JPH0460222B2 - - Google Patents
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- JPH0460222B2 JPH0460222B2 JP58244733A JP24473383A JPH0460222B2 JP H0460222 B2 JPH0460222 B2 JP H0460222B2 JP 58244733 A JP58244733 A JP 58244733A JP 24473383 A JP24473383 A JP 24473383A JP H0460222 B2 JPH0460222 B2 JP H0460222B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な抗原定量方法に関するものであ
る。
る。
近年医療分野においては病気の診断等を行うに
おいて、抗原を高度の信頼性にしてしかも簡便迅
速に定量することが極めて重要な課題になつてい
た。
おいて、抗原を高度の信頼性にしてしかも簡便迅
速に定量することが極めて重要な課題になつてい
た。
従来免疫化学的測定法による抗原の定量法とし
ては、(A)放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセ
イ）、(B)酵素免疫測定法、(C)逆受身赤血球凝集反
応法、及び(D)一元放射状免疫拡散法等により行わ
れているが、これらの方法は次の如き欠点を有す
るものであつた。即ち Ａ方法：洗浄操作を必要とし、またラジオアイ
ソトープを使用するため特別の設備を必要とする
等莫大な設備費と煩雑な手数を要する。
ては、(A)放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセ
イ）、(B)酵素免疫測定法、(C)逆受身赤血球凝集反
応法、及び(D)一元放射状免疫拡散法等により行わ
れているが、これらの方法は次の如き欠点を有す
るものであつた。即ち Ａ方法：洗浄操作を必要とし、またラジオアイ
ソトープを使用するため特別の設備を必要とする
等莫大な設備費と煩雑な手数を要する。
Ｂ方法：一般的に洗浄の操作を必要とし且つ判
定まで長時間を要する。
定まで長時間を要する。
Ｃ方法：ダイリユーターにて試料を２倍に階段
希釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要する。
又判定までに長時間を要すると共に抗原量を２倍
階段希釈の終末値で判定するため雑駁な判定にな
るおそれがある。
希釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要する。
又判定までに長時間を要すると共に抗原量を２倍
階段希釈の終末値で判定するため雑駁な判定にな
るおそれがある。
Ｄ方法：判定までに多大な時間を要すると共に
感度的にも不十分である。
感度的にも不十分である。
またリポソームを使用して抗体又は抗原を定量
する方法がある。リポソームは主として脂質より
なる閉鎖小胞であり、リポソームの形状として多
重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム、大き
な１膜リポソームに分類される。リポソーム膜は
多くの水溶性物質に対してバリヤー能を有してい
るため、リポソーム内の水相には水溶物質を保持
することができる。リポソームの研究は
Banghamが主としてイオン透過性を生体膜レベ
ルで研究するためのモデルとして用いたのにはじ
まる。その後Kinsky等がリポソームに糖脂質の
抗原（ハプテン）を導入すると抗体及び補体の存
在下でリポソーム内の水層に保持された物質が膜
外に遊離する現象を見い出し、リポソームを抗脂
抗体の検出系として用いたものである。しかし
Kimsky等の方法は抗体を定量するものであり、
抗原を定量するものではない。更にその後リポソ
ームを使用し抗原を定量する方法がいくつか報告
されている。例えばケイイチ・ウエムラ等の方法
（ジヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソツド、
J.Immunol.Methods，53，1982，221−232）、フ
ランシス．エツクス；コール、Francis.X.Cole等
の方法（ユナイテツド・ステート・パテント、
United States・Patent No.4342826）などがあ
る。この方法は試料（抗原）と抗体とを反応さ
