JPH0544626B2 - - Google Patents

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JPH0544626B2
JPH0544626B2 JP58244731A JP24473183A JPH0544626B2 JP H0544626 B2 JPH0544626 B2 JP H0544626B2 JP 58244731 A JP58244731 A JP 58244731A JP 24473183 A JP24473183 A JP 24473183A JP H0544626 B2 JPH0544626 B2 JP H0544626B2
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JP
Japan
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antigen
liposome
liposomes
protein
complement
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JP58244731A
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JPS60138464A (ja
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Shosaku Motoda
Shigeru Sekine
Yoshitaka Tsunoda
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Denka Seiken Co Ltd
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Denka Seiken Co Ltd
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗原定量方法に関するものであ
る。
近年医療分野においては病気の診断等を行なう
ように際し、高度の信頼性をもつて抗原を簡便迅
速に定量することが極めて重要な課題になつてき
た。
従来免疫化学的測定法による抗原の定量法とし
ては、(A)放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセ
イ）、(B)酵素免疫測定法、(C)逆受身赤血球凝集反
応法、及び(D)一元放射状免疫拡散法等により行わ
れているが、これらの方法は次の如き欠点を有す
るものであつた。即ち Ａ方法：洗浄操作を必要とし、またラジオアイソ
トープを使用するため特別の設備を必要とする
等莫大な設備費と煩雑な手数を要する。
Ｂ方法：一般的に洗浄の操作を必要とし且つ判定
まで長時間を要する。
Ｃ方法：ダイリユーターにて試料を２倍に階段希
釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要す
る。又判定までに長時間を要すると共に抗原量
を２倍階段希釈の終末値で判定するため雑駁な
判定になるおそれがある。
Ｄ方法：判定までに多大な時間を要すると共に感
度的にも不十分である。
またリポソームを使用して抗体又は抗原を定量
する方法がある。リポソームは主として脂質より
なる閉鎖小胞であり、リポソームの形状として多
重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム、大き
な１枚膜リポソームに分類される。リポソーム膜
は多くの水溶性物質に対してバリヤー能を有して
いるため、リポソーム内の水相には水溶性物質を
保持することができる。リポソームの研究は
Banghamが主としてイオンの透過性を生体膜レ
ベルで研究するためのモデルとして用いたのには
じまる。その後Kinsky等がリポソームに糖脂質
の抗原（ハプテン）を導入すると抗体及び補体の
存在下でリポソーム内の水層に保持された物質が
膜外に遊離する現象を見い出し、リポソームを抗
脂質抗体の検出系として用いたものである。しか
しKinsky等の方法は抗体を定量するものであり、
抗原を定量するものではない。更にその後リポソ
ームを使用し抗原を定量する方法がいくつか報告
されている。例えばケイイチ・ウエムラ等の方法
（ジヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソツド、
J.Immunol.Methods、53、1982、221−232）、フ
ランシス・エツクス：コール、Francis・Ｘ・
Cole等の方法（ユナイテツド・ステート・パテ
ント、United・State・Patent、No.4342836）な
どがある。この方法は試料（抗原）と抗体とを反
応させ、次いで抗原を結合させたリポソーム及び
補体を反応させるものであり、このとき試料中に
抗原が存在しないと抗体とリポソームに結合させ
た抗原とが抗原抗体反応をおこし、補体の作用に
よつてリポソームは破壊される。しかし抗原が試
料中に存在すると試料中の抗原が抗体と反応し抗
