JPH06100601B2 - 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 - Google Patents
免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法Info
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- JPH06100601B2 JPH06100601B2 JP58224509A JP22450983A JPH06100601B2 JP H06100601 B2 JPH06100601 B2 JP H06100601B2 JP 58224509 A JP58224509 A JP 58224509A JP 22450983 A JP22450983 A JP 22450983A JP H06100601 B2 JPH06100601 B2 JP H06100601B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法に関
し、更に詳しくは、試料中に存在する特定の抗原又は抗
体を定量分析するための免疫分析用試薬及びそれを用い
た分析方法に関する。
し、更に詳しくは、試料中に存在する特定の抗原又は抗
体を定量分析するための免疫分析用試薬及びそれを用い
た分析方法に関する。
ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の腫瘍マ
ーカーが見出されるようになつた。例えばα−フエトプ
ロテイン（AFP）、ガン胎児性抗原（CEA）、塩基性フエ
トプロテイン（EFP）および膵ガン胎児性抗原（POA）な
どがその代表例として挙げることができる。これらの腫
瘍マーカーの濃度は正常人の場合、非常に低い（例え
ば、AFPの場合:10ng/ml以下）。一方、腫瘍患者の場合
には正常人の10倍程度の値を示すことが多い。いずれに
しても、腫瘍マーカーの分析定量には、非常に高い検出
感度が要求される。
ーカーが見出されるようになつた。例えばα−フエトプ
ロテイン（AFP）、ガン胎児性抗原（CEA）、塩基性フエ
トプロテイン（EFP）および膵ガン胎児性抗原（POA）な
どがその代表例として挙げることができる。これらの腫
瘍マーカーの濃度は正常人の場合、非常に低い（例え
ば、AFPの場合:10ng/ml以下）。一方、腫瘍患者の場合
には正常人の10倍程度の値を示すことが多い。いずれに
しても、腫瘍マーカーの分析定量には、非常に高い検出
感度が要求される。
この要求を満すために、従来は、放射性物質で標識化し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（RIA）が
開発された。しかしながら、RIAは取扱いが面倒で廃棄
処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵素や
螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは抗体
を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにおいて
も遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなければ
ならないという欠点を有していた。また、Rosenthal A.
F,Vargas,M.G.and klass C.S.（1976）Clin.Chem.22,18
99に発表されたEMIT法は、分離工程の不要な均一系で測
定できる画期的な手法であるが、原理的に高分子量のタ
ンパク質抗原あるいは抗体に適用できない。
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（RIA）が
開発された。しかしながら、RIAは取扱いが面倒で廃棄
処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵素や
螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは抗体
を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにおいて
も遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなければ
ならないという欠点を有していた。また、Rosenthal A.
F,Vargas,M.G.and klass C.S.（1976）Clin.Chem.22,18
99に発表されたEMIT法は、分離工程の不要な均一系で測
定できる画期的な手法であるが、原理的に高分子量のタ
ンパク質抗原あるいは抗体に適用できない。
ところで、Haxby,J.A,kinsky,C.B.and kinsky S.c.（19
68）Biochemistry.61 300で、脂溶性の抗原を膜内に取
り込みグルコースを封入したリポソームを調製し、抗原
抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグルコースの流
出量を測定することにより、抗体の定量を行う手法が発
表された。しかしながら、腫瘍マーカーを測定するため
には、マーカー自身あるいはこれらのマーカーに対する
抗体、すなわちタンパク質である免疫グロブリンをリポ
ソーム上に担持させねばならない。ところが、現在ま
で、脂溶性のタンパク質を担持したリポソームを用いる
ことは可能であつたが、親水性のタンパク質を担持した
りリポソームを用いる抗原または抗体の免疫分析法は報
告されていない。それは、親水性のタンパク質をリポソ
ームに担持せしめる技術が確立されていなかつたからで
ある。
68）Biochemistry.61 300で、脂溶性の抗原を膜内に取
り込みグルコースを封入したリポソームを調製し、抗原
抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグルコースの流
出量を測定することにより、抗体の定量を行う手法が発
表された。しかしながら、腫瘍マーカーを測定するため
には、マーカー自身あるいはこれらのマーカーに対する
抗体、すなわちタンパク質である免疫グロブリンをリポ
ソーム上に担持させねばならない。ところが、現在ま
で、脂溶性のタンパク質を担持したリポソームを用いる
ことは可能であつたが、親水性のタンパク質を担持した
りリポソームを用いる抗原または抗体の免疫分析法は報
