JP2652881B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、標識物質を封入したリポソームを用いる免
疫分析方法の改良方法に関する。
疫分析方法の改良方法に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を
実施するためには各種の標識物質（マーカー）、例えば
ラジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質
等が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラ
ジオアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソ
トープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能
障害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物
質や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研
究と相俟つて一層注目を集めるに至つている。
実施するためには各種の標識物質（マーカー）、例えば
ラジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質
等が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラ
ジオアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソ
トープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能
障害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物
質や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研
究と相俟つて一層注目を集めるに至つている。
螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、
現在、標識物質の内で抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
現在、標識物質の内で抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
ヘテロジニアスな系を使用する免疫測定法としてはラ
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物
と既反応物とを分離することを必須とするものであり、
この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅速化
が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニ
アスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃
することによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案
されたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲
が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化される
に至つていないのが実情である。
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物
と既反応物とを分離することを必須とするものであり、
この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅速化
が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニ
アスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃
することによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案
されたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲
が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化される
に至つていないのが実情である。
斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカー
を封入させたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させてリ
ポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗
体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この
複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出するマ
ーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種
々既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に
流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
を封入させたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させてリ
ポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗
体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この
複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出するマ
ーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種
々既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に
流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
この免疫分析方法によれば、従来存在した問題点を解