体は消費されリポソームに結合させた抗原と反応
しなくなり、リポソームは破壊されない。即ち抗
原量とリポソームの破壊量とが反比例することに
より抗原を定量する方法である。
然しながらこの方法は抗原を結合させたリポソ
ームを使用するための多量の抗原を必要とし、特
に抗原の入手が困難な抗原を定量する方法として
は工業的に適用し難いものであつた。
本発明はかかる現状に鑑み鋭意研究を行つた結
果、感度よくしかも簡便迅速にして抗原を定量す
る方法を開発したものである。即ち、本発明は、
プロテインＡを結合させたリポソームに定着しよ
うとする抗原に対する抗体を添加した後、さらに
抗原および補体を添加して該リポソームを破壊
し、該リポソーム内に内臓される物質を遊離させ
て該物質を測定することを特徴とするものであ
る。
本発明方法においてリポソームにプロテインＡ
を結合させる方法としてはレイザーマン
Leserman等の方法（ネイチヤー、Mature、288、
602−604、1980）、マルチンMartin等の方法（バ
イオケミストリー、Biochemistry20、4229−
4238、1981）などがある。即ちホスフアチジルエ
タノールアミンにSH基と反応する試薬｛Ｎ−ハ
イドロキシスクシニル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）｝を共有結合させ
たものを合成し、リポソームに組み込んでおく。
これにタンパク質をSPDPによつてSH化したも
のを結合させる方法である。
本発明において使用するリポソームとしては多
重量リポソーム、小さな１枚膜リポソーム又は大
きな１枚膜リポソームの何れでもよい。又リポソ
ームの成分としてはシリンダー型に属する脂質例
えばレシチン、スフインゴエミエリン、ホスフア
チジルセリンの内１種又は２種以上を単独又は主
体とし、これに他の脂質例えばコレステロール、
ステアリルアミンなどの内１種又は２種以上を組
合せてなるものである。
ただし、プロテインＡをリポソームと結合させ
るため例えばレイザーマン等の方法の場合にはＮ
−｛３−（２ピリジルチオ）プロピオニルホスフア
チジルエタノールアミン｝（PDP−PE）を使用す
ることが必要である。
又本発明方法において使用する補体は限定され
るものではなく補体活性の高い補体が望ましく、
例えばモルモツト補体等である。
又本発明方法において定量できる抗原として
は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫
グロブリンＡ、ミオグロビン、HBS抗原、α−フ
エトプロテイン、Ｃ−反応性蛋白、フエリチンな
どがあげることができるがこれらの抗原に限定さ
れるものではなく、抗原抗体反応に補体が関与す
るすべての種類の抗原を定量することができる。
又リポソーム内に内臓する物質及びその測定方
法としては次の如く知られている。
(A) スピンラベル試薬 電子スピン共鳴（ERS）で行う方法（ロー
ゼンクイスト、Rosenquist等、ジヤーナル・
オブ・イムノロジカル・メソツド、J.
Immounol、Methads、15、147、1977） (B) グルコース グルコース酵素電極で行う方法（梅沢等：日
本化学会誌、10：1437、1980） (C) 酵素 非色法により行う。
(D) 螢光色素 分光螢光光度計により行う（上村等：免疫実
験操作法、P2235、日光免疫学会（1978） (E) 塩化テトラペンチルアンモニウム 薄膜ポテンシオメトリーにより行う。（チバ
Chiba等アナリテイカルケミストリー、Anal、
Chem52：1610、1980） 次に本発明の実施例について説明する。
実施例 フラスコ内に10mMコレステロール（クロロフ
オルムで溶解した。）100μ、5mMレシチン（ク
ロロフオルムで溶解した）200μ、100mMジセ
チルホスフエイト50μ、50mM（PDP−PE）（レ
イザーマン等の方法で調整したもの）100μと
エタノール50μとを添加して混合し、ロータリ
ーエバホレーターにて溶媒を十分に除去して、該
フラスコ内面に脂質膜を形成した。これに酵素パ
ーオキシターゼ溶液（1000単位／ml）1.0mlを加
えて50℃加温し、ボルテツクスミキサーにて撹拌
しリポソームを作製した。然る後30000Kg、30分
間遠心し、上清液をすてて沈渣物に生理食塩液を
加え再度遠心した。この操作をパーオキシターゼ
活性が上清液になくなるまで行ない、最後に生理
食塩液500μを加えてリポソーム懸濁液とした。
このリポソーム懸濁液にレイザーマン等の方法に
よつてＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジール
ジチオ）プロピオネート（SPDP）とプロテイン
Ａとを結合せしめ、ジチオスレイトール（DTT）
により処理したプロテインＡを反応させることに
より該リポソームにプロテインＡを結合させた。
然る後30000Kg、30分間遠心し上清液をすてて、
プロテインＡ結合リポソーム沈渣を生理食塩液に
て懸濁し、再度30000Kg、30分間遠心して上清液
をすてた。この操作を２回繰返して生理食塩液に
てプロテインＡ結合リポソーム懸濁液（20％
ｖ／ｖ）とした。なおこれらの操作はすべて窒素
