JPS61269070A - 抗原の定量法 - Google Patents
抗原の定量法Info
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- JPS61269070A JPS61269070A JP27785685A JP27785685A JPS61269070A JP S61269070 A JPS61269070 A JP S61269070A JP 27785685 A JP27785685 A JP 27785685A JP 27785685 A JP27785685 A JP 27785685A JP S61269070 A JPS61269070 A JP S61269070A
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- Japan
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- antibody
- antigen
- ribosomes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は抗原の定量法に係り、殊にマーカを封入したリ
ボソームに抗体を共有結合により感作さ ・せ、こ
の抗体感作リボソームを検体と共存させて検体中の抗原
により抗原抗体複合体をリボソームに形成させ、この複
合体を特異的に破壊し、リボソームから流出するマーカ
を測定することにより検体中の抗原を定量する方法に係
る。
ボソームに抗体を共有結合により感作さ ・せ、こ
の抗体感作リボソームを検体と共存させて検体中の抗原
により抗原抗体複合体をリボソームに形成させ、この複
合体を特異的に破壊し、リボソームから流出するマーカ
を測定することにより検体中の抗原を定量する方法に係
る。
従って、本発明は各種内分泌疾患、感染症、腫瘍等の診
断目的に利用することができる。
断目的に利用することができる。
（従来の技術）
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患、
感染症、腫瘍等の臨床診断等において欠くべからざる程
に重要なものとなっており、この方法は標識法と非標ｉ
ｉｌ法とに大別することができる。
感染症、腫瘍等の臨床診断等において欠くべからざる程
に重要なものとなっており、この方法は標識法と非標ｉ
ｉｌ法とに大別することができる。
これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を実
施するためには各種の標識物質例えばラジオアイソトー
プ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等が用いられて来
た。標識物質としては感度の点からラジオアイソトープ
が従来汎用されて来たがラジオアイソトープ試薬はその
半減期がある上に不安定であり放射能障害や高価な施設
の使用に問題点があるために、螢光物質や酵素を標識と
する測定法がその感度向上に関する研究と相俟って一層
注目を集めるに至っている。
施するためには各種の標識物質例えばラジオアイソトー
プ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等が用いられて来
た。標識物質としては感度の点からラジオアイソトープ
が従来汎用されて来たがラジオアイソトープ試薬はその
半減期がある上に不安定であり放射能障害や高価な施設
の使用に問題点があるために、螢光物質や酵素を標識と
する測定法がその感度向上に関する研究と相俟って一層
注目を集めるに至っている。
螢光物資又は酵素を標識物資とする免疫測定法には、現
在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと結合し
なかったものとを分離する工程を必要とするヘテロジニ
アスな系を使用する方法と、このような分離工程を必要
としないホモジニアスな系を使用する方法とがある。
在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと結合し
なかったものとを分離する工程を必要とするヘテロジニ
アスな系を使用する方法と、このような分離工程を必要
としないホモジニアスな系を使用する方法とがある。
（発明が解決しようとする問題点）
ヘテロジニアスな系を使用する免疫測定法としてはラジ
オアイソトープ標識免疫測定法においても利用されてい
る２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物と
既反応物とを分離することを必須とするものであり、こ
の分離工程の実施が煩雑であり、従って定量の迅速化が
困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニア
スな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃す
ることによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案さ
れたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲が
狭いために定量用として、実用化されるに至っていない