消して、均一系で被検物質を簡便に定量することができ
るが、被検試料中に含まれた定量分析対象の被検物質と
前述のリポソーム間の反応は、免疫反応であり、より感
度良く測定するには、反応時間を長くとることが必要で
あつた。そして、感度を低下させず、反応時間を短縮さ
せるために、従来から用いられている種々の界面活性剤
を上記反応系に添加すると、リポソームが破壊され、逆
に分析できなくなるという欠点があつた。
消して、均一系で被検物質を簡便に定量することができ
るが、被検試料中に含まれた定量分析対象の被検物質と
前述のリポソーム間の反応は、免疫反応であり、より感
度良く測定するには、反応時間を長くとることが必要で
あつた。そして、感度を低下させず、反応時間を短縮さ
せるために、従来から用いられている種々の界面活性剤
を上記反応系に添加すると、リポソームが破壊され、逆
に分析できなくなるという欠点があつた。
斯る実状において本発明者は、測定の感度を低下させ
ることなく反応時間を短縮させる方法に関し、鋭意研究
をおこなつた結果、反応系にある種の水溶性高分子化合
物を添加すれば上記目的が達成されることを見出し、本
発明を完成した。
ることなく反応時間を短縮させる方法に関し、鋭意研究
をおこなつた結果、反応系にある種の水溶性高分子化合
物を添加すれば上記目的が達成されることを見出し、本
発明を完成した。
すなわち、本発明はリン脂質及びコレステロールを主
要構成成分とし、その内部に親水性標識物質が封入さ
れ、その表面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又
は抗体が固定化されているリポソームを含有するリポソ
ーム試薬と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを
反応させてリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離
する標識物質を検出することにより被検試料中の被検物
質量を測定する免疫分析方法において、反応溶液中に分
子量が2,000〜700,000の水溶性高分子化合物を0.5〜5W/
V％添加することを特徴とする免疫分析方法を提供する
ものである。
要構成成分とし、その内部に親水性標識物質が封入さ
れ、その表面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又
は抗体が固定化されているリポソームを含有するリポソ
ーム試薬と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを
反応させてリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離
する標識物質を検出することにより被検試料中の被検物
質量を測定する免疫分析方法において、反応溶液中に分
子量が2,000〜700,000の水溶性高分子化合物を0.5〜5W/
V％添加することを特徴とする免疫分析方法を提供する
ものである。
本発明において用いられる水溶性高分子化合物は、そ
の分子量が2,000〜700,000程度のものであり、例えばポ
リエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロ
リドン、ゼラチン、アラビアゴム等が挙げられる。これ
らの水溶性高分子化合物は、反応の最初から存在させて
も、また、途中の工程において反応系に添加しても良
く、その添加量は0.5〜5W/V％程度である。
の分子量が2,000〜700,000程度のものであり、例えばポ
リエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロ
リドン、ゼラチン、アラビアゴム等が挙げられる。これ
らの水溶性高分子化合物は、反応の最初から存在させて
も、また、途中の工程において反応系に添加しても良
く、その添加量は0.5〜5W/V％程度である。
この水溶性高分子化合物のうち、好ましいものとして
は、分子量6,000〜20,000のポリエチレングリコールが
挙げられ、その添加量は反応系の終濃度として0.5〜5W/
V％程度が望ましい。
は、分子量6,000〜20,000のポリエチレングリコールが
挙げられ、その添加量は反応系の終濃度として0.5〜5W/
V％程度が望ましい。
本発明において、リポソームはリン脂質及びコレステ
ロールを主要構成成分とするものであれば、従来使用さ
れている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロ
ールの比が1:1前後であるとき、特に安定なリポソーム
が得られる。
ロールを主要構成成分とするものであれば、従来使用さ
れている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロ
ールの比が1:1前後であるとき、特に安定なリポソーム
が得られる。
またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜18
であることが好ましく、更には偶数であることがより好
ましい。
であることが好ましく、更には偶数であることがより好
ましい。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であつ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレセ
インのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフエリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシユークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。リポソーム試薬は、例えば次
の方法で製造される。まずリン脂質とコレステロールを
フラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留
去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成され
たフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓を
して振とうし、標識物質封入リポソームを得る。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレセ
インのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフエリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシユークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。リポソーム試薬は、例えば次
の方法で製造される。まずリン脂質とコレステロールを
フラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留
去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成され
たフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓を
して振とうし、標識物質封入リポソームを得る。
一方、被検物質に対する抗原又は抗体と架橋剤とを緩
衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要で
あれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオスレイ
トール;DTT）と更に反応させて、修飾抗体又は抗原を得
る。
衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要で
あれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオスレイ
トール;DTT）と更に反応させて、修飾抗体又は抗原を得
る。
最後に、標識物質封入リポソームと修飾抗体又は抗原
とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体又は抗原
結合リポソームが得られる。かかるリポソームは、通
常、標識物質を内包し、表面に固定化された抗体又は抗
原を担持したマイクロカプセルとして得られる。
とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体又は抗原
結合リポソームが得られる。かかるリポソームは、通
常、標識物質を内包し、表面に固定化された抗体又は抗
原を担持したマイクロカプセルとして得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミゾル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
シル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミシル４−（ｐ−マレイドフエニ
ル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）
が挙げられる。
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミゾル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
シル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミシル４−（ｐ−マレイドフエニ
ル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）
が挙げられる。
このようにして調製したリポソーム試薬を用いて、被
検体中の抗原あるいは抗体である被検物質を測定するに
は、被検体にリポソーム試薬及び補体を加え、リポソー
ム上で抗原−抗体複合体を形成せしめ、次いで、補体依
存性リポソーム膜損傷反応を引き起こさせる。すると、
かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識物質が
放出されてくるのであるが、本発明の水溶性高分子化合
物は、これらの反応において、その速度を促進する作用
を有するものである。
検体中の抗原あるいは抗体である被検物質を測定するに
は、被検体にリポソーム試薬及び補体を加え、リポソー
ム上で抗原−抗体複合体を形成せしめ、次いで、補体依
存性リポソーム膜損傷反応を引き起こさせる。すると、
かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識物質が
放出されてくるのであるが、本発明の水溶性高分子化合
物は、これらの反応において、その速度を促進する作用
を有するものである。
この測定操作において使用する補体は、格別限定され
ないが、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
ないが、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
最後に、放出された標識物質に応じた分析方法（例え
ば、標識物質が螢光物質であれば、螢光分析法）により
定量を行い、例えば、予め作成した検量線により、試料
中の被検物質の量を測定することができる。
ば、標識物質が螢光物質であれば、螢光分析法）により
定量を行い、例えば、予め作成した検量線により、試料
中の被検物質の量を測定することができる。
本発明方法によれば、後記実施例で示す如く、反応時
間を1/2以下とすることができ、より短時間で感度良
く、被検体中の抗体又は抗原量を測定することが可能と
なる。
間を1/2以下とすることができ、より短時間で感度良
く、被検体中の抗体又は抗原量を測定することが可能と
なる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。
実施例１ ヒト血清中に含まれる成人Ｔ細胞白血病（ATL）ウイ
ルス抗体価の測定を行つた。ATL抗体測定のためのリポ
ソーム試薬の調製、ATLウイルス抗原のリポソームへの
感作及び抗ATLV抗体の測定は、以下の通りにおこなつ
た。
ルス抗体価の測定を行つた。ATL抗体測定のためのリポ
ソーム試薬の調製、ATLウイルス抗原のリポソームへの
感作及び抗ATLV抗体の測定は、以下の通りにおこなつ
た。
（ｉ） リポソームの調製 クロロホルムに溶解させたジパルミトイルホスフアチ
ジルコリン（DPPC）１μモル、コレステロール（Chol）
１μモルおよびジチオピリジル化ジパルミトイルホスフ
アチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）0.05μモルを
ナシ型フラスコにとり、これら脂質を溶解していたクロ
ロホルムをエバポレーターで留去した。さらに１時間真
空デシケーターで乾燥後、ナシ型フラスコに0.2Mカルボ
キシフルオレセイン（CF）200μを入れ、激しく振と
うし、ナシ型フラスコのガラス壁上の脂質薄膜をはがし
てCF封入リポソームを調製した。未封入のCFは、0.01M