告されていない。それは、親水性のタンパク質をリポソ
ームに担持せしめる技術が確立されていなかつたからで
ある。
また、特開昭56−132564“免疫分析用生成物および方
法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に酵素
を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法が開
示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法とし
てグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いる方
法を提案している。本発明者らの研究によると、このよ
うな架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、一般に
抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソームの
破壊が引起されなくなることが判明した。
法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に酵素
を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法が開
示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法とし
てグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いる方
法を提案している。本発明者らの研究によると、このよ
うな架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、一般に
抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソームの
破壊が引起されなくなることが判明した。
更に、従来の免疫分析技術は、総じて、分析時間に長時
間を要し、しかも大量の試料を自動的に測定することが
できないという欠点を有していた。
間を要し、しかも大量の試料を自動的に測定することが
できないという欠点を有していた。
本発明は、親水性の抗原又は抗体をリポソームに担持せ
しめた免疫分析用試薬を開発し、もつて試料中の抗原又
は抗体を短時間で簡便に定量することができる免疫分析
方法を提供することを目的とする。
しめた免疫分析用試薬を開発し、もつて試料中の抗原又
は抗体を短時間で簡便に定量することができる免疫分析
方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた
結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に、活性を低下させることなく、試料中の抗原又は抗体
に対応する抗体又は抗原を固定化することに成功し、更
に、リポソーム内に標識物質を封入することにより、本
発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成す
るに至つた。
結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に、活性を低下させることなく、試料中の抗原又は抗体
に対応する抗体又は抗原を固定化することに成功し、更
に、リポソーム内に標識物質を封入することにより、本
発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成す
るに至つた。
すなわち、本発明の免疫分析用試薬は、リポソーム；架
橋法もしくは活性脂質法によつて該リポソーム上に固定
化された親水性の抗原又は抗体；及び、該リポソーム内
に封入された親水性の標識物質からなることを特徴とす
る。
橋法もしくは活性脂質法によつて該リポソーム上に固定
化された親水性の抗原又は抗体；及び、該リポソーム内
に封入された親水性の標識物質からなることを特徴とす
る。
また、本発明の免疫分析法は、 リポソーム；架橋法もしくは活性脂質法によつて該リポ
ソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；及び、
該リポソーム内に封入されたう標識物質からなる免疫分
析用試薬を、抗原又は抗体を含む試料及び補体と混合
し、次いで、リポソーム内から溶出した標識物質を定量
することにより、試料中の抗原又は抗体を定量すること
を特徴とする。
ソーム上に固定化された親水性の抗原又は抗体；及び、
該リポソーム内に封入されたう標識物質からなる免疫分
析用試薬を、抗原又は抗体を含む試料及び補体と混合
し、次いで、リポソーム内から溶出した標識物質を定量
することにより、試料中の抗原又は抗体を定量すること
を特徴とする。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫瘍マーカ
ー（前述のAFP,BFP,CEA,及びPOA等）免疫グロブリン（I
gA,IgE,IgG及びIgM等）、ホルモン（インシユリン、T3
及びT4等）及び薬物等の抗原、あるいはそれらに対応す
る抗体であつて、広範囲に亘る。
ー（前述のAFP,BFP,CEA,及びPOA等）免疫グロブリン（I
gA,IgE,IgG及びIgM等）、ホルモン（インシユリン、T3
及びT4等）及び薬物等の抗原、あるいはそれらに対応す
る抗体であつて、広範囲に亘る。
本発明の免疫分析用試薬におけるリポソームとは、赤血
球ゴースト膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであつてもよいが、リン脂質又は糖脂質とコレス
テロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン
脂質とコレステロールからリポソームを合成する場合
は、これらの比が1:1前後にあるとき、安定なリポソー
ムが得られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素
原子数が12〜18であることが好ましく、更には偶数であ
ることがより好ましい。
球ゴースト膜をも含む広義の意味を有する。かかるリポ
ソームは、従来から使用されているものであればいかな
るものであつてもよいが、リン脂質又は糖脂質とコレス
テロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン
脂質とコレステロールからリポソームを合成する場合