せ、次いで抗原を結合させたリポソーム及び補体
を反応させるものであり、このとき試料中に抗原
が存在しないと抗体とリポソームに結合させた抗
原とが抗原抵抗反応をおこし、補体の作用によつ
てリポソームは破壊される。しかし抗原が試料中
に存在すると試料中の抗原が抗体と反応し抗体は
消費されリポソームに結合させた抗原と反応しな
なり、リポソームは破壊されない。即ち抗原量と
リポソームの破壊量とが反比例することにより抗
原を定量する方法である。
する方法がある。リポソームは主として脂質より
なる閉鎖小胞であり、リポソームの形状として多
重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム、大き
な１膜リポソームに分類される。リポソーム膜は
多くの水溶性物質に対してバリヤー能を有してい
るため、リポソーム内の水相には水溶物質を保持
することができる。リポソームの研究は
Banghamが主としてイオン透過性を生体膜レベ
ルで研究するためのモデルとして用いたのにはじ
まる。その後Kinsky等がリポソームに糖脂質の
抗原（ハプテン）を導入すると抗体及び補体の存
在下でリポソーム内の水層に保持された物質が膜
外に遊離する現象を見い出し、リポソームを抗脂
抗体の検出系として用いたものである。しかし
Kimsky等の方法は抗体を定量するものであり、
抗原を定量するものではない。更にその後リポソ
ームを使用し抗原を定量する方法がいくつか報告
されている。例えばケイイチ・ウエムラ等の方法
（ジヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソツド、
J.Immunol.Methods，53，1982，221−232）、フ
ランシス．エツクス；コール、Francis.X.Cole等
の方法（ユナイテツド・ステート・パテント、
United States・Patent No.4342826）などがあ
る。この方法は試料（抗原）と抗体とを反応さ
せ、次いで抗原を結合させたリポソーム及び補体
を反応させるものであり、このとき試料中に抗原
が存在しないと抗体とリポソームに結合させた抗
原とが抗原抵抗反応をおこし、補体の作用によつ
てリポソームは破壊される。しかし抗原が試料中
に存在すると試料中の抗原が抗体と反応し抗体は
消費されリポソームに結合させた抗原と反応しな
なり、リポソームは破壊されない。即ち抗原量と
リポソームの破壊量とが反比例することにより抗
原を定量する方法である。
然しながらこの方法は抗原を結合させたリポソ
ームを使用するための多量の抗原を必要とし、特
に抗原の入手が困難な抗原を定量する方法として
は工業的に適用し難いものであつた。
ームを使用するための多量の抗原を必要とし、特
に抗原の入手が困難な抗原を定量する方法として
は工業的に適用し難いものであつた。
本発明はかかる現状に鑑み鋭意研究を行つた結
果、感度よくしかも簡便迅速にして抗原を定量す
る方法を開発したものである。
果、感度よくしかも簡便迅速にして抗原を定量す
る方法を開発したものである。
即ち、本発明の抗原定量法は、定量しようとす
る抗原に対する第１抗体と、該第１抗体の起源で
ある動物と同種の動物の免疫グロブリン蛋白に対
する第２抗体を結合させたリポソームとを混合し
て反応させた後、更に定量しようとする抗原及び
補体を添加して該リポソームを破壊せしめ、該リ
ポソーム内に内蔵される物質を遊離させて該物質
を測定することを特徴とするものである。
る抗原に対する第１抗体と、該第１抗体の起源で
ある動物と同種の動物の免疫グロブリン蛋白に対
する第２抗体を結合させたリポソームとを混合し
て反応させた後、更に定量しようとする抗原及び
補体を添加して該リポソームを破壊せしめ、該リ
ポソーム内に内蔵される物質を遊離させて該物質
を測定することを特徴とするものである。
第１抗体は第２抗体に対する抗原であるから、
第１抗体と第２抗体を結合させたリポソームとを
混合して反応させた時点で抗原抗体反応が生じ、
これに補体を添加することによつてリポソームが
破壊されると考えられたが、リポソームは破壊さ
れない。
第１抗体と第２抗体を結合させたリポソームとを
混合して反応させた時点で抗原抗体反応が生じ、
これに補体を添加することによつてリポソームが
破壊されると考えられたが、リポソームは破壊さ
れない。
本発明方法においてリポソームに抗体に結合さ
せる方法としてはレイザーマン（Leserman）等
の方法（ネイチヤー、Nature，288，602−604，