ヘペス緩衝液（0.15M NaCl含有;ph7.5）で遠心洗浄を３
回行つて分離した。
ジルコリン（DPPC）１μモル、コレステロール（Chol）
１μモルおよびジチオピリジル化ジパルミトイルホスフ
アチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）0.05μモルを
ナシ型フラスコにとり、これら脂質を溶解していたクロ
ロホルムをエバポレーターで留去した。さらに１時間真
空デシケーターで乾燥後、ナシ型フラスコに0.2Mカルボ
キシフルオレセイン（CF）200μを入れ、激しく振と
うし、ナシ型フラスコのガラス壁上の脂質薄膜をはがし
てCF封入リポソームを調製した。未封入のCFは、0.01M
ヘペス緩衝液（0.15M NaCl含有;ph7.5）で遠心洗浄を３
回行つて分離した。
（ii） ATLウイルス抗原のリポソームへの感作 あらかじめ、10mMヘペス緩衝液（0.15M NaCl,ph7.5）
で透析処理した2mg/mlのATLウイルス可溶化抗原1mlに、
30mM N−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）3.0μを添加し、室温で3
0分間反応させた。引き続き過剰のSPDPを除去するため
に、20mM MES緩衝液（0.15M NaCl,ph6.0）で平衡化した
セフアデツクスＧ−25でゲルろ過した。ゲルろ過より得
られたタンパク分画は、ジチオスレイトール（DTT）20m
gを添加し、室温で30分間反応させた後、10mMヘペス緩
衝液（0.15M NaCl,ph7.5）で平衡化しておいたセフアデ
ツクスＧ−25でゲルろ過し、過剰のDTTとタンパク分画
を分離した。こうして得られたタンパク分画1mlに
（ｉ）で調製したリポソームペレツトの懸濁させ、６〜
10℃で18〜20時間ゆつくり撹拌しながら反応させた。反
応後リポソーム懸濁液を遠心洗浄し、未結合のタンパク
質を分離し、0.1％NaN3含有ゼラチン・ベロナール緩衝
液（ph7.4）1mlに再懸濁した。
で透析処理した2mg/mlのATLウイルス可溶化抗原1mlに、
30mM N−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）3.0μを添加し、室温で3
0分間反応させた。引き続き過剰のSPDPを除去するため
に、20mM MES緩衝液（0.15M NaCl,ph6.0）で平衡化した
セフアデツクスＧ−25でゲルろ過した。ゲルろ過より得
られたタンパク分画は、ジチオスレイトール（DTT）20m
gを添加し、室温で30分間反応させた後、10mMヘペス緩
衝液（0.15M NaCl,ph7.5）で平衡化しておいたセフアデ
ツクスＧ−25でゲルろ過し、過剰のDTTとタンパク分画
を分離した。こうして得られたタンパク分画1mlに
（ｉ）で調製したリポソームペレツトの懸濁させ、６〜
10℃で18〜20時間ゆつくり撹拌しながら反応させた。反
応後リポソーム懸濁液を遠心洗浄し、未結合のタンパク
質を分離し、0.1％NaN3含有ゼラチン・ベロナール緩衝
液（ph7.4）1mlに再懸濁した。
（iii） ATLウイルス抗原感作リポソームを用いた抗AT
LV抗体の測定 96穴のマイクロプレート（住友ベイクライト製）を用
いて測定を行つた。検体及び補体の希釈には0.5mM MgCl
2と0.15mM CaCl2を含むゼラチンベロナール緩衝液（GVB
2+）を用いた。また、リポソームの希釈にはGVB 及び
2.5％ポリエチレングリコール＃6000（半井化学）のGVB
溶液を用いた。400倍希釈したリポソーム50μに、
非働化処理したヒト血清をGVB2+で適当に希釈したもの2
5μを添加した。引き続き5.0CH50U/mlのモルモツト補
体25μを添加し、37℃で反応させた反応は、10mM EDT
A含有ベロナール緩衝液（ph7.5）を100μ添加するこ
とで停止した。ATL抗体価に依存したCF放出量は、螢光
測定機（励起490nm,螢光530nm）で測定した。
LV抗体の測定 96穴のマイクロプレート（住友ベイクライト製）を用
いて測定を行つた。検体及び補体の希釈には0.5mM MgCl
2と0.15mM CaCl2を含むゼラチンベロナール緩衝液（GVB
2+）を用いた。また、リポソームの希釈にはGVB 及び
2.5％ポリエチレングリコール＃6000（半井化学）のGVB
溶液を用いた。400倍希釈したリポソーム50μに、
非働化処理したヒト血清をGVB2+で適当に希釈したもの2
5μを添加した。引き続き5.0CH50U/mlのモルモツト補
体25μを添加し、37℃で反応させた反応は、10mM EDT
A含有ベロナール緩衝液（ph7.5）を100μ添加するこ
とで停止した。ATL抗体価に依存したCF放出量は、螢光
測定機（励起490nm,螢光530nm）で測定した。
ATL抗体陽性検体の希釈系列を組み、上記に従つてア
ツセイした時の結果を第１図（水溶性高分子化合物無添
加）及び第２図（水溶性高分子化合物添加）に示した。
これらの図より明らかなように、反応促進物質の添加に
より反応速度が速くなつていることがわかる。さらに同
程度の感度を出すのに、反応促進物質非存在下の場合の
約1/2に反応時間が短縮されることが示された。
ツセイした時の結果を第１図（水溶性高分子化合物無添
加）及び第２図（水溶性高分子化合物添加）に示した。
これらの図より明らかなように、反応促進物質の添加に
より反応速度が速くなつていることがわかる。さらに同
程度の感度を出すのに、反応促進物質非存在下の場合の
約1/2に反応時間が短縮されることが示された。
実施例２ HBウイルス表面抗原（HBsAg）の測定をリポソームを
用いたサンドウイツチ法で行つた。測定のためのリポソ
ーム試薬は次のようにして調製した。
用いたサンドウイツチ法で行つた。測定のためのリポソ
ーム試薬は次のようにして調製した。
（ｉ） リポソームの調製 実施例１に示した方法に従つた。
（ii） 抗HBsAgモノクローナル抗体のリポソームへの
感作 10mMヘペス緩衝液（0.15M NaCl,ph7.5）に透析した1m
g/mlの抗HBsAgモノクローナル抗体（IgG1）1mlに、30mM
SPDP5μを添加し、室温で30分間反応させた。引き続
き過剰のSPDPを除去するために、0.1M酢酸緩衝液（0.15
M NaCl,ph4.5）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲ
ルろ過した。ゲルろ過により得られたタンパク分画に、
ジチオスレイトール（DTT）7.7mgを添加し、室温で30分
間反応させた後、10mMヘペス緩衝液（0.15M NaCl,ph7.
