JPS62214357A

JPS62214357A - 免疫分析用試薬の製造方法

Info

Publication number: JPS62214357A
Application number: JP5692086A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Ishimori; 石森　義雄; Masako Hado; 羽藤　正子; Masao Koyama; 小山　昌夫
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1986-03-17
Filing date: 1986-03-17
Publication date: 1987-09-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕（産業上の／）Ｊ用分野）本発明は免疫分析用試薬の製造方法に係り、特にリポソ
ームを用いた免疫分析用試薬の製造方法に関する。

（従来の技術）本発明者らは先に表面に親水性の抗原又は抗体を固定化
し、内部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬
を用いた免疫分析方法を開発し、た（特開昭６０−１１
７１５９号公報記載）。この方法では、まず前述したリ
ポソーム試薬が試料中の抗原または抗体及び別に加えら
れた補体とともに反応して破壊されて、封入していた標
識物質が流出する。この流出した標識物質の量が、ある
濃度範囲において試料中の被検物質の量と対応関係にあ
るため、流出した標識物質を定量すること番こより、被
検物質の定量分析が行なえる。この免役分析方法によれ
ば、短時間のうちに均一系で試料中の被検試料定量が簡
便に行なうことができる。

前述の抗原抗体反応を利用した免疫分析は、均一系で、
かう短時間で被検出物質の定量ができるため非常ｌこ有
効な方法である。しかし容易に入手できる分子量の比較
的小さい脂質でリポソームを合成し免疫分析用試薬を作
製した場合、反応に伴う標識物質の流出量が必ずしも大
きいとは限らず、このため十分なＳＮ比を得ることがで
きず、測定精度が低くなるという問題が生じてきた。

（発明が解決しようとする問題点）以上のように分子量の小さな脂質で合成した免疫分析用
試薬には測定精度が低いという問題があった。

本発明は分子量が小さな脂質を出発物質として測定精度
が高い免疫分析用試薬を製造する方法を提供することを
目的とする。

〔発明の構成〕

（問題点を解決するための手段と作用）本発明は、アミ
ノ基を有するリン脂質及び／又は糖脂質とＢｏｃ基でア
ミノ基が保護されたアミノ酸を反応させることによりア
ミノ基を有するリン脂質及び／又は糖脂質のアミノ末端
にアミノ酸残基を導入する工程と、Ｂｏｃ基を除去する
工程と、アミノ酸残基〜リン脂質及び／又は糖脂質のア
ミノ末端に架橋基を導入する工程と、架橋基〜アミノ酸
残基〜リン脂質及び／又は糖脂質と標識物質とからリポ
ソームを合成する工程と、得られたリポソームに抗原又
は抗体の少なくとも一部を固定化する工程を具備したこ
とを特徴とする免疫分析用試薬の製造方法である。

本発明をさらに説明すると、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミノ（ＤＰ
ＰＢ）のようなアミノ基を有する脂質とジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような縮合剤、ざらにｔ
−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ　）基でアミノ基が
保護されたアミノ酸とを反応させる。

次にＢｏｃ基を０．５Ｍ〜２ＭのＨＣｔ／酢酸により除
去する。更に、リポソーム上に固定化される抗原又は抗
体と結合し得る架橋基を導入する。

このようにして得られた架橋基及びアミノ酸残基を有す
る脂質、必要であれば他の脂質及びコレステロールをフ
ラスコに入れ溶媒を加えて反応させる。反応後溶媒を留
去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成され
たフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓を
して振とうし、リポソームの懸濁液を得る。

一方、リポソームに固定化すべき抗原又は抗体は必要で
あれば架橋基を導入する。

以上のようにして得たリポソームと抗原又は抗体とを緩
衝液中で反応せしめることｌこより、免疫分析用試薬が
得られる。

本発明で用いられるアミノ基を有するリン脂質及び／又
は糖脂質としては、分子量が小さいものだけでなくどの
ようなものであってもよく、格別に限定されるものでは
ない。例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミノ（ＤＰＰＥ）。

