JPH0949840A - 免疫測定用試薬及び免疫測定法 - Google Patents
免疫測定用試薬及び免疫測定法Info
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- JPH0949840A JPH0949840A JP20208195A JP20208195A JPH0949840A JP H0949840 A JPH0949840 A JP H0949840A JP 20208195 A JP20208195 A JP 20208195A JP 20208195 A JP20208195 A JP 20208195A JP H0949840 A JPH0949840 A JP H0949840A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 干渉物質の影響を抑えて正確に検体中の抗原
濃度を測定することのできる免疫測定用試薬及び免疫測
定法を提供する。 【解決手段】 固相に固定した固定化抗体及び標識抗体
を必須構成成分とする免疫測定用試薬において，α−グ
ロブリン（α-globukin)を干渉抑制剤として配合してな
ることを特徴とする免疫測定用試薬。
濃度を測定することのできる免疫測定用試薬及び免疫測
定法を提供する。 【解決手段】 固相に固定した固定化抗体及び標識抗体
を必須構成成分とする免疫測定用試薬において，α−グ
ロブリン（α-globukin)を干渉抑制剤として配合してな
ることを特徴とする免疫測定用試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，異好性抗体などの
干渉物質の影響を抑えて，正確に抗原濃度を測定するこ
とのできる免疫測定用試薬及び免疫測定法に関するもの
である。
干渉物質の影響を抑えて，正確に抗原濃度を測定するこ
とのできる免疫測定用試薬及び免疫測定法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】血清，血奬，もしくは尿などの排泄物に
含まれている微量物質 (例えば，蛋白質，ぺプチドホル
モン，薬物など) を測定する場合には，被測定物の含有
量が少量であるために，高感度で，かつ特異性の高い測
定法が要求されている。この目的を満たす測定法とし
て，抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られてお
り，免疫測定法は，抗原とそれに対する抗体とが結合す
る反応が極めて特異的で，かつ低濃度でも起こることを
利用したものであり，抗原抗体反応の結果生ずる凝集反
応や，標識抗体あるいは標識抗原を用いたサンドイッチ
法あるいは競合法などによる測定法が知られている。
含まれている微量物質 (例えば，蛋白質，ぺプチドホル
モン，薬物など) を測定する場合には，被測定物の含有
量が少量であるために，高感度で，かつ特異性の高い測
定法が要求されている。この目的を満たす測定法とし
て，抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られてお
り，免疫測定法は，抗原とそれに対する抗体とが結合す
る反応が極めて特異的で，かつ低濃度でも起こることを
利用したものであり，抗原抗体反応の結果生ずる凝集反
応や，標識抗体あるいは標識抗原を用いたサンドイッチ
法あるいは競合法などによる測定法が知られている。
【０００３】そのうちサンドイッチ法は，第一抗体を固
相に固定化した固定化抗体に被測定物質である抗原含有
試料溶液を添加して抗原抗体反応を行ない，次いで，酵
素，化学発光物質，蛍光発色物質，アイソトープなどで
標識した標識抗体 (第二抗体) を抗原抗体反応により抗
原に結合させ，結合した標識抗体の量から抗原の量を測
定する方法である。しかし，サンドイッチ法において
は，第一抗体と第二抗体を橋渡しする物質，例えば異好
性抗体などの干渉物質が存在すると，実際よりも抗原濃
度を多く見積ってしまうために，誤って偽陽性，もしく
は偽陰性と判定してしまうことがあるという問題があっ
た。このような干渉物質は，正常血奬の４０％に含まれ
ていることがボスカト (Boscato)らによって報告されて
いる〔クリニカル ケミストリー（Clin. Chem.) 32,
8, 1492〜1495(1986)〕。異好性抗体による干渉の免疫
応答の原因は今のところ明らかにされていないが，腫瘍
組織に対して薬剤及び放射能を集中させるためにこれら
の抗体を用いたことにより，自然免疫応答の結果として
引き起こされるヒト抗マウス抗体などの発生率の増加に
よるものと考えられている〔臨床化学, 23, 175a-1 - 1
0(1994) 〕。
相に固定化した固定化抗体に被測定物質である抗原含有
試料溶液を添加して抗原抗体反応を行ない，次いで，酵
素，化学発光物質，蛍光発色物質，アイソトープなどで
標識した標識抗体 (第二抗体) を抗原抗体反応により抗
原に結合させ，結合した標識抗体の量から抗原の量を測
定する方法である。しかし，サンドイッチ法において
は，第一抗体と第二抗体を橋渡しする物質，例えば異好
性抗体などの干渉物質が存在すると，実際よりも抗原濃
度を多く見積ってしまうために，誤って偽陽性，もしく
は偽陰性と判定してしまうことがあるという問題があっ
た。このような干渉物質は，正常血奬の４０％に含まれ
ていることがボスカト (Boscato)らによって報告されて
いる〔クリニカル ケミストリー（Clin. Chem.) 32,
8, 1492〜1495(1986)〕。異好性抗体による干渉の免疫
応答の原因は今のところ明らかにされていないが，腫瘍
組織に対して薬剤及び放射能を集中させるためにこれら
の抗体を用いたことにより，自然免疫応答の結果として
引き起こされるヒト抗マウス抗体などの発生率の増加に
よるものと考えられている〔臨床化学, 23, 175a-1 - 1
0(1994) 〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような干渉物質に
よる影響を抑える方法としては，血清などの検体を熱抽
出する方法や，抗原抗体反応を行なう際に，反応溶液中
