JPH0361859A - リポソーム分散液安定化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリボソーム分散液安定化剤及びこれを用いた安
定な免疫分析試薬に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

リボソームは、主として脂質よりなる二分子膜を有し、
その内部に水層を有する閉鎖小胞体である。このリボソ
ームは広く生体膜モデルとしてその物理化学的諸性質の
研究が進められている一方、その内水層に標識物質を保
持することが可能であるため、免疫測定法への利用も試
みられている。

本発明者らは、すでに表面に親水性の抗体又は抗原を固
定化し、内部に親水性の標識物質を封入したリボソーム
試薬を開発した（特開昭６０−１３８４６５号、特開昭
６２−１０８８２号、特開昭６２−１０８８３号公報）
。この試薬を用いた免疫分析法は以下のようなものであ
る。すなわち、抗原又は、抗体が存在する試料中に前記
リボソーム試薬を加え、これに補体や二次抗体を加える
と抗原−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用によって
リボソームが破壊され、封入されていた標識物質が流出
し、この流出した標識物質の量は試料中の被検物質の量
に比例するので、流出した標識物質を所定の分析方法に
より分析、定量することにより被検物質を定量すること
ができるというものである。

しかしながら、リボソームの構造は熱力学的には安定で
ない場合が多く、懸濁液として調製しても、保存中にリ
ボソーム同士凝集したり、リボソームに封入した標識物
質が漏出し、そのため、被検物質の定量分析に影響を与
えるという問題点があった。この問題を回避するため、
水系溶媒中に分散した状態で保存せず、凍結乾燥し保存
する方法が試みられているが、いまだ実用段階に至って
いない。

上記の如くリボソームを用いた免疫分析試薬はその不安
定さから商品化されておらず、その安定化が望まれてい
た。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究を
行なった結果、リボソームを用いた免疫分析試薬に特定
の化合物よりなる安定化剤を添加すれば、該試薬の保存
安定性が向上し、免疫分析が高い精度で行なえることを
見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は多価アルコール、糖類、ゼラチン、塩
化リチウム、塩化セシウム及びポリオキシエチレン系界
面活性剤から選ばれる化合物を含有するリボソーム分散
液安定化剤及びリン脂質及びコレステロールを主要構成
成分とし、表面に抗原又は抗体が結合し、かつ内部に標
識物質が封入されているリボソームを含有するリボソー
ム分散液に上記安定化剤を配合したことを特徴とする免
疫分析試薬、並びに更に該リボソーム内部にも上記安定
化剤を封入したことを特徴とする免疫分析試薬を提供す
るものである。

本発明のリボソーム分散液安定化剤に用いる多価アルコ
ールとしてはグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリ
ン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール
、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエ
チレングリコール、ポリエチレングリコール等を例示す
ることができる。

糖類としては例えばブドウ糖、ガラクトース、マンノー
ス、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロー
ス等の単ｔｉ類；乳糖、ショ１、セロビオース、トレハ
ロース、マルトース等の二ｉｌｌ；マンナン、プルラン
、デキストラン等の多ｔｌ［が挙げられる。ポリオキシ
エチレン系界面活性剤としては、例えば次式（１）〜（
３）で表わされるものが、リボソームを溶解せず、しか
もリボソームの保存安定化作用が優れているため特に好
ましい。

（１）　　ＨＯ（Ｃ２Ｈ３Ｏ）Ｆ（Ｃ２Ｈ４０）、（Ｃ
２Ｈ３Ｏ）、Ｈ〔式中ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ正の数を
示し、ｐ＋ｒ≧１１であり、かつｑ≧１５である〕（２
）　（８０（ＣＪａＯ）ｘ（Ｃｓ１１ｉ０）ｙｌｚＮｃ
ＨｚｃＨＪ［（ＣｓｌｌｉＯ）ｙ（ＣｚＨｎＯ）−ｌｘ 〔式中、ｘ、ｙ及び２はそれぞれ正の数を示し、ｙ≧５
であり、かつｘ＋ｚ≧３０である〕〔式中、Ｒは直鎖ア
ルキル基を示し、ｎは３０以上の数を示す〕 本発明安定化剤のリボソーム分散液への配合量は、特に
限定されないが、リボソーム外液がリボソーム内液と等
張もしくはやや高張となるように配合するのが好ましい
。ポリオキシエチレン系界面活性剤の場合は、特に好ま
しい配合量は０．００１〜３．０％（ｗ／ｖ）　（以下
単に％で示す）である。