のが実情である。
オアイソトープ標識免疫測定法においても利用されてい
る２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物と
既反応物とを分離することを必須とするものであり、こ
の分離工程の実施が煩雑であり、従って定量の迅速化が
困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニア
スな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃す
ることによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案さ
れたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲が
狭いために定量用として、実用化されるに至っていない
のが実情である。
従って、本発明が解決しようとする問題点は、ホモジニ
アスな系を使用する免疫測定法、殊に抗原の定量法にお
いて感度を高め且つ測定範囲を広げることにある。
アスな系を使用する免疫測定法、殊に抗原の定量法にお
いて感度を高め且つ測定範囲を広げることにある。
一般にボモジニアスな系を使用して抗原を定量しようと
する場合には、マーカを封入したリボソームに抗原を感
作させ、この抗原感作リボソームと検体中の抗原を試薬
中のフリーな抗体の存在下で競合させて抗原感作リボソ
ームと上記のフリーな抗体とで抗原抗体複合体を形成さ
せ、この複合体の形成されたリボソームを補体により特
異的に破壊して流出するマーカを測定することにより行
われるのが通例であるが、この場合には検体中の抗原冴
とマーカの流出酋は反比例する。この一般的方法は抗原
をリボソームに感作させて用いるために不安定な抗原は
測定対象となし得ない点に問題があり、又測定範囲が狭
い点に問題があった。
する場合には、マーカを封入したリボソームに抗原を感
作させ、この抗原感作リボソームと検体中の抗原を試薬
中のフリーな抗体の存在下で競合させて抗原感作リボソ
ームと上記のフリーな抗体とで抗原抗体複合体を形成さ
せ、この複合体の形成されたリボソームを補体により特
異的に破壊して流出するマーカを測定することにより行
われるのが通例であるが、この場合には検体中の抗原冴
とマーカの流出酋は反比例する。この一般的方法は抗原
をリボソームに感作させて用いるために不安定な抗原は
測定対象となし得ない点に問題があり、又測定範囲が狭
い点に問題があった。
一方、マーカ封入リボソームに抗体を感作させることも
できるが、この抗体感作リボソームを検体と共存させ該
検体中の抗原と上記の抗体感作リボソームとで抗原抗体
複合体を形成させる場合には、この複合体が補体を活性
化しないので、このような方法は抗原の定量法として確
立されていなかった。
できるが、この抗体感作リボソームを検体と共存させ該
検体中の抗原と上記の抗体感作リボソームとで抗原抗体
複合体を形成させる場合には、この複合体が補体を活性
化しないので、このような方法は抗原の定量法として確
立されていなかった。
本発明は、この後者の方法を改善して実用的な抗原定量
法となすものである。
法となすものである。
（問題点を解決するための手段及び作用）本発明によれ
ば、上記の問題点はマーカを封入したリボームに抗体を
共有結合により感作させ、この抗体感作リボソーム及び
フリーの抗体を検体と共存させて検体中の抗原をリボソ
ームに共有結合している抗体とフリーの抗体とでサンド
インチ型の抗原抗体複合体となし、この複合体の形成さ
れたリボソームを補体により特異的に破壊してリボソー
ムから流出するマーカを測定し、この測定値を別途作成
された標準検量線に照合させることにより解決される。
ば、上記の問題点はマーカを封入したリボームに抗体を
共有結合により感作させ、この抗体感作リボソーム及び
フリーの抗体を検体と共存させて検体中の抗原をリボソ
ームに共有結合している抗体とフリーの抗体とでサンド
インチ型の抗原抗体複合体となし、この複合体の形成さ
れたリボソームを補体により特異的に破壊してリボソー
ムから流出するマーカを測定し、この測定値を別途作成
された標準検量線に照合させることにより解決される。
即ち、本発明による定量法の本質的特徴は、マーカ封入
リボソームに抗体を共有結合させた抗体感作リボソーム
を用い、この抗体感作リボソームを検体及びフリーの抗
体と共存させ、リボソームに共有結合した抗体とフリー
の抗体とで検体中の抗原をサンドインチした抗原抗体複
合体を形成し、この複合体によって補体の活性化、延い
てはリボソームの破壊によるマーカの放出をもたらすこ
とにある。
リボソームに抗体を共有結合させた抗体感作リボソーム
を用い、この抗体感作リボソームを検体及びフリーの抗
体と共存させ、リボソームに共有結合した抗体とフリー
の抗体とで検体中の抗原をサンドインチした抗原抗体複
合体を形成し、この複合体によって補体の活性化、延い
てはリボソームの破壊によるマーカの放出をもたらすこ
とにある。
本発明による定量法の実施に際して使用される補体とし
ては適宜動物種のものを用い得るが、力価が高く従って
使用に際しての希釈倍率を著しく高くすることができ（
１００〜２００倍に）、相当して経済的であるためにモ
ルモット補体を用いるのが好ましい。
