JPH02150991A - チオール基含有脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は例えば免疫分析試薬の構成要素となるリポソー
ムや、ドラ・ソゲ番プリバリーーシステムの構成要素と
なるリポソームを構成するチオール基含有脂質を製造す
る方法に関する。

（従来の技術） 近年、リポソームを構成要素とする免疫分析試薬やドラ
ッグ・デリバリ−・システムが開発されている。

このうち、リポソームを構成要素とする免疫分析試薬は
、リポソームの内部に親水性の標識物質を封入し、リポ
ソームの表面に親水性の抗体又は抗原を固定化したもの
である。この免疫分析試薬による免疫分析は以下のよう
にして行われる。すなわち、被検物質として抗原又は抗
体が存在する試料中に前記免疫分析試薬を加え、これと
別に補体を加えると、抗原−抗体反応及びそれに伴う補
体の作用によってリポソームが破壊され、封入されてい
た標識物質（例えば蛍光性化合物）が流出する。この流
出した標識物質の量と、試料中の被検物質の量との間に
は相関関係があるので、流出した標識物質を所定の分析
方法（例えば蛍光分析）によって定量することにより、
被検物質を定量することができる。

また、リポソームを構成要素とするドラッグ・デリバリ
−〇システムは、リポソームの内部に親水性又は脂溶性
の薬物を封入し、リポソームの表面に例えば癌細胞に対
する抗体を固定化したものである。このドラッグ・デリ
バリ−・システムは、例えば癌細胞の存在する部位で抗
原−抗体反応によりリポソームを破壊させ、封入された
薬物を局所的に集中して作用させる一方、他の細胞に対
する副作用は軽減しようとするものである。

このような免疫分析試薬やドラッグ・デリバリ−・シス
テムの構成要素となるリポソームは、親水基側に遊離の
チオール基が結合した脂質及びコレステロールやその他
の脂質から構成されている。

そして、前記チオール基を抗体や抗原を固定化するため
の官能基として用いている。

従来、前述したチオール基含有脂質は、例えば以下のよ
うな方法により製造されている。

まず、適当なアミノ基含有脂質（例えばジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン）と適当なチオールカ
ルボン酸とをクロロホルムに溶解し、これにジシクロへ
キシルカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
及びトリエチルアミンを添加して、２０℃で一晩撹拌す
る。次に、溶媒を除去した後、酢酸エチルを加え、生じ
た白色沈殿をろ別する。再びろ液から溶媒を除去し、ク
ロロホルム／メタノール１５％クエン酸水溶液−７／２
／１で脂質成分を抽出する。無水硫酸ナトリウムで脱水
し、溶媒を除去した後、クロロホルムを加え、適当な濃
度の親水基側に遊離のチオール基が結合した脂質のクロ
ロホルム溶液を得る。

なお、チオールカルボン酸を予めジチオピリジンなどの
チオール基保護剤で保護し、これをアミノ基含有脂質と
結合させた後、ジチオスライトール、メルカプトエチル
アミン、システィン、エタンチオールなどの還元剤によ
り還元してチオール基を露出させる方法が用いられるこ
ともある。

しかし、アミノ基含有脂質とチオールカルボン酸とを反
応させて、チオール基含有脂質を製造する方法では、反
応途中で種々の副生成物が生じ、これらを分離精製する
ことが困難であり、チオール基含有脂質の収率も３０％
以下と極めて低いという問題がある。

一方、チオールカルボン酸をチオール基保護剤で保護し
、アミノ基含有脂質と結合させた後、還元剤により還元
する方法でも、精製過程で還元剤を完全に除去すること
は困難であるという問題がある゛。そして、このような
アミノ基含有脂質を含むリポソーム中に還元剤が残留し
ている場合、例えばこれを血清と混合しただけで非特異
反応が生じ、リポソームが破壊してしまうことがある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は前記問題点を解決するためになされたものであ
り、副生成物が生じず、精製も容易であり、チオール基
含有脂質を高収率で製造し得る方法を提供することを目
的とする。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段と作用） 本発明のチオール基含有脂質の製造方法は、親水基側に
アミノ基を含有する脂質とチオラクトン誘導体とを反応
させることを特徴とするものである。

本発明の対象となる脂質は、リン脂質でも糖脂質でもよ
い。そして、親水基側にアミノ基を含有する脂質として
は、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、
ステアリルアミンなどを挙げることができる。

本発明において、チオラクトン誘導体としては、例えば
り、Ｌ−Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン、Ｄ
、Ｌ−ホモシスティンチオラクトンなどを挙げることが
できる。