また本発明安定化剤のリボソーム分散液への配合方法は
、 （１）　　リボソーム分散液に本発明安定化剤を添加す
るか、（２）リボソーム内部に本発明安定化剤を封入せ
しめ、さらに調製後のリボソーム分散液にも本発明安定
化剤を添加する方法のいずれかが好ましい０本発明安定
化剤のうち、ポリエチレングリコール、デキストラン、
ゼラチン、ポリオキシエチレン系界面活性剤、塩化リチ
ウム及び塩化セシウムはリボソーム分散液に添加するだ
けで充分な安定化効果を奏する。

上記安定化剤を用いた免疫分析試薬は、自体公知の手段
例えば次の如くして製造することができる。

まず、先に特開昭６０−１３８４６５号に開示された方
法に従い、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて、リボ
ソーム上に固定化される抗体または抗原と結合し得る官
能基を脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂
質とコレステロール及び必要であれば他の脂質とをフラ
スコに入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し
、吸引乾燥する。

しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の
標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リボソ
ームの懸濁液を得る。ここで必要により標識物質の水溶
液に本発明安定化剤を添加すれば、リボソーム内に安定
化剤を導入することができる。この添加量は０．００１
〜３％が好ましい。

一方、リボソーム表面に結合する抗体または抗原は、緩
衝液中で架橋剤と反応せしめて抗体又は抗原に架橋基を
導入し、必要により該架橋基を還元する試薬、例えばジ
チオスレイトール等を更に反応せしめて修飾抗体又は修
飾抗原とする。

次に、上記リボソーム懸濁液と修飾抗体又は修飾抗原と
を緩衝液中で例えば１０〜２５℃、１５〜２０時間反応
させてリボソーム表面に抗体又は抗原を固定化せしめる
０反応終了後、遠心洗浄を行なえば免疫分析試薬が得ら
れる。得られたリボソーム免疫分析試薬を、本発明安定
化剤を添加した緩衝液中に分散せしめれば、本発明の安
定化剤配合免疫分析試薬が得られる。なお、遠心洗浄の
際、使用する緩衝液中に本発明安定化剤を添加しておけ
ば、更に好ましい、また本発明免疫分析試薬のｐＨは６
〜８程度に調節することがリボソームの安定性の面から
好ましい。

このようにして得られた本発明リボソーム免疫分析試薬
は必要により適当な濃度に希釈し測定に供することがで
きる。

〔発明の効果〕

本発明の安定化剤をリボソーム免疫分析試薬に添加する
ことにより、該試薬の保存安定性を著しく向上させるこ
とができる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１．ヒ）　ＣＲＰ測定用リボソーム試薬の調製■
　リボソームの調製 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；１０
１１Ｍ、１００／／ｌ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ　
；　１０ｍＭ、　１００μβ）、ジチオピリジル化ジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−
ＤＰＰＩ！　；１５Ｍ２０μｍ）　−１：　１　：０．
０２　（モル比＞　（ＤＴＰ−ＤＰＰＥとはＤＰＰＥの
アミ〕基にアミド結合を介してジチオピリジル基を導入
したもの）をクロロホルムに溶解し、１０１１１ナシ型
フラスコに仕込み、クロロホルムをエバポレーターで留
去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成させた。この脂質
薄膜を１〜２時間、真空乾燥した後、標識物質として０
．１Ｍカルボキシフルオレセイン溶液（ｐＨ７，４）１
００μｌを添加し、ポルテックスξキサ−で５〜１０分
間激しく攪拌した。

次いで、過剰のカルボキシフルオレセインを遠心除去し
、カルボキシフルオレセイン封入リボソームを得た。こ
の際、遠心洗浄には、０．０１ＭのＨＥＰＢＳ緩衝液（
０，１５Ｍ　　ＮａＣｊ！含有、ｐＨ７，４）を用いた
。得られたリボソームは５００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液
に懸濁せしめた。

■　リボソームの抗体感作 ヤギ抗ＣＲＰ抗体ＣＩｇＧ分ｉＮ）を予め０．０ＩＭ■
ＥＰＥＳ緩衝液で透析処理して得られる２、０■／ｓｆ
の抗体溶液に０．１ａＭとなるようにＮ−ヒドロキシス
クシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネ−）　（ＳＰＤＰ）のエタノール溶液を添加し、室温
で３０分間反応させる。次いでセファデックスＧ−２５
カラムを用いて過剰の５ＰＤＰと抗体を分離させるが、
この際に緩衝液を０．１　Ｍ酢酸緩衝液（０，１５Ｍ　
　ＮａＣｊ！含有、ｐＨ４，５）に交換すると共に分光
光度計により、波長２８０ｎｍで抗体の溶出を確認した
。

