ｈ（Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ〕
   ＿２ＮＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｎ〔（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（
   Ｃ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ｃＨ〕＿２（本式においてｂは少く
   とも５であり、ａとｃとの和は約３０ないし１１３であ
   る） で表わされる前項（１５）に記載の組成物。 （２１）ａとｃとの和が５０および７５から選ばれる前
   項（２３）に記載の組成物。 （２５）試料中のリガンドに対する結合性パートナーと
   、第一および第二の構成成分を有する検出系と、表面に
   結合したリガンドまたはリガンド類似体と、小胞内に、
   前記第二成分と反応して検出し得る応答を生じ得る前記
   検出系の第一成分とを有する選択的に接近可能な小胞と
   、表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体と結合
   性パートナーとの結合に応答して小胞の接近可能性を変
   化させる物質と、小胞の接近可能性を変化させない少く
   とも一種の界面活性剤とを含有して成る組成物と試料と
   を反応させ、これにより生ずる検出可能な応答を観測す
   ることを特徴とする試料中のリガンド測定用特異的結合
   検定法。 （２６）（ａ）試料を（ｉ）試料中のリガンドに対する
   結合性パートナー、（ｉｉ）第一および第二の構成成分
   を有する検出系の第二成分、および（ｉｉｉ）小胞の接
   近可能性を変化させない少くとも一種の界面活性剤を含
   有して成る第一の組成物と反応させ、 （ｂ）（ａ）の反応混合物を（ｉｖ）リガンドまたはリ
   ガンド類似体の結合した表面を有し、小胞の内部に、前
   記第二の成分と反応して検出可能な応答を生じ得る前記
   検出系の第一の成分を有する選択的に接近可能な小胞、
   （ｖ）表面に結合したリガンドまたはリガンド類似体と
   結合性パートナーとの結合に応答して小胞の接近可能性
   を変化させる物質、および（ｖｉ）小胞の接近可能性を
   変化させない少くとも一種の界面活性剤を含有して成る
   第二の組成物と反応させ、そして （ｃ）これにより生ずる検出可能な応答を観測する ことを特徴とする、試料中のリガンド測定用特異的結合
   検定法。 （２７）（ａ）は試料を（ｉ）前記リガンドに対する抗
   体、（１１）酵素基質と、該基質とこれに対する酵素と
   の相互作用によつて検出可能な変化を受ける物質とを含
   有して成る前記検出系の複数の成分、および（ｉｉｉ）
   小胞の接近可能性を変化させない少くとも一種の界面活
   性剤を含有して成る第一の組成物と反応させることから
   成り （ｂ）は（ａ）の反応混合物を、（ｉｖ）リガンドまた
   はリガンド類似体の結合した表面を有しかつ、リポソー
   ムの内部に、前記基質と反応して前記検出可能な変化を
   受け得る物質を変化させろ酵素を有するリポソーム、（
   ｖ）補体、および（ｖｉ）小胞の接近可能性を変化させ
   ない少くとも一種の界面活性剤を含有して成る第二の組
   成物と反応させることから成る前項（２６）に記載の特
   異的結合検定法。 （２８）流体系中において試料を、前記リガンドに対す
   る結合性パートナー、第一および第二の構成成分を有す
   る検出糸、表面に結合したリガンドまたはリガンド類似
   体および、小胞内に、前記第二の成分と反応して検出可
   能な応答を生じ得る前記検出系の第一の成分を有する選
   択的に接近可能な小胞、表面結合リガンドまたはリガン
   ド類似体と結合性パートナーとの結合に応答して小胞の
   接近可能性を変化させる物質、および小胞の接近可能性
   を変化させず流体系の流体力学的要求に適合する少くと
   も一種の界面活性剤を含有して成る組成物と反応させ、
   これにより生ずる検出可能な応答を観測することを特徴
   とする、制御されたが流体力学的特性を有する流体系中
   において特異的結合検定を実施する方法。 （２９）単一の入口と逐次連続する第一、第二および第
   三の区分とを有する単一の導管内を流れる、ガス部分と
   液体部分とが逐次交替する流れの選ばれた液体部分中の
   リガンドを検出するための特異的結合検定法であつて、 （ａ）前記単一の入口に、前記リガンドを含有する疑い
   のある試料の第一の液体部分と（ｉ）前記リガンドに対
   する結合性パートナー、（ｉｉ）第一および第二の構成
   成分を有する検定系の第二の成分、および（ｉｉｉ）小
   胞の接近可能性を変化させない少くとも一種の界面活性
   剤を含有して成る第一の試薬とを導入し、 （ｂ）前記単一の入口に、該単一入口と前記第一の導管
   区分とに閉塞され得る第一の空気部分を導入し、 （ｃ）前記単一の入口に、（ｉｖ）リガンドまたはリガ
   ンド類似体の結合した表面と、小胞内に、前記第二の成
   分と反応して検出可能の応答を生じ得る検出系の第一の
   成分とを有する選択的に接近可能な小胞、（ｖ）表面に
   結合したリガンドまたはリガンド類似体と結合性パート
   ナーとの結合に応答して小胞の接近可能性を変化させる
   物質、および（ｖｉ）小胞の接近可能性を変化させない
   少くとも一種の界面活性剤を含有して成る第二の試薬の
   第二の液体部分を導入し、 （ｄ）前記単一の入口に、前記入口と前記第一の導管区
   分とに閉塞される第二の空気部分を導入し、 （ｅ）前記複数の部分を前記プローブおよび第一の導管
   区分にある間分離状態に保ち、 （ｆ）第一の導管区分において分離状態に保たれていた
   前記複数部分を、前記第一のガス部分が第二導管区分で
   非閉塞性となるに十分なだけ前記第一の導管区分よりも
   大きい直径を有する第二導管区分に通し、 （ｇ）前記第一および第二の液体部分を前記第二の導管
   区分内において合一させ、 （ｈ）前記第一および第二のガス部分を前記第二の導管
   区分内において合一させ、 （ｉ）前記第二および第三の導管区分を前記合一された
   ガス部分で閉基することにより、前記合一された液体部
   分を他の液体部分から分離された状態に保ち、 （ｊ）前記第三の導管区分内において前記合一された液
   体部分を完全に混合し、 （ｋ）前記完全に混合された液体部分が前記第三の導管
   区分を通過している間に前記検出し得る応答を分析する ことを特徴とする前記特異的結合検定法。 （３０）前記界面活性剤がそれぞれ独立に、少くとも２
   ３個のエチレンオキシドモノマー単位を有するポリオキ
   シエチレンポリマーから選ばれる前項四に記載の方法。 （３１）前記界面活性剤がそれぞれ独立に、式ＨＯ（Ｃ
   ＿２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（Ｃ＿２Ｈ
   ＿４Ｏ）＿ｃＨ（本式においてｂは少くとも１５であり
   ａとｃとの和は約１１ないし７３である） で表わされるものから選ばれる前項（２９）に記載の方
   法。 （３２）前記界面活性剤がそれぞれ独立に式〔Ｈ（Ｃ＿
   ２Ｈ＿４Ｏ）＿ａ（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ〕＿２ＮＣＨ
   ＿２ＣＨ＿２Ｎ〔（Ｃ＿３Ｈ＿６Ｏ）＿ｂ（Ｃ＿２Ｈ＿
   ４Ｏ）＿ｃＨ〕＿２（本式においてｂは少くとも５であ
   り、ａとｃとの和は約３０ないし１１３である） で表わされるものから選ばれる前項（２９）に記載の方
   法。