ては適宜動物種のものを用い得るが、力価が高く従って
使用に際しての希釈倍率を著しく高くすることができ（
１００〜２００倍に）、相当して経済的であるためにモ
ルモット補体を用いるのが好ましい。
本発明により各種の抗原を定量することができる、その
種類に格別の制限はないが、具体例としては例えばウィ
ルス抗原、毒素、癌マーカ、Ｃ反応性蛋白抗原、免疫グ
ロブリン等を挙げることができる。
種類に格別の制限はないが、具体例としては例えばウィ
ルス抗原、毒素、癌マーカ、Ｃ反応性蛋白抗原、免疫グ
ロブリン等を挙げることができる。
尚、上記のサンドイッチ型の抗原抗体複合体を形成する
に当っては、リボソームに共有結合させる抗体源として
山羊のＩｇＧフランクション、山羊のｌ” ａｂ’又は
家兎のＦａｂ’を、又フリーな抗体源として家兎のｌｌ
７Ｇフランクジヨンを用いることができる。
に当っては、リボソームに共有結合させる抗体源として
山羊のＩｇＧフランクション、山羊のｌ” ａｂ’又は
家兎のＦａｂ’を、又フリーな抗体源として家兎のｌｌ
７Ｇフランクジヨンを用いることができる。
リボソームに共有結合させる抗体とフリーの抗体とが共
にモノクローナル抗体であることもでき、又モノクロー
ナル抗体とポリクローナル抗体を組合せて用いることが
できる。リボソームに共有結合させる抗体源としてマウ
スモノクローナル抗体を用い、一方フリーの抗体源とし
てマウスモノクローナル抗体又は家兎ポリクローナル抗
体を用いるのが有利である。リボソームに共有結合させ
るモノクローナル抗体とフリーのモノクローナル抗体と
は、それぞれ異なる抗原決定部位を認識して結合する、
互いに異なるモノクローナル抗体であるのが殊に好まし
い。
にモノクローナル抗体であることもでき、又モノクロー
ナル抗体とポリクローナル抗体を組合せて用いることが
できる。リボソームに共有結合させる抗体源としてマウ
スモノクローナル抗体を用い、一方フリーの抗体源とし
てマウスモノクローナル抗体又は家兎ポリクローナル抗
体を用いるのが有利である。リボソームに共有結合させ
るモノクローナル抗体とフリーのモノクローナル抗体と
は、それぞれ異なる抗原決定部位を認識して結合する、
互いに異なるモノクローナル抗体であるのが殊に好まし
い。
（発明の効果）
本発明方法によれば、抗体をリボソームに共有結合させ
たものを用いて抗原の定量を行なうために比較的不安定
な抗原をも測定対象とすることができる。
たものを用いて抗原の定量を行なうために比較的不安定
な抗原をも測定対象とすることができる。
本発明方法の実施に際１ノで形成されるサンドインチ型
の抗原抗体複合体は補体を活性化してリボソームを破壊
し封入されたマーカを流出させることができ、この場合
には検体中のｉｉｍに比例してマーカの流出量が増加し
、従って測定精度が高く測定範囲も広い。
の抗原抗体複合体は補体を活性化してリボソームを破壊
し封入されたマーカを流出させることができ、この場合
には検体中のｉｉｍに比例してマーカの流出量が増加し
、従って測定精度が高く測定範囲も広い。
本発明方法は、洗浄操作＜Ｂ／Ｆ分離）が不要であるた
めに操作がａｍであり、ウィルス抗原等のように感染の
危険性のある抗原の定量も安全に実施することができる
。
めに操作がａｍであり、ウィルス抗原等のように感染の
危険性のある抗原の定量も安全に実施することができる
。
更に抗体としてモノクローナル抗体を使用すれば特異性
が向上して調定精度を更に高めることができる。
が向上して調定精度を更に高めることができる。
尚、具体例においては、リボソームが多噴膜を有するＭ
ＬＶ型であるが１Ｉｔ１式のしＵｖ又はＳＵＶ型のもの
であっても差支えなく、リボソームに封入されるマーカ
即も標識物質として螢光物質、酵素、酵素関連物質等の
この分野において用いられる任意の物質を用いることが
でき、抗原及び抗体として専らＣ反応性蛋白に由来する
ものが用いられているが、これは任意のものに変するこ
とができ、又、リボソームに抗体を感作させるための試
薬として５ＰＤＰが例示されているがこれは他の任意の
２官能性試薬例えばＮ、Ｎ’ −〇−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ−スクシンイミジル−〇−（Ｎ−マレイミ
ドフェニル）−４−ブチレート、Ｎ −ス／ｌ／ ホス
クシンイミジル−−−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート
等に変することができ、従って本発明方法は汎用性に優
れており、実用性が極めて高いと云う効果をもたらす。
ＬＶ型であるが１Ｉｔ１式のしＵｖ又はＳＵＶ型のもの
であっても差支えなく、リボソームに封入されるマーカ
即も標識物質として螢光物質、酵素、酵素関連物質等の
この分野において用いられる任意の物質を用いることが
でき、抗原及び抗体として専らＣ反応性蛋白に由来する
ものが用いられているが、これは任意のものに変するこ
とができ、又、リボソームに抗体を感作させるための試
薬として５ＰＤＰが例示されているがこれは他の任意の
２官能性試薬例えばＮ、Ｎ’ −〇−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ−スクシンイミジル−〇−（Ｎ−マレイミ
ドフェニル）−４−ブチレート、Ｎ −ス／ｌ／ ホス