1980）、マルチン（Martin）等の方法（バイオケ
ミストリー、Bio−Chemisty，20，4229−4238，
1981）などがあるが何れの方法でもよい。
せる方法としてはレイザーマン（Leserman）等
の方法（ネイチヤー、Nature，288，602−604，
1980）、マルチン（Martin）等の方法（バイオケ
ミストリー、Bio−Chemisty，20，4229−4238，
1981）などがあるが何れの方法でもよい。
即ち、ホスフアチジルエタノールアミンにSH
基と反応する試薬｛Ｎ−ハイドロキシスクシニル
−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）｝を共有結合させたものを合成し、リポ
ソームに組み込んでおく。これに抗体をSH化し
たものあるいは抗体間のＳ−Ｓ結合をはずして
SH化したものを結合させる方法である。
基と反応する試薬｛Ｎ−ハイドロキシスクシニル
−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）｝を共有結合させたものを合成し、リポ
ソームに組み込んでおく。これに抗体をSH化し
たものあるいは抗体間のＳ−Ｓ結合をはずして
SH化したものを結合させる方法である。
本発明方法において使用するリポソームとして
は多重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム又
は大きな１枚膜リポソームの何れでもよい。又リ
ポソームの成分としてはシリンダー型に属する脂
質例えばレシチン、スフインゴエミエリン、ホス
フアチジルセリンの内１種又は２種以上を単独又
は主体とし、これに他の脂質例えばコレステロー
ル、ステアリルアミンなどの内１種又２種以上を
組合せてなるものである。
は多重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム又
は大きな１枚膜リポソームの何れでもよい。又リ
ポソームの成分としてはシリンダー型に属する脂
質例えばレシチン、スフインゴエミエリン、ホス
フアチジルセリンの内１種又は２種以上を単独又
は主体とし、これに他の脂質例えばコレステロー
ル、ステアリルアミンなどの内１種又２種以上を
組合せてなるものである。
ただし抗体をリポソームと結合させるため例え
ばマルチン等の方法の場合にはＮ−｛３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオニルホスフアチジルエタノ
ールアミン｝（POP−PE）を使用することが必要
である。
ばマルチン等の方法の場合にはＮ−｛３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオニルホスフアチジルエタノ
ールアミン｝（POP−PE）を使用することが必要
である。
又本発明方法において使用する補体は限定され
るものではなく補体活性の高い補体が望ましく、
例えばモルモツト補体等である。
るものではなく補体活性の高い補体が望ましく、
例えばモルモツト補体等である。
又本発明方法において定量できる抗原として
は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫
グロブリンＡ、ミオグロピン、HBs抗原、α−
フエトフロテイー、Ｃ−反応性蛋白、フエリチン
などがあけることができるが、これらの抗原に限
定されるものではなく抗原抗体反応に補体が関与
するすべての新規の抗原を定量することができ
る。
は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫
グロブリンＡ、ミオグロピン、HBs抗原、α−
フエトフロテイー、Ｃ−反応性蛋白、フエリチン
などがあけることができるが、これらの抗原に限
定されるものではなく抗原抗体反応に補体が関与
するすべての新規の抗原を定量することができ
る。
メリポリーム内に内蔵せる物質及びその測定方
法としては次の如く知られている。
法としては次の如く知られている。
Ａ スピンラベル試薬
電子スピン共鳴（ESR）で行う方法（ロー
ゼンクイスト、Rosenquist等、ジヤーナル・
オブ・イムノロジカル・メソツド、J.
Immounol，Methods，15，147，1977） Ｂ グルコース グルコース酵素電極で行う方法（梅沢等：日
本化学会誌、10：1437，1980） Ｃ 酵素 比色法により行う。
ゼンクイスト、Rosenquist等、ジヤーナル・
オブ・イムノロジカル・メソツド、J.