以下、本発明のチオール基含有脂質の製造方法を更に具
体的に説明する。

まず、適当なアミノ基含有脂質（例えばジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン）と適当なチオラクト
ン誘導体（例えばり、Ｌ−Ｎ−アセチルホモシスティン
チオラクトン）とをトリエチルアミンの存在下、例えば
クロロホルム及び少量のメタノールからなる混合溶媒中
で反応させる。反応温度は２０℃、反応温度は４０時間
程度である。反応後、クロロホルム／メタノール１５％
クエン酸水溶液−７／２／１で脂質成分のみを抽出する
。無水硫酸ナトリウムで脱水すると、粗製のチオール基
含有脂質が得られる。目的に応じて更に精製が必要な場
合には、高速液体クロマトグラフィーや分取用薄層クロ
マトグラフィーを用いればよい。

このような方法により製造されるチオール基含有脂質の
一例を以下に構造式で示す。

Ｃｌｌ３　（Ｃ１１２）。Ｃ０Ｏ−Ｃ１１２ＯＮｌＩＣ
０ＣＩ＋３ （ただし、ｎは１２．１４．１８％１８など）このよう
な本発明方法によれば、副生成物が生じず、精製も容品
であり、高純度のチオール基含有脂質を高収率で製造す
ることができる。

更に、このようなチオール基含有脂質を用いて免疫分析
試薬やドラッグ・デリバリ−・システムを製造するには
、従来から用いられている方法を採用することができる
。まず、前記のようにして得られたチオール基含有脂質
及びコレステロールやチオール基を含有していないリン
脂質、糖脂質などの他の脂質の適当量をフラスコに入れ
、溶媒を加えて溶解・混合した後、溶媒を吸引除去して
乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成さ
れる。次に、フラスコ内に標識物質又は水溶性薬物を含
有する水溶液を加え、密栓して振そうすることにより、
リポソームの懸濁液を調製する。一方、抗体、抗原など
を例えばＮ−サクシンイミジルー３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような二官能性試
薬で予め処理して、抗体、抗原などにジチオピリジル基
を導入しておく。次いで、前記リポソーム懸濁液と抗体
、抗原などとを反応させて、免疫分析試薬又はドラッグ
・デリバリ−・システムを製造する。

そして、本発明方法で製造されたチオール基含有脂質を
含むリポソームと抗体や抗原との結合部位（チオラクト
ン誘導体の残基）は、血清や血液と非特異反応を起すこ
とがないので、免疫分析の高感度化・高精度化に貢献で
き、ドラッグ・デリバリ−・システムとしても有効であ
る。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

実施例Ｉ　　Ｄ、Ｌ−Ｎ−アセチルホモシスティン−ホ
スファチジルエタノールアミン（ＳＨ−ＡＢＣ−ＤＰＰ
Ｅ）の合成 本実施例において用いた試薬のうちジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ）及び他
の脂質はシグマ社製のものを用いた。他°の試薬は市販
特級品を精製せずに使用した。なお、水は全てイオン交
換水を用いた。

Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ　１００μモルをクロロホルム３０ｍ　
ｌ及びメタノール１ｍｇからなる混合溶媒に溶解し、Ｄ
、Ｌ−Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン（Ａｌ
ｄｒｌｃｈ社製）１ｍモル及びトリエチルアミン１００
μｇを添加し、２０℃で４０時間反応させた。反応後、
反応液をロータリーエバポレータで濃縮し、クロロホル
ム／メタノール１５％クエン酸水溶液−７／２／１を１
００ｍｇ用いて３回抽出し、有機溶媒層を２％重曹水溶
液で２回洗浄した後、５ｇの無水硫酸ナトリウムで脱水
して、粗製５Ｈ−ＡＨＣ−ＤＰＰＥを得た。更に、これ
を分取用薄層クロマトグラフィーにより精製した。

５Ｈ−ＡＨＣ−ＤＰＰＥ（７）収率（，１９０％以上で
あり、収率は従来より大幅に向上した。

実施例２　５Ｈ−ＡＨＣ−ＤＰＰＥを含むリポソームと
血清との反応 ■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５　ｍ　ＭのＤＰＰＣ溶液２００　μｉ　、　１０ｍＭ
のコレステロール溶液ｔｏｏμｐ、及び１ｍＭの５Ｈ−
ＡＨＣ−ＤＰＰＥ溶液５０ｔｔｌ）を、ＩＯｍ　（ｌ容
量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍｊ？
を加えてよく混合した。次に、約４０℃の水浴中でロー
タリーエバポレータにより溶媒を除去した。再びクロロ
ホルム２ｍｊ？を加えて充分に撹拌しｈ後、再度ロータ
リーエバポレータにより溶媒を除去した。この操作を数
回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。

つづいて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプ
で約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２　Ｍのカルボキシフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦと記
す）溶液１００μｇを添加し、フラスコ内部を窒素で置
換した後、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間浸漬し
た。つづいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサーを用い、フラス
コ壁面の脂質薄膜が完全に消失するまで、フラスコを激
しく振とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が調
製された。更に、リポソーム懸濁液に、０．０１ＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（０，８５％ＮａＣ１含有、ｐＨ７，４
５：以下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後、全て遠心
チューブに移し、４℃において１５０００　ｒｐｍで２
０分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に、リポソ
ームを２ｍ１ｌのＨＢＳに懸濁させた。