ジオレオイルホスファチジルエタノールアミノ（ＤＯＰ
Ｂ）、シミリストイルホスファチジルエタノールアミノ
（ＤＭＰ　Ｅ　）　、ジステアロイルホスファチジルエ
タノールアミノ（ＤＳＰＢ）　等が挙げられる。

リポソームの合成の際にリン脂質及び糖脂質に対してコ
レステロールを１０〜５００モル％　含ｔせてもよく、
これｌこより安定なリポソームを得ることができる。ま
た、リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１
８であることが好ましく、更には偶数！あることがより
好ましい。

本発明で用いられるアミノ酸はいかなるものでもよく、
格別に限定されるものではない。例えばε−アミノカプ
ロン酸、γ−アミノ酪酸、５−アミノ告草酸、８−アミ
ノカプリル酸、ｌｌ−アミノウンデカン酸、１２−アミ
ノドデカン酸等が挙げられる。

架橋基を導入するための架橋剤としては、アミノ基と結
合できるものであれば何であってもよく、特に限定され
るものではないが、例えば、Ｎ−サクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰＤＰ）
、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレート（ＳＭＰＢ）。

Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）
アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）
、Ｎ−（ｒ−マレイミ　ドブチリルオキシ）サクシンイ
ミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ａ−マレイミドカプロイルオ
キシ）サクシンイミド（ＥＭＣ８）及びジサクシンイミ
ジルスペレート（ＤＢＳ）が挙げられる。

例えば、５ＰＤＰは、次式：で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。

で示され、５ＰＤＰと同様な反応で抗体を固定化できる
が、最終生成物中に−８−８−結合を含まず（−Ｓ−結
合のみ）、血清などの還元的雰囲気下でも安定である。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（ＩＱ−３
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラベ
ルチルアンモニウムのヨウな比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法。

感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上で、
適宜に選択される。

本発明において、リポソーム上に固定化される抗原ある
いは抗体としては、特に限定されるものではないが、次
のようなものが挙げられる。例えば、腫瘍マーカー（前
述のＡＦＰ、ＢＦＰ、ＣＥＰ、及びＰＯＡ等）免疫グロ
ブリン（ＩｇＡ、　ＩｇＥ、　ＩｇＧ及びＩｇＭ等）、
ホルモン（インシーリン、Ｔ３等）及び薬物等の抗原、
さらにはそれらに対応する抗体等である。

（実施例）本発明に使用する脂質を以下のようにして合成した。用
いた試薬は、ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミノ（ＤＰＰＢ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（
Ｈ８工）〔以上３ｉｇｍａ社〕。

Ｂｏｃ−ε−アミノカプロン酸（Ｂｏｃ−ＡＣＡ）アミ
ノ（ＴＥＡ）［和光純薬社夷〕である。その他の試薬は
市販特級品を精製せずに用いた。また、水としてはすべ
てイオン交換水を１度蒸留したものを使用した。

３００μモルＤＰＰＥを５５ｍｔのクロロホルム／メタ
ノール（１０：１）に溶解し、これに４３０μモルのＢ
ｏｃ−ＡＣＡ　、　ｌ、　５　ｒｎ　モ／Ｌ／のＤＣＣ
，３，０ｍ　モ）ＩｉのＨ８Ｉ及び１．４８　ｍ　モル
（７）Ｔ　Ｅ　Ａを加え、室温で２時間反応後、溶媒を
除去した。６０ｍｔクロロホルム／メタノール（２：１
）に溶解し、水（約２０ｍｔ）で水溶性物質を抽出した
。有機層を蒸発させ、酢酸エチル（約２０ｍｔ）を加え
、白色沈殿を日別した。溶媒を蒸発させ、再び６ｍｔの
クロロホルム／メタノール（５：１）にだ解して、分取
用薄層クロマトグラフィ（Ｍｅｙｃｋ社！：Ａ）により
精製した（展開溶媒；クロロホルム／メタノール／水＝
６５：２５：４）このようにして得られたＢｏｃ−ＡＣ
Ａ−ＤＰＰＢの収率は約７０チであった。