Immounol，Methods，15，147，1977） Ｂ グルコース グルコース酵素電極で行う方法（梅沢等：日
本化学会誌、10：1437，1980） Ｃ 酵素 比色法により行う。
Ｄ 蛍光色素
分光蛍光光度計により行う。（上村等、免疫
実験操作法、P2235、日光免疫学会（1978） Ｅ 塩化テトラペンチルアンモニウム 薄層ポテンシオメトリーにより行う。（チバ
Chuba等アナリテイカルケミストリー、Anal，
chem 52：1610，1980） 次に本発明の実施例について説明する。
実験操作法、P2235、日光免疫学会（1978） Ｅ 塩化テトラペンチルアンモニウム 薄層ポテンシオメトリーにより行う。（チバ
Chuba等アナリテイカルケミストリー、Anal，
chem 52：1610，1980） 次に本発明の実施例について説明する。
実施例
フラスコ内に10mMコレステロール（クロロフ
オルムで溶解した）100μl，5mMレシチン（クロ
ロフオルムで溶解した）200μl，10mMスフイン
ゴミエソン（クロロフオルムで溶解した）100μl，
50mM PDP−PE（マルチン等の方法で調製した）
100μlとエタノール50μlとを混合し、ロータリー
エバポレーターにて溶媒を十分に除去することに
よつてフラスコ内面に脂質膜を作製した。これに
酵素グルコースオキシターゼ溶液（700単位／ml）
を添加し、50℃に加温しボルテツクスミキサーに
て撹拌しリポソームを作製した。然る後
30000xg、30分間遠心し上清液をすてて、沈渣に
生理食塩液を加え再び遠心した。この操作をグク
ルコースオキシターゼの活性が遠心上清液になく
なるまで行い、最後に生理食塩液500μlを加えリ
ポソーム懸濁液とする。このリポソーム懸濁液に
抗ウサギ免疫グロブリンＧヤギ抗体Ｆ（ab）2
（200μg）をジチオスレイトール（DTT）によつ
て処理したものを反応せしめ、リポソームに抗体
を結合させた。然る後30000xg、30分間遠心し上
清液をすてて抗体結合リポソームとし沈渣を生理
食塩液で懸濁し、再び30000xg、30分間遠心し、
上清液をすてる。この操作を２回繰返し生理食塩
液にて抗体結合リポソーム懸濁液（20％ｖ／ｖ）
とした。なおこれらの操作はすべて窒素ガスの存
在下で行つた。
オルムで溶解した）100μl，5mMレシチン（クロ
ロフオルムで溶解した）200μl，10mMスフイン
ゴミエソン（クロロフオルムで溶解した）100μl，
50mM PDP−PE（マルチン等の方法で調製した）
100μlとエタノール50μlとを混合し、ロータリー
エバポレーターにて溶媒を十分に除去することに
よつてフラスコ内面に脂質膜を作製した。これに
酵素グルコースオキシターゼ溶液（700単位／ml）
を添加し、50℃に加温しボルテツクスミキサーに
て撹拌しリポソームを作製した。然る後
30000xg、30分間遠心し上清液をすてて、沈渣に
生理食塩液を加え再び遠心した。この操作をグク
ルコースオキシターゼの活性が遠心上清液になく
なるまで行い、最後に生理食塩液500μlを加えリ
ポソーム懸濁液とする。このリポソーム懸濁液に
抗ウサギ免疫グロブリンＧヤギ抗体Ｆ（ab）2
（200μg）をジチオスレイトール（DTT）によつ
て処理したものを反応せしめ、リポソームに抗体
を結合させた。然る後30000xg、30分間遠心し上
清液をすてて抗体結合リポソームとし沈渣を生理
食塩液で懸濁し、再び30000xg、30分間遠心し、
上清液をすてる。この操作を２回繰返し生理食塩
液にて抗体結合リポソーム懸濁液（20％ｖ／ｖ）
とした。なおこれらの操作はすべて窒素ガスの存
在下で行つた。
而して抗体結合リポソーム懸濁液25μlに抗フエ
リチンウサギ抗体（50μg／nl）25μlを加え、更に
種々の濃度即ち50ng／ml、100ng／ml、200ng／
ml、300ng／mlの濃度を有するフエリチン溶液
25μl及びベロナール緩衝液にて30倍に希釈したモ
ルモツト補体1.0とを加え、しかる後20％β−Ｄ
−グルコース溶液100μlを加え、37℃にて15分間
反応後、過酸化水素電極によつて発生した過酸化
水素を測定し、リポソーム内に内蔵せる物質（グ
ルコースオキシターゼ）の遊離割合（％）を求め
た。その結果は図面に示す通りである。
リチンウサギ抗体（50μg／nl）25μlを加え、更に
種々の濃度即ち50ng／ml、100ng／ml、200ng／
ml、300ng／mlの濃度を有するフエリチン溶液
25μl及びベロナール緩衝液にて30倍に希釈したモ
ルモツト補体1.0とを加え、しかる後20％β−Ｄ
−グルコース溶液100μlを加え、37℃にて15分間
反応後、過酸化水素電極によつて発生した過酸化
水素を測定し、リポソーム内に内蔵せる物質（グ
ルコースオキシターゼ）の遊離割合（％）を求め
た。その結果は図面に示す通りである。
ただし抗体結合リポソーム懸濁液25μlに抗フエ
リチンウサギ抗体25μlを加え、更にベロナール緩
衝液25μl及びベロナール緩衝液にて30倍に希釈し
たモルモツト補体1.0mlを加え、トリトンＸ−100
（Rahm and Hass）にて結合リポソームを破壊
させた後、20％β−Ｄ−グルコース溶液100μlを
加えて、37℃、15分間反応せしめた後、過酸化水
素電極にて発生した過酸化水素を測定し、この値
をリポソーム内に内蔵せる物質（グルコースオキ
シターゼ）の遊離割合を100％とした。
リチンウサギ抗体25μlを加え、更にベロナール緩
衝液25μl及びベロナール緩衝液にて30倍に希釈し
たモルモツト補体1.0mlを加え、トリトンＸ−100
（Rahm and Hass）にて結合リポソームを破壊