■血清とリポソームとの反応による非特異反応の評価 予めＧＶＢ”（ＧＶＢ−１：ｌ：０．５　ｍＭＭｇ（１
）２及びＯ，１５ｍＭＣａ　Ｃ１）　２を添加したもの
）で１０倍に希釈したヒト血清と、１０倍に希釈したリ
ポソーム懸濁液ｌＯμｇとを混合し、３７℃で１０分間
インキュベートした。次に、２０倍に希釈した補体（モ
ルモット血清；補体価２５０ＣＨ，。）２５μｇを添加
し、更に３７℃で３０分間反応させた。次いで、０．０
１ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液（ＶＢ）１００μｇ
で反応を停止させ、流出したＣＦｆｆｉを蛍光分光光度
計（ＭＴＰ−３２、コロナ電気製）により励起波長４９
０　ｎｍ、蛍光波長５２０　ｎｍの条件で測定した。

そして、次式に基づいて相対蛍光強度を計算した。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ　：リポソーム
と補体だけで、血清が含まれていない場合の蛍光強度、
Ｆａ：イオン交換水５０μｇを添加してリポソームを全
て破壊した時の蛍光強度である。

１００検体の血清について検討した結果、前記相対蛍光
強度が５％以上になったものは１検体もなかった。この
ことから、Ｄ、Ｌ−Ｎ−アセチルホモシスティンチオラ
クトンの残基が原因となる非特異反応はほとんど生じな
いことがわかる。

実施例３　ヒト■ｇＧ固定化免疫分析試薬の調製及びそ
の評価 ６　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｆｌのヒトＩｇＧ／ＨＢＳ溶液０
．５ｍ（ｌに１０ｍ　Ｍの５ＰＤＰ／エタノール溶液１
０ｕｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした
。反応後、ＨＢＳを溶出液としてミニチュアディスポー
ザブルゲルろ過カラム（セファデックスＧ−２５、ファ
ルマシア社製）でゲルろ過し、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉ
Ｉの修飾ヒトＩｇＧ／ＨＢＳ溶液を調製した。

次いで、この修飾ヒトＩｇＧ溶液０．５ｍｇと実施例２
で調製したリポソーム懸濁液とを混合し、２０℃で一晩
撹拌した。反応後、ＧＶＢ−で洗浄し、最後に２ｍｊｌ
のＧＶＢ−に懸濁させて４℃で保存した。

得られた免疫分析試薬について、実施例２と同様にして
、ウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）の測定を
行った。すなわち、予めＧＶＢ２＋で１０〜１０６倍に
希釈したウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体と、前記免疫分析試
薬ｌＯμｇ及び８０倍に希釈した補体（モルモット血清
；補体価２５０ＣＨ，。）２５μｇを混合し、３７℃で
３０分間インキュベートした。次に、０．０１ＭのＥＤ
ＴＡ−ベロナール緩衝液（Ｖ　Ｂ）１００μｇで反応を
停止させ、流出したＣＦＩＩを蛍光分光光度計（ＭＴＰ
−３２、コロナ電気製）により励起波長４９０　ｎｍ、
蛍光波長５２０■の条件でＡＰＩ定し、実施例２と同様
に相対蛍光強度を計算した。

この測定結果を第１図に示す。

なお、第１図には、比較例として従来のチオールカルボ
ン酸を用いて製造されたチオール基含有脂質を含むリポ
ソームにヒトＩｇＧを固定化した免疫分析試薬を用いた
場合のＡｌｌ定結果を併記する。

第１図から明らかなように、いずれの免疫分析試薬を用
いてもΔＩｌｌ定結果定結色んど差がないことがわかる
。したがって、本発明に係るチオール基含有脂質は精製
が簡単であるなど製造上のメリットを生かすことができ
る。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明によれば、副生成物が生じず
、精製も容易であり、高純度のチオール基含有脂質を高
収率で製造することができる。

更に、本発明方法で製造されたチオール基含有脂質を含
むリポソームと抗体や抗原との結合部位（チオラクトン
誘導体の残りは、血清や血液と非特異反応を起すことが
ないので、免疫分析の高感度化・高精度化に貢献でき、
ドラッグ・デリバリ−・システムとしても有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例において製造されたチオール基
含有脂質を含むヒトＩｇＧ固定化免疫分析試薬と、従来
の方法で製造されたチオール基含有脂質を含むヒトＩｇ
Ｇ固定化免疫分析試薬とによる、ウサギ抗−ヒトＩｇＧ
抗体のａｌｌ定結果を示す特性図である。 ＬＹＳＩＳ（”／、）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 親水基側に遊離チオール基が結合した脂質を製造するに
   あたり、親水基側にアミノ基を含有する脂質とチオラク
   トン誘導体とを反応させることを特徴とするチオール基
   含有脂質の製造方法。