次に、１００μモルＢｏｃ−ＡＣＡ−ＤＰＰＥを３ｍｔ
の１Ｍ塩酸／酢酸に溶解し、室温で２時間放置した。酸
を除去した後、ｓｍｔのクロロホルムに溶解し、再び分
取用薄層クロマトグラフィーで精製した。このようにし
てＡＣＡ−ＤＰＰＥを収率約６０俤で得た。更に、タン
パク質固定化用の架橋基付脂質（ＩＪＴＰ−ＡＣＡ−Ｄ
ＰＰＥ　）を次のようにして調製した。密栓付三角フラ
スコに５０μモルのＡＣＡ−ＤＰＰＥを分取し、２５ｍ
ｔのクロロホルム／メタノール（５：１）溶液に溶解し
、６０μｔのトリエタノールアミノ及び７０μモルの５
ＰＤＰを添加後窒素置換した。室温で１時間反応させた
後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。その
乾ｉ物を５ｍｔのクロロホルム／メタノール（１０：１
　）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いてＭｆｉした
。生成物画分を回収し、二ノくボレーターで約５ｍｔま
で濃縮した。収率は８０〜９５％であった。保存は窒素
封入下−２０℃で行った。

ついでリポソームの調製を行なった。

使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１）に溶解した。まず５ｍＭ　ＤＰ
ＰＣ（２００μｔ）、１０ｍＭ　コレステロール（１０
０μｔ）及び１　ｍＭＤＴＰ−ＡＣＡ−ＤＰＰＥ（５０
μｔ）を１０ｍＬのナス型フラスコに入れ、更ニ２１１
１６のクロロホルムを加えて良く混合した。

水浴中（約５０℃）でロータリーエバポレーターにより
溶媒を除去した。再び２ｍｔのクロロホルムを添加し、
十分攪拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒
を蒸発させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁
面に薄膜が形成され池フラスコをデシケータ−中に移し
、真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した
。次に、１００μｔの０．２　Ｍカルボキシフルオレセ
イン（以下、ＣＦと略記）を添加し、フラスコ内部を窒
素で置換した後尾密栓して、６０℃程度の水浴中に約１
分間浸漬した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、
壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく
振とうした。この操作により、リボン調一ム懸濁液が艙製された。これに０．ＯＩＭ　ＨＥＰＢ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７，４５、０，８５％　ＮａＣｔ含有）
を少量添加して、リポソーム懸濁液を完全に遠心チュー
ブに移した。そして４℃、ｘｓ、ｏｏｏｒｐｍで２０分
間遠心する操作を数回くり返した。２ｍｔのＨＥＰＥＳ
緩衝液に分散し、使用するまで水中に保存した。

次いで、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をリポソーム
に固定化する方法を示す。

５ｍｇのヒトＩｇＧ（Ｍｉｌｅｓ社製）を２ｒｒｓｌ−
の０、ＯＩＭ　ＨＥＰＥＳ　＆漬液（ｐＨ７，４５０，
８５％　ＮａＣｔ含有）に溶解し、窒素で置換した後、
１０μｔの１０ｍＭ　５ＰＤＰ　　（エタノール溶液）
を加え、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応させ
た。