は、これらの比が1:1前後にあるとき、安定なリポソー
ムが得られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素
原子数が12〜18であることが好ましく、更には偶数であ
ることがより好ましい。
リポソーム上に固定化される抗原又は抗体としては前記
のものが例示されるが、これらは親水性であることが必
要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体と
抗原抗体反応を起こす被検物質（抗体又は抗原）は、親
水性でなくともよい。本発明の試薬において、抗原又は
抗体は、架橋剤又は脂質の活性化剤によつて、リポソー
ム上に原子間の共有結合で固定化される。
のものが例示されるが、これらは親水性であることが必
要である。しかしながら、固定化された抗原又は抗体と
抗原抗体反応を起こす被検物質（抗体又は抗原）は、親
水性でなくともよい。本発明の試薬において、抗原又は
抗体は、架橋剤又は脂質の活性化剤によつて、リポソー
ム上に原子間の共有結合で固定化される。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であつ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解される酵素消費あるいは過酸化水素生成をもた
らすグリコース及びシユークロースなどの糖類；テトラ
ペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化
合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
のようは補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は本
発明においては標識物質として使用しない。これらの化
合物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因
子を勘案した上で、適宜に選択される。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解される酵素消費あるいは過酸化水素生成をもた
らすグリコース及びシユークロースなどの糖類；テトラ
ペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化
合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
のようは補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は本
発明においては標識物質として使用しない。これらの化
合物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因
子を勘案した上で、適宜に選択される。
以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤
（これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応
せしめ（架橋剤の代わりに脂質の活性化剤を用いてよ
く、この方法を活性脂質法という）、リポソーム上に固
定化される抗原又は抗体と結合し得る官能基を脂質分子
に導入する。次いで、得られた官能性脂質とコレステロ
ール及び必要であれば他の脂質とをフラスコに入れ、溶
媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥す
る。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所
定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、感
作リポソームの懸濁液を得る。
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋剤
（これを用いた場合を架橋法という）とを溶媒中で反応
せしめ（架橋剤の代わりに脂質の活性化剤を用いてよ
く、この方法を活性脂質法という）、リポソーム上に固
定化される抗原又は抗体と結合し得る官能基を脂質分子
に導入する。次いで、得られた官能性脂質とコレステロ
ール及び必要であれば他の脂質とをフラスコに入れ、溶
媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥す
る。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所
定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、感
作リポソームの懸濁液を得る。
一方、リポソームに固定化すべき抗原又は抗体と架橋剤
とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、
必要であれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオ
トレイトール;DTT）と更に反応させて、修飾抗原又は抗
体を得る。なお、前記工程で脂質をその活性化剤で処理
した場合は、本工程は不要である。
とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、
必要であれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオ
トレイトール;DTT）と更に反応させて、修飾抗原又は抗
体を得る。なお、前記工程で脂質をその活性化剤で処理
した場合は、本工程は不要である。
最後に、感作リポソームと修飾抗原又は抗体（活性脂質
法を用いた場合は、未修飾の抗原又は抗体）とを緩衝液
中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬
が得られる。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、
表面に固定化された抗原又は抗体を担持したマイクロカ
プセルとして得られる。
法を用いた場合は、未修飾の抗原又は抗体）とを緩衝液
中で反応せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬
が得られる。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、