こうして、ジチオピリジル基を導入した抗体溶液に５Ｑ
＋ａＭになるようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を固
形のまま添加し、室温で３０分間反応させる。

その後、反応溶液をセファデックスＧ−２５カラムを用
いてゲル濾過し、過剰のＤＴＴと抗体とを分離させるが
、この際、緩衝液をＯ，，０１ＭのＩＩＥＰＢＳ緩衝液
に交換すると共に分光光度計により波長２８０ｎｏ＋で
抗体の溶出を確認した。

次いで、得られたチオール化抗体溶液（１■／ｍｌ：５
００μｌを■で調製したリボソーム懸濁液５００μ℃に
添加して緩徐に１５〜２０時間撹拌し、抗体感作リボソ
ームを調製した。

■　リボソーム試薬への安定化剤の添加ａ、グルコース
の添加 ■において、リボソームに封入する標識物質たる０．１
　Ｍカルボキシフルオセイン溶液に代え、これに更にグ
ルコースを０．０５　Ｍとなる様に加えた溶液を用いそ
の他は■■と同様にして抗体感作リボソームを調製した
。

このリボソームを、グルコース０．２Ｍを含む０、００
５　Ｍベロナール緩衝液で遠心洗浄し未反応の抗体を除
去した。次いで、ＩＩＩＩＩｌの同緩衝液にリボソーム
を懸濁せしめ、さらに防腐剤として０．０５％となるよ
うにＮａＮ、を添加し本発明免疫分析試薬（本発明品ａ
）を得た。

ｂ、ゼラチンの添加 ■で得られた抗体感作リボソームをゼラチン０．１％、
及び０．１５　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．００５　Ｍベロ
ナール緩衝液（ｐＨ７，５）で遠心洗浄し、未反応の抗
体を除去した。次いで同緩衝液１ｍｊ！にリボソームを
懸濁せしめ、さらに防腐剤として０．０５％となるよう
にＮａＮ　ｚを添加し本発明免疫分析試薬（本発明品ｂ
）を得た。

Ｃ０塩化リチウムの添加 ■で得られた抗体感作リボソームを塩化リチウム０．１
８　Ｍを含む０．００５　Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ７
，５）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去した０次いで
同緩衝液１ｃａｌにり・ポソームを懸濁せしめ、さらに
防腐剤として０．０５％となるようにＮａＮ５を添加し
、本発明免疫分析試薬（本発明品Ｃ）を得た。

ｄ、デキストランＴ−１０（ファルマシア社製）■で得
られた抗体感作リボソームをデキストランＴ−１００，
５％及び０．１５　Ｍ　ＮａＣｊ！を含む０．００５Ｍ
ベロナール緩衝液（ｐＨ７，５）で遠心洗浄し、未反応
の抗体を除去した。次いで同緩衝液１　ｍｆｔにリボソ
ームを懸濁せしめ、さらに防腐剤として０．０５％とな
るようにＮａＮ、を添加し本発明免疫分析試薬（本発明
品ｄ）を得た。

ｅ、ポリエチレングリコール６００の添加■で得られた
抗体感作リボソームをポリエチレングリコール６０００
．５％及び０．１５　Ｍ　Ｈａ（ｆｔを含む０．００５
　Ｍベロナール緩衝液（ｐ）１７．５）で遠心洗浄し、
未反応の抗体を除去した０次いで同緩衝液１　ｒａｆｔ
にリボソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤として０．０
５％となるようにＮａＮ、を添加し本発明免疫分析試薬
（本発明品ｅ）を得た。

ｒ、ポリオキシエチレン系界面活性剤の添加■で得られ
た抗体感作リボソームをテトロニックＴＲ−７０４（旭
電化製）０．２％及び０．１５　ＭＮａＣｌを含む０．
００５　Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ７，５）で遠心洗浄
し、未反応の抗体を除去した０次いで同緩衝液１　ｎ／
！にリボソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤として０．
０５％となるようにＮａｐｓを添加し本発明免疫分析試
薬（本発明品ｒ）を得た。

ｇ、安定化剤無添加 ■で得られた抗体感作リボソームを０．１５ＭＮａＣｊ
！を含む０．００５Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ７，５）
で遠心洗浄し未反応の抗体を除去した。次いで同緩衝液
ＩＪＩｄ！にリボソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤と
して０．０５％となるようにＮａＮ５を添加し、免疫分
析試薬（対照品ｇ）を得た。

試験例１　安定性試験 実施例１．■のａ　−ｇで得られた免疫分析試薬のそれ
ぞれ１　ｖａｌを２　ｍｌｌのスクリューキャップ付ガ
ラスビンに分注し、１０℃の恒温室内に一年後まで保存
し、標識物質として封入したカルボキシフルオレセイン
のリボソームからの漏れを下記測定方法により測定した
。結果を第１表に示す。

測定方法： 調製直後、６ケ月及び１年保存後の各免疫分析試薬をと
り、それぞれの外液に用いた分散液と同一、ｔＵ威の緩
衝液で５００倍に希釈した。このものを、螢光強度計（
コロナ社製）を用いて下記式により相対螢光強度を求め
た（励起４９０ｎｍ　、螢光５３０ｎｓ）。

相対螢光強度＝［（Ｆ＋−Ｆｏ）／（Ｐｇ−Ｆｏ）］ｘ
ｌＯＯ（Ｘ）第 ＦＩ　：各免疫分析試薬の螢光強度 Ｆ２　：脱イオン水を添加してリボソームを破壊したも
のの螢光強度 Ｆｏ　：各免疫分析試薬の外液に用いた分散液と同一組
成の緩衝液の螢光強度 表　リボソームからの標識物質の漏出 以上の結果より、安定化剤を添加した本発明免疫分析試
薬は対照品ｇと比べ、標識物質たるカルボキシフルオレ
セインの漏出が少なく、安定であることが判る。

試験例２　　　ＣＲＰ検量線の作成 ゼラチン−ベロナール緩衝液（０，１％ゼラチン含有ベ
ロナール緩衝液、ｐＨ７，４）に０．５ｍＭ塩化マグネ
シウム及び０．１５ｍＭ塩化カルシウムを添加した緩衝
液（以下ｒＧ［ＩＢ”Ｊという）で希釈したヒトＣＲＰ
抗原溶液（１０〜３００ｎｇ／ｍＡり　２５ｕ　Ｑと実
施例１で調製した各試薬（ａ−ｇの調製直後及び１年保
存後のもの）を５００倍に希釈したちの２５μｌとを９
６穴マイクロプレートに分注し、３７°Ｃにおいて３０
分間反応させた。これに、二次抗体としてウサギ抗ＣＲ
Ｐ抗体（２＋ｏｇ／ｍ　ｌ　）を５０倍に希釈したもの
及びＧ　Ｕ　Ｂ　！”で希釈し、３〜５ＣＩ、。／ｒａ
ｎとしたモルモット補体をそれぞれ２５μｌずつ添加し
、更に３０分間反応せしめた。

次いで補体反応を停止させるため１０ｍＭ　ＥＤＴＡ含
有ベロナール緩衝液１００ｕｆを添加した。この螢光強
度を測定（励起４９０ｔｖ、螢光５３０ｎｍ）し、次式
により相対螢光強度を求めた。得られた検量線を第１図
〜第７図に示す。

相対螢光強度＝［（Ｆｔ−Ｆ）／（Ｆｙ−Ｆ）ＩＸｌｏ
ｏ　　（％）Ｆ、：検体使用の螢光強度 Ｆ、：検体に変えｌＯ％トリトンＸ−１００を添加した
ものの螢光強度 Ｆ　：検体に代えＧＵＢ”を添加したものの螢光強度 第１図〜第６図に示す本発明免疫分析試薬（ａ〜ｆ）の
検量線は、調製後１年を経たものであっても変化は少な
く、一方、対照品（ｇ）の検量線（第７図）は明らかに
感度の低下が認められた。

以上の結果より本発明免疫分析試薬は経時的に極めて安
定な試薬であることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第７図はそれぞれ本発明免疫分析試薬（ａ−ｆ
）及び対照品（ｇ）の調製直後及び１年保存後の検量線
を示す図面である。 −・−二　調製直後の検量線 −ｘ−：１年保存後の検量線 以上 ＣＲＰ濃度（ｎｇ／’ｍＬ　） 第２ 図 ＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ　） 第 ３ 図 ＣＲＰ濃度（ｎｇ／　ｍｔ　） ＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍｊ　） 第 図 ＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍ１） ＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍ４）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多価アルコール、糖類、ゼラチン、塩化リチウム、
   塩化セシウム及びポリオキシエチレン系界面活性剤から
   選ばれる化合物を含有するリボソーム分散液安定化剤。 ２、リン脂質及びコレステロールを主要構成成分とし、
   表面に抗原又は抗体が結合し、かつ内部に標識物質が封
   入されているリボソームを含有するリボソーム分散液に
   、請求項１記載の安定化剤を配合したことを特徴とする
   免疫分析試薬。 ３、更にリボソーム内部に請求項１記載の安定化剤を封
   入したことを特徴とする請求項２記載の免疫分析試薬。