クシンイミジル−−−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート
等に変することができ、従って本発明方法は汎用性に優
れており、実用性が極めて高いと云う効果をもたらす。
（実施例等）
次に参考例及び実施例について本発明を具体的に説明す
る。
る。
参考例１（マーカ封入リボソームのＷ４製）ＤＰＰＣ（
５＋ａ Ｍ、 １００ｕｆｌ ） ： ｃｈｏＩ！／（
１０ｍＭ、５０μ悲）：ＤＴＰ−ＤＰＰＥ（１ｍＭ、１
０μ悲）−１：１：０．２（モル比） （ＤＴＰ−ＤＰＰＥとはジホスファチジルエタノールア
ミンにアミド結合によりジヂオピリジルを導入したもの
） １０ｗＱ、フラスコに上記割合となるように各脂質を装
填し、溶媒のクロロホルムをエバポレータテ揮敗させれ
ばフラスコ内面にフィルム状物カ付着形成される。この
フィルム状物を１〜２時間に亘り真空乾燥した後にマー
カとして用いられるカルボキシフルオレセインの０．１
Ｎ ＮａＯＨ溶液１００１１１Ｊを添加し、ポルテッ
クスミキサで５〜１０分間激しく攪拌する。
５＋ａ Ｍ、 １００ｕｆｌ ） ： ｃｈｏＩ！／（
１０ｍＭ、５０μ悲）：ＤＴＰ−ＤＰＰＥ（１ｍＭ、１
０μ悲）−１：１：０．２（モル比） （ＤＴＰ−ＤＰＰＥとはジホスファチジルエタノールア
ミンにアミド結合によりジヂオピリジルを導入したもの
） １０ｗＱ、フラスコに上記割合となるように各脂質を装
填し、溶媒のクロロホルムをエバポレータテ揮敗させれ
ばフラスコ内面にフィルム状物カ付着形成される。この
フィルム状物を１〜２時間に亘り真空乾燥した後にマー
カとして用いられるカルボキシフルオレセインの０．１
Ｎ ＮａＯＨ溶液１００１１１Ｊを添加し、ポルテッ
クスミキサで５〜１０分間激しく攪拌する。
次いで、過剰のカルボキシフルオレセインを１００００
Ｇで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマー
カとして封入されたリボソーム（ＭＬＶ型）が得られる
。
Ｇで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマー
カとして封入されたリボソーム（ＭＬＶ型）が得られる
。
このリボソームはＯ，ＯＩＭのトＩＥＰＥｓＩＩ衝ｗ１
（０，１５Ｍ ＮａＣＱ、、ｐＨ７，４５＞５００μ
悲中に懸濁させて保存してお（。
（０，１５Ｍ ＮａＣＱ、、ｐＨ７，４５＞５００μ
悲中に懸濁させて保存してお（。
１１１Ｌ（リボソームの抗体感作）
ａ）予め０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で透析処理した
２、０＊ｏ／ｓＭのＣ反応性蛋白抗体（山羊ＩＯＧフラ
ンクシジン）１−１に０．１園ＭとなるようにＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピ半一ト（８ＰＤＰ）のエタノール溶液を添加し、
時々攪拌しながら空温で３０分間反応させる。次いで、
セファデックスＧ−２５カラムを用いて過剰の５ｐｏｐ
と抗体とを分離させるが、この際にＯ，ＩＭ酢酸Ｉり衝
液（０，１５Ｍ ＮａＣＱ、、ｐｈ４．５）に緩衝液
交換を行なうと共に分光光度計により波長２８ Ｏｎ＋
＊で抗体の溶出を確認する（分画量は１−Ｑづつ）。
２、０＊ｏ／ｓＭのＣ反応性蛋白抗体（山羊ＩＯＧフラ
ンクシジン）１−１に０．１園ＭとなるようにＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピ半一ト（８ＰＤＰ）のエタノール溶液を添加し、
時々攪拌しながら空温で３０分間反応させる。次いで、
セファデックスＧ−２５カラムを用いて過剰の５ｐｏｐ
と抗体とを分離させるが、この際にＯ，ＩＭ酢酸Ｉり衝
液（０，１５Ｍ ＮａＣＱ、、ｐｈ４．５）に緩衝液
交換を行なうと共に分光光度計により波長２８ Ｏｎ＋
＊で抗体の溶出を確認する（分画量は１−Ｑづつ）。
ジチオピリジル化した抗体溶液に、抗体蛋白の種類にも
依存するが約５（ＩＭとなるようにジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を固形のＲ添加し、室温で３０分間反応させ
る。
依存するが約５（ＩＭとなるようにジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を固形のＲ添加し、室温で３０分間反応させ
る。
その後、反応溶液をセファデックスＧ−２５カラムを用
いて処理し過剰のＤＴＴと抗体とを分離させるが、この
際にＯ，ＯＩＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＥＩ Ｈ７，５＞
により緩衝液交換を行なうと共に分光光度計により波長
２８０ ｎｓで抗体の溶出を確認する（分画量は１−悲
づつ）。
いて処理し過剰のＤＴＴと抗体とを分離させるが、この
際にＯ，ＯＩＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＥＩ Ｈ７，５＞
により緩衝液交換を行なうと共に分光光度計により波長
２８０ ｎｓで抗体の溶出を確認する（分画量は１−悲
づつ）。
次いで、得たるチオール化抗体溶液（１ｍｏ／ｍｅ）５
００μ悲を、参考例１で得られたリボソーム懸ｓ１！５
００μ症に添加して緩徐に１５〜２０時間に亘り攪拌し
、遠心処理すれば所望の抗体感作リボソームが得られる
。
００μ悲を、参考例１で得られたリボソーム懸ｓ１！５
００μ症に添加して緩徐に１５〜２０時間に亘り攪拌し
、遠心処理すれば所望の抗体感作リボソームが得られる
。
抗体感作は、リボソームにおけるＤＴＰ−ＤＰＰＥ成分
の量割合及び感作に用いた抗体の濃度に依存して変化し
、これらを適宜変化させて感作量をダイバインディング
アッセイにより測定してプロットとした結果は第１図に
示される通りであった。
の量割合及び感作に用いた抗体の濃度に依存して変化し
、これらを適宜変化させて感作量をダイバインディング
アッセイにより測定してプロットとした結果は第１図に
示される通りであった。
ｂ）上記ａ項では抗体源として山羊のＩＯＧフラクショ
ンがその侭用いられているが、山羊及び家兎のｆｏＧフ
ラクシミンをペプシン分解し、メルカプトエタノールに
て処理して得たこれらのＦａｂを抗体源として用い上記
ａ項と同様に処理して抗体感作リボソームを１１＠シた
。
ンがその侭用いられているが、山羊及び家兎のｆｏＧフ
ラクシミンをペプシン分解し、メルカプトエタノールに
て処理して得たこれらのＦａｂを抗体源として用い上記
ａ項と同様に処理して抗体感作リボソームを１１＠シた
。
この場合の感作量変化も第１図に示されるものと同様で
ありた。
ありた。
参考例１に記載の方法により調製されたマーカ封入リボ
ソーム（脂質のモル比粗成 ｏｐｐｃ ：ｃｈｏ（Ｌ
：ＤＴＰ−ＤＰＰＥ−１：１ ：０．１０＞にＣ反応
性蛋白抗体を参考例２ａに記載の要領で８０μり／ｍ
Ｑ感作させ且つフリーな抗体源（Ｃ反応性蛋白抗体源）
として家兎のＩａＧフラクション（抗体含有１７．ｏｌ
ｌＪ／一応、希釈倍率１Ｘ １０−３及びｌＸ１Ｏ−２
）を用い、検体中のＣ反応性蛋白抗原を上記のＣ反応性
蛋白抗体感作リボソームと上記のフリーなＣ反応性蛋白
抗体とでサンドインチして抗原抗体複合体を形成させ、
この複合体を力価Ｉ ＣＨ５ｏ及び２’ＣＨ５ｏのモル
モット補体の添加によりそれぞれ破壊させ、この破壊に
よりリボソームから流出するマーカの放出割合と上記の
検体中のＣ反応性蛋白抗原量との関係を調べた処理２８
及び２ｂ図に示される通りであった。
ソーム（脂質のモル比粗成 ｏｐｐｃ ：ｃｈｏ（Ｌ
：ＤＴＰ−ＤＰＰＥ−１：１ ：０．１０＞にＣ反応
性蛋白抗体を参考例２ａに記載の要領で８０μり／ｍ
Ｑ感作させ且つフリーな抗体源（Ｃ反応性蛋白抗体源）
として家兎のＩａＧフラクション（抗体含有１７．ｏｌ
ｌＪ／一応、希釈倍率１Ｘ １０−３及びｌＸ１Ｏ−２
）を用い、検体中のＣ反応性蛋白抗原を上記のＣ反応性
蛋白抗体感作リボソームと上記のフリーなＣ反応性蛋白
抗体とでサンドインチして抗原抗体複合体を形成させ、
この複合体を力価Ｉ ＣＨ５ｏ及び２’ＣＨ５ｏのモル
モット補体の添加によりそれぞれ破壊させ、この破壊に
よりリボソームから流出するマーカの放出割合と上記の
検体中のＣ反応性蛋白抗原量との関係を調べた処理２８
及び２ｂ図に示される通りであった。
これら図から検体中の抗原量に比例してマーカの放出量
が増加し、従ってマーカの流出」を測定することにより
検体中の抗原量を定量し得ること、補体の力価やフリー
抗体の濃度等を制御することにより測定感度を適宜設定
し得ることが判る。
が増加し、従ってマーカの流出」を測定することにより
検体中の抗原量を定量し得ること、補体の力価やフリー
抗体の濃度等を制御することにより測定感度を適宜設定
し得ることが判る。
尚、第２８及び２ｂ図で検体抗１ｉＩｍの測定範囲が３
００ｎｏ／ｓｉまでしか示されていないが約５００ｎＭ
ｌｌ込まで充分に定量可能であった。
００ｎｏ／ｓｉまでしか示されていないが約５００ｎＭ
ｌｌ込まで充分に定量可能であった。
１１１Ｌ
各脂質をＤＰＰＣ：ｃｈｏ？ ： ＤＴＰ−ＤＰＰＥ
−１：１：０．０２のモル比でフラスコに添加し、４０
０単位のグルコースオキシダーゼ溶液を添加し、ポルテ
ックスミキサで５〜１０分間激しく攪拌する。次いで、
未封入のグルコースオキシダーゼを遠心除去すればグル
コースオキシダーゼ封入リボソームが得られる。このリ
ボソームには、参考例２に記載の方法で抗ＣＲＰ山羊１
０Ｇが感作された。
−１：１：０．０２のモル比でフラスコに添加し、４０
０単位のグルコースオキシダーゼ溶液を添加し、ポルテ
ックスミキサで５〜１０分間激しく攪拌する。次いで、
未封入のグルコースオキシダーゼを遠心除去すればグル
コースオキシダーゼ封入リボソームが得られる。このリ
ボソームには、参考例２に記載の方法で抗ＣＲＰ山羊１
０Ｇが感作された。
この抗体感作リボソームを、実施例１におけると同様の
方法で、フリーな抗体としての抗ＣＲＰ家兎Ｉ（ＩＧ及
びＣＲＰ抗原含有検体と共存させ、グルコースオキシダ
ーゼ封入リボソームに感作された抗体とフリーな抗体と
で検体中のＣＲＰ抗原をサンドイッチして抗原抗体複合
体を形成させ、次いでこの複合体にモルモット補体を作
用させて特異的に破壊し、リボソームから流出するグル
コースオキシダーゼの活性を吸光度測定から調べ検体中
のＣＲＰ抗原量との関係をプロットした処、第３図に示
される通りであった。
方法で、フリーな抗体としての抗ＣＲＰ家兎Ｉ（ＩＧ及
びＣＲＰ抗原含有検体と共存させ、グルコースオキシダ