表面に固定化された抗原又は抗体を担持したマイクロカ
プセルとして得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−スク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
SPDPは、次式： で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。フアルマシ
ア社から市販されている。該架橋剤は、例えば、タンパ
ク質抗原をSPDPで処理し、ジチオトレイトール（DTT）
で還元した後、予めSPDPを作用させたマイクロカプセル
と反応させると、室温以下、数時間から１日でマイクロ
カプセル上に抗原を固定化することができる。
する化合物どうしを結合する架橋剤である。フアルマシ
ア社から市販されている。該架橋剤は、例えば、タンパ
ク質抗原をSPDPで処理し、ジチオトレイトール（DTT）
で還元した後、予めSPDPを作用させたマイクロカプセル
と反応させると、室温以下、数時間から１日でマイクロ
カプセル上に抗原を固定化することができる。
SMPBは、次式： で示され、SPDPと同様な反応でタンパク質を固定化でき
るが、最終生成物中に−Ｓ−Ｓ−結合を含まず（−Ｓ−
結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定でき
る。
るが、最終生成物中に−Ｓ−Ｓ−結合を含まず（−Ｓ−
結合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定でき
る。
一方、脂質の活性化剤としては、例えば、シアノーゲン
ブロミド（CNBr）、シアヌリツククロリド（CC）、エピ
クロロヒドリン（EH）、Ｏ−ブロモアセチル−Ｎ−ヒド
ロオキシスクシンイミド及び1,4−ビス（2,3−エポキシ
プロポキシ）ブタン（BEPB）等が挙げられる。このう
ち、CNBr,CC,EH,BEPBは、糖残基を有する化合物を活性
化して、それを第一アミノ基を有する化合物と結合せし
める化合物である。従つて、マイクロカプセル上に糖残
基が存在する場合には本試薬が適用できる。また、抗原
自身が糖タンパク質であり、マイクロカプセル上に第一
アミノ基が存在するような場合にも有効である。
ブロミド（CNBr）、シアヌリツククロリド（CC）、エピ
クロロヒドリン（EH）、Ｏ−ブロモアセチル−Ｎ−ヒド
ロオキシスクシンイミド及び1,4−ビス（2,3−エポキシ
プロポキシ）ブタン（BEPB）等が挙げられる。このう
ち、CNBr,CC,EH,BEPBは、糖残基を有する化合物を活性
化して、それを第一アミノ基を有する化合物と結合せし
める化合物である。従つて、マイクロカプセル上に糖残
基が存在する場合には本試薬が適用できる。また、抗原
自身が糖タンパク質であり、マイクロカプセル上に第一
アミノ基が存在するような場合にも有効である。
以上に述べた架橋剤又は脂質の活性化剤を用いた場合
は、従来は不可能であつた親水性抗原又は抗体のリポソ
ーム上への固定化が可能となる。なお、本発明にあつて
は、グルタルアルデヒドの如き強力な架橋剤を用いて固
定化した際に生じる抗原又は抗体の活性低下という現象
が回避される。
は、従来は不可能であつた親水性抗原又は抗体のリポソ
ーム上への固定化が可能となる。なお、本発明にあつて
は、グルタルアルデヒドの如き強力な架橋剤を用いて固
定化した際に生じる抗原又は抗体の活性低下という現象
が回避される。
なお、本発明の免疫分析用試薬は、まず脂質と抗原又は
抗体とを、架橋剤又は脂質の活性化剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはゲル
ロ過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
抗体とを、架橋剤又は脂質の活性化剤を用いて結合せし
め、次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に
加えてミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはゲル
ロ過等を用いて界面活性剤を除去することにより製造す
ることも可能である。
本発明の免疫分析方法は、前記の免疫分析用試薬を、抗
原又は抗体を含む試料（リポソームに固定化したものが
抗原であれば抗体試料を用い、抗体であれば抗原試料を
用いる）及び補体と適当な緩衝液（例えば、ゼラチン−
ベロナール緩衝液）中で混合し、抗原−抗体と補体との
結合反応を引き起こさせる。すると、かかる反応量に比
例して、リポソーム内から標識物質が放出されてくる。
次いで、この標識物質に応じた分析方法（例えば、標識
物質が螢光物質であれば、螢光分析法）により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗原
又は抗体の量を測定することができる。
原又は抗体を含む試料（リポソームに固定化したものが
抗原であれば抗体試料を用い、抗体であれば抗原試料を
用いる）及び補体と適当な緩衝液（例えば、ゼラチン−
ベロナール緩衝液）中で混合し、抗原−抗体と補体との
結合反応を引き起こさせる。すると、かかる反応量に比
例して、リポソーム内から標識物質が放出されてくる。
次いで、この標識物質に応じた分析方法（例えば、標識
物質が螢光物質であれば、螢光分析法）により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗原
又は抗体の量を測定することができる。
定量操作において使用する補体は、格別限定されない
が、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
が、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
なお、本発明を応用して、基質又は酵素をリポソーム上
に固定化した分析試薬を製造することにより、試料中の
酵素又は基質を定量することも可能である。
に固定化した分析試薬を製造することにより、試料中の
酵素又は基質を定量することも可能である。
本発明の分析方法では、活性を低下させることなく抗原
又は抗体をリポソーム上に固定化し、更にリポソーム内
に標識物質を封入した免疫分析用試薬を用いているの
で、均一系で、かつ短時間で、検出感度の高い正確な抗
原又は抗体の定量を行うことができる。しかも、本発明
分析方法にあつては、被検物質の適用範囲が広く、かつ
分析費用も安い。更に、自動分析化も容易であつて、多
