JP3598701B2 - 不溶性担体を用いた免疫化学的測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体感作不溶性担体を用いた免疫化学的測定法及び免疫化学的測定法用試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、病院、検査センター等に於いては、人手不足、コスト削減、或いは多数検体処理の要請等の面から、臨床検査等の諸検査の自動化または測定時間の短縮が図られてきた。現在、免疫化学的測定方法に於いては、このような自動化に適した方法として、測定対象物質に対する抗体を担持させた不溶性担体粒子が測定対象物質と反応して起こる凝集反応を利用して、測定対象物質を測定する凝集法等が注目され、一般に広く使用されている。
【0003】
凝集法は、例えば血液、血漿、血清等の体液や尿中の、例えば、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、補体(C3、C4、C5、C1q)、C−反応性タンパク質、B型肝炎ウイルス、癌胎児性抗原、B型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体、リウマチ因子、抗ストレプトリジン−O抗体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等、免疫化学的に抗原又は抗体に属する物質の測定等に利用されている。
【0004】
凝集法の原理は、例えば、特公昭58−11575号公報に記載されているように、試料中の測定対象物質(抗原)を測定する場合であれば、該抗原に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有するフラグメント〔Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab’フラグメント等〕を担持させた例えばラテックス粒子等の不溶性担体と目的の試料を混合して、測定対象抗原と不溶性担体に担持させた抗体との抗原抗体反応の結果生ずる凝集の程度を測定することにより、該抗原を検出または定量するというものである。
【0005】
この方法により試料中の抗原を測定する場合に使用する、該抗原に特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル抗体(以下、PCAと略記する。)やモノクローナル抗体(以下、MCAと略記する。)が用いられる。しかし、PCAを用いた場合、抗原抗体反応による凝集度が高く、濁りの度合が強すぎるため、抗原の低濃度域での測定には適しているが、高濃度域の測定には適さず、広い測定範囲を有する測定系の確立は困難であった。また、MCAを用いた場合、親和力の高い抗体を選択することが可能となるものの、PCAを使用した場合と異なり、三次元的網目構造の発達する凝集反応を行わせることが困難であるため、その凝集力が弱く低濃度域での充分な測定感度が得られないという問題点があった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、測定対象物質の濃度に応じた充分な測定感度を有し、低濃度から高濃度にわたる広い測定範囲に於いて、高精度にその濃度を測定することが可能な抗体感作不溶性担体を用いる測定対象物質の免疫化学的測定方法及びこれに用いる免疫化学的測定法用試薬を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の構成よりなる。
(1)抗体感作不溶性担体として、測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体と、当該モノクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体1容量に対して、 0.02 〜2容量の当該測定対象物質に対するポリクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体とを混合させて得られるものを用いることを特徴とする、当該測定対象物質の免疫学的測定方法。
(2)測定対象物質に対するモノクローナル抗体と、当該モノクローナル抗体1重量に対して、 0.02 〜2重量の当該測定対象物質に対するポリクローナル抗体とを用いて調製された、当該モノクローナル抗体及び当該ポリクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体を用いることを特徴とする、当該測定対象物質の免疫学的測定方法。
(3)測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体と、当該モノクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体1容量に対して、 0.02 〜2容量の当該測定対象物質に対するポリクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体とを含んで成る当該測定対象物質の免疫化学的測定法用試薬。
(4)測定対象物質に対するモノクローナル抗体と、当該モノクローナル抗体1重量に対して、 0.02 〜2重量の当該測定対象物質に対するポリクローナル抗体とを用いて調製された、当該モノクローナル抗体及び当該ポリクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体を含んで成る当該測定対象物質の免疫化学的測定法用試薬。
【0008】
