JPH01214762A

JPH01214762A - 免疫測定法

Info

Publication number: JPH01214762A
Application number: JP3872988A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Matsuda; 寛松田; Yuichiro Inui; 乾　祐一郎; Ryutaro Yamana; 山名　隆太郎
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1988-02-23
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1989-08-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野本発明は免疫測定法における試料処理法に関する。

（ロ）従来の技術および課題マイクロカプセルを用いる免疫測定法は測定用の緩衝液
中に測定すべき抗原または抗体のみを溶解した液を試料
として測定する場合には、試料中の抗原または抗体の量
とマイクロカプセルが破壊されて放出されるマーカーの
量には一定の関係があり、測定条件を一定にすればマー
カーの量から一義的に抗原または抗体の量が算出される
。しかし試料中にある種の物質が存在する場合には、試
料中の抗原または抗体の量とマイクロカプセルが破壊さ
れて放出されるマーカーの量の関係が変化し抗原または
抗体量の算出ができない。ある種の物質とはすなわちマ
イクロカプセル膜の溶解を誘起する物質またはその前駆
物質でありこの免疫測定中に膜の溶解を誘起する物質に
変化する物質または膜の溶解を誘起する物質の作用に影
響を及ぼす物質またはその前駆物質でありこの免疫測定
中に膜の溶解を誘起する物質の作用に影響を及ぼす物質
に変化する物質を指す。例えば血清を試料とした場合、
少なくとも血清中にはマイクロカプセル膜の溶解を誘起
る物質すなわち補体が明らかに含まれているので、含ま
れている補体濃度に応じてマイクロカプセルの破壊量は
変化する。また血清中の補体濃度は血清の保存状態や個
体差によって変化するので、マイクロカプセルから放出
されたマーカー量から血清試料中の抗原または抗体の量
を正確に算出することはできない。血清中にはその他の
夾雑物質も含まれており、これらについても同様な影響
が考えられる。従って、従来の技術では血清のような夾
雑物質を含む試料の中の抗原または抗体の正確な測定が
できなかった。

（ハ）発明が解決しようとする課題本発明の目的は一般に検体中に含まれている前記の夾雑
物質が前記免疫測定系に影響を及ぼさぬような試料の熱
処理法を提供することである。

（ニ）課題を解決するための手段本発明では膜に抗原または抗体を結合すると同時に内部
にマーカーを封入したマイクロカプセルと抗原・抗体反
応により前記膜の溶解を誘起する物質と前記抗原または
抗体と抗原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有する試
料を混合し、そこで生じた抗原抗体反応により生じる膜
溶解作用によるマイクロカプセルの破壊により放出され
たマイクロカプセル内のマーカーを検出することにより
、前記試料中の抗体または抗原量を測定する免疫測定法
（以下、Ｍ　ＣＩ　Ａ法ともいう）において、当該試料
を一定条件（試料中の夾雑物質が前記の膜の溶解を誘起
する物質に影響を及ぼさない条件）で加熱処理すること
により非特異反応を抑えることを特徴とする。

すなわち、非特異反応を起こす夾雑物質を含む試料をそ
のまま、あるいは希釈用緩衝液で稀釈して一定条件で加
熱する。加熱条件は測定すべき個々の抗原または抗体に
応じて設定する必要がある。

加熱は前記夾雑物質の影響が抑えられかつ測定すべき抗
原の抗原性または抗体の抗体価が変化しない条件で行な
うことが望ましい。但し前記夾雑物質の影響を充分に抑
えるためには抗原の抗原性または抗体の抗体価が変化し
てしまう場合にはいずれかを犠牲にし、妥協によって適
当な条件を設定する必要がある。特に抗原の熱安定性は
個々の抗原によって大きく変わるので注意が必要である
。

具体的な加熱条件としては、５６〜７０℃、３〜６０分
間程分間例示され、好ましくは、５６〜６４℃、５〜３
０分間程度である。さらに好ましくは、５６℃、３０分
間程度または６３℃、５分間程度が示される。