ーゼ封入リボソームに感作された抗体とフリーな抗体と
で検体中のＣＲＰ抗原をサンドイッチして抗原抗体複合
体を形成させ、次いでこの複合体にモルモット補体を作
用させて特異的に破壊し、リボソームから流出するグル
コースオキシダーゼの活性を吸光度測定から調べ検体中
のＣＲＰ抗原量との関係をプロットした処、第３図に示
される通りであった。
この図から、本実施例の方法によるＣＲＰの定量可６Ｍ
範囲は１２．５〜４００ｎａ／ｍ Ｑ、であることが判
る。
範囲は１２．５〜４００ｎａ／ｍ Ｑ、であることが判
る。
哀１」Ｌし
１）マーカ封入リボソームの調製
ＤＰＣＣ：ｃｈｏ７： ＤＴＰ−ＤＰＰＥ−１： １
：０．０４のモル比となるように各脂質をフラスコに添
加し、溶媒のクロロホルムをエバポレータで拡散させれ
ばフラスコ内面にフィルム状物が付着形成される。
：０．０４のモル比となるように各脂質をフラスコに添
加し、溶媒のクロロホルムをエバポレータで拡散させれ
ばフラスコ内面にフィルム状物が付着形成される。
このフィルム状物を減圧下に１〜２時園乾燥させた後に
、マーカとして用いられるカルボキシフルオレセインの
０．ＩＮ ＮａＯＨ溶液１溶液１配０ 激しく攪拌した後に未封入のカルボキシフルオレセイン
を遠心除去すればマーカ封入リボソームが得られる。
、マーカとして用いられるカルボキシフルオレセインの
０．ＩＮ ＮａＯＨ溶液１溶液１配０ 激しく攪拌した後に未封入のカルボキシフルオレセイン
を遠心除去すればマーカ封入リボソームが得られる。
１）抗体のジチオピリジル化
０、０１ＭのＨＥＰＥＳｌｉｉｉ液で透析処理した抗Ｃ
ＲＰ抗体（マウスモノクローナル抗体又は山羊ポリクロ
ーナル抗体のＩａＧフラクション）１。
ＲＰ抗体（マウスモノクローナル抗体又は山羊ポリクロ
ーナル抗体のＩａＧフラクション）１。
０１ｆｆｉに終濃度が１００μＭとなるように５ＰＤＰ
のエタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させ、
次いで０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ Ｈ４．５）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過すれば所望
のジチオピリジル化抗体が得られる。
のエタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させ、
次いで０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ Ｈ４．５）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過すれば所望
のジチオピリジル化抗体が得られる。
ｌ）抗体のチオール化
上記第１１）項で得たジチオビオジル化抗体の溶液に、
５０１Ｍとなるようにジチオスレイトールを添加し、室
温で３０分間反応させ、次いで０．０１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ
−２５カラムでゲル濾過すれば所望のチオール化抗体が
得られる。
５０１Ｍとなるようにジチオスレイトールを添加し、室
温で３０分間反応させ、次いで０．０１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ
−２５カラムでゲル濾過すれば所望のチオール化抗体が
得られる。
ｉＶ）リボソームへの抗体感作
上記第…）項で得たチオール化抗体の溶液に、上記第１
）項で得たマーカ封入リボソーム懸濁液を添加し、緩や
かに１５〜２０時間攪拌し、次いで遠心処理して未結合
の抗体を除去すれば所望の抗体感作リボソームが得られ
る。
）項で得たマーカ封入リボソーム懸濁液を添加し、緩や
かに１５〜２０時間攪拌し、次いで遠心処理して未結合
の抗体を除去すれば所望の抗体感作リボソームが得られ
る。
ψ）ＣＲＰの定量
上記第１ｉｊ）項で得た抗体感作リボソーム及びフリー
な抗体としての抗ＣＲＰマウスモノクローナル抗体又は
抗ＣＲＰ家兎ボリク０ーナル抗体（何れもＩｓ＋Ｇラク
ション）を用い、リボソームに感作 □された抗
体とフリーな抗体とで検体中のＣＲＰをサンドイッチし
て抗原抗体複合体を形成させ、こ ′の複合体に
モルモット補体を作用させて特異的に破壊し流出するマ
ーカの放出割合とＯＲＰＭとのｒｓｅｍ″ゞ・
ｉ尚、リボソームに感作させる
抗体としては、マ □ウスモノクローナル抗体１
（Ｍｌ）を使用し、−゛方フリーな抗体としては上記
のマウスモノクローナル抗体１ （Ｍｌ ）とは異なる
抗原決定部位を認 “臓してＣＲＰと結合するマ
ウスモノクローナル抗体２ （Ｍｌ ） 、このマウス
モノクローナル抗体２ ；（Ｍｌ）と同一の抗原
決定部位を認識するが感度”において異なるマウスモノ
クローナル抗体３（ＭＪ）又は家兎ポリクローナル抗体
（Ｐｒ ）を用い、これらの抗体を各種組合せて試験が
行われた。
な抗体としての抗ＣＲＰマウスモノクローナル抗体又は
抗ＣＲＰ家兎ボリク０ーナル抗体（何れもＩｓ＋Ｇラク
ション）を用い、リボソームに感作 □された抗
体とフリーな抗体とで検体中のＣＲＰをサンドイッチし
て抗原抗体複合体を形成させ、こ ′の複合体に
モルモット補体を作用させて特異的に破壊し流出するマ
