JPS63179254A - 抗原定量方法 - Google Patents
抗原定量方法Info
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- JPS63179254A JPS63179254A JP1088387A JP1088387A JPS63179254A JP S63179254 A JPS63179254 A JP S63179254A JP 1088387 A JP1088387 A JP 1088387A JP 1088387 A JP1088387 A JP 1088387A JP S63179254 A JPS63179254 A JP S63179254A
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-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は被検体中に存在する特定の抗原を高感度で測定
することのできる抗原定量方法に関する。
することのできる抗原定量方法に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患の
臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものとな
っており、この方法は標識法と非標識法とに大別するこ
とができる。
臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものとな
っており、この方法は標識法と非標識法とに大別するこ
とができる。
これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を実
施するためには各種の標識物質(1−カー)、例えばラ
ジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等
が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラジ
オアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソト
ープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能障
害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物質
や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研究
と相俟って一層注目を集めるに至っている。
施するためには各種の標識物質(1−カー)、例えばラ
ジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等
が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラジ
オアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソト
ープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能障
害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物質
や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研究
と相俟って一層注目を集めるに至っている。
螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、現
在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと結合し
なかったものとを分離する工程を必要とするヘテロゾニ
アスな系を使用する方法と、このような分離工程を必要
としないホモゾニアスな系を使用する方法とがある。
在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと結合し
なかったものとを分離する工程を必要とするヘテロゾニ
アスな系を使用する方法と、このような分離工程を必要
としないホモゾニアスな系を使用する方法とがある。
ヘテロゾニアスな系を使用する免疫測定法としてはラジ
オアイソトープ標識免疫測定法においても利用されてい
る2抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物と
既反応物とを分離することを必須とするもので1>、こ
の分離工程の実施が繁雑でアシ、従って定量の迅速化が
困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモゾニア
スな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃す
るととくよる定量の簡便化、迅速化を目的として提案さ
れたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲が
狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化されるに
至っていないのが実情である。
オアイソトープ標識免疫測定法においても利用されてい
る2抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物と
既反応物とを分離することを必須とするもので1>、こ
の分離工程の実施が繁雑でアシ、従って定量の迅速化が
困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモゾニア
スな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃す