ＭＣＩＡ法の具体的な態様としては以下のようなものが
挙げられる。

すなわち、抗体を結合し、補体活性により溶解作用を受
ける膜よりなり、内部に定量可能なマーカー物質を含有
するマイクロカプセル、補体、抗原（被検物質）を含む
試料、二次抗体および反応用緩衝液からなる免疫反応系
である。

まず、試料はＭＣＩＡ法において非特異反応を起こす夾
雑物質を含有していてもよい。このような試料としては
、ヒト血漿または血清などが挙げられる。

本発明で使用されるマイクロカプセルとしては、補体活
性により溶解作用を受ける膜よりなるものであれば特に
制限はなく、好適には、ヒト赤血球（特に、０型赤血球
）、リボソーム（特開昭６１−９９８６７号）等が使用
される。

本発明で使用されるリボソームには特に制限はなく、た
とえばリン脂質よりなるもの（必要に応じてさらに糖類
を添加したもの）が例示され、その構造としても、マル
チラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラー
ジュニラメラベシクノベリハースフェーズエバボレーシ
ョンベシクルなど特に制限はない。

マイクロカプセル内部に包含される定量可能なマーカー
物質としては、本発明の目的に適い、かつかかる機能を
有するものであれば特に制限はなく、赤血球の場合はヘ
モグロビンであり、リボソームの場合はカルボキシフル
オレセインのヨウナ蛍光物質、ルミノールやルシフェリ
ンのような発光性化合物、特異的吸収帯を有する吸光性
化合物（水溶性色素等）等が好適に用いられる。

マイクロカプセルに感作させる抗体は被検目的（被検抗
原）に応じて適宜選択される。例えば、後記被検物質と
して列挙した抗原に対応する抗体が例示される。

当該抗体は動物への免疫、モノクロナール抗体作製の通
常技術等〔免疫学実験入門（学会出版センター）、モノ
クローナル抗体（講談社）等参照〕によって製造される
。

また、抗体は抗原認識部位を含む断片（例えばＦａｂ　
、　Ｆａｂ’　、Ｆ（ａｂ’）２であってもよい。

抗体のマイクロカプセルへの結合（感作）は、公知の方
法に従えばよい。対象が動物赤血球の場合、抗体の結合
はたとえば、公知の塩化クロム法により行われる。また
リボソームへの抗体の結合は、例えばＬｅｓｅｒｍａｎ
等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２８８．６０６−６０４、
１９８０）　、　！、１ａｒｔ　ｉｎ等の方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２０．４２２９−４２３８．１
９８１）　あるいは還元法（特願昭６２−１１１９４３
など）により行われる。

本発明で使用される補体は補体活性の高いものほどよい
。例えば、モルモット補体などが例示される。補体は、
公知の手段により提供される。かかる手段としては、た
とえば血液の血清化、更にはＰＥＧ　（ポリエチレング
リコール）による混在するグロブリンの除去等が例示さ
れる。

また、反応用緩衝液としては、ベロナールａ１１％液、
ゼラチン−ベロナール緩衝液などが例示される。これは
、反応用の他に稀釈用に用いられる。

二次抗体としては、各種哺乳動物に目的とする抗原（被
検物質）を免疫して得られたポリクローナル抗体、具体
的にはウサギやウマ由来のポリクローナル抗体が使用さ
れる。

被検物質としてはＡＦＰ　（アルファーフェトプロティ
ン）　、ＣＥＡ　（癌胎児性抗原）、フェリチン、　　
β２−ミクログロブリン、ＣＡ（カルボハイドレート・
アンティゲン）１９〜９等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ、
ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓ抗体、ＨＴＬＶ　（ヒユーマン・Ｔ
セル・ロイケミア・ウィルス）−１，ＨＴＬＶ−［［等
のウィルス関連の抗原・抗体、更には血中の各種ホルモ
ンやＩｇＧ等の血漿蛋白質が好適に例示される。

測定方法には以下のような手順でなされる。まず、マイ
クロカプセルに試料であるヒト血清または血漿を接触さ
せると、当該試料中にマイクロカプセルに結合した抗体
に対応する抗原が含まれている場合、前記抗体と試料中
の抗原との間に特異的に抗原抗体反応が生起する。これ
に、更に二次抗体を反応させると、結合された抗原に対
し二次抗体が反応する。しかして、当該二次抗体の結合
したマイクロカプセルは補体活性による溶解作用を受け
て、そこに包含されているマーカー物質が溶出される。