項目同時測定も可能である。
又は抗体をリポソーム上に固定化し、更にリポソーム内
に標識物質を封入した免疫分析用試薬を用いているの
で、均一系で、かつ短時間で、検出感度の高い正確な抗
原又は抗体の定量を行うことができる。しかも、本発明
分析方法にあつては、被検物質の適用範囲が広く、かつ
分析費用も安い。更に、自動分析化も容易であつて、多
項目同時測定も可能である。
以下、実施例により本発明お更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１ ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）を感作したリポソームを
用いる抗IgG抗体の測定（Ｉ） （Ａ）試薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスフアチジルコリン（DPPC）、コレス
テロール、ジパルミトイルフオスフアチジルエタノール
アミン（DPPE）及びジチオトレイトール（DTT）はシグ
マ社製のものを用いた。Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）及びセフア
デツクスＧ−25フアインはフアルマシア社より購入し
た。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用した。
なお、水はイオン交換水を用いた。
用いる抗IgG抗体の測定（Ｉ） （Ａ）試薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスフアチジルコリン（DPPC）、コレス
テロール、ジパルミトイルフオスフアチジルエタノール
アミン（DPPE）及びジチオトレイトール（DTT）はシグ
マ社製のものを用いた。Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）及びセフア
デツクスＧ−25フアインはフアルマシア社より購入し
た。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに使用した。
なお、水はイオン交換水を用いた。
（２）感作リポソームの調製 ａ）DPPE−ジチオピリジネート（DPPE−DTP）の調製 試験管に10mM DPPE（クロロホルム溶液）5mlと50mgのSP
DPを加え、窒素ガスで置換した後、密栓して室温で２時
間反応させた。反応後、５倍量の生理食塩水で３回抽出
し、残つたクロロホルム相を減圧乾燥し、最後に5mlの
クロロホルムを加え、密栓試験管中、−20℃で保存し
た。
DPを加え、窒素ガスで置換した後、密栓して室温で２時
間反応させた。反応後、５倍量の生理食塩水で３回抽出
し、残つたクロロホルム相を減圧乾燥し、最後に5mlの
クロロホルムを加え、密栓試験管中、−20℃で保存し
た。
ｂ）リポソームの調製 使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（2/1）に溶解した。まず、5mM DPPC（200
μ）,10mMコレステロール（100μ）及び1mM DPPE−
DTP（60μ）を10mlのナス型フラスコに入れ、更に2ml
のクロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約50
℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し
た。再び2mlのクロロホルムを添加し、十分攪拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。
この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成
された。フラスコをデシケーター中に移し真空ポンプで
約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、100μ
の0.2Mカルボキシルフルオレセイン（イーストマン・
コダツク社製,pH7.4）を添加し、フラスコ内部を窒素で
置換した後に密栓して、60℃程度の水浴中に約１分間浸
漬した。続いて、Vortexミキサーを用い、壁面の脂質薄
膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうした。
この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。ゼラ
チン−ベロナール緩衝液（0.1mM MgCl2及び0.03mM CaCl
2含有；以下、GVB2+と略記）を少量添加し、リポソーム
懸濁液を完全に遠心チユーブに移した。４℃,15,000rpm
で20分間遠心し、遊離のカルボキシルフルオレセインを
除去した。上清が透明になるまでGVB2+を用いてこの操
作を繰り返した。。最後に2mlのGVB2+及び５μの10％
NaN3を加え、Vortexミキサーで懸濁させ、窒素封入後、
冷蔵庫に保存した。
／メタノール（2/1）に溶解した。まず、5mM DPPC（200
μ）,10mMコレステロール（100μ）及び1mM DPPE−
DTP（60μ）を10mlのナス型フラスコに入れ、更に2ml
のクロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約50
℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し
た。再び2mlのクロロホルムを添加し、十分攪拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。
この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成
された。フラスコをデシケーター中に移し真空ポンプで
約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、100μ
の0.2Mカルボキシルフルオレセイン（イーストマン・
コダツク社製,pH7.4）を添加し、フラスコ内部を窒素で
置換した後に密栓して、60℃程度の水浴中に約１分間浸
漬した。続いて、Vortexミキサーを用い、壁面の脂質薄
膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうした。
この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。ゼラ