(5)グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液に懸濁させた、測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体及び当該測定対象物質に対するポリクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体を用いることを特徴とする、当該測定対象物質の免疫学的測定方法。
(6)グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液に懸濁させた、測定対象物質に対するモノクローナル抗体と該物質に対するポリクローナル抗体とを感作させた抗体感作不溶性担体を用いることを特徴とする、当該測定対象物質の免疫学的測定方法。
(7)グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体と、当該測定対象物質に対するポリクローナル抗体を感作させた抗体感作不溶性担体とを含んで成る当該測定対象物質の免疫化学的測定用試薬。
(8)グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体と当該測定対象物質に対するポリクローナル抗体とを感作させた抗体感作不溶性担体とを含んで成る当該測定対象物質の免疫化学的測定用試薬。
【0009】
即ち、本発明者らは、測定対象物質の濃度に応じた充分な測定感度を有し、低濃度から高濃度にわたる広い測定範囲に於いて高精度にその濃度を測定し得る、抗体感作不溶性担体を用いる免疫化学的測定法を求めて鋭意研究を重ねた結果、感作させる抗体として、測定対象物質に対するMCAと、該物質に対するPCAとを用いて調製された抗体感作不溶性担体を使用して、免疫化学的測定を行えば、意外にも、MCAのみ又はPCAのみを用いた場合の問題点、即ち、PCAのみを用いた場合の高濃度域の測定には適さないという問題点、また、MCAのみを用いた場合の低濃度域での測定感度が得られないという問題点等、従来の技術では解決出来なかった問題点を一挙に解決し、低濃度から高濃度にわたる広い測定範囲に於いて高精度にその濃度を測定し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
本発明に於いて使用される、測定対象物質に対するMCAとしては、測定対象物質との反応性を有するものであれば良く、特に限定されない。
これらMCAの由来は特に限定されず、市販品、或いは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eur.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生された、上記した如き性質を有するMCAは全て使用可能である。
また、本発明に於いて使用される測定対象物質に対するMCAには、パパイン等で部分分解して得られるFabフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるF(ab’)2フラグメント、F(ab’)2フラグメントを還元処理して得られるFab’フラグメント等の、所謂抗体フラグメントも全て包含される。尚、このようなフラグメントとして使用した方が、目的の測定対象物質測定時に於ける非特異的反応を回避し易くなるのでより望ましい。
また、該MCAは、2種以上を適宜混合して用いても良い。
【0011】
本発明に於いて使用される、測定対象物質に対するPCAとしては、測定対象物質との反応性を有するものであれば良く、特に限定されない。
また、該PCAの由来についても特に限定されないが、例えば、兎、馬、羊、山羊、ラット、マウス等に由来する、上記した如き性質を有するものが挙げられる。
これらPCAは、市販のものを使用しても良いし、また、動物抗血清から公知の方法(例えば、「タンパク質精製法,Robert.K.Scopes著,シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社,1985年,37頁〜179頁」等に記載された方法等。)で取得されるPCAを使用しても良い。
また、本発明に於いて使用される測定対象物質に対するPCAには、PCAの一部、例えば、PCAをパパイン等で部分分解して得られるFabフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるF(ab’)2フラグメント、F(ab’)2フラグメントを還元処理して得られるFab’フラグメント等の、所謂抗体フラグメントも全て包含される。尚、このような抗体フラグメントとして使用した方が、目的の測定対象物質測定時に於ける非特異的反応を回避し易くなるのでより望ましい。
また、該PCAは、2種以上を適宜混合して用いても良い。
【0012】
本発明に於いて用いられる不溶性担体としては、通常の免疫化学的測定法で用いられる不溶性担体であれば何れも使用可能であるが、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が好ましく挙げられる。また、これら不溶性担体は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子、ラテックス粒子、マイクロプレート等多種多様の形態で使用し得る。なかでも、ラテックス粒子は、人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の点から特に好ましく用いられる。その材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス等が好ましく挙げられる。