ーカの放出割合とＯＲＰＭとのｒｓｅｍ″ゞ・
ｉ尚、リボソームに感作させる
抗体としては、マ □ウスモノクローナル抗体１
（Ｍｌ）を使用し、−゛方フリーな抗体としては上記
のマウスモノクローナル抗体１ （Ｍｌ ）とは異なる
抗原決定部位を認 “臓してＣＲＰと結合するマ
ウスモノクローナル抗体２ （Ｍｌ ） 、このマウス
モノクローナル抗体２ ；（Ｍｌ）と同一の抗原
決定部位を認識するが感度”において異なるマウスモノ
クローナル抗体３（ＭＪ）又は家兎ポリクローナル抗体
（Ｐｒ ）を用い、これらの抗体を各種組合せて試験が
行われた。
結果は第４及び５図に示される通りであり、これからリ
ボソームに感作させる抗体としてモノクローナル抗体を
、又フリーの抗体としてモノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体を用いることにより高感度な測定系をもた
らすことができ、モノクローナル抗体の種類を適宜選択
することにより感度を更に向上せしめ得ることが判明し
た。
ボソームに感作させる抗体としてモノクローナル抗体を
、又フリーの抗体としてモノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体を用いることにより高感度な測定系をもた
らすことができ、モノクローナル抗体の種類を適宜選択
することにより感度を更に向上せしめ得ることが判明し
た。
第１図はリボソームの抗体感作に際してのリボソームの
脂質組成と、抗体濃度と、感作量との関係を示すグラフ
、第２８及び２ｂ図は抗体感作リボソームをフリー抗体
及び抗原含有検体と共存させて形成されたサンドイッチ
型の抗原抗体複合体を補体で破壊させた場合に、リボソ
ームから流出するマーカの放出量と検体中の抗原量との
関係を示すグラフであって、フリーの抗体である家兎Ｉ
ＱＧフランクシコンとして稀釈倍率１０−３及び１Ｑ−
２のものをそれぞれ用いた場合のグラフであり、第３図
はリボソームに封入されるマーカとしてグルコースオキ
シダーピを用い、ＣＲＰ抗原を定量した場合の０ＲＰ１
１と吸光度との関係を示すグラフ、第４図及び５図はカ
ルボキシフルオレセインをマーカとして検体中のＣＲＰ
抗原を定量するに当り、マーカ封入りボンームに感作さ
せる抗体及びフリーの抗体として各種のモノクローナル
抗体を選択してマーカの放出量と検体中の抗原量との関
係を示したグラフである。 特 許 出 願 人 日水製桑株式会社第１図 饗）イ乍１午Ｉ：ム・］る↑代停」セ度（Ａ９／Ｉηｌ
）第４図 ローロ Ｍ＋ −Ｐ。 第き図 フ゛Ｊ−”；Ｃ反ブ七在蛋色餓へ量（ｎｇ／ｍｌ ）第
２ｂ図
脂質組成と、抗体濃度と、感作量との関係を示すグラフ
、第２８及び２ｂ図は抗体感作リボソームをフリー抗体
及び抗原含有検体と共存させて形成されたサンドイッチ
型の抗原抗体複合体を補体で破壊させた場合に、リボソ
ームから流出するマーカの放出量と検体中の抗原量との
関係を示すグラフであって、フリーの抗体である家兎Ｉ
ＱＧフランクシコンとして稀釈倍率１０−３及び１Ｑ−
２のものをそれぞれ用いた場合のグラフであり、第３図
はリボソームに封入されるマーカとしてグルコースオキ
シダーピを用い、ＣＲＰ抗原を定量した場合の０ＲＰ１
１と吸光度との関係を示すグラフ、第４図及び５図はカ
ルボキシフルオレセインをマーカとして検体中のＣＲＰ
抗原を定量するに当り、マーカ封入りボンームに感作さ
せる抗体及びフリーの抗体として各種のモノクローナル
抗体を選択してマーカの放出量と検体中の抗原量との関
係を示したグラフである。 特 許 出 願 人 日水製桑株式会社第１図 饗）イ乍１午Ｉ：ム・］る↑代停」セ度（Ａ９／Ｉηｌ
）第４図 ローロ Ｍ＋ −Ｐ。 第き図 フ゛Ｊ−”；Ｃ反ブ七在蛋色餓へ量（ｎｇ／ｍｌ ）第
２ｂ図
Claims (5)
- （１）マーカを封入したリボームに抗体を共有結合によ
り感作させ、この抗体感作リボソーム及びフリーの抗体
を検体と共存させて検体中の抗原をリボソームに共有結
合している抗体とフリーの抗体とでサンドイッチ型の抗
原抗体複合体となし、この複合体の形成されたリボソー
ムを補体により特異的に破壊してリボソームから流出す
るマーカを測定し、この測定値を別途作成された標準検
量線に照合させることを特徴とする、抗原の定量法。 - （２）補体がモルモット補体であることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項に記載の定量法。 - （３）リボソームに共有結合させる抗体源として山羊の
ＩｇＧフランクション、山羊のＦａｂ′及び家兎のＦａ
ｂ′に何れか１つが用いられ且つフリーな抗体源として
家兎のＩｇＧフランクションが用いられることを特徴と
する、特許請求の範囲第１又は２項に記載の定量法。 - （４）リボソームに共有結合させる抗体源としてマウス
モノクローナル抗体が用いられ、又フリーの抗体源とし
てマウスモノクローナル抗体又は家兎ポリクローナル抗
体が用いられることを特徴とする、特許請求の範囲第１
〜３項の何れか１つに記載の定量法。 - （５）リボソームに共有結合されるモノクローナル抗体
とフリーのモノクローナル抗体がそれぞれ異なる抗原決
定部位を認識して結合する、互いに異なるモノクローナ
ル抗体であることを特徴とする、特許請求の範囲第４項