にマウス血清や，血清成分のうち干渉を抑制すると考え
られている免疫グロブリン (以下，Ｉｇと略記する。)
又はそれを含む画分を加える方法が広く用いられてい
る。また，近年，ＨＢＲ(Human anti-Mouse Antibodies
Blocking Reagent : Scantibodies社製) や，ＭＡＫ３
３ (Boehringer Mannhaim 社製) などの異好性抗体によ
る干渉を抑制することを目的とした異好性阻止試薬が市
販されている。これらの異好性阻止試薬は，異好性抗体
と親和性を持つ抗体からなり，立体的な障害により異好
性抗体が固定化抗体及び標識抗体と結合するのを防いで
いる。
よる影響を抑える方法としては，血清などの検体を熱抽
出する方法や，抗原抗体反応を行なう際に，反応溶液中
にマウス血清や，血清成分のうち干渉を抑制すると考え
られている免疫グロブリン (以下，Ｉｇと略記する。)
又はそれを含む画分を加える方法が広く用いられてい
る。また，近年，ＨＢＲ(Human anti-Mouse Antibodies
Blocking Reagent : Scantibodies社製) や，ＭＡＫ３
３ (Boehringer Mannhaim 社製) などの異好性抗体によ
る干渉を抑制することを目的とした異好性阻止試薬が市
販されている。これらの異好性阻止試薬は，異好性抗体
と親和性を持つ抗体からなり，立体的な障害により異好
性抗体が固定化抗体及び標識抗体と結合するのを防いで
いる。
【０００５】しかし，これらの異好性阻止試薬は，すべ
ての検体に対して干渉抑制作用を示すわけではなく，こ
れらの異好性阻止試薬を単独又は組み合わせて用いて
も，例えばマウス血清を用いた場合には，およそ４％の
検体で干渉物質の影響を抑えることができないことが報
告されている〔クリニカル ケミストリー（Clin. Che
m.) 32, 8, 1492〜1945(1986)〕。また，マウスＩｇと
ＨＢＲ，あるいはマウスＩｇとＰｏｌｙ ＭＡＫ３３
(Boehringer Mannhaim 社製) とを組み合わせても約２
％の検体で干渉物質の影響を抑えることができないとい
う問題点があった。
ての検体に対して干渉抑制作用を示すわけではなく，こ
れらの異好性阻止試薬を単独又は組み合わせて用いて
も，例えばマウス血清を用いた場合には，およそ４％の
検体で干渉物質の影響を抑えることができないことが報
告されている〔クリニカル ケミストリー（Clin. Che
m.) 32, 8, 1492〜1945(1986)〕。また，マウスＩｇと
ＨＢＲ，あるいはマウスＩｇとＰｏｌｙ ＭＡＫ３３
(Boehringer Mannhaim 社製) とを組み合わせても約２
％の検体で干渉物質の影響を抑えることができないとい
う問題点があった。
【０００６】本発明は，干渉物質の影響を抑えて，正確
に抗原濃度を測定することのできる免疫測定用試薬及び
免疫測定法を提供することを目的とするものである。
に抗原濃度を測定することのできる免疫測定用試薬及び
免疫測定法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは，上記課題
を解決するために鋭意検討の結果，従来の免疫測定用試
薬に，α−グロブリンを配合することで, 干渉物質の影
響を抑えることができるということを見出し，本発明を
完成するに至った。
を解決するために鋭意検討の結果，従来の免疫測定用試
薬に，α−グロブリンを配合することで, 干渉物質の影
響を抑えることができるということを見出し，本発明を
完成するに至った。
【０００８】すなわち，第１の発明は，固相に固定した
固定化抗体及び標識抗体を必須構成成分とする免疫測定
用試薬において, α−グロブリンを干渉抑制剤として配
合してなることを特徴とする免疫測定用試薬を要旨とす
るものである。
固定化抗体及び標識抗体を必須構成成分とする免疫測定
用試薬において, α−グロブリンを干渉抑制剤として配
合してなることを特徴とする免疫測定用試薬を要旨とす
るものである。
【０００９】また，第２の発明は，抗原抗体反応を利用
して抗原濃度を測定するに際し，α−グロブリンの存在
下で抗原抗体反応を行うことを特徴とする免疫測定法を
要旨とするものである。
して抗原濃度を測定するに際し，α−グロブリンの存在
下で抗原抗体反応を行うことを特徴とする免疫測定法を
要旨とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下，本発明を詳細に説明する。
本発明の免疫測定用試薬は，固相に固定化した固定化抗
体及び標識抗体を必須構成成分とするものであり，これ
らにα−グロブリンを配合したものである。
本発明の免疫測定用試薬は，固相に固定化した固定化抗
体及び標識抗体を必須構成成分とするものであり，これ
らにα−グロブリンを配合したものである。
【００１１】本発明の試薬においては，α−グロブリン
が抗原抗体反応を行うときに存在するように配合すれば
よく，例えば，固相に固定した固定化抗体，標識抗体，
血清希釈液，標識抗体溶液などに配合すればよい。ま
た，α−グロブリンの配合量としては，抗原と標識抗体
との反応液１ミリリットルに対して０．０５〜１０．０
ｍｇとなるように配合することが好ましく，特に０．１
〜５．０ｍｇとなるように配合することが好ましい。
が抗原抗体反応を行うときに存在するように配合すれば
よく，例えば，固相に固定した固定化抗体，標識抗体，
血清希釈液，標識抗体溶液などに配合すればよい。ま
た，α−グロブリンの配合量としては，抗原と標識抗体
との反応液１ミリリットルに対して０．０５〜１０．０
ｍｇとなるように配合することが好ましく，特に０．１
〜５．０ｍｇとなるように配合することが好ましい。
【００１２】本発明に用いられるα−グロブリンとして
は，市販のものを用いればよく，例えば，α−グロブリ
ン フラクションIV-4（α-GLOBULINS, Fraction IV-4,
由来：牛血液，United Stales Biochemical Corp. 社
製），グロブリン（alpha, Bovine fraction IV, lot.