尚、これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子等は、表面の疎水性が強いため、タンパク質或いはペプチドをスムーズに吸着し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有しているので、特に好ましい。尚、種々の変性ラテックス(例えば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカルボン酸変性ラテックス)、磁性ラテックス(磁性粒子を内包させたラテックス)等も必要に応じて使用できることは言うまでもない。
また、本発明に於いて用いられるラテックス粒子としては、市販のものが使用できるが、ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体を効率良く感作させることができるので好ましく用いられる。より具体的には、通常0.05〜2.4μm、好ましくは0.05〜1.0μmの平均粒径のものが好ましく用いられる。
【0013】
本発明に於いて使用される、抗体感作不溶性担体としては、上記した如き不溶性担体に感作させる抗体として、前述した如き、測定対象物質に対するMCAと、該物質に対するPCAの両方を用いる以外は、特に限定されない。
【0014】
不溶性担体に抗体を感作させる方法としては、MCA又は/及びPCAと不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体に該MCA又は/及び該PCAを感作させ得る方法であれば良く、特に限定されない。
このような感作方法としては、通常この分野で利用される自体公知の感作方法は全て挙げられ、例えば、MCA又は/及びPCAを不溶性担体に物理的に吸着させて該MCA又は/及び該PCAを不溶性担体に感作させる、所謂物理的吸着法〔特公平5−41946号公報、スミロン テクニカルレポート,SUMILON ELISAシリーズ 1 ELISA測定法の紹介,住友ベークライト(株)発行、スミロン テクニカルレポート,SUMILON ELISAシリーズ 2ELISA製品の固相表面,住友ベークライト(株)発行等〕が、代表的なものとして挙げられる。該方法は、通常、例えば、ポリスチレン,ポリプロピレン,ポリ塩化ビニール,ポリエチレン,ポリクロロカーボネート等の合成高分子化合物、活性炭、例えば多孔性ガラス,スリガラス,アルミナ,シリカゲル,金属酸化物,ヒドロキシアパタイト等の無機物質を不溶性担体として用いた場合に好ましく用いられる方法である。なかでも、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール等を、例えばチューブ、ビーズ、ディスク片、微粒子、ラテックス粒子、マイクロプレート等の形態とした不溶性担体を用いた場合に、特に好ましく用いられる方法である。
より具体的には、例えば、▲1▼測定対象物質に対するMCAを通常0.1μg/ml〜20mg/ml、好ましくは1μg/ml〜5mg/mlの範囲で含む溶液と不溶性担体とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて調製されたMCA単独感作不溶性担体と、測定対象物質に対するPCAを通常0.1μg/ml〜20mg/ml、好ましくは1μg/ml〜5mg/mlの範囲で含む溶液と不溶性担体とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて調製されたPCA単独感作不溶性担体とを夫々別々に調製し、該MCA単独感作不溶性担体と該PCA単独感作不溶性担体とを混合し、目的の抗体感作不溶性担体を調製する方法(以下、調製法1と略記する。)や、例えば、▲2▼測定対象物質に対するMCAと、該MCA1重量に対して、通常0.02〜2重量、好ましくは0.04〜1重量のPCAとを、MCA量とPCA量の総和量として通常0.1μg/ml〜20mg/ml、好ましくは1μg/ml〜5mg/mlの範囲で含む溶液と、不溶性担体とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて目的の抗体感作不溶性担体を調製する方法(以下、調製法2と略記する。)等が挙げられる。尚、上記調製法1及び2に於いて、MCA又は/及びPCA含有溶液と不溶性担体との使用比率は、感作が充分に行われるものであれば特に限定されない。そして、例えば不溶性担体としてラテックス粒子を使用する場合は、MCA又は/及びPCAを通常0.2〜40mg/ml、好ましくは1〜10mg/mlの範囲で含む溶液と、通常0.05〜2.4μm、好ましくは0.05〜1.0μmの平均粒径を有するラテックス粒子を、通常0.1〜20%(W/V)、好ましくは0.1〜2%(W/V)懸濁させた懸濁液とを等量用いれば良い。
また、上記調製法1に於いて、MCA単独感作不溶性担体とPCA単独感作不溶性担体とを混合する割合は、測定対象物質、使用する不溶性担体及び使用する抗体の種類等により異なるため一概に言えないが、例えば不溶性担体としてラテックス粒子を使用する場合は、夫々ほぼ等濃度の不溶性担体を懸濁させた、MCA単独感作不溶性担体懸濁液と、PCA単独感作不溶性担体懸濁液とを調製し、該MCA単独感作不溶性担体懸濁液1容量に対して、通常0.02〜2容量、好ましくは0.04〜1容量の該PCA単独感作不溶性担体懸濁液とを適宜混合すれば良い。
【0015】
尚、調製法1と調製法2の何れが好ましいのかは、測定対象物質と用いる不溶性担体の形態により異なり、特に限定されない。例えばラテックス粒子等を用いて調製された抗体感作不溶性担体を用いて本発明の測定方法を行う場合には、検量範囲の広さ、プロゾーン限定が生じにくい点や、測定感度を調整し易い点等を考慮すると、上記調製法1により得られた抗体感作不溶性担体が好ましく用いられる。これに対して、調製法2により得られた抗体感作不溶性担体を用いた測定法は、低濃度域での測定感度が高いという効果を有している。従って、目的とする測定対象物質とその好ましい測定範囲とを考慮し、これら調製法を適宜選択して抗体感作不溶性担体を調製して本発明の測定方法を実施することが望ましい。