るととくよる定量の簡便化、迅速化を目的として提案さ
れたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲が
狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化されるに
至っていないのが実情である。
斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカーを
封入させたり?ソームを調製してこれに抗原又は抗体を
感作させ、この感作す?ソームを検体と共存させてリポ
ソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体
又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複
合体を特異的に破壊させてり?ソームから流出するマー
カーを測定し、一方上記と同様の感作り?ソームを種々
既知量の抗原又は抗体と共存させ且つ上記と同様に流出
マーカーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検
体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて
、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
封入させたり?ソームを調製してこれに抗原又は抗体を
感作させ、この感作す?ソームを検体と共存させてリポ
ソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体
又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複
合体を特異的に破壊させてり?ソームから流出するマー
カーを測定し、一方上記と同様の感作り?ソームを種々
既知量の抗原又は抗体と共存させ且つ上記と同様に流出
マーカーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検
体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて
、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
しかしながら、このり?ソームを用いる免疫測定法にお
いても、検体中の抗原を定量する場合には種々の問題点
があった。
いても、検体中の抗原を定量する場合には種々の問題点
があった。
抗原感作り?ソームを用いる場合は、競合法によって行
われる。この競合法では、検体中のフリーな抗原を抗原
感作り?ソームと一定量の特異抗体存在下で競争させ、
モルモット補体添加により、す?ソームから放出される
マーカーの流出量から検体中の抗原量を測定するもので
ある。従って、これにはり一ソームに感作する抗原量や
特異抗体量など十分に考慮する必要があった。
われる。この競合法では、検体中のフリーな抗原を抗原
感作り?ソームと一定量の特異抗体存在下で競争させ、
モルモット補体添加により、す?ソームから放出される
マーカーの流出量から検体中の抗原量を測定するもので
ある。従って、これにはり一ソームに感作する抗原量や
特異抗体量など十分に考慮する必要があった。
また、抗体感作り?ソームを用いる場合は、抗体として
は、ウサギやヤギに抗原を免疫して得られる?リフロー
ナル抗体をす?ソームに感作していた。しかし、ウサギ
から得られた抗体(IgG分画)をす?ノームに感作し
たものを用いると、す?ソームから非特異的にマーカー
の放出がみられ(モルモット補体の添加により非特異的
にマーカーが放出される)、実際の測定には不適であっ
た。又、ヤギから得られた抗体(IgG分画)をり?ソ
ームに感作したものを用いると、す?ソーム表面で抗原
抗体複合物が形成されても、モルモット補体を活性化せ
ず、補体活性に伴うす?ソーム膜からのマーカー放出は
みられない。
は、ウサギやヤギに抗原を免疫して得られる?リフロー
ナル抗体をす?ソームに感作していた。しかし、ウサギ
から得られた抗体(IgG分画)をす?ノームに感作し
たものを用いると、す?ソームから非特異的にマーカー
の放出がみられ(モルモット補体の添加により非特異的
にマーカーが放出される)、実際の測定には不適であっ
た。又、ヤギから得られた抗体(IgG分画)をり?ソ
ームに感作したものを用いると、す?ソーム表面で抗原
抗体複合物が形成されても、モルモット補体を活性化せ
ず、補体活性に伴うす?ソーム膜からのマーカー放出は
みられない。
これらの点を改良した測定法として、?リフローナル抗
体上用いるサンドインチ法(特開昭60−138465
号)があるが、この方法も2種類の動物に免疫した抗体
を必要とする点、および抗体感作す?ソームと二次抗体
を同時に抗原に添加すると、競争反応によシ抗原測定に
悪影響(例えがフック現象)を及ぼすという点に問題が
あった。
体上用いるサンドインチ法(特開昭60−138465
号)があるが、この方法も2種類の動物に免疫した抗体
を必要とする点、および抗体感作す?ソームと二次抗体
を同時に抗原に添加すると、競争反応によシ抗原測定に
悪影響(例えがフック現象)を及ぼすという点に問題が
あった。
斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、異なるエピトープを認識する2種のモノクローナル抗
体を用いるサンドイツチ法によれば上記欠点が克服され
ることを見出し、本発明を完成した。
、異なるエピトープを認識する2種のモノクローナル抗
体を用いるサンドイツチ法によれば上記欠点が克服され
ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、異なる工ぎトープを認識する2種
類のモノクローナル抗体のうちの一方を固定化した標識
物質封入り?ソームを、抗原を含む被検体、他方のモノ