かくして溶出されたマーカー物質を定量して、試料中の
抗原の定量が行われる。なお、試料中にマイクロカプセ
ルに結合した抗体に対応する抗原が含まれていない場合
には二次抗体は結合しないので、補体活性によるマイク
ロカプセルの溶解は生起せず、マーカー物質の溶出も起
こらない。

（ホ）発明の効果本発明の免疫反応系において、夾雑物質（例えば、試料
中の補体、その他の補体活性に影響を及ぼす物質）を含
有する試料を適当な条件で加熱処理することにより、試
料中に含まれる補体を非動化させ、その他の補体活性に
影響を及ぼす物質を失活させることができる。

この結果、非特異反応を抑えることができ、試料中の測
定すべき抗原または抗体の正確な定量が可能となった。

さらに、感度の上昇、精度のばらつき等も改善されうる
。こうして、本発明の方法は、ＭＣＩＡ法にとって、極
めて有用である。

（へ）実施例本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されない
。

実験例１正常２７人から採血した血清試料をそれぞれゼラチン−
ベロナール緩衝液で１０倍に希釈し５６℃の恒温水槽中
で３０分間加熱した。熱処理した試料と熱処理していな
い試料それぞれ２７個を前記のマイクロカプセルを用い
た免疫測定法で測定した。結果を表１に示した。マイク
ロカプセルの表面に結合した抗体と同種の抗原は試料中
に殆ど存在しておらず、測定結果に影響を与えないこと
を確認している。従って、測定結果のばらつきは試料中
の夾雑物質によって生じた非特異反応によるものである
。試料を熱処理したことによってすべての試料で非特異
反応が生じ難くなり、その程度もほぼ同じになることが
わかる。

表　　　１実験例２標準血清に０．０．５、■、２．５．１０．２０．４０
．８０ｎｇ／ｍｊ！となるようにアルファフェトプロテ
ィンを添加し、これをゼラチン−ベロナール緩衝液で１
０倍希釈したものをそれぞれ６０．７０．８０．９０．
１００℃で５分間加熱した。未処理の血清とこれらの熱
処理した血清を試料として表面に抗アルファフェトプロ
ティンを結合したリボソームを用いて免疫測定を行ない
、リボソームの破壊率を測定した（表２）。未処理の血
清では抗原がＯｎｇ／ｍｊ！の試料でもリボソームが２
５％程度破壊されているのに対し、熱処理した試料では
７０℃の場合に７〜８％の破壊率を示し、非常に非特異
反応が抑えられていることがわかる。一方、抗原濃度８
０ｎｇ／ｍ１２の場合のリボソーム破壊率は未処理の試
料で８７％であるのに対し、熱処理温度が８０℃以上の
場合せいぜい１５〜２０％に過ぎず試料中の抗原が変性
したことをうかがわせた。

表　　２添加したモルモット血清の希釈度は２０倍。

各条件の上段は破壊率（％）の平均、下段はａ４偏差を
示した。

−ＡｂＣ：モルモット血清に代えて緩衝液を添加した時
の対照実験例３患者血清７０検体を用いてＲＩＡと前記マイクロカプセ
ルを用いた免疫測定法の相関性を求めた。

ＲＩＡでは通常通り血清試料を熱処理せずに抗原濃度を
測定した。一方、マイクロカプセルを用いた免疫測定法
では血清試料を反応用緩衝液で１０倍希釈した後６３℃
５分間の熱処理を行なった。結果を表３に示した。相関
係数０．９４と良い相関性を示した。

表　　３実施例１　（フェリチンの測定）本実験例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）　、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステ
ロール及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製
のものを用いた。また、Ｎ−サクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート　（ＳＰＤＰ）及び
セファデックスＧ−２５フアインはファルマシア社製の
ものを用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに
使用した。尚、水は全てイオン交換水を用いた。