チン−ベロナール緩衝液（0.1mM MgCl2及び0.03mM CaCl
2含有；以下、GVB2+と略記）を少量添加し、リポソーム
懸濁液を完全に遠心チユーブに移した。４℃,15,000rpm
で20分間遠心し、遊離のカルボキシルフルオレセインを
除去した。上清が透明になるまでGVB2+を用いてこの操
作を繰り返した。。最後に2mlのGVB2+及び５μの10％
NaN3を加え、Vortexミキサーで懸濁させ、窒素封入後、
冷蔵庫に保存した。
ｃ）IgGの修飾 5mgのIgG（マイルズ社製）を2mlの0.01M HEPES緩衝液
（pH7.45 0.85％NaCl含有）に溶解し、窒素で置換した
後、10μの10mM SPDP（エタノール溶液）を加え、十
分攪拌してそのまま室温で30分間反応させた。反応後、
反応液を予め生理食塩水で飽和させたセフアデツクスＧ
−25フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体積：約15
ml）に展開し、0.1M酢酸緩衝液（pH4.5,0.85％NaCl含
有）で溶出させた。最初のピークフラクシヨン（約2m
l）に更に2mlの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオ
トレイトール（約30mg）を添加した。十分に攪拌して20
分間室温で反応させた。反応後、予め0.01M HEPES緩衝
液で飽和させたセフアデツクスＧ−25のフアインのゲル
を充填してあるカラム（ゲル体積：約30ml）に反応液を
展開し、HEPES緩衝液で溶出した。最初のピークフラク
シヨン（約2ml）を集め、窒素置換後、使用するまで冷
蔵庫に保存した。
（pH7.45 0.85％NaCl含有）に溶解し、窒素で置換した
後、10μの10mM SPDP（エタノール溶液）を加え、十
分攪拌してそのまま室温で30分間反応させた。反応後、
反応液を予め生理食塩水で飽和させたセフアデツクスＧ
−25フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体積：約15
ml）に展開し、0.1M酢酸緩衝液（pH4.5,0.85％NaCl含
有）で溶出させた。最初のピークフラクシヨン（約2m
l）に更に2mlの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオ
トレイトール（約30mg）を添加した。十分に攪拌して20
分間室温で反応させた。反応後、予め0.01M HEPES緩衝
液で飽和させたセフアデツクスＧ−25のフアインのゲル
を充填してあるカラム（ゲル体積：約30ml）に反応液を
展開し、HEPES緩衝液で溶出した。最初のピークフラク
シヨン（約2ml）を集め、窒素置換後、使用するまで冷
蔵庫に保存した。
ｄ）IgG感作リポソームの調製 前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量の修
飾IgG溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆつく
り振とうしながら１晩反応させた。HEPES緩衝液、次い
でGVB2+で洗浄して、未反応のIgGを除去した。反応に用
いたリポソーム懸濁液の量に相当するGVB2+及び５μ
の10％NaN3を最後に添加し、懸濁・窒素置換後、使用す
るまで冷蔵庫に保存した。
飾IgG溶液を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆつく
り振とうしながら１晩反応させた。HEPES緩衝液、次い
でGVB2+で洗浄して、未反応のIgGを除去した。反応に用
いたリポソーム懸濁液の量に相当するGVB2+及び５μ
の10％NaN3を最後に添加し、懸濁・窒素置換後、使用す
るまで冷蔵庫に保存した。
（３）IgG感作リポソームを用いた抗IgG抗体の測定 タンク社製のＵ型プレート（96穴）に適当量のGVB2+で
希釈した抗IgG抗体を25μずつ注入した。次いで、上
記感作リポソーム懸濁液をGVB2+で100倍に希釈し、５μ
ずつ各ウエル（well）に分注した。最後に、適当にGV
B2+で希釈した補体（モルモツト由来）を25μずつ添
加した。反応は37℃高温度下で1.5時間行つた。反応
後、各wellに100μの0.01M EDTA−ベロナール溶液を
加えて反応を停止し、プレート用螢光分光光度計（コロ
ナ電子社製）で各wellの螢光を測定した（Ex:490nm,Em:
520nm）。なお、測定値は、抗体の代わりに10％TritonX
−100を25μ添加したwellの螢光と、抗体の代わりに2
5μのGVB2+を添加したものの差を100％とした相対値
で表示した。400倍（図中、Ａ）及び800倍（図中、Ｂ）
希釈の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。
希釈した抗IgG抗体を25μずつ注入した。次いで、上
記感作リポソーム懸濁液をGVB2+で100倍に希釈し、５μ
ずつ各ウエル（well）に分注した。最後に、適当にGV
B2+で希釈した補体（モルモツト由来）を25μずつ添
加した。反応は37℃高温度下で1.5時間行つた。反応
後、各wellに100μの0.01M EDTA−ベロナール溶液を
加えて反応を停止し、プレート用螢光分光光度計（コロ
ナ電子社製）で各wellの螢光を測定した（Ex:490nm,Em:
520nm）。なお、測定値は、抗体の代わりに10％TritonX
−100を25μ添加したwellの螢光と、抗体の代わりに2
5μのGVB2+を添加したものの差を100％とした相対値
で表示した。400倍（図中、Ａ）及び800倍（図中、Ｂ）
希釈の補体を用いた場合の結果を第１図に示した。
実施例２ IgG感作リポソームを用いる抗IgG抗体の測定（II） （１）感作リポソームの調製 実施例１と同様の操作でカルボキシルフルオレセイン包
含リポソームを調製した。遠心洗浄後、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.5,0.85％NaCl含有）に懸濁させ（2ml）、これ
に150mgのDTTを添加した。窒素置換後、よく攪拌し、そ
のまま室温で２時間反応させた。遠心（15,000rpm,20
分）洗浄（GVB2+,窒素置換済）して、５μの10％NaN3
を加えた後、冷蔵庫に保存した。一方、抗原については
実施例１と同様にSPDPを作用させ、ゲルロ過（HEPES緩
衝液で溶出）により分離・精製した。得られたリポソー
ム懸濁液及び修飾IgG溶液を等量ずつ混合し、窒素置換
後、室温でゆつくり浸とうしながら１晩反応させた。反
応後、十分に洗浄して（窒素置換GVB2+使用）５μの1
0％NaN3を添加してから冷蔵庫に保存した。なお修飾IgG
とのカツプリング反応に適用するリポソームとしては、
なるべくカツプリング直前にDTT処理したものを使用す
るのが望ましいが、やむを得ず冷蔵保存してあるものを
用いる場合には、カツプリング反応前に少量（10〜20m
g）のDTTを再び添加し30分程室温で反応させるようにし
た方が好ましい。これは、保存中にリポソーム間で生成
したＳ−Ｓ結合を切断する為である。
含リポソームを調製した。遠心洗浄後、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.5,0.85％NaCl含有）に懸濁させ（2ml）、これ
に150mgのDTTを添加した。窒素置換後、よく攪拌し、そ
のまま室温で２時間反応させた。遠心（15,000rpm,20
分）洗浄（GVB2+,窒素置換済）して、５μの10％NaN3
を加えた後、冷蔵庫に保存した。一方、抗原については
実施例１と同様にSPDPを作用させ、ゲルロ過（HEPES緩
衝液で溶出）により分離・精製した。得られたリポソー
ム懸濁液及び修飾IgG溶液を等量ずつ混合し、窒素置換
後、室温でゆつくり浸とうしながら１晩反応させた。反
応後、十分に洗浄して（窒素置換GVB2+使用）５μの1
0％NaN3を添加してから冷蔵庫に保存した。なお修飾IgG
とのカツプリング反応に適用するリポソームとしては、
なるべくカツプリング直前にDTT処理したものを使用す
るのが望ましいが、やむを得ず冷蔵保存してあるものを
用いる場合には、カツプリング反応前に少量（10〜20m
g）のDTTを再び添加し30分程室温で反応させるようにし
た方が好ましい。これは、保存中にリポソーム間で生成
したＳ−Ｓ結合を切断する為である。
（２）IgG感作リポソームを用いる抗IgG抗体の測定 実施例１と全く同一の手法により本リポソームを用いて
抗IgG抗体を測定したところ、実施例１と同様の結果が
得られた。
抗IgG抗体を測定したところ、実施例１と同様の結果が
得られた。
実施例３ IgG感作リポソームを用いるヒト血清中のIGGの測定 実施例１で調製したIgG感作リポソームを用いて、ヒト
血清中のIgG量を測定した。マイクロタイタープレート
上に1,000倍、10,000倍及び20,000倍希釈（GVB2+使用）
の抗IgG抗体を25μずつ、それぞれ１列ずつ分注し、
試料のヒト血清を10〜106倍に希釈したものを25μ添
加して４℃で１晩反応させた。次に100倍希釈したIgG感
作リポソームを５μずつ添加し、最後に400倍あるい
は800倍に希釈した補体（モルモツト血清）を25μず
つ加えて、37℃で1.5時間静置した。以下の操作は実施
例１の抗IgG抗体の測定の項に示したものと同一であ
る。実験結果を第２図に示した。一方、既知濃度のIgG
を含む溶液を用い、同様の操作によりIgG濃度に対する
検量線を作成した。この検量線を用いて、ヒト血清中の
IgG量が測定できる。
血清中のIgG量を測定した。マイクロタイタープレート
上に1,000倍、10,000倍及び20,000倍希釈（GVB2+使用）
の抗IgG抗体を25μずつ、それぞれ１列ずつ分注し、
試料のヒト血清を10〜106倍に希釈したものを25μ添
加して４℃で１晩反応させた。次に100倍希釈したIgG感
作リポソームを５μずつ添加し、最後に400倍あるい
は800倍に希釈した補体（モルモツト血清）を25μず
つ加えて、37℃で1.5時間静置した。以下の操作は実施
例１の抗IgG抗体の測定の項に示したものと同一であ
る。実験結果を第２図に示した。一方、既知濃度のIgG
を含む溶液を用い、同様の操作によりIgG濃度に対する
検量線を作成した。この検量線を用いて、ヒト血清中の
IgG量が測定できる。
実施例４ ヒトAFP感作リポソームを用いたヒトAFPの測定 実施例１に示した方法に従つて、カルボキシルフルオレ
セインを含有するリポソーム表面上にヒトAFP（日本バ
イオテスト研究所より購入）を固定化した。一方、実施
例３と同様に、マイクロタイタープレート上に抗ヒトAF
P抗体を適当に（100〜1000ng/ml）希釈した（GVB2+使
用）溶液を25μずつ加え、各wellに５μのヒトAFP
標準液（３〜1000ng/ml、日本バイオテスト研究所製）
をそれぞれ2wellずつ添加して室温（約25℃）で30分間
反応させた。次に、上述のヒトAFP感作リポソーム（GVB
2+で100倍に希釈）懸濁液５μ及びモルモツト血清（G
VB2+で400倍に希釈）25μを添加して37℃で1.5時間静
置した後、100μのEDTA溶液を加えて反応を停止し
た。螢光分光光度計で各wellの螢光強度を測定し、AFP
の濃度に対してプロツトした。例えば、100ng/mlの抗ヒ
トAFP抗体と800倍希釈のモルモツト血清（補体）を使用
した場合、10〜500ng/mlの範囲内でヒトAFPが定量でき
ることが判明した。このような検量線を用い、未知試量
中のAFP濃度を求めることができる。
セインを含有するリポソーム表面上にヒトAFP（日本バ
イオテスト研究所より購入）を固定化した。一方、実施
例３と同様に、マイクロタイタープレート上に抗ヒトAF
P抗体を適当に（100〜1000ng/ml）希釈した（GVB2+使
用）溶液を25μずつ加え、各wellに５μのヒトAFP
標準液（３〜1000ng/ml、日本バイオテスト研究所製）
をそれぞれ2wellずつ添加して室温（約25℃）で30分間
反応させた。次に、上述のヒトAFP感作リポソーム（GVB
2+で100倍に希釈）懸濁液５μ及びモルモツト血清（G
VB2+で400倍に希釈）25μを添加して37℃で1.5時間静
置した後、100μのEDTA溶液を加えて反応を停止し
た。螢光分光光度計で各wellの螢光強度を測定し、AFP
の濃度に対してプロツトした。例えば、100ng/mlの抗ヒ
トAFP抗体と800倍希釈のモルモツト血清（補体）を使用
した場合、10〜500ng/mlの範囲内でヒトAFPが定量でき
ることが判明した。このような検量線を用い、未知試量
中のAFP濃度を求めることができる。
実施例５ CNBr−活性化ヘマトシド（糖脂質）含有リポソーム上へ
のヒト−IgGの固定化 ａ）CNBr−活性化ヘマトシドの調製 50mgのヘマトシド（GM3）をクロロホルム／メタノール
（2:1）30mlに溶解し、5NNaOHを滴下して溶液のpHを10.