クローナル抗体及び補体と混合し、次いでり?ノーX内
から溶出した標識物質を定量することを特徴とする抗原
定量方法を提供するものである。
類のモノクローナル抗体のうちの一方を固定化した標識
物質封入り?ソームを、抗原を含む被検体、他方のモノ
クローナル抗体及び補体と混合し、次いでり?ノーX内
から溶出した標識物質を定量することを特徴とする抗原
定量方法を提供するものである。
本発明において、す献ソームとは、赤血球ゴースト膜を
も含む広義の意味を有する。かかるリポソームは、従来
から使用されているものであればいかなるものであって
もよいが、リン脂質又は糖脂質とコレステロールから構
成されるものが好ましい。例えば、リン脂質とコレステ
ロールからり?ソームを合成する場合は、これらの比が
1=1前後にあるとき、安定なり?ソームが得られ易い
。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜
18であることが好ましく、更には偶数であることがよ
り好ましい。
も含む広義の意味を有する。かかるリポソームは、従来
から使用されているものであればいかなるものであって
もよいが、リン脂質又は糖脂質とコレステロールから構
成されるものが好ましい。例えば、リン脂質とコレステ
ロールからり?ソームを合成する場合は、これらの比が
1=1前後にあるとき、安定なり?ソームが得られ易い
。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜
18であることが好ましく、更には偶数であることがよ
り好ましい。
す?ソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度(10−s
M以下)で非常に強い螢光を発するカル〆キシルフルオ
レセインのような螢光性化合物;177ノーム外で酸化
反応によシ発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物:可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物(水溶性色素等);酸化酵素の作
用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をも
たらすグルコース及びシュークロースなどの糖類;テト
ラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性
化合物;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NA
D )のような補酵素類;メチルビオロゲンを初めとす
るラジカル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素
類は本発明においては標識物質として使用しない。これ
らの化合物は、検出方法、感度及びす?ソームの安定性
等の因子ta案した上で、適宜に選択される。
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度(10−s
M以下)で非常に強い螢光を発するカル〆キシルフルオ
レセインのような螢光性化合物;177ノーム外で酸化
反応によシ発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物:可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物(水溶性色素等);酸化酵素の作
用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をも
たらすグルコース及びシュークロースなどの糖類;テト
ラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性
化合物;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NA
D )のような補酵素類;メチルビオロゲンを初めとす
るラジカル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素
類は本発明においては標識物質として使用しない。これ
らの化合物は、検出方法、感度及びす?ソームの安定性
等の因子ta案した上で、適宜に選択される。
本発明で使用される2種類のモノクローナル抗体は、例
えばヒ) CRP抗原をBALB/Cマウスに免疫し、
その牌細胞とマウスミエローマ細胞株MS−1を細胞融
合して得たヒ) CRP抗原に対するモノクローナル抗
体中から異なるエピトープを認識するものを選択採取す
ることによって得られる。本発明において、二次抗体に
使用するモノクローナル抗体はモルモット補体を活性化
できることが必要であるが、す?ソームに感作するモノ
クローナル抗体は補体活性を有さなくてもよ(、Fab
’でもよい。
えばヒ) CRP抗原をBALB/Cマウスに免疫し、
その牌細胞とマウスミエローマ細胞株MS−1を細胞融
合して得たヒ) CRP抗原に対するモノクローナル抗
体中から異なるエピトープを認識するものを選択採取す
ることによって得られる。本発明において、二次抗体に
使用するモノクローナル抗体はモルモット補体を活性化
できることが必要であるが、す?ソームに感作するモノ
クローナル抗体は補体活性を有さなくてもよ(、Fab
’でもよい。
本発明の抗体固定化す?ソームは、例えば次の方法で製
造される。まず、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて
、リポソーム上に固定化される抗体と結合し得る官能基
を脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂質と
コレステロール及び必要であれば他の脂質とをフラスコ
に入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸
引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラス
コ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振と
うし、感作り一ソームの懸濁液を得る。
造される。まず、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて
、リポソーム上に固定化される抗体と結合し得る官能基
を脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂質と
コレステロール及び必要であれば他の脂質とをフラスコ
に入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸
引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラス
コ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振と
うし、感作り一ソームの懸濁液を得る。
一方、す?ソームに固定化すべき抗体と架橋剤とを緩衝
液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要であ
れば、該架橋基を還元する試薬(例えばジチオトレイト
ール;DTT )と更に反応させて、修飾抗体を得る。
液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要であ
れば、該架橋基を還元する試薬(例えばジチオトレイト
ール;DTT )と更に反応させて、修飾抗体を得る。
なお、前記工程で脂質をその活性化剤で処理した場合は
、本工程は不要である。
、本工程は不要である。
最後に1感作り?ソームと修飾抗体と全緩衝液中で反応
せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られ
る。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に固
定化された抗体を担持したマイクロカブセルとして得ら
れる。
せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られ
る。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に固
定化された抗体を担持したマイクロカブセルとして得ら
れる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、N−スク
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
ト(5PDP ) 、N−スクシンイミジル4−(p−
マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB )、N−
スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)アセ
テート(sMPA)、N−スクシンイミジル4−(p−
マレイミドフェニル)fロピオネート(5MPP )、
N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド
(GMBS ) 及ヒN −(ε−マレイミドカシロイ
ルオキシ)スクシンイミド(EMC3)が挙げられる。
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネー
ト(5PDP ) 、N−スクシンイミジル4−(p−
マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB )、N−
スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)アセ
テート(sMPA)、N−スクシンイミジル4−(p−
マレイミドフェニル)fロピオネート(5MPP )、
N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド
(GMBS ) 及ヒN −(ε−マレイミドカシロイ
ルオキシ)スクシンイミド(EMC3)が挙げられる。
本発明方法によって定量可能な抗原としては、例えば腫
瘍マーカー(CRP 、 AFP 、 BFP 。
瘍マーカー(CRP 、 AFP 、 BFP 。
CEA、及びPOA等)免疫グロブリン(工gA。
IgE 、 IgG及びIgM等)、ホルモン(イン7
ユリン、T3及びT4等)及び薬物等が挙げられる。
ユリン、T3及びT4等)及び薬物等が挙げられる。
本発明方法は次の如くして実施される。すなわち、抗体
固定化リポソームを、抗原を含む被検体、他方のモノク
ローナル抗体及び補体と混合し、抗原−抗体と補体との
結合反応を引き起こさせる。すると、かかる反応量に比
例して、す?ソーム内から標識物質が放出されてくる。
固定化リポソームを、抗原を含む被検体、他方のモノク
ローナル抗体及び補体と混合し、抗原−抗体と補体との
結合反応を引き起こさせる。すると、かかる反応量に比
例して、す?ソーム内から標識物質が放出されてくる。
次いで、この標識物質に応じた分析方法(例えば、標識
物質が螢光物質であれば、螢光分析法)により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗体
の量を測定することができる。
物質が螢光物質であれば、螢光分析法)により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗体
の量を測定することができる。
定量操作において使用する補体は、格別限定されないが
、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