■官能性リン脂質：ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロピオ
ン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ）の調製密栓付三角フラ
スコにＤ　Ｐ　Ｐ　Ｅ７０ｍｇを分取し、クロロホルム
／メタノール（５：１）混合溶媒２５−に溶解した。次
に、トリエタノールアミン６０μ！及びＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐ
５０ｍｇを添加し、窒素置換した後、室温で１時間反応
させてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ）を
導入した。続いて、ロータリーエバポレータにより溶媒
を除去した。次いで、乾燥物をクロロホルム／メタノー
ル（１０：　１）混合溶媒に溶解した後、シリカゲルカ
ラムを用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収し
た。

更に、ロータリーエバポレータにより約５ｍｆ！まで濃
縮した。ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０乃至９５％であ
った。これを窒素封入して一２０℃で保存した。

この反応によりＤＰＰＥに導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リボソームの調製使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合媒液に溶解した。

５ｍＭのＤＰＰＣ２００ｐｉ！、　ｌｏｍＭのコレステ
ロール１００１！及び１ｍＭのＤＰＰＥ−ＤＴＰ　（■
で得られた官能性リン脂質）５０μｌを１０ｒｎ１１容
量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２−を加
えてよく混合した。次に、約４０℃の水浴中でロータリ
ーエバポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホル
ム２ｍｊ！を加えて十分に撹拌した後、再度ロータリー
エバポレータにより溶媒を除去した。

この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が
形成された。続いて、フラスコをデシケーク中に移して
真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦと記す
）１００μｌを添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後、密栓して約６０℃の水浴中に約１時間浸漬した。つ
づいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサーを用い、フラスコ壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく震盪
した。この操作によりリボソーム懸濁液が調整された。

さらにリボソーム懸濁液に０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
（０，８５％Ｎ　ａ　Ｃｊ！金含有ｐＨ７，５、以下、
ＨＢＳと記す）を少量添加した後、全てを遠心チューブ
に移し、４℃において１５、　ＯＯＯｒｐｍで２０分間
遠心する操作を数回繰返した。

リボソームは湿重量で２５ｍｇとれた。

■リボソーム還元得られたリボソーム２５ｍｇ　（湿重量）に１．５ｍｇ
のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加する。

ＨＢＳＩ−を加え、懸濁後ゆっくり撹拌しつつ２０℃、
２０分間還元処理を行った。その後、リボソームを遠心
分離（１５，００Ｏｒｐｍ、　２０分間）ｔ、ＨＢＳで
３回繰り返し洗浄を行い、過剰のＤＴＴ、並びに分解物
を除去した。

■抗ヒトフェリチン抗体の修飾１ｍｇ／ｍｊ！の抗ヒトフェリチン抗体２ｒｎ！！をＨ
ＢＳで希釈し、１０ｍＭの５ＰＤＰエタノール溶液１０
μβを添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応さ
せ、抗ヒトフェリチン抗体にジチオピリジル基を導入し
た。次に、予めＨＢＳで平衡化したセファデックスＧ−
２５フアインカラム（ゲル体積的１５ｒｄ）を用いたゲ
ル濾過により未反応の５ＰＤＰを除去して精製し、蛋白
質分画のみを回収した。

■抗ヒトフェリチン抗体感作リボソームの調製■で得ら
れた還元リボソームのパックと■で得られた修飾抗ヒト
フェリチン抗体（Ａ２８０　＝１．５）５００μｌを混
合撹拌し、窒素置換した後、密栓して２０℃でゆっくり
振とうしながら１晩反応させた。

次に、ＨＢＳで洗浄して未反応の抗体を除去した。

このようにして得られたリボソーム試薬に、ゼラチンベ
ロナールバッファー（ｐＨ７，４、以下ＧＶＢ−’）２
ｍｌ及び１０％ＮａＮａ２Ｏμｊ！を添加して十分に撹
拌した後、窒素置換して４℃で保存した。

■血清中フェリチン測定 ■で得られた抗ヒトフェリチン抗体感作リボソームを用
い、血清ベースでのフェリチンのドーズ・レスポンスを
調べた。

予め内因性フェリチンを除去した正常ヒトプール血清（
ＮＨ３）に所定量のフェリチンを添加後ＧＶＢ″”（Ｇ
ＶＢ−にＣａイオン、ｊＪｇイオン添加）で１０倍希釈
した。それを検体として用い、６３℃で５分間加熱処理
した後にそれぞれｌＯμｌをマイクロプレートに分注し
た。■で得られた感作リボソーム（１０倍希釈）１０μ
βを加えた後、撹拌して３７℃、１０分間反応させた。