反応後、反応液を予め生理食塩水で飽和させたセファデ
ックスＧ−２５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル
体積：約１５ｍＬ）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，５、０，８５％ＮａＣ１含有）で溶出させた。最
初のタンパク質フラクション（約２　ｍｚ）に更に２ｍ
ｔの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオトレイトー
ル（約３０ｍｇ）を添加した。十分に攪拌して２０分間
室温で反応させた。反応後、予め０．ＯＩＭＨＥＰＥＳ
　　緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フアイ
ンのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３　ｏｍ
ｚ　）に反応液を展開し前記ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出し
た。最初のタンパク質フラクション（約２ｍｔ）を集め
、前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と混合し
、−晩罠温で反応させた。ゼラチン・ベロナール緩衝液
（ＧＶＢ−）で３回洗浄することにより本発明の実施例
であるヒトＩｇＧ固定化リポソーム（ＡＣＡ−ＤＰＰＥ
）を得た。一方、比較例として全く同様にして、アミノ
酸残基を導入しない脂質を用いてＩｇＧ　　固定化リポ
ソーム（ＤＰＰＥ）を得た。これらリポソーム試薬を用
いて抗−ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ）の定量を行った。予
め既知濃度になるようｉｃｉ当ｉノ（）ｖ１３　　（０
，１ｍＭＭｇＣｚ、及び０．Ｏ３ｍＭＣａ　ＣＬｘを含
有したＧＶＢ−）で希釈した抗−ヒトＩｇＧ抗体（ウサ
ギ）　（Ｍｉｌｅｓ社製）を２５μＬずつＵ型マイクロ
プレート（９６穴；タンク社Ｍ）のｗｅｌｌに入れた。

次いで、前記ヒトＩｇＧ固定化リポソーム（ＡＣＡ−Ｄ
ＰＰＥ　）をＧＶＢで１００倍に希釈したものを５μｔ
ずつ添加した後、補体としてモルモット血清（０，５Ｃ
Ｈ５゜）を各々２５μｔずつ加え、３７℃で１，０時間
反応させた。

反応後、各ｗｅｌｌに１００μｔの０．ＯＩＭ　ＥＤＴ
Ａ　−ペロナール緩衝液を加えて反応を停止し、プレー
ト用蚤光分光光度計（コロナ電子社製、ＭＴＰ−１２Ｆ
）ｔ’各ｗｅｌｌの螢光を測定した（ＥＸ：４９０！１
ｍ、加：５２０ｎｍ）。なお、測定値は、抗体及び補体
の代わりにｌ　Ｑ　％　Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ−１００及び
ＧＶＢ−を２５μｔずつ添加したｗｅｌｌの螢光と、抗
−ヒトＩｇＧ抗体の代わりに２５μｔのＧＶＢ　を添加
したものの差を１００チとした相対遊出率で表示した。

結果を第１図の曲線ａに示す。図かられかるように１０
　　乃至１ｏ　　（ｇ／ｍｔ）の濃度範囲で標識物質の
遊出が認められた。そしてこの中で１０−’乃至１０　
　Ｃｇ／ｍＡ）の濃度範囲で特性を示した線を検量線と
して用いることにより、このような微量な範囲内での未
知の濃度の試料の定量分析が行なえることがわかる。し
かも、最大遊出率が７５チという値を得た。これに対し
、ＩｇＧ固定化リポソーム（ＤＰＰＥ　）の場合は第１
図すに示すように、測定範囲はほとんど変化しないが、
最大遊出率が６０％弱と、明らかに本発明の実施例の場
合より低い値を示した。

以上のように、本発明の実施例では測定のダイナミック
レンジが広がり、８Ｎ比が向上することが示された。

〔発明の効果〕

以上硅ｍしたように、本発明によれば、分子量が／トさ
い脂質を出発物質としてＳＮ比が向上し測定鞘度の高い
免疫分析用試薬の製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗−ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ）を測定しるた結果を表わすグラフであ〜。ｉ椿体溌硼蜀洟聰代理人
　弁理士　則　近　憲　佑同　　　　竹　花　喜久男

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アミノ基を有するリン脂質及び／又は糖脂質とＢ
ｏｃ基でアミノ基が保護されたアミノ酸を反応させるこ
とによりアミノ基を有するリン脂質及び／又は糖脂質の
アミノ末端にアミノ酸残基を導入する工程と、Ｂｏｃ基
を除去する工程と、アミノ酸残基〜リン脂質及び／又は
糖脂質のアミノ末端に架橋基を導入する工程と、架橋基
〜アミノ酸残基〜リン脂質及び／又は糖脂質と標識物質
とからリポソームを合成する工程と、得られたリポソー
ムに抗原又は抗体の少なくとも一部を固定化する工程を
具備したことを特徴とする免疫分析用試薬の製造方法。