5）で平衡化しておいたセフアデツクスＧ−25でゲルろ
過し過剰のDTTとタンパクを分離した。こうして得られ
たタンパク分画1mlに（ｉ）で調製したリポソームペレ
ツトを懸濁させ、６〜10℃で18〜20時間ゆつくり撹拌し
ながら反応させた。反応後、リポソーム懸濁液を遠心洗
浄し、未結合のタンパク質を分離し、0.1％NaN3含有ゼ
ラチンベロナール緩衝液（ph7.4）1mlに再懸濁した。
感作 10mMヘペス緩衝液（0.15M NaCl,ph7.5）に透析した1m
g/mlの抗HBsAgモノクローナル抗体（IgG1）1mlに、30mM
SPDP5μを添加し、室温で30分間反応させた。引き続
き過剰のSPDPを除去するために、0.1M酢酸緩衝液（0.15
M NaCl,ph4.5）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲ
ルろ過した。ゲルろ過により得られたタンパク分画に、
ジチオスレイトール（DTT）7.7mgを添加し、室温で30分
間反応させた後、10mMヘペス緩衝液（0.15M NaCl,ph7.
5）で平衡化しておいたセフアデツクスＧ−25でゲルろ
過し過剰のDTTとタンパクを分離した。こうして得られ
たタンパク分画1mlに（ｉ）で調製したリポソームペレ
ツトを懸濁させ、６〜10℃で18〜20時間ゆつくり撹拌し
ながら反応させた。反応後、リポソーム懸濁液を遠心洗
浄し、未結合のタンパク質を分離し、0.1％NaN3含有ゼ
ラチンベロナール緩衝液（ph7.4）1mlに再懸濁した。
（iii） 抗HBsAgモノクローナル抗体感作リポソームを
用いたHBsAgの測定 96穴のマイクロプレート（住友ベークライト製）を用
いて測定を行つた。検体、補体及び２次抗体（ウサギ抗
HBs抗体）の希釈には、GVB を用いた。また、リポソー
ムの希釈は、GVB 及び５％ポリエチレングリコール＃6
000含有GVB2+を用いた。アツセイは、400倍希釈したリ
ポソーム250μに、非働化したヒト血清をGVB2+で適当
に希釈したもの25μを加え、37℃で反応させた（１次
反応）。その後、適当に希釈した２次抗体25μ及びモ
ルモツト補体25μを添加し、さらに37℃で反応させた
（２次反応）。反応は、10mM EDTA含有ベロナール緩衝
液100μを加えて停止させ、HBsAg量に依存したCF放出
量を螢光測定機（励起490nm,螢光530nm）で測定した。
用いたHBsAgの測定 96穴のマイクロプレート（住友ベークライト製）を用
いて測定を行つた。検体、補体及び２次抗体（ウサギ抗
HBs抗体）の希釈には、GVB を用いた。また、リポソー
ムの希釈は、GVB 及び５％ポリエチレングリコール＃6
000含有GVB2+を用いた。アツセイは、400倍希釈したリ
ポソーム250μに、非働化したヒト血清をGVB2+で適当
に希釈したもの25μを加え、37℃で反応させた（１次
反応）。その後、適当に希釈した２次抗体25μ及びモ
ルモツト補体25μを添加し、さらに37℃で反応させた
（２次反応）。反応は、10mM EDTA含有ベロナール緩衝
液100μを加えて停止させ、HBsAg量に依存したCF放出
量を螢光測定機（励起490nm,螢光530nm）で測定した。
HBsAg陽性検体の希釈系列を組み、上記に従つてアツ
セイした時の結果を第３図（水溶性高分子化合物無添
加）及び第４図（水溶性高分子化合物添加）に示した。
図より明らかなように、反応促進物質を含まない系第３
図では、１次反応30分−２次反応30分の反応時間では、
充分な感度が出ていない。しかしながら、反応促進物質
を含んでいる系第４図においては、同様の条件において
もより高い感度が出ている。さらに反応促進物無添加の
系に比較して約1/2に反応時間で、同程度以上の感度を
出すことが示された。
セイした時の結果を第３図（水溶性高分子化合物無添
加）及び第４図（水溶性高分子化合物添加）に示した。
図より明らかなように、反応促進物質を含まない系第３
図では、１次反応30分−２次反応30分の反応時間では、
充分な感度が出ていない。しかしながら、反応促進物質
を含んでいる系第４図においては、同様の条件において
もより高い感度が出ている。さらに反応促進物無添加の
系に比較して約1/2に反応時間で、同程度以上の感度を
出すことが示された。
第１図は、水溶性高分子化合物無添加時の反応時間と検
量線の関係を示す図面であり、第２図は水溶性高分子化
合物無添加時の検量線の関係を示す図面である。 第３図は、水溶性高分子化合物無添加で、サンドウイツ