次に１０倍希釈した抗ヒトフェリチン抗体（ウサギ）を
２５μｌ及び２０倍希釈したモルモット補体を２５μｌ
添加し、撹拌後再び３７℃、３０分間反応させた。最後
に０．０１　ＭＥＤＴＡ／ベロナールバッファ（ｐＨ７
，４）　１００μｌで反応を停止させ、各濃度のヒトフ
ェリチン液について、流出したＣＦ量をＭＴＰ　　２２
蛍光分光器（コロナ電気製）により、励起波長４９０ｎ
ｍ　、蛍光波長５３０ｎｍの条件で測定した。

この測定に基づいて、次式により相対蛍光強度を計算し
た。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ　：　ＧＶＢ”
の蛍光強度、Ｆａ：脱イオン水を添加しリボソームを全
て破壊した時の蛍光強度である。尚、標準値として、１
０−７Ｍ及び１０−’ＭのＣＦ溶液の蛍光強度を用いた
。

その結果、フェリチンは１０〜１１０００ｎ／ｍｌに亘
って測定可能であった。また、フェリチン５０ｎｇ／＋
＋ｕ？を測定時の再現性はＣｖ値で５％以下（ｎ＝１０
）であった。

実施例２　　（ＡＦＰの測定）リボソーム感作用抗体として抗ヒトフェリチン抗体の代
わりに抗ヒ）ＡＦＰ抗体Ｆ　（ａｂ’　）２を用い、二
次抗体として抗ヒトフェリチン抗体（ウサギ）の代わり
に抗ヒ）ＡＦＰ抗体（ウサギ）を用い、測定用抗原とし
てフェリチンの代わりにＡＦＰを用いる以外は全て実施
例１に準じて行った。

その結果、ＡＦＰは０．１〜１００　ｎｇ／ｍｆに亘っ
て測定可能であった。また、Ａ　Ｆ　Ｐ２０ｎｇ／ｍｊ
！を測定時の再現性はＣＶ値で５％以下（ｎ＝１０）で
あった。

実施例３　（ＣＥＡの測定）リボソーム感作用抗体として抗ヒトフェリチン抗体の代
わりに抗ヒ）ＣＥＡ抗体Ｆ　（ａｂ’　）ａを用い、二
次抗体として抗ヒトフェリチン抗体（ウサギ）の代わり
に抗ヒ）ＣＥＡ抗体（ウサギ）を用い、測定用抗原とし
てフェリチンの代わりにＣＥＡを用いる以外は全て実施
例１に準じて行った。

その結果、ＣＥＡは２〜１００　ｎｇ／　ｍｅに亘って
測定可能であった。また、ＣＥＡ５ｎｇ／ｍＡを測定時
手続補正書昭和６３年５月３０日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）膜に抗原または抗体を結合すると同時に内部にマ
ーカーを封入したマイクロカプセルと抗原・抗体反応に
より前記膜の溶解を誘起する物質と前記抗原または抗体
と抗原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有する試料を
混合し、そこで生じた抗原抗体反応により生じる膜溶解
作用によるマイクロカプセルの破壊により放出されたマ
イクロカプセル内のマーカーを検出することにより、前
記試料中の抗体または抗原量を測定する免疫測定法にお
いて、試料中の夾雑物質が前記の膜の溶解を誘起する物
質に影響を及ぼさない条件で試料を加熱することを特徴
とする免疫測定法。
（２）測定されるべき試料中の抗原が変性しない条件で
熱処理を行う請求項１記載の免疫測定法。
（３）測定されるべき試料中の抗体の抗体価が低下しな
い条件で熱処理を行う請求項１記載の免疫測定法。
（４）抗原抗体反応によりマイクロカプセル膜の溶解を
誘起する物質が補体であることを特徴とする請求項１記
載の免疫測定法。
（５）マイクロカプセルがリボソームであることを特徴
とする請求項１記載の免疫測定法。