GA01, 東京化成工業社製) などがあげられる。
は，市販のものを用いればよく，例えば，α−グロブリ
ン フラクションIV-4（α-GLOBULINS, Fraction IV-4,
由来：牛血液，United Stales Biochemical Corp. 社
製），グロブリン（alpha, Bovine fraction IV, lot.
GA01, 東京化成工業社製) などがあげられる。
【００１３】本発明においては，α−グロブリンのほか
に，マウスＩｇやＨＢＲ，ＭＡＫ３３，Poly ＭＡＫ３
３などの干渉抑制剤を配合してもよい。
に，マウスＩｇやＨＢＲ，ＭＡＫ３３，Poly ＭＡＫ３
３などの干渉抑制剤を配合してもよい。
【００１４】本発明に用いられる固相としては，例え
ば, マイクロタイタープレートやポリスチレンビーズな
どがあげられ，固相に固定する抗体を緩衝液に溶解し，
これを固相に接触させて，４℃で一晩以上放置すること
により，固相に抗体を固定化することができる。このと
き，固相に均一にコートされているとは限らないため，
牛血清アルブミンをトリス緩衝液に溶解し，これを固相
に接触させ，同様にしてコートしておくことが好まし
い。固相にα−グロブリンを配合する場合には，トリス
緩衝液に血清アルブミンと同時にα−グロブリンを溶解
し，固定化すればよい。
ば, マイクロタイタープレートやポリスチレンビーズな
どがあげられ，固相に固定する抗体を緩衝液に溶解し，
これを固相に接触させて，４℃で一晩以上放置すること
により，固相に抗体を固定化することができる。このと
き，固相に均一にコートされているとは限らないため，
牛血清アルブミンをトリス緩衝液に溶解し，これを固相
に接触させ，同様にしてコートしておくことが好まし
い。固相にα−グロブリンを配合する場合には，トリス
緩衝液に血清アルブミンと同時にα−グロブリンを溶解
し，固定化すればよい。
【００１５】また，血清希釈液としては，リン酸緩衝液
などの緩衝液が用いられ，血清希釈液にα−グロブリン
を配合する場合には，０．０１〜１．０ｍｇ／ミリリッ
トルとなるように配合すればよい。
などの緩衝液が用いられ，血清希釈液にα−グロブリン
を配合する場合には，０．０１〜１．０ｍｇ／ミリリッ
トルとなるように配合すればよい。
【００１６】標識抗体としては，例えば, アルカリホス
ファターゼやペルオキシダーゼなどの酵素や，蛍光発色
物質，化学発光物質，アイソトープなどで標識したもの
が用いられ，標識抗体にα−グロブリンを配合する場合
には，標識抗体溶液にα−グロブリンを配合するか，標
識抗体を高濃度溶液又は凍結乾燥状態で保存し，標識抗
体希釈液にα−グロブリンを配合しておいて，測定時に
調製して標識抗体溶液としてもよい。この場合の配合量
としては，０．０１〜１．０ｍｇ／ミリリットルとなる
ように配合すればよい。
ファターゼやペルオキシダーゼなどの酵素や，蛍光発色
物質，化学発光物質，アイソトープなどで標識したもの
が用いられ，標識抗体にα−グロブリンを配合する場合
には，標識抗体溶液にα−グロブリンを配合するか，標
識抗体を高濃度溶液又は凍結乾燥状態で保存し，標識抗
体希釈液にα−グロブリンを配合しておいて，測定時に
調製して標識抗体溶液としてもよい。この場合の配合量
としては，０．０１〜１．０ｍｇ／ミリリットルとなる
ように配合すればよい。
【００１７】次に，本発明の免疫測定法について説明す
ると，α−グロブリンの存在下で抗原抗体反応を行うこ
とが必要であり，このα−グロブリンにより，干渉物質
の影響を抑えて，正確に抗原濃度を測定することができ
る。
ると，α−グロブリンの存在下で抗原抗体反応を行うこ
とが必要であり，このα−グロブリンにより，干渉物質
の影響を抑えて，正確に抗原濃度を測定することができ
る。
【００１８】例えば，本発明の免疫測定用試薬を用いて
抗原濃度を測定する場合には，通常の１ステップ法及び
２ステップ法などの手順に従って行えばよい。すなわ
ち，１ステップ法では，抗体を固定化した固相に検体と
標識抗体溶液を加え，インキュベートし（例えば，４〜
３７℃で６０分〜１日間），固相に捕捉されなかった標
識抗体を洗浄して取り除いた後，固相に捕捉された標識
抗体の量を測定する。また，２ステップ法では，抗体を
固定化した固相に検体を加えてインキュベートし（例え
ば，４〜３７℃で３０分〜２時間），固相に捕捉されえ
なかった抗原を取り除く。次に，標識抗体溶液を加えて
再びインキュベートし（例えば，４〜３７℃で３０分〜
２時間），固相に捕捉されなかった標識抗体を洗浄して
取り除いた後，固相に捕捉された標識抗体の量を測定す
る。
抗原濃度を測定する場合には，通常の１ステップ法及び
２ステップ法などの手順に従って行えばよい。すなわ
ち，１ステップ法では，抗体を固定化した固相に検体と
標識抗体溶液を加え，インキュベートし（例えば，４〜
３７℃で６０分〜１日間），固相に捕捉されなかった標
識抗体を洗浄して取り除いた後，固相に捕捉された標識
抗体の量を測定する。また，２ステップ法では，抗体を
固定化した固相に検体を加えてインキュベートし（例え
ば，４〜３７℃で３０分〜２時間），固相に捕捉されえ
なかった抗原を取り除く。次に，標識抗体溶液を加えて
再びインキュベートし（例えば，４〜３７℃で３０分〜
２時間），固相に捕捉されなかった標識抗体を洗浄して
取り除いた後，固相に捕捉された標識抗体の量を測定す
る。
【００１９】標識抗体の量を測定する方法としては，酵
素で標識した場合には酵素活性の測定により測定するこ
とができ，蛍光発色物質で標識した場合には蛍光光度計
により測定することができ，化学発光物質で標識した場
合には酵素を用いた化学発光により測定することがで
き，アイソトープで標識した場合には放射線測定装置を
用いることにより測定することができる。例えば，アル
カリホスファターゼで標識した場合にはｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートを，ペルオキシダーゼで標識した場合
には２’−アジノ−ビ−（３’−エチルベンジルチアゾ
リンスルホン酸）を基質として用い，一定時間反応させ
て生成する生成物の吸収波長の吸光度を測定すればよ
い。
素で標識した場合には酵素活性の測定により測定するこ
とができ，蛍光発色物質で標識した場合には蛍光光度計
により測定することができ，化学発光物質で標識した場
合には酵素を用いた化学発光により測定することがで
き，アイソトープで標識した場合には放射線測定装置を
用いることにより測定することができる。例えば，アル
カリホスファターゼで標識した場合にはｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートを，ペルオキシダーゼで標識した場合
には２’−アジノ−ビ−（３’−エチルベンジルチアゾ
リンスルホン酸）を基質として用い，一定時間反応させ
て生成する生成物の吸収波長の吸光度を測定すればよ
い。
【００２０】本発明において測定対象となる抗原として
は，いかなる抗原でもよく，例えば，インシュリン，Ｈ
ＣＧ−β，成長ホルモン，ＴＳＨ，サイロキシン，トリ
ヨードサイロニン，ガストリン，グルカゴン，ソマトシ
タチンなどのホルモン，エステラーゼ，アミラーゼ，プ
ロテアーゼ，リパーゼ，リボクレアーゼなどの酵素，Ｉ
ｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，糖タ
ンパク質，β2 −マイクログロブリン，ＴＢＧ，糖脂質
などの血清タンパク質，ＣＥＡ，α−フェトプロテイ
ン，フェリチン，ＰＯＡ，ＰＳＡ，ＣＡ１９−９，ＣＡ
１２５などの腫瘍関連抗原，ＤＮＡ結合性タンパク質因
子，インターフェロン，インターロイキン１，インター
ロイキン２などのサイトカイン又は種々の細菌，ウイル
ス，原虫などがあげられる。
は，いかなる抗原でもよく，例えば，インシュリン，Ｈ
ＣＧ−β，成長ホルモン，ＴＳＨ，サイロキシン，トリ
ヨードサイロニン，ガストリン，グルカゴン，ソマトシ
タチンなどのホルモン，エステラーゼ，アミラーゼ，プ
ロテアーゼ，リパーゼ，リボクレアーゼなどの酵素，Ｉ
ｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，糖タ
ンパク質，β2 −マイクログロブリン，ＴＢＧ，糖脂質
などの血清タンパク質，ＣＥＡ，α−フェトプロテイ
ン，フェリチン，ＰＯＡ，ＰＳＡ，ＣＡ１９−９，ＣＡ
１２５などの腫瘍関連抗原，ＤＮＡ結合性タンパク質因
子，インターフェロン，インターロイキン１，インター
ロイキン２などのサイトカイン又は種々の細菌，ウイル
ス，原虫などがあげられる。
【００２１】
【実施例】次に，本発明を実施例によって具体的に説明
する。 参考例１ 入手した検体に異好性抗体が含まれているかどうかをボ
スカト(Boscato L. M.）らの方法〔クリニカル ケミス
トリー（Clin. Chem. ）, 32, 8, 1492 〜1495(1986)〕
を改変した方法で調べた。すなわち，尿中ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンβ分画（β−ＨＣＧ）に対する抗体の代わ
りに，α−フェトプロテイン（以下，ＡＦＰと略記す
る。）の単一のエピトープを認識するモノクローナル抗
体を固定化抗体及び標識抗体の両方に用いて行った。こ
の方法は，固定化抗体と標識抗体のＡＦＰの認識部位が
同一であるため，通常，標識抗体はＡＦＰを介してプレ
ートに結合しないが，異好性抗体が含まれていると両者
の抗体は架橋され，プレートに標識抗体が結合すること
を利用している。
する。 参考例１ 入手した検体に異好性抗体が含まれているかどうかをボ
スカト(Boscato L. M.）らの方法〔クリニカル ケミス
トリー（Clin. Chem. ）, 32, 8, 1492 〜1495(1986)〕
を改変した方法で調べた。すなわち，尿中ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンβ分画（β−ＨＣＧ）に対する抗体の代わ
りに，α−フェトプロテイン（以下，ＡＦＰと略記す
る。）の単一のエピトープを認識するモノクローナル抗
体を固定化抗体及び標識抗体の両方に用いて行った。こ
の方法は，固定化抗体と標識抗体のＡＦＰの認識部位が
同一であるため，通常，標識抗体はＡＦＰを介してプレ
ートに結合しないが，異好性抗体が含まれていると両者
の抗体は架橋され，プレートに標識抗体が結合すること
を利用している。
【００２２】まず，ポリスチレンプレート（Nunc社製）
に，抗ＡＦＰモノクローナル抗体 (コスモバイオ社製 M
O-AFP-P)をホスフェート バッファー サリン（ＰＢ
Ｓ）緩衝液（ｐＨ７．２）に２０μｇ／ミリリットルと
なるように溶解したものを加え，４℃で３日間放置して
抗体をプレートに固定化した抗ＡＦＰモノクローナル抗
体固定化プレートを得た。このプレートにブロッキング
溶液 (ブロックエース :大日本製薬社製) を添加して４
℃で保存した。
に，抗ＡＦＰモノクローナル抗体 (コスモバイオ社製 M
O-AFP-P)をホスフェート バッファー サリン（ＰＢ
Ｓ）緩衝液（ｐＨ７．２）に２０μｇ／ミリリットルと
なるように溶解したものを加え，４℃で３日間放置して
抗体をプレートに固定化した抗ＡＦＰモノクローナル抗
体固定化プレートを得た。このプレートにブロッキング
溶液 (ブロックエース :大日本製薬社製) を添加して４
℃で保存した。
【００２３】一方，抗ＡＦＰモノクローナル抗体に，ジ
メチルフォルムアミドに溶解した無水ｓ−アセチルメル
カプトコハク酸 (東京化成工業製) を室温（約２５℃）
で反応させた後，反応液を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）
Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラムで精製することに
より，チオール基を導入した抗ＡＦＰモノクローナル抗
体を得た。
メチルフォルムアミドに溶解した無水ｓ−アセチルメル
カプトコハク酸 (東京化成工業製) を室温（約２５℃）
で反応させた後，反応液を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）
Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラムで精製することに
より，チオール基を導入した抗ＡＦＰモノクローナル抗
体を得た。
【００２４】また，アルカリホスファターゼ (以下，Ａ
ＦＰと略記する，ベーリンガーマンハイム社製) ３ｍｇ
に，ジメチルフォルムアミド１００マイクロリットルに
溶解した５ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸シクロヘキシ
ルマレイミド (ベーリンガーマンハイム社製) を添加
し，３７℃で１５分間インキュベートした。これを０．
１Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
セファデックス（Sephadex） Ｇ−２５（ファルマシア
社製）カラムに供し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分
収してマレイミド基を導入したＡＬＰを得た。
ＦＰと略記する，ベーリンガーマンハイム社製) ３ｍｇ
に，ジメチルフォルムアミド１００マイクロリットルに
溶解した５ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸シクロヘキシ
ルマレイミド (ベーリンガーマンハイム社製) を添加
し，３７℃で１５分間インキュベートした。これを０．
１Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
セファデックス（Sephadex） Ｇ−２５（ファルマシア
社製）カラムに供し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分
収してマレイミド基を導入したＡＬＰを得た。
【００２５】次いで，標識抗体を得るため，チオール基
を導入した抗ＡＦＰモノクローナル抗体とマレイミド基
導入ＡＬＰとを混合した後，これを０．０５Ｍのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲル
（Ultrogel) AcA 34 （ファルマシア社製）カラムに通
し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分収してＡＬＰ標識
抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。
を導入した抗ＡＦＰモノクローナル抗体とマレイミド基
導入ＡＬＰとを混合した後，これを０．０５Ｍのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲル
（Ultrogel) AcA 34 （ファルマシア社製）カラムに通
し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分収してＡＬＰ標識
抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。
【００２６】次に，抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定化
プレートに８０マイクロリットルのＡＬＰ標識抗ＡＦＰ
モノクローナル抗体溶液及び２０マイクロリットルの血
清を加えて１時間インキュベートした後，トリス緩衝液
（ｐＨ８．５）で洗浄した。これに発色試薬 (DAKO dia
gnostic laboratory社製，商品名：アンパック) を加え
て, 吸光度４９２ｎｍより発色が観察されるかどうかを
調べた。
プレートに８０マイクロリットルのＡＬＰ標識抗ＡＦＰ
モノクローナル抗体溶液及び２０マイクロリットルの血
清を加えて１時間インキュベートした後，トリス緩衝液
（ｐＨ８．５）で洗浄した。これに発色試薬 (DAKO dia
gnostic laboratory社製，商品名：アンパック) を加え
て, 吸光度４９２ｎｍより発色が観察されるかどうかを
調べた。
【００２７】その結果, 血清１２５検体のうち，２５検
体で発色が観察された。
体で発色が観察された。
【００２８】次に，上記の方法で作成した抗ＡＦＰモノ
クローナル抗体固定化プレートに，α−グロブリン０．
５ｍｇ／ミリリットル又はＨＢＲ０．０５ｍｇ／ミリリ
ットルを含むＡＬＰ標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶
液８０マイクロリットルを加え，これに上記で干渉が観
察された血清２５検体のうち２０検体を２０マイクロリ
ットルずつ加えて１時間室温（約２５℃）でインキュベ
ートした。このプレートをトリス緩衝液（ｐＨ８．５）
で洗浄した後，上記の方法と同様にして発色が観察され
るかどうかを調べた。
クローナル抗体固定化プレートに，α−グロブリン０．
５ｍｇ／ミリリットル又はＨＢＲ０．０５ｍｇ／ミリリ
ットルを含むＡＬＰ標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶
液８０マイクロリットルを加え，これに上記で干渉が観
察された血清２５検体のうち２０検体を２０マイクロリ
ットルずつ加えて１時間室温（約２５℃）でインキュベ
ートした。このプレートをトリス緩衝液（ｐＨ８．５）
で洗浄した後，上記の方法と同様にして発色が観察され
るかどうかを調べた。
【００２９】なお，α−グロブリンとしては，United S
tates Biochemical Corp. 製のα−グロブリン（商品
名：α-GLOBULINS, FRACTION IV-4,由来:bobine blood,
lot.■44290)を使用した。
tates Biochemical Corp. 製のα−グロブリン（商品
名：α-GLOBULINS, FRACTION IV-4,由来:bobine blood,
lot.■44290)を使用した。
【００３０】その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１に示すように，α−グロブリンの存在
下で抗原抗体反応を行うことにより，すべての検体にお
いて，異好性抗体の影響を抑えることができることがわ
かる。
下で抗原抗体反応を行うことにより，すべての検体にお
いて，異好性抗体の影響を抑えることができることがわ
かる。
【００３３】実施例１〔カルボハイドレートアンチゲン
１２５（以下，ＣＡ１２５と略記する。）の測定〕，比
較例１，２ まず，標識抗体及び抗体固定化プレートに用いる抗体を
それぞれ抗ＡＦＰモノクローナル抗体から抗ＣＡ１２５
モノクローナル抗体Ｏｖ１８５ＭＡｂ (CanAg社製) 及
びＯｖ１９７ＭＡｂ (CanAg 社製) に代える以外は参考
例１と同様にして，ＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モノクロー
ナル抗体及び抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体固定化プ
レートを作製した。
１２５（以下，ＣＡ１２５と略記する。）の測定〕，比
較例１，２ まず，標識抗体及び抗体固定化プレートに用いる抗体を
それぞれ抗ＡＦＰモノクローナル抗体から抗ＣＡ１２５
モノクローナル抗体Ｏｖ１８５ＭＡｂ (CanAg社製) 及
びＯｖ１９７ＭＡｂ (CanAg 社製) に代える以外は参考
例１と同様にして，ＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モノクロー
ナル抗体及び抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体固定化プ
レートを作製した。
【００３４】下記の成分からなるＣＡ１２５測定用試薬
を調製し，検体中のＣＡ１２５濃度を測定した（実施例
１）。
を調製し，検体中のＣＡ１２５濃度を測定した（実施例
１）。
【００３５】 ・抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体固定化プレート １枚 ・α−グロブリン０．５ｍｇ／ミリリトルを含むＡ ＬＰ標識抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体溶液 ８０マイクロリットル ・洗浄液（トリス緩衝液：ｐＨ８．５） ４００マイクロリットル×６ ・発色試薬（ダコジャパン社製，商品名：アンパック） 試薬Ｓ １００マイクロリットル 試薬Ａ １００マイクロリットル ・０．３Ｍの硫酸 １００マイクロリットル 上記の抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体固定化プレート
に，ＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体溶液を
加え，これに参考例１で発色が観察された血清２５検体
のうち２２検体を２０マイクロリットルずつ加えて１時
間攪拌しながら室温（２５℃）でインキュベートした。
このプレートを洗浄液で洗浄した後，発色試薬を加えて
１０分間インキュベートし，０．３Ｍの硫酸を加えて反
応を停止した後，４９２ｎｍの吸光度を測定した。ＣＡ
１２５の濃度は，ＣＡ１２５濃度既知サンプルを用いて
作成した検量線から求めた。
に，ＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体溶液を
加え，これに参考例１で発色が観察された血清２５検体
のうち２２検体を２０マイクロリットルずつ加えて１時
間攪拌しながら室温（２５℃）でインキュベートした。
このプレートを洗浄液で洗浄した後，発色試薬を加えて
１０分間インキュベートし，０．３Ｍの硫酸を加えて反
応を停止した後，４９２ｎｍの吸光度を測定した。ＣＡ
１２５の濃度は，ＣＡ１２５濃度既知サンプルを用いて
作成した検量線から求めた。
【００３６】その結果を図１に示す。なお，陽性と陰性
を判断するカットオフ値は，健常者群の９５％が陰性と
なる３５．０Ｕ／ミリリットルとした。
を判断するカットオフ値は，健常者群の９５％が陰性と
なる３５．０Ｕ／ミリリットルとした。
【００３７】なお，比較のため，実施例１のα−グロブ
リン０．５ｍｇ／ミリリトルを含むＡＬＰ標識抗ＣＡ１
２５モノクローナル抗体溶液の代わりに，ＨＢＲ０．０
５ｍｇ／ミリリットルを含むＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モ
ノクローナル抗体溶液（比較例１）又はＡＬＰ標識抗Ｃ
Ａ１２５モノクローナル抗体溶液（α−グロブリン及び
ＨＢＲを含まない，比較例２）を含むＣＡ１２５測定用
試薬を調製した以外は実施例１と同様にしてＣＡ１２５
の濃度を測定した。
リン０．５ｍｇ／ミリリトルを含むＡＬＰ標識抗ＣＡ１
２５モノクローナル抗体溶液の代わりに，ＨＢＲ０．０
５ｍｇ／ミリリットルを含むＡＬＰ標識抗ＣＡ１２５モ
ノクローナル抗体溶液（比較例１）又はＡＬＰ標識抗Ｃ
Ａ１２５モノクローナル抗体溶液（α−グロブリン及び
ＨＢＲを含まない，比較例２）を含むＣＡ１２５測定用
試薬を調製した以外は実施例１と同様にしてＣＡ１２５
の濃度を測定した。
【００３８】その結果を図１に示す。図１は，本発明の
ＣＡ１２５測定用試薬と従来のＣＡ１２５測定用試薬を
用いて，検体中のＣＡ１２５濃度を測定したときの結果
を示す図であり，縦軸にＣＡ１２５濃度を示した。
ＣＡ１２５測定用試薬と従来のＣＡ１２５測定用試薬を
用いて，検体中のＣＡ１２５濃度を測定したときの結果
を示す図であり，縦軸にＣＡ１２５濃度を示した。
【００３９】図２に示すように，偽陽性を示す１０検体
のうち，７検体でＨＢＲを含む免疫測定用試薬を用いる
ことにより偽陽性を抑制することができた。また，α−
グロブリンを含む本発明の免疫測定用試薬を用いること
により，すべての検体で偽陽性を抑制することができ
た。この結果から，本発明の免疫測定用試薬を用いると
従来の免疫測定用試薬を用いたときより，正確に抗原
（ＣＡ１２５）の濃度を測定することができることがわ
かる。
のうち，７検体でＨＢＲを含む免疫測定用試薬を用いる
ことにより偽陽性を抑制することができた。また，α−
グロブリンを含む本発明の免疫測定用試薬を用いること
により，すべての検体で偽陽性を抑制することができ
た。この結果から，本発明の免疫測定用試薬を用いると
従来の免疫測定用試薬を用いたときより，正確に抗原
（ＣＡ１２５）の濃度を測定することができることがわ
かる。
【００４０】実施例２，３〔前立腺特異抗原（以下，Ｐ
ＳＡと略記する。）の測定〕，比較例３，４ 抗ＰＳＡモノクローナル抗体 (コスモ ・バイオ社製)
０．６２５ｍｇにクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を添加
して，クエン酸濃度が０．２Ｍになるように調製した。
これにペプシン (シグマ社製) ５０ｎｇを加えて３７℃
で４時間インキュベートして抗体をペプシンで消化した
溶液を得た。この溶液を５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア
社製）に通して脱塩，緩衝液交換を行ない，吸光度２８
０ｎｍで溶出画分を分収し，この溶出画分を上記緩衝液
で平衡化したジエチルアミノエチルセルロール（ＤＥＡ
Ｅ，ファルマシア社製）カラムに通し，素通り画分を回
収してF(ab')2 とした。このペプシン処理抗体F(ab')2
に５Ｍのメルカプトエタノールアミンを加え，還元処理
を行なった後，０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したセファデックス（Sephadex） Ｇ−２５
（ファルマシア社製）カラムに通し，吸光度２８０ｎｍ
で溶出画分を分収し，これをFab'とした。
ＳＡと略記する。）の測定〕，比較例３，４ 抗ＰＳＡモノクローナル抗体 (コスモ ・バイオ社製)
０．６２５ｍｇにクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を添加
して，クエン酸濃度が０．２Ｍになるように調製した。
これにペプシン (シグマ社製) ５０ｎｇを加えて３７℃
で４時間インキュベートして抗体をペプシンで消化した
溶液を得た。この溶液を５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア
社製）に通して脱塩，緩衝液交換を行ない，吸光度２８
０ｎｍで溶出画分を分収し，この溶出画分を上記緩衝液
で平衡化したジエチルアミノエチルセルロール（ＤＥＡ
Ｅ，ファルマシア社製）カラムに通し，素通り画分を回
収してF(ab')2 とした。このペプシン処理抗体F(ab')2
に５Ｍのメルカプトエタノールアミンを加え，還元処理
を行なった後，０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したセファデックス（Sephadex） Ｇ−２５
（ファルマシア社製）カラムに通し，吸光度２８０ｎｍ
で溶出画分を分収し，これをFab'とした。
【００４１】このようにして得られたFab'を参考例１で
得たマレイミド基を導入したＡＬＰと混合した後，５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
ウルトロゲル（Ultrogel）AcA 34（ファルマシア社製）
カラムに通し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分収して
ＡＬＰ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液を得た。
得たマレイミド基を導入したＡＬＰと混合した後，５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
ウルトロゲル（Ultrogel）AcA 34（ファルマシア社製）
カラムに通し，吸光度２８０ｎｍで溶出画分を分収して
ＡＬＰ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液を得た。
【００４２】また，ポリスチレンプレート（Nunc社製）
に，抗ＰＳＡモノクローナル抗体 (コスモ・バイオ社
製）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に２０μｇ／ミリリ
ットルとなるように溶解したものを加え，４℃で３日間
静置して抗体をプレートに固定化した抗ＰＳＡモノクロ
ーナル抗体固定化プレートを得た。このプレートにブロ
ッキング溶液 (ブロックエース :大日本製薬社製) を添
加して４℃で保存した。上記の方法で作成した抗ＰＳＡ
モノクローナル抗体固定化プレートに，α−グロブリン
０．５ｍｇ／ミリリットル（実施例２），α−グロブリ
ン０．５ｍｇ／ミリリットルとＨＢＲ（Scantibodies社
製）０．０５ｍｇ／ミリリットル（実施例３）又はＨＢ
Ｒ０．０５ｍｇ／ミリリットル（比較例３）を含むＡＬ
Ｐ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液及びＡＬＰ標識
抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液（α−グロブリン及び
ＨＢＲを含まない：比較例４）８０マイクロリットルを
加え，これに参考例１で発色が観察された２５検体のう
ち３検体を２０マイクロリットルずつ加えて１時間室温
（２５℃）でインキュベートした。このプレートをトリ
ス緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後，発色試薬として
DAKO diagnostic laboratory社製のアンパックを用い,
４９２ｎｍの吸光度を測定した。ＰＳＡの濃度は，ＰＳ
Ａ濃度既知サンプルを用いて作成した検量線から求め
た。
に，抗ＰＳＡモノクローナル抗体 (コスモ・バイオ社
製）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に２０μｇ／ミリリ
ットルとなるように溶解したものを加え，４℃で３日間
静置して抗体をプレートに固定化した抗ＰＳＡモノクロ
ーナル抗体固定化プレートを得た。このプレートにブロ
ッキング溶液 (ブロックエース :大日本製薬社製) を添
加して４℃で保存した。上記の方法で作成した抗ＰＳＡ
モノクローナル抗体固定化プレートに，α−グロブリン