5に調節した。スターラーで撹拌しながら1gのCNBr（数m
lのメタノールに溶解したもの）を添加し、即座に5N Na
OHを滴下してpHを10〜11の範囲に合せた。数分後、反応
液を分液ロートに移し、蒸留水5mlを添加して激しく振
とうした。10分後、下層を分取して、CNBr−活性化ヘマ
トシドとした。
のヒト−IgGの固定化 ａ）CNBr−活性化ヘマトシドの調製 50mgのヘマトシド（GM3）をクロロホルム／メタノール
（2:1）30mlに溶解し、5NNaOHを滴下して溶液のpHを10.
5に調節した。スターラーで撹拌しながら1gのCNBr（数m
lのメタノールに溶解したもの）を添加し、即座に5N Na
OHを滴下してpHを10〜11の範囲に合せた。数分後、反応
液を分液ロートに移し、蒸留水5mlを添加して激しく振
とうした。10分後、下層を分取して、CNBr−活性化ヘマ
トシドとした。
ｂ）リポソーム上へのヒト−IgGの固定化 実施例１と同様にしてリポソームを調製し、この懸濁液
中に5mgのヒト−IgGを加え、室温で３時間反応させた。
GVB洗浄後、再び2mlのGVBに懸濁し、N2封入後冷蔵庫に
保存した、 ｃ）抗ヒト−IgG抗体（ウサギ）の定量 実施例１と全く同様の操作で抗体を定量した結果、10- 8
〜10-10g/mlの範囲で抗体の定量が行えることが明らか
になつた。
中に5mgのヒト−IgGを加え、室温で３時間反応させた。
GVB洗浄後、再び2mlのGVBに懸濁し、N2封入後冷蔵庫に
保存した、 ｃ）抗ヒト−IgG抗体（ウサギ）の定量 実施例１と全く同様の操作で抗体を定量した結果、10- 8
〜10-10g/mlの範囲で抗体の定量が行えることが明らか
になつた。
第１図は、IgG感作リポソームを用いて抗IgG抗体の測定
を行つた場合における、抗IgG抗体の希釈倍率と相対螢
光強度との相関図、第２図は、IgG感作リポソームを用
いて血清中のIgGの測定を行つた場合における、血清希
釈倍率と相対螢光強度との相関図である。
を行つた場合における、抗IgG抗体の希釈倍率と相対螢
光強度との相関図、第２図は、IgG感作リポソームを用
いて血清中のIgGの測定を行つた場合における、血清希
釈倍率と相対螢光強度との相関図である。
フロントページの続き (72)発明者 保田 立二 神奈川県横浜市金沢区富岡町2500 富岡住 宅１―905 (56)参考文献 特開 昭56−132564（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】リポソーム;SPDP、SMPB、SMPA、SMPP、GMB
S及びEMCSよりなる群から選ばれる架橋剤あるいはCNB
r、ブロモアセチルヒドロオキシスクシンイミド及びシ
アヌリッククロリドよりなる群から選ばれる脂質活性化
剤によって、該リポソーム上に固定化された親水性の抗
原又は抗体；及び、該リポソーム内に封入された、蛍光
性化合物、発光性化合物、吸光性化合物、糖類、イオン
性化合物、補酵素類及びラジカル化合物から選ばれる親
水性の標識物質からなることを特徴とする免疫分析用試
薬。 - 【請求項２】リポソーム;SPDP、SMPB、SMPA、SMPP、GMB
S及びEMCSよりなる群から選ばれる架橋剤あるいはCNB
r、ブロモアセチルヒドロオキシスクシンイミド及びシ
アヌリッククロリドよりなる群から選ばれる脂質活性化
剤によって、該リポソーム上に固定化された親水性の抗
原又は抗体；及び、該リポソーム内に封入された、蛍光
性化合物、発光性化合物、吸光性化合物、糖類、イオン
性化合物、補酵素類及びラジカル化合物から選ばれる親
水性の標識物質からなることを特徴とする免疫分析用試
薬を、抗原又は抗体を含む試料及び補体と混合し、次い
で、リポソーム内から溶出した標識物質を定量すること
により、試料中の抗原又は抗体を定量することを特徴と
する免疫分析方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58224509A JPH06100601B2 (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
| EP84114528A EP0144084A3 (en) | 1983-11-30 | 1984-11-30 | Reagent for immunoassay and analytical method using the same |
| US07/157,772 US5108934A (en) | 1983-11-30 | 1988-02-19 | Quantitative immunoassay utilizing liposomes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58224509A JPH06100601B2 (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60117159A JPS60117159A (ja) | 1985-06-24 |
| JPH06100601B2 true JPH06100601B2 (ja) | 1994-12-12 |
Family
ID=16814910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58224509A Expired - Lifetime JPH06100601B2 (ja) | 1983-11-30 | 1983-11-30 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0144084A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06100601B2 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5053497A (en) * | 1984-12-28 | 1991-10-01 | Technion Instruments Corporation | Phospholipid conjugates and their preparation |
| JPS6250665A (ja) * | 1985-08-30 | 1987-03-05 | Denka Seiken Co Ltd | 肺炎マイコプラズマ抗体価の測定法 |
| CA1291423C (en) * | 1985-10-24 | 1991-10-29 | Ping W. Tang | Biochemical reagent |
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