させた後、20％β−Ｄ−グルコース溶液100μlを
加えて、37℃、15分間反応せしめた後、過酸化水
素電極にて発生した過酸化水素を測定し、この値
をリポソーム内に内蔵せる物質（グルコースオキ
シターゼ）の遊離割合を100％とした。
図面より明らかなの如くフエリチン濃度とリポ
ソーム封じ込め物質の遊離割合との比較関係によ
つてフエリチンを定量することができた。
ソーム封じ込め物質の遊離割合との比較関係によ
つてフエリチンを定量することができた。
以上詳述した如く本発明方法によれば洗浄や固
液分離などの煩雑な操作を必要とすることなく簡
便迅速に抗原を定量することが出来る等顕著な効
果を有する。
液分離などの煩雑な操作を必要とすることなく簡
便迅速に抗原を定量することが出来る等顕著な効
果を有する。
図面は本発明抗原の定量法の１例におけるフエ
リチンの濃度とグルコースオキシターゼの遊離割
合との関係を示す曲線図である。
リチンの濃度とグルコースオキシターゼの遊離割
合との関係を示す曲線図である。
Claims (1)
- １ 定量しようとする抗原に対する第１抗体と、
該第１抗体の起源である動物と同種の動物の免疫
グロブリン蛋白に対する第２抗体を結合させたリ
ポソームとを混合して反応させた後、更に定量し
ようとする抗原及び補体を添加して該リポソーム
を破壊せしめ、該リポソーム内に内蔵される物質
を遊離させて該物質を測定することを特徴とする
新規な抗原定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24473383A JPS60138466A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24473383A JPS60138466A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60138466A JPS60138466A (ja) | 1985-07-23 |
| JPH0460222B2 true JPH0460222B2 (ja) | 1992-09-25 |
Family
ID=17123080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24473383A Granted JPS60138466A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60138466A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60159652A (ja) * | 1984-01-31 | 1985-08-21 | Toshiba Corp | 免疫分析用試薬 |
| EP0313666B1 (en) * | 1987-05-06 | 1993-04-21 | Teijin Limited | Method for immunoassay utilizing liposome and kit therefor |
| JP2604171B2 (ja) * | 1987-09-22 | 1997-04-30 | 日水製薬 株式会社 | 免疫分析方法 |
| US5256532A (en) * | 1988-05-02 | 1993-10-26 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
| JP4271086B2 (ja) * | 2004-06-08 | 2009-06-03 | 株式会社東芝 | 免疫分析方法 |
| CN106124716B (zh) * | 2016-07-21 | 2018-09-07 | 武汉市农业科学技术研究院农业环境安全检测研究所 | 一种克伦特罗快速检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156865A (en) * | 1978-10-06 | 1980-12-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
| JPS56132564A (en) * | 1980-02-04 | 1981-10-16 | Koraboreiteibu Research Inc | Product for and method of immunity analysis |
-
1983
- 1983-12-27 JP JP24473383A patent/JPS60138466A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156865A (en) * | 1978-10-06 | 1980-12-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
| JPS56132564A (en) * | 1980-02-04 | 1981-10-16 | Koraboreiteibu Research Inc | Product for and method of immunity analysis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60138466A (ja) | 1985-07-23 |
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Legal Events
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |