JPH0467150B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫検定法に関する。さらに詳しくは
本発明は免疫グロブリンの断片を使用する免疫検
定法に関する。 本発明者らはその英国特許出願第2013211A号
明細書において、体液中の抗原（この用語にはハ
プテンも含む）をこの抗原に対して特異的な免疫
グロブリンのＦ（ab′）₂断片と反応させ、その際反
応は（全）免疫グロブリンおよびそのＦ(c)断片の
実質的不在において行なうことから成る免疫検定
法について記載した。詳細は前記明細書を参照す
べきであるが、全免疫グロブリンの代りに（そし
てＦ(c)断片の不在において）Ｆ（ab′）₂断片を使用
する主要な目的および利点は、検定において、い
ずれもヒト血清中に存在することのあるリウマチ
様因子（RF）およびc1g（補体の成分）による干
渉を防止することである。 前記の方法は特に粒子凝集検定において有用で
あるが、検定、特にヒト血清の検定においては他
の種類の干渉も生じ得る。例えば非特異的粒子凝
集が一般的に血清タンパクの存在によつて生ずる
ことがあり、本発明者らはこれを酵素的消化作用
によつて克服する方法を記載した（本発明者らの
ヨーロツパ特許第51985号明細書参照）。一般の血
清タンパクによる干渉防止のための酵素的消化作
用の使用は、検定すべき抗原（またはその抗原の
所定断片−ヨーロツパ特許第51985号明細書）が
酵素に対して安定な場合にのみ、例えばペプシン
を酵素として使う場合はチロキシンまたはプロゲ
ステロンのような抗原に対する検定においての
み、実施可能である。血清タンパクによる干渉を
減少または防止する別の方法としてはケイオトロ
ピツク剤（chaotropic agent）を使用する方法が
ある（本発明者らはヨーロツパ特許第38181号明
細書参照）。この方法はひろく応用し得るもので
あるが比較的凝集力の弱い場合に限られ、このた
め検定の精度が低くなり得る。 周知の通り免疫検定の技術においては抗血清
（検定すべき特定の抗原に対する）を動物源から
取得するのが常法であつて、最も普通の供給源は
ウサギ、ヤギおよびヒツジである。動物源からの
抗体を使用するヒト血清中の抗源の検定において
は、患者の中には動物免疫グロブリンに対する抗
体を持つ者があるため、干渉が生ずることがしば
しばある。この問題を処理するのに、ヒト血清に
大量の動物免疫グロブリン（ただ検定すべき抗源
に対して特異的でないもの）を加え、これにより
ヒト血清中に存在して得る、動物免疫グロブリン
と反応性の抗体を反応させ、その後の検定におい
て干渉を生じ得ないようにすることは知られてい
る。 本発明者らは、粒子凝集検定における干渉防止
のために前記の予防を行なつた場合でも、ある種
の検定において１−２％もの血清について得られ
た結果の誤差が非常に大きいことが見いだした。
発明者は鋭意研究の結果、この誤差が従来知られ
ていないそして全く予期されなかつた事実による
ことを知つた。すなわちヒト血清のあるものは、
動物（ヒト以外）の全免疫グロブリンとは反応性
がないがそのＦ（ab′）₂断片とは反応性がある抗体
を含むことがある事実を見いだした。従来は、あ
る特定の種の中では、Ｆ（ab′）₂断片との反応する
が全免疫グロブリンとは反応しない抗体が存在し
得ることが知られていた。しかしこの効果は単一
の種の中でのみ起り全く異なる二つの種の間では
起り得ないと常に信じられてきた（例えば、M.
Waller、American Journal of Medicine、54
巻、1973年６月、731ページ参照）ので、実に驚
くべきことである。 さらに本発明者らは、検定すべき生物体液（例
えばヒト血清）源となる異なる種の動物源から導
いたＦ（ab′）₂断片を使用する検定において、前記
の効果により誤差が生じ得ることを確めた。 さらにまた、ヒト血清中にヒト以外のＦ（ab′）₂
断片と反応する抗体が含まれているときは、これ
らの抗体はまた（弱くではあるが）他の（ヒト以
外の）免疫グロブリンのFab断片とも反応するも
ののようである。従つて一般に、抗体の（Ig−マ
イナス−Fc）断片（Igは免疫グロブリンを意味
する）を使用する免疫検定は、異種の動物からの
これに対する抗体との反応の可能性があるために
干渉が起り得ることがわかる。（Ig−マイナス−
Fc）抗体断片を使用する免疫検定において生じ
得る干渉のこの原因は、前記の通りこの種類の異
種間相互作用は決して生じないものと考えられて
いたので、従来は全く気づかれていなかつた。 従つて本発明は、第一の動物種からの生物体液
中の免疫原を免疫検定するにあたり、検定反応混
合物中の前記被検定免疫原成分に対して免疫的に
特異的である、第二の動物種からの免疫グロブリ
ンのうち、その完全体（全免疫グロブリン）およ
びそのＦ(c)断片の不在下に、その（Ig−マイナス
−Fc）断片（以下特異的断片と称する）を反応
体として使う方法において、 前記第一の動物種の生物体液中に存在し、前記
特異的断片に対して反応する第一の動物種の抗体
と、前記特異的断片との反応による、検定への干
渉を防止または減少させる工程を含む免疫検定法
を提供するものである。 本発明の方法において、使用する『特異的断
片』は反応混合物の被検定成分に対して免疫的に
特異的である免疫グロブリン（通常IgGであるが
必ずしもそれに限らない）から導かれる。従つて
例えばその断片は検定すべき免疫原に対し免疫的
に特異的であつて、これと直接反応するものであ
つてもよい。あるいはまた、その断片は反応混合
物中の別の成分、例えば、免疫原に応じた量で生
成するかまたは存在する成分に対し特異的であつ
てもよく、従つて免疫原は断片と直接反応するの
でなく間接的に検出または定量されるものであつ
てもよい。 好ましい（Ig−マイナス−Fc）断片はIgGのＦ
（ab′）₂断片であるが、この分野において周知の通
り、他の断片例えばFab′またはFab断片も（IgG
以外の免疫グロブリンからの断片も同様）免疫検
定において全免疫グロブリンの代りに、時に使用
することができる。 本発明の方法においては、『特異的断片』と被
検定試料中の第一の種のこれに対する抗体（これ
は本質的にIgMであろう）との間の反応によつて
生ずる干渉は防止または少くとも実質的に減少す
る。これを行なうには数種の方法がある。本発明
において好ましい方法は、それ自体は検定におい
て全く干渉を生ぜず、第一の種の干渉性抗体を選
択的に不活性化する一種以上の物質で被検定試料
を処理することである。反発明のきわめて好まし
い特徴によれば、ある種の（Ig−マイナス−Fc）
断片、好ましくはここで『非特異的断片』と称す
るＦ（ab′）₂断片がこの目的に使用される。『非特
異的断片』と『特異的断片』との区別は次の通り
である。 『特異的断片』は検定すべき第一の動物種の免
疫原（または反応混合物の他の成分）とも、第一
の動物種のそれ（『特異的断片』）に対する抗体
（この抗体の存在によつて干渉が生ずる）とも反
応することのできる第二の動物種の（Ig−マイナ
ス−Fc）断片であり； 『非特異的断片』は前記免疫原とは反応できな
いが第一の動物種の前記抗体とは反応することの
できる第二の種の（Ig−マイナス−Fc）断片で
ある。 従つて、検定すべき試料を『非特異的断片』で
処理することによつて、試料中に存在する、第二
の種の断片に対する第一の動物種の前記抗体はそ
の『非特異的断片』と結合するため検定時に『特
異的断片』と反応して干渉を起すことができなく
なる。 周知のように、Ｆ（ab′）₂断片は二価の免疫グロ
ブリン断片である。しかし、それに対する第一の
種の抗体のあるものは二価（すなわちIgG）であ
るが、一部は確かに多価（IgM）であろう。『非
特異的断片』と称する第一の種の抗体との間の結
合効率を改善するためには、凝集された『非特異
的断片』を使用する方が好ましい。というのは後
者は多価であつてそれに対するIgM抗体の結合効
率がより大きいからである。 『非特異的断片』は熱によるかまたは化学的に
凝集させることができ、どちらの場合も緩衝液に
可溶である。熱凝集体は高度希釈時にあ長期間で
は不安定であるので化学的に凝集した『非特異的
断片』を使用する方が好ましい。熱凝集および化
学的凝集断片の調製はいずれも当業界において公
知であり文献に記載されている。 凝集した非特異的断片の使用がきわめて好まし
いが、その代わりに非特異的断片を例えば固形不
溶性支持体または可溶性物質例えばタンパクと結
合させることも可能である。適当な固形支持体と
しては例えばポリエスチレン、セフアロースまた
はポリアクリルアミドが挙げられる。 本発明の方法を非特異的断片を使用して行なう
ときは、『特異的断片』と同一の動物源から得る
ことが好ましい。例えば非特異的断片を好ましく
は免疫されていないウキギから得、次にそのウサ
ギを免疫して特異的断片を得る。しかし実際には
例えば免疫全のウサギと免疫後のウサギから採つ
た血液試料を混注して断片を得るのが最良であ
る。この操作により、ある特定の動物個体からの
非特異的断片が第一の種（通常、ヒト）の抗体に
対して（正常よりも）反応性が弱い場合に生じ得
る問題を防止することができる。 前記のように本発明においては『非特異的断
片』の使用がきわめて好ましいが、それだけに限
定されるものではない。第一の種の抗体と『特異
的断片』との反応によつて生ずる干渉を除去また
は減少するために、前記抗体を選択的に不活性化
するか試料から除去することができるようなその
他の物質または技術、例えばケイオトロピツク剤
の使用、酵素的消化またはジスルフイド橋の還元
によるIgM抗Ｆ（ab′）₂抗体の破壊等を含む、他の
試薬または技術を使用することができる。 本発明の方法において、好ましい『非特異的断
片』を使用する具体的方法は種種であつてよい。
例えば、凝集された『非特異的断片』を単に生物
体液と混合して、検定中の液体中に残してもよ
く、また除去してもよい。これよりは好ましくな
いが別の方法としては検定前に生物体液を凝集さ
れた『非特異的断片』と、または例えば固相支持
体上に固定した『非特異的断片』と接触させて予
備処理することである。例えばこのような材料を
つめたカラムを使用することができる。 本発明の方法は粒子凝集検定法に有用ではある
が、（Ig−マイナス−Fc）断片を反応体として使
用する他の免疫検定にも使用することができ、例
として本発明者らの英国特許第2013211A号およ
び2045431A号明細書および米国特許第4184849号
明細書が挙げられる。いずれの場合も本方法を手
動的にも、または自動連続的または半連続的にも
実施することができる。 好ましい粒子凝集検定法においては、抗原の検
定は『特異的断片』を担持した微細に分散したラ
テツクス往子と抗原とを混合することによつて行
なわれる。抗原の存在量に応じた程度の粒子凝集
が起る。凝集せずに残つた粒子数を数えることに
より抗原の存在量が測定できる。この一般的方法
は、種々に改変し得るが、当業界において周知で
あるのでこれ以上は記載しない。 本発明の方法は（粒子凝集検定に適用するにせ
よ他の検定に適用するにせよ）免疫原一般の検定
に広く適用することができる。本方法はヒト血清
中のアルフアフエトタンパク、フエリチン、ヒト
胎盤ラクトゲン、チロキシン結合グロブリンの検
定および、強いケイオトロピツク剤を使用すると
抗原の減衰が生ずるような種々の物質の検定にお
いて特に有用である。そのような物質とてしては
刺激ホルモン（甲状腺刺激および卵脆刺激ホルモ
ン等、）酸素（酸性ホスホターゼ）およびある種
の大型ウイルス抗原が挙げられる。 本発明をさらに完全に理解できるようにするた
め、例として次の実験結果を示す。 １ 凝集たウサギのＣ（ab′）₂ (a) ウサギのＦ（ab′）₂断片本発明者らの英国特
許第2013211A号明細書の記載と同様にして
得た。 (b) 熱凝集断片は単に30分間63℃で加熱するこ
とによつて調製した。 (c) 化学的凝集断片は次のようにして調製し
た：重炭酸塩緩衝液（0.1N NaHCO₃、PH
8.8）中にＦ（ab′）₂（ウサギ）５−10mg／mlを
含有する溶液にグルタルアルデヒドの25％溶
液を加え最終反応成分濃度を0.5％とした。
混合物を室温（約25℃）に30分間かきまぜな
がら保温し次に等容量の2.5％エタノールア
ミン（PH8.5）を加えて反応を停止した。次
に混合物をグリシン−緩衝塩液（GBS）に
対して十分に透析し、得られた凝集したＦ
（ab′）₂を、混注正常ウサギ血清10％を含有す
るグルシン−緩衝塩液に希釈し、凝集したＦ
（ab′）₂濃度0.1mg／mlとした。検定用の血清
は上記混合物中に１：10に希釈した。 ２ Ｆ（ab′）₂断片を使用する検定において、第二
の種（この場合ウサギ）の断片と第一の種（こ
の場合ヒト）のこれに対する抗体との間の相互
作用により干渉が起ることを示すために、アル
フアフエトタンパクの測定用に開発した検定法
を使用して次の試験を行なつた。ウナギの抗ヒ
ト−アルフアフエトタンパク免疫グロブリンを
処理してそのＦ（ab′）₂断片（『特異的断片』）を
調製した。まず、『非特異的断片』で被覆した
ラテツクス粒子をアルフアフエトタンパクの不
在において凝集させる血清を識別するために約
200の血清を予備検査した。この目的のため、
非免疫ウサギからＦ（ab′）₂断片（すなわち『非
特異的断片』）を調製し、これらを免疫したウ
サギからの血清を使用するラテツクスの標準的
な調製におけるのと同様な方法で同量、ラテツ
クスに共有結合的に結合させた。従来技術の知
見によれば、このようなラテツクスはRFまた
はC1qの存在においても血清中で凝集するとは
予想されなかつた。結果を第１図に示す。図に
は16の血清のそれだれについて４種の粒子計数
値が示されており、これら16の血清は干渉がお
きることを示したものである。図において各試
料には番号を付してある。各試料につき粒子係
数は次のように行なつた：左から一番目の柱状
図：『非特異的断片』を担持したラテツクス粒
子を0.27M BSA／GBS（BSAはウシ血清アル
ブミンを意味する）の血清と混合したときの計
数値。 左から二番目の柱状図：正常ウサギ血清
（NRS）をも含む場合の計算値。 左から三番目の柱状図：『非特異的断片』を
担持したラテツクス粒子を血清（0.27M
BSA／GBS中）と混合し、凝集した『非特異
的断片』も加えた場合の計数値。 右から一番目の柱状図：左から三番目の柱状
図の場合にさらに正常ウサギ血清も含めた場合
の計数値。 計数されるのは非凝集粒子であるので、粒子
計数値が大きい程干渉が少いことを意味する。 第１図に示すように16個の血清は非常に凝集
の著しいもの（No.51、76）から軽いもの（No.
43、146）まで種々の程度の凝集を示した（そ
れぞれの番号の左から一番目の柱状図）。左か
ら二番目の柱状図から、正常ウサギ血清の添加
（試料の10％）で相当程度干渉が減少している
のは一つの試料（No.76）だけであること、一方
左から三番目の柱状図から、ウサギＦ（ab′）₂凝
集体（0.1mg／ml）の添加により二例（No.144、
100）を除く全部で干渉が実質的に除かれてい
ることが認められる。正常ウサギ血清の添加
（右から一番目の柱状図）ではどの血清におい
ても干渉は完全には除去されない。 従つて、『非特異的断片』で被覆されたラテ
ツクスは（ある種の血清中で）凝集されるこ
と、しかしこの凝集は混合物中に凝集された
『非特異的断片』を加えることによつて防止で
きることがわかる。正常ウサギ血清の添加の効
果は小さく、これは凝集が実際、ウサギのＦ
（ab′）₂断片とは反応するがウサギの全免疫グロ
ブリンとは反応しない（ヒト血清中の）抗体に
よつて引き起されることを示している。 他の種からの免疫グロブリンもこの干渉の除
去に有効か否かを検討するため、ヤギＦ
（ab′）₂、ヒトＦ（ab′）₂（凝集したものおよびし
ていないもの）、凝集したヒトIgGおよび凝集
したウサギIgGを試験した。ヒトIgGもウサギ
IgGも（凝集したものもしていないものも）、
またヤギＦ（ab′）₂も干渉を除去しなかつた。ヒ
トＦ（ab′）₂は若干の血清には有効であつたが、
他の血清に対しては効果が認められなかつた。 ３ 干渉がIgG抗体によるかIgM抗体によるかを
決定するため、非特異的断片によつて強い干渉
を示す前記のうちの三つの血清を0.3％ｗ／ｖ
のジチオトレイトール（DTT）で37℃で10分
間処理しIgMを破壊した。ヤギの抗ヒトIgM血
清を干渉を示すこの三つの血清に添加すると三
つの血清のうち二つは干渉がなくなつた。
DTT処理後に干渉がなくなつたのと同じ二つ
血清がこの実験で干渉がなくなつた。従つて干
渉は明らかにIgGおよびIgMであつた。 ４ 凝集していないＦ（ab′）₂の効果を凝集したも
のと比較測定するためにさらに一つ実験を行な
つた。非特異的断片により凝集を示す六つの血
清を、熱的または化学的に凝集したＦ（ab′）₂、
または凝集していない非特異的断片的によつて
処理した。非凝集断片は前記の場合よりも２−
３倍高い濃度において干渉をかなり減少させた
が完全にはなくならなかつた。化学的に凝集し
た非特異的断片の方が熱凝集したものよりわず
かに効率が良く安定性がよいので好ましい。 ５ 本発明の方法を粒子凝集検定においてさらに
説明するため、約40づつ３系列の血清について
アルフアフエトタンパクの分析を行なつた。結
果を第１表に示す： (1) 第１欄は″ダイナボツトAFPキツト″
（Dinabot AFP Kit）（アボツト研究所）を
使用するRIA（放射線免疫検定法）による。 (2) 第２欄は、凝集したＦ（ab′）₂不使用で、正
常ウサギ血清を含有するグリシン緩衝塩溶液
（GBS／NRS）使用のPACIA（粒子計数免疫
検定法による検定装置）による。 (3) 第３欄はGBS／NRS中凝集Ｆ（ab′）₂使用
のPACIAによる。 (4) 第４欄は非免疫ウサギＦ（ab′）₂担持ラテツ
クスを使用し、自己凝集干渉を示す（結果は
応答曲線の低下％で示す）。緩衝液は前記(2)
と同じである。 (5) 第５欄は、前記(4)と同様であるが緩衝液中
にＦ（ab′）₂を使用する。 Ｆ（ab′）₂凝集体がすべての干渉を完全に除
去できなかつたのは２列のみである（210581
−24、−27）。臨床的には残りの干渉は重要で
ない。 第２図に凝集Ｆ（ab′）₂を使用しない陽性血
清30試料の検定結果（PACIA対RIA）を示
す（ｒ＝0.97、ｙ＝0.79x＋16.2）。これと比
較するために凝集Ｆ（ab′）₂を使用した同じ血
清の検定結果を第３図に示す（ｒ＝0.99、ｙ
＝0.85x＋0.2）。相関性および傾斜は明らか
に改善されている。 ６ 本発明をさらに説明するため、妊娠第16週の
女子からの血清99についてアルフアフエトタン
パクを分析し、結果を第２表に示す。表中にお
いて： Ａ欄は試料番号であり、 Ｂ欄は妊娠期間（週）であり、 Ｃ欄は放射免疫検定法により測定したアルフア
フエトタンパクであり、 Ｆ欄は本発明によらない二つの粒子凝集検定