に記載の定量法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26180684 | 1984-12-13 | ||
| JP59-261806 | 1984-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61269070A true JPS61269070A (ja) | 1986-11-28 |
| JPH0799373B2 JPH0799373B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
ID=17366971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60277856A Expired - Lifetime JPH0799373B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | 抗原の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0799373B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63179254A (ja) * | 1987-01-20 | 1988-07-23 | Nitsusui Seiyaku Kk | 抗原定量方法 |
| JPS63193065A (ja) * | 1987-02-06 | 1988-08-10 | Hitachi Ltd | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
| WO1988008982A1 (en) * | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Teijin Limited | Method for immunoassay utilizing liposome and kit therefor |
| JPS6459070A (en) * | 1987-08-28 | 1989-03-06 | Toshiba Corp | Immunoassay method |
| JPS6479661A (en) * | 1987-09-22 | 1989-03-24 | Nissui Seiyaku Co | Immunological analysis |
| WO1990014435A1 (en) * | 1989-05-01 | 1990-11-29 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
| JPH04303770A (ja) * | 1991-03-30 | 1992-10-27 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 抗原の免疫分析法 |
| WO2002025283A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Instrument de mesure d'immunochromatographie |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60138465A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
-
1985
- 1985-12-12 JP JP60277856A patent/JPH0799373B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60138465A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
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| US5128241A (en) * | 1987-02-06 | 1992-07-07 | Hitachi, Ltd. | Microcapsule immunoassay and reagents therefor |
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| US5173406A (en) * | 1987-05-06 | 1992-12-22 | Teijin Limited | Liposome immunoassay method and kit therefor |
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| WO2002025283A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Instrument de mesure d'immunochromatographie |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0799373B2 (ja) | 1995-10-25 |
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