次に参考例及び実施例を挙げて説明する。
参考例1(モノクローナル抗体の製造)− ヒトCRP
陽性血清から公知の方法で精製されたヒ) CRP抗原
をBALB/Cマウスに免疫し、その牌細胞とマウスミ
エローマ細胞株MS −1と細胞融合してヒ) CRP
抗原に対するモノクローナル抗体を得た。このようにし
て得られた抗体のうち、本発明に用いることのできると
思われるモノクローナル抗体は5種類であった。これら
について、競合法によるEIAにより、CRP抗原中の
エピトープ認識部位の検討を行った結果、少なくとも異
ったエピトープを認識する2つのグループに分けられた
。
陽性血清から公知の方法で精製されたヒ) CRP抗原
をBALB/Cマウスに免疫し、その牌細胞とマウスミ
エローマ細胞株MS −1と細胞融合してヒ) CRP
抗原に対するモノクローナル抗体を得た。このようにし
て得られた抗体のうち、本発明に用いることのできると
思われるモノクローナル抗体は5種類であった。これら
について、競合法によるEIAにより、CRP抗原中の
エピトープ認識部位の検討を行った結果、少なくとも異
ったエピトープを認識する2つのグループに分けられた
。
これらについて、更に補体活性能を検討して次の結果を
得た。
得た。
実施例1(マーカー封入す−ソームの調製)DPPC(
5mM、 100μj) :Chol (10mM。
5mM、 100μj) :Chol (10mM。
50 uJ) :DTP−DPPE(1mM、 10
uJ) =1 : 1 : 0.02(モル比)(DT
P−DPPEとはゾノQルミトイルホスファチゾルエタ
ノールアミンにアミド結合によりジチオビリゾルを導入
したもの)10−フラスコに上記割合となるように各脂
質を装填し、溶媒のクロロホルムをエバーレータで揮散
させればフラスコ内面にフィルム状物が付着形成される
。このフィルム状物を1〜2時間に亘り真空乾燥した後
に、マーカーとして用いられるカルボキシルフルオレセ
インのQ、l N NaOH溶液100−を添加し、メ
ルチツクスミキサで5〜10分間激しく攪拌する。
uJ) =1 : 1 : 0.02(モル比)(DT
P−DPPEとはゾノQルミトイルホスファチゾルエタ
ノールアミンにアミド結合によりジチオビリゾルを導入
したもの)10−フラスコに上記割合となるように各脂
質を装填し、溶媒のクロロホルムをエバーレータで揮散
させればフラスコ内面にフィルム状物が付着形成される
。このフィルム状物を1〜2時間に亘り真空乾燥した後
に、マーカーとして用いられるカルボキシルフルオレセ
インのQ、l N NaOH溶液100−を添加し、メ
ルチツクスミキサで5〜10分間激しく攪拌する。
次いで、過剰のカル〆キシフルオレセインを100OO
XGで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマ
ーカーとして封入されたり一ソーム(ML、V 屋)が
得られる。
XGで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマ
ーカーとして封入されたり一ソーム(ML、V 屋)が
得られる。
このす?ソームは0.01MのHEPES緩衝液(0,
15M NaCJ、 pH7,45) 500 xl中
に懸濁させて保存しておく。
15M NaCJ、 pH7,45) 500 xl中
に懸濁させて保存しておく。
実施例2(す?ソームの抗体感作)
(a)参考例1で得たマウスモノクローナル抗体ム1を
予めα01 M oHEPES緩衝液で透析処理して得
られる抗体AI (2,0即/xi)La−にQ、 l
mMとなるようにN−ヒドロキシスクシンイミジル−
3−(2−fリジルジチオ)プロピオネート(SPDP
)のエタノール溶液を添加し、時々攪拌しながら室温で
30分間反応させる。次いで、セファデックスG−25
カラムを用いて過剰の5PDPと抗体とを分離させるが
、この際K O,I M酢酸緩衝液(αlsMNaCj
、 pH45)K:緩衝液交換を行うと共に分光光度計
によシ波長280nmで抗体の溶出を確認する(分画量
は11Rtづつン。
予めα01 M oHEPES緩衝液で透析処理して得
られる抗体AI (2,0即/xi)La−にQ、 l
mMとなるようにN−ヒドロキシスクシンイミジル−
3−(2−fリジルジチオ)プロピオネート(SPDP
)のエタノール溶液を添加し、時々攪拌しながら室温で
30分間反応させる。次いで、セファデックスG−25
カラムを用いて過剰の5PDPと抗体とを分離させるが
、この際K O,I M酢酸緩衝液(αlsMNaCj
、 pH45)K:緩衝液交換を行うと共に分光光度計
によシ波長280nmで抗体の溶出を確認する(分画量
は11Rtづつン。
ゾチオピリゾル化した抗体溶液に、50mMになるよう
にジテオスレイトール(DTT )を固形のイ尽添加し
、室温で30分間反応させる。
にジテオスレイトール(DTT )を固形のイ尽添加し
、室温で30分間反応させる。
その後、反応溶液をセファデックスG−25カラムを用
いて処理し過剰の「げと抗体とを分離させるが、この際
に0.OIMのffPE5緩衝液(pH7,5)Kよシ
緩衝液交換を行うと共に分光光度計によシ波長280n
mで抗体の溶出を確認する(分画量は1ゴづつ)。
いて処理し過剰の「げと抗体とを分離させるが、この際
に0.OIMのffPE5緩衝液(pH7,5)Kよシ
緩衝液交換を行うと共に分光光度計によシ波長280n
mで抗体の溶出を確認する(分画量は1ゴづつ)。
次いで、得たるチオール化抗体溶液(1肩9/d)50
0μjを、実施例1で得られたり?ソーム懸濁液500
μノに添加して緩徐に15〜20時間に亘シ攪拌し、遠
心処理すれば、マウスモノクローナル抗体煮1感作り?
ソームが得られる。
0μjを、実施例1で得られたり?ソーム懸濁液500
μノに添加して緩徐に15〜20時間に亘シ攪拌し、遠
心処理すれば、マウスモノクローナル抗体煮1感作り?