【0016】
MCA又は/及びPCA含有溶液又は不溶性担体懸濁液を調製するための溶媒としては、該MCA又は/及び該PCAが不溶性担体上に吸着或いは結合するのを妨げる性質を有するものでなければ良く、例えば精製水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましく挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜300mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、該MCA又は/及び該PCAが不溶性担体上に吸着或は結合するのを妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。
【0017】
尚、上記した如き物理的感作方法によっては、感作させたいMCA又は/及びPCAを不溶性担体に安定に担持させることができない場合は、該物理的感作方法以外の自体公知の感作方法、例えば共有結合法〔特公平5−41946号公報、スミロン テクニカルレポート,SUMILON ELISAシリーズ 2 ELISA製品の固相表面,住友ベークライト(株)発行、代謝,第8巻,696頁,1971年、及びJ.Biochemd.,第80巻,895頁,1976年等〕等の化学的感作方法を利用して該MCA又は/及び該PCAを不溶性担体に感作させることができる。
【0018】
以下に、不溶性担体としてラテックス粒子を使用し、本発明に係る調製法1により、本発明に於いて使用される抗体感作不溶性担体を調製する方法をより具体的に説明する。
即ち、先ず、MCAを通常0.2〜40mg/ml、好ましくは1〜10mg/mlの範囲で含む10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)と、PCAを通常0.2〜40mg/ml、好ましくは1〜10mg/mlの範囲で含む含む10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)とを夫々別々に調製し、これらを夫々ラテックス粒子(粒径0.05〜2.4μm)を通常0.1〜20%(W/V)、好ましくは0.1〜2%(W/V)懸濁させた10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)と、等量混合し、通常0〜56℃、好ましくは2〜40℃で通常0.5〜24時間、好ましくは0.5〜5時間反応させる。その後、夫々の反応懸濁液を遠心分離し、得られたラテックス粒子を10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)で夫々洗浄し、更に、得られたラテックス粒子を夫々等濃度となるように、適当な緩衝液に再度懸濁する。次いで、得られたMCA単独感作ラテックス粒子懸濁液とPCA単独感作ラテックス粒子懸濁液とを、上記した如き比率となるように混合すれば、目的の抗体感作ラテックス粒子の懸濁液が得られる。
【0019】
次に、不溶性担体としてラテックス粒子を使用し、本発明に係る調製法2により、本発明に於いて使用される抗体感作不溶性担体を調製する方法をより具体的に説明する。
即ち、先ず、MCA及びPCAを上記した如き割合で、MCA量とPCA量との和が通常0.2〜40mg/ml、好ましくは1〜10mg/mlの範囲で含む10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)と、ラテックス粒子(粒径0.05〜2.4μm)を通常0.1〜20%(W/V)、好ましくは0.1〜2%(W/V)懸濁させた10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)とを、等量混合し、通常0〜56℃、好ましくは2〜40℃で通常0.5〜24時間、好ましくは0.5〜5時間反応させる。その後、反応懸濁液を遠心分離し、得られたラテックス粒子を10〜500mMの上記した如き緩衝液(pH5.0〜10.0)で洗浄し、適当な緩衝液に再度懸濁することにより、目的の抗体感作ラテックス粒子の懸濁液が得られる。
【0020】
尚、通常この分野で行われているブロッキング処理、即ち、上述の如くして得られたMCA又は/及びPCAを感作させた不溶性担体を、更に該MCA及び該PCAとは無関係のタンパク質、例えば牛血清アルブミン、乳タンパク質、卵白アルブミン等を含有する溶液中に浸漬する処理を行うことは、測定時の非特異的反応を防ぐ点から望ましい。
【0021】
上記の如くして得られた抗体感作不溶性担体は、本発明の測定方法に供されるまで、凍結処理や凍結乾燥処理等を施した状態、或いは懸濁液等の状態等、多種の形態で保存し得ることは言うまでもない。
尚、これらのうち、懸濁液状態で保存する場合に用いられる溶液としては、例えば感作されたMCA又は/及びPCAの抗体価を低下させる性質等、本発明の抗体感作不溶性担体の安定性に悪影響を与える性質を有するものでなければ良く、例えば精製水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましく挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜300mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、該MCA又は/及び該PCAの抗体価を低下させない量であれば、例えば糖類、タンパク質、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤等が含まれていても良い。