（D.E）の結果の平均値であり、 Ｉ欄はＤおよびＥと同様にであるが本発明に従
つて凝集Ｆ（ab′）₂断片を加えて行なつた二つの
粒子凝集検定（G.H）の結果の平均値である。 本発明に従つてＦ（ab′）₂凝集体を使用するこ
とによる改善は次の統計的数値により示され
る： RIAによる平均値 ：34.6mg／ml Ｆ（ab′）₂凝集体を使用するPACIAによる平均
値 ：34.6mg／ml NRSを使用するがＦ（ab′）₂凝集体を使用しな
いPACIAによる平均値 ：45.6mg／ml

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は16個の血清のそれぞれについての４種
の検定操作による粒子計数結果を示す図表であ
る。横軸に血清の試料番号を、縦軸に計数を示
す。第２図は凝集Ｆ（ab′）₂を使用しない陽性血清
についてのRIAとPACIAとの相関を示す図表で
ある。第３図は同じ血清について凝集Ｆ（ab′）₂を
使用した場合の同様の図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第一の動物種からの生物体液中の被検定成分
   を免疫検定するにあたり、前記生成物体液と、検
   定反応混合物中の前記被検定成分に対して免疫的
   に特異的である、第二の動物種からの第一の免疫
   グロブリンの抗原結合性断片との反応混合物であ
   つて、前記第一の免疫グロブリン全体およびその
   Ｆ(c)断片は含まない反応混合物を形成する免疫検
   定方法において、 (a) 前記生物体液と、前記被検定成分とは結合し
   ないが前記第一の動物種からの抗体とは結合す
   る、前記第二の動物種からの第二の免疫グロブ
   リンの抗原結合性断片とを、混合し、 (b) こうして前記第一の免疫グロブリンの抗原結
   合性断片と前記生物液体中に存在しこの断片に
   対して反応する前記第一の動物種からの抗体と
   の反応による、検定への干渉を、減少させ、そ
   して (c) 次に前記第一の免疫グロブリンの抗原結合性
   断片と前記被検定成分とにより形成される複合
   体について、前記反応混合物を分析する ことを特徴とする免疫検定方法。 ２ 第二の免疫グロブリンの前記断片としてＦ
   （ab′）₂断片を使う、前項１に記載の方法。 ３ 第二の免疫グロブリンのＦ（ab′）₂断片を凝集
   させて行なう、前頁２に記載の方法。 ４ 第二の免疫グロブリンの前記断片を化学的に
   凝集させて行なう、前項１に記載の方法。 ５ 第二の免疫グロブリンの前記断片を固体不溶
   性支持体または可溶性担体と結合させて行なう、
   前項１に記載の方法。 ６ 工程ａにおいて、第一の免疫グロブリンの前
   記断片を被覆した微細粒子であつて、反応混合物
   中の前記被検定成分の量に従つて凝集する粒子
   を、反応混合物中に含有させ、工程(c)において、
   前記被検定成分の量を非凝集粒子の計数により測
   定し、そして第二の免疫グロブリンの前記断片は
   検定の間、反応混合物中に溶解して存在する、前
   項１に記載の方法。 ７ 第一の免疫グロブリンの前記断片としてIgG
   のＦ（ab′）₂断片を使う、前項１に記載の方法。 ８ ヒト血清中の被検定成分を免疫検定するにあ
   たり、 (a) （）ヒト血清と、（）ヒト以外の動物か
   らの第一の免疫グロブリンのＦ（ab′）₂断片を担
   持した微細粒子と［ここで反応混合物は第一の
   免疫グロブリン全体およびそのＦ(c)断片は含ま
   ずそして第一の免疫グロブリンは反応混合物中
   の前記被検定成分に対して免疫特異的であるも
   のとする］、（）前記のヒト以外の動物からの
   第二の免疫グロブリンのＦ（ab′）₂断片と［ここ
   で前記第二の免疫グロブリンは前記被検定成分
   とは非反応性であるが前記ヒト以外の動物から
   の第一の免疫グロブリンのＦ（ab′）₂断片に対す
   るヒトの抗体とは反応性であるものとする］と
   の反応混合物を形成し、 (b) 非凝集粒子を計数し、得られた計数値を既知
   濃度の前記被検定成分を含む一連の標準組成物
   について得られた計数値と比較することによつ
   て、存在する前記被検定成分の量を検定する 前項１に記載の方法。