ソームが得られる。
斯くして得た抗体感作り一ソームは、17!のゼラチン
−ベロナール緩衝液に懸濁して、4℃にて保存する。
−ベロナール緩衝液に懸濁して、4℃にて保存する。
実施例3(CRPの定量)
希釈には、ゼラチン−ベロナール緩衝液(GVB −)
K O,1mM MgC1z及び0.03 mM C
aCj2を添加した緩衝液(GVB”)を使用した。測
定には、実施例2で調製した抗体感作り?ソーム保存液
をGVB”+で100倍希釈して用いた。
K O,1mM MgC1z及び0.03 mM C
aCj2を添加した緩衝液(GVB”)を使用した。測
定には、実施例2で調製した抗体感作り?ソーム保存液
をGVB”+で100倍希釈して用いた。
又、モルモット補体はGVB!+で1〜5単位になるよ
うに希釈した。二次抗体(マウスモノクローナル抗体I
gG分画;タンノqり濃度zOη/−)は、1000倍
希釈して用いた。測定は次の様に行われた。96穴マイ
クロプレートに、検体(CRP抗原)25μjXt−分
注し、引き続き100倍希釈したり?ソーム懸濁液5μ
lに次抗体25μ!、補体(2単位)25μlの順で分
注する。37℃、1時間反応させた後、補体反応を停止
させるため、10 mM EDTA含有ペロナール緩衝
液100μ!を加える。検体中の抗原量は、す?ソーム
から放出されたカルボキシフルオレセイン量に比例する
ので、490圓で励起し、530nmのケイ光放出量を
測定する。尚、ケイ光強度は、界面活性剤です?ソーム
を破壊して得られるケイ光量を100%として、それに
対するマーカーリリース量で表わした。
うに希釈した。二次抗体(マウスモノクローナル抗体I
gG分画;タンノqり濃度zOη/−)は、1000倍
希釈して用いた。測定は次の様に行われた。96穴マイ
クロプレートに、検体(CRP抗原)25μjXt−分
注し、引き続き100倍希釈したり?ソーム懸濁液5μ
lに次抗体25μ!、補体(2単位)25μlの順で分
注する。37℃、1時間反応させた後、補体反応を停止
させるため、10 mM EDTA含有ペロナール緩衝
液100μ!を加える。検体中の抗原量は、す?ソーム
から放出されたカルボキシフルオレセイン量に比例する
ので、490圓で励起し、530nmのケイ光放出量を
測定する。尚、ケイ光強度は、界面活性剤です?ソーム
を破壊して得られるケイ光量を100%として、それに
対するマーカーリリース量で表わした。
このようKして得られた検量線は第1図のとおりである
。第1図中、・−・は本発明方法、−一1はり?ソーム
感作抗体にマウスモノクローナル抗体、二次抗体にウサ
ギIgG(ポリクローナル抗体)を使用した方法、ムー
ムはす?ソーム感作抗体にヤギポリクローナル抗体、二
次抗体にウサギポリクローナル抗体を使用した方法の検
量線を示す。
。第1図中、・−・は本発明方法、−一1はり?ソーム
感作抗体にマウスモノクローナル抗体、二次抗体にウサ
ギIgG(ポリクローナル抗体)を使用した方法、ムー
ムはす?ソーム感作抗体にヤギポリクローナル抗体、二
次抗体にウサギポリクローナル抗体を使用した方法の検
量線を示す。
第1図から明らかな如く、本発明方法の場合が最も高感
度であることがわかる。
度であることがわかる。
第1図は本発明方法によってCRP抗原を測定したとき
の検量線である。 以上
の検量線である。 以上
Claims (1)
- 1、異なるエピトープを認識する2種類のモノクローナ
ル抗体のうちの一方を固定化した標識物質封入リポソー
ムを、抗原を含む被検体、他方のモノクローナル抗体及
び補体と混合し、次いでリポソーム内から溶出した標識
物質を定量することを特徴とする抗原定量方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1088387A JPS63179254A (ja) | 1987-01-20 | 1987-01-20 | 抗原定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1088387A JPS63179254A (ja) | 1987-01-20 | 1987-01-20 | 抗原定量方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63179254A true JPS63179254A (ja) | 1988-07-23 |
Family
ID=11762716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1088387A Pending JPS63179254A (ja) | 1987-01-20 | 1987-01-20 | 抗原定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63179254A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04303770A (ja) * | 1991-03-30 | 1992-10-27 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 抗原の免疫分析法 |
JP2007131080A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Mazda Motor Corp | 自動車のジャッキ配設構造 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61269070A (ja) * | 1984-12-13 | 1986-11-28 | Nitsusui Seiyaku Kk | 抗原の定量法 |
JPS63120256A (ja) * | 1986-11-07 | 1988-05-24 | Toshiba Corp | 免疫分析用試薬 |
-
1987
- 1987-01-20 JP JP1088387A patent/JPS63179254A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61269070A (ja) * | 1984-12-13 | 1986-11-28 | Nitsusui Seiyaku Kk | 抗原の定量法 |
JPS63120256A (ja) * | 1986-11-07 | 1988-05-24 | Toshiba Corp | 免疫分析用試薬 |
Cited By (2)
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JPH04303770A (ja) * | 1991-03-30 | 1992-10-27 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 抗原の免疫分析法 |
JP2007131080A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Mazda Motor Corp | 自動車のジャッキ配設構造 |
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