ガスの雰囲気で行つた。
然る後プロテインＡ結合リポソーム懸濁液25μ
に抗ヒト−α−フエトプロテインウサギ抗体
（200μｇ／ml）25μを加え、更に種々の濃度
｛50、100、200、300、400、（ｎｇ／ml）｝のヒト
−α−フエトプロテイン25μとベロナール緩衝
液にて30倍に希釈したモルモツト補体1.0mlを加
え、37℃15分間反応させた。その後発色試薬（４
−アミノアンチピリン−フエノール−H2O2系）
（P.Trinder、Am.Clin.Biochm.6、24（1969）1.0
mlを加え、37℃、５分間反応せしめて吸光度
（500mm）を測定してリポソーム内に内臓せる物質
（パーオキシターゼ）の遊離割合（％）を求めた。
その結果は図面に示す通りである。
ただしプロテインＡ結合リポソーム懸濁液25μ
に抗ヒト−α−フエトプロテインウサギ抗体
25μとベロナール緩衝液25μとを加え、更に
ブロナール緩衝液にて30倍に希釈したモルモツト
補体1.0mlを加え、トリトンＸ−100（Rohm and
Hass）にてプロテインＡ結合リポソームを完全
に破壊させた後、発色試薬1.0mlを添加し、37℃、
５分間反応せしめて吸光度（500ml）を測定し、
この吸光度をリポソーム内に内臓した物質（パー
オキシターゼ）の遊離割合を100％とした。
図面より明らかの如くヒト−α−フエトプロテ
インの濃度とパーオキシターゼの遊離割合との比
例関係によつてヒト−α−フエトプロテインを定
量することができた。
以上詳述した如く本発明方法によれば洗浄や固
液分離などの煩雑な操作を全く必要とせず、簡便
迅速にて抗原を定量しうる等顕著な効果を有す
る。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明抗原定量法の１例におけるヒト−
α−フエトプロテインの濃度とパーオキシターゼ
の遊離割合との関係を示す曲線図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ プロテインＡを結合させたリポソームに定量
    しようとする抗原に対する抗体を添加した後、さ
    らに抗原および補体を添加して該リポソームを破
    壊し、該リポソーム内に内臓される物質を遊離さ
    せて該物質を測定することを特徴とする新規な抗
    原定量法。
JP58244731A 1983-12-27 1983-12-27 新規な抗原定量法 Granted JPS60138464A (ja)

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JP58244731A JPS60138464A (ja) 1983-12-27 1983-12-27 新規な抗原定量法

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JP58244731A JPS60138464A (ja) 1983-12-27 1983-12-27 新規な抗原定量法

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JPS60138464A JPS60138464A (ja) 1985-07-23
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0757178B2 (ja) * 1986-08-29 1995-06-21 メルシャン株式会社 プロテインａで被覆した生物学的粒子及びその用途
US5256532A (en) * 1988-05-02 1993-10-26 Zynaxis Technologies, Inc. Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities
JPH0333657A (ja) * 1989-06-30 1991-02-13 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体
JP4892256B2 (ja) * 2006-03-10 2012-03-07 フランスベッド株式会社 棚装置
JPWO2020189766A1 (ja) * 2019-03-20 2020-09-24

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56132564A (en) * 1980-02-04 1981-10-16 Koraboreiteibu Research Inc Product for and method of immunity analysis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56132564A (en) * 1980-02-04 1981-10-16 Koraboreiteibu Research Inc Product for and method of immunity analysis

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