０．５ｍｇ／ミリリットル（実施例２），α−グロブリ
ン０．５ｍｇ／ミリリットルとＨＢＲ（Scantibodies社
製）０．０５ｍｇ／ミリリットル（実施例３）又はＨＢ
Ｒ０．０５ｍｇ／ミリリットル（比較例３）を含むＡＬ
Ｐ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液及びＡＬＰ標識
抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液（α−グロブリン及び
ＨＢＲを含まない：比較例４）８０マイクロリットルを
加え，これに参考例１で発色が観察された２５検体のう
ち３検体を２０マイクロリットルずつ加えて１時間室温
（２５℃）でインキュベートした。このプレートをトリ
ス緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後，発色試薬として
DAKO diagnostic laboratory社製のアンパックを用い,
４９２ｎｍの吸光度を測定した。ＰＳＡの濃度は，ＰＳ
Ａ濃度既知サンプルを用いて作成した検量線から求め
た。
【００４３】その結果を図２に示す。図２は，本発明の
ＰＳＡ測定法と従来のＰＳＡ測定法によって，検体中の
ＰＳＡ濃度を測定したときの結果を示す図であり，縦軸
にＰＳＡ濃度を示した。また，カットオフ値は，ＰＳＡ
における一般的なカットオフ値である３．０ｎｇ／ミリ
リットルとした。
ＰＳＡ測定法と従来のＰＳＡ測定法によって，検体中の
ＰＳＡ濃度を測定したときの結果を示す図であり，縦軸
にＰＳＡ濃度を示した。また，カットオフ値は，ＰＳＡ
における一般的なカットオフ値である３．０ｎｇ／ミリ
リットルとした。
【００４４】図２に示すように，α−グロブリンの存在
下で抗原抗体反応を行うことにより，すべての検体にお
いて，偽陽性を抑制することができた。
下で抗原抗体反応を行うことにより，すべての検体にお
いて，偽陽性を抑制することができた。
【００４５】
【発明の効果】本発明の免疫測定用試薬及び免疫測定法
によれば，干渉物質の影響を抑えて正確に検体中の抗原
濃度を測定することができる。このため，免疫測定にお
いて問題となっていた偽陽性や偽陰性を抑制することが
できる。
によれば，干渉物質の影響を抑えて正確に検体中の抗原
濃度を測定することができる。このため，免疫測定にお
いて問題となっていた偽陽性や偽陰性を抑制することが
できる。
【図１】本発明の免疫測定用試薬と従来の免疫測定用試
薬を用いて検体中のＣＡ１２５濃度を測定したときの結
果を示す図である。
薬を用いて検体中のＣＡ１２５濃度を測定したときの結
果を示す図である。
【図２】本発明の免疫測定法と従来の免疫測定法で検体
中のＰＳＡ濃度を測定したときの結果を示す図である。
中のＰＳＡ濃度を測定したときの結果を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 固相に固定した固定化抗体及び標識抗体
を必須構成成分とする免疫測定用試薬において，α−グ
ロブリンを干渉抑制剤として配合してなることを特徴と
する免疫測定用試薬。 - 【請求項２】 抗原抗体反応を利用して抗原濃度を測定
するに際し，α−グロブリンの存在下で抗原抗体反応を
行うことを特徴とする免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20208195A JPH0949840A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 免疫測定用試薬及び免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20208195A JPH0949840A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 免疫測定用試薬及び免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949840A true JPH0949840A (ja) | 1997-02-18 |
Family
ID=16451652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20208195A Pending JPH0949840A (ja) | 1995-08-08 | 1995-08-08 | 免疫測定用試薬及び免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0949840A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005156482A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-06-16 | Sysmex Corp | 血液凝固能測定方法および血液凝固能測定用試薬 |
| JP2008249738A (ja) * | 2008-07-18 | 2008-10-16 | Eiken Chem Co Ltd | 免疫反応干渉物質の除去方法 |
-
1995
- 1995-08-08 JP JP20208195A patent/JPH0949840A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005156482A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-06-16 | Sysmex Corp | 血液凝固能測定方法および血液凝固能測定用試薬 |
| JP2008249738A (ja) * | 2008-07-18 | 2008-10-16 | Eiken Chem Co Ltd | 免疫反応干渉物質の除去方法 |
| JP4657328B2 (ja) * | 2008-07-18 | 2011-03-23 | 栄研化学株式会社 | 免疫反応干渉物質の除去方法 |
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