チ法をおこなつた場合の反応時間と検量線の関係を示す
図面であり、第４図は水溶性高分子化合物を添加し、サ
ンドウイツチ法をおこなつた場合の反応時間と検量線の
関係を示す図面である。
量線の関係を示す図面であり、第２図は水溶性高分子化
合物無添加時の検量線の関係を示す図面である。 第３図は、水溶性高分子化合物無添加で、サンドウイツ
チ法をおこなつた場合の反応時間と検量線の関係を示す
図面であり、第４図は水溶性高分子化合物を添加し、サ
ンドウイツチ法をおこなつた場合の反応時間と検量線の
関係を示す図面である。
Claims (3)
- 【請求項１】リン脂質及びコレステロールを主要構成成
分とし、その内部に親水性標識物質が封入され、その表
面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又は抗体が固
定化されているリポソームを含有するリポソーム試薬
と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを反応させ
てリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離する標識
物質を検出することにより被検試料中の被検物質量を測
定する免疫分析方法において、反応溶液中に分子量が2,
000〜700,000の水溶性高分子化合物を0.5〜5W/V％添加
することを特徴とする免疫分析方法。 - 【請求項２】水溶性高分子化合物が、ポリエチレングリ
コール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ゼラチ
ン及びアラビアゴムから選ばれたものである請求項第１
項記載の免疫分析方法。 - 【請求項３】ポリエチレングリコールが分子量6,000〜2
0,000の範囲のものである請求項第２項記載の免疫分析
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63240442A JP2652881B2 (ja) | 1988-09-26 | 1988-09-26 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63240442A JP2652881B2 (ja) | 1988-09-26 | 1988-09-26 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0287064A JPH0287064A (ja) | 1990-03-27 |
| JP2652881B2 true JP2652881B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=17059556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63240442A Expired - Lifetime JP2652881B2 (ja) | 1988-09-26 | 1988-09-26 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2652881B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02108969A (ja) * | 1988-10-18 | 1990-04-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | リポソームを用いる免疫測定法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6179164A (ja) * | 1984-09-26 | 1986-04-22 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 抗原抗体反応の短縮方法 |
| JPH07113639B2 (ja) * | 1987-01-20 | 1995-12-06 | 日水製薬株式会社 | 免疫分析用試薬 |
-
1988
- 1988-09-26 JP JP63240442A patent/JP2652881B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0287064A (ja) | 1990-03-27 |
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