【0022】
本発明の測定方法は、上記した如き方法により調製された抗体感作不溶性担体を用いる免疫化学的測定法であり、該抗体感作不溶性担体を用いる以外は特に限定されない。
このような免疫化学的測定法としては、例えば、逆受身凝集反応法(東京化学同人 続生化学実験講座5 免疫生化学研究法 p.36−37、金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.844−845等)等の凝集反応を利用した測定法、例えば、比ろう法(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.851−853等)、免疫比濁法(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.853−854等)等の凝集反応を応用した光学的測定法、ラジオイムノアッセイ法(RIA)(東京化学同人 続生化学実験講座5 免疫生化学研究法 p.57−61、金原出版株式会社臨床検査法提要 第30版 p.856−862等)、イムノラジオメトリックアッセイ法(IRMA)(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.856−862等)、エンザイムイムノアッセイ法(EIA)(東京化学同人 続生化学実験講座5免疫生化学研究法 p.62−65、金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.862−865、特開昭56−106154号公報、特開昭58−23796号公報等)、固相酵素免疫測定法(ELISA)(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.1145−1149等)、蛍光・発光免疫測定法(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.865−867等)等の抗体感作不溶性担体上での抗原抗体反応を利用した自体公知の免疫化学的測定方法は全て挙げられる。
【0023】
また、測定対象物質としては、通常この分野に於ける測定対象であれば特に限定されることなく挙げられるが、例えば血液、血漿、血清等の体液や尿中の、例えば免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、補体(C3、C4、C5、C1q)、B型肝炎ウイルス、癌胎児性抗原、C−反応性タンパク質(以下、CRPと略記する。)、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等が挙げられる。
【0024】
本発明の免疫化学的測定法用試薬は、種々の免疫化学的測定法に於いて使用されるものであって、前述した如き抗体感作不溶性担体を含有するものであり、その構成要件の好ましい態様及び具体例は上で述べた通りである。また、免疫学的測定法の例示は、先に述べた通りであり、本発明の免疫化学的測定法用試薬は、これら何れの免疫化学的測定法にも使用し得るが、なかでもMCA又は/及びPCAを感作させる不溶性担体としてラテックス粒子を用いた測定法(金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.854−856、特開昭59−125064号公報等)に於いて、本発明の免疫化学的測定法用試薬を使用すれば、検査の自動化又は測定時間の短縮に適した、経済的且つ充分な測定感度を有し、しかも広い測定範囲の免疫化学的測定用試薬を得ることができるという点で特に好ましい。
【0025】
また、各種試料中の測定対象物質を測定する目的で使用される、本発明の免疫化学的測定法用試薬には、抗体感作不溶性担体として上記した如き方法によって調製された本発明に係る抗体感作不溶性担体を含んでなる以外に、自体公知の免疫化学的測定法用試薬に使用される試薬類を含んでいても良く、これら試薬類の使用濃度としては、通常この分野で使用される範囲内から適宜選択される。
例えば、不溶性担体としてラテックス粒子を用いて調製された本発明に係る抗体感作不溶性担体を含んでなる免疫化学的測定法用試薬は、該不溶性担体を緩衝液等の溶液に懸濁させた懸濁液の形態で免疫化学的測定に供される場合がある。このような懸濁液を調製するために用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有するもの、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましく挙げられる。尚、使用する不溶性担体の性質によっては、懸濁液の状態で放置しておくと自然凝集を起こしやすいものもあるが、このような場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を使用して懸濁液を調製する方が保存安定性の面から好ましい。
また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜300mMの範囲から適宜選択される。
上記のような緩衝液に、本発明に係る抗体感作不溶性担体を懸濁させる場合の、不溶性担体の濃度としては、通常0.05〜10%(W/V)、好ましくは0.05〜1%(W/V)の範囲から適宜選択される。
尚、該懸濁液には、通常この分野で使用されている、例えば、糖類,タンパク質,界面活性剤等の安定化剤、NaCl等の塩類、防腐剤等が、通常この分野で使用される範囲内で添加されていてもよい。
【0026】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
【0027】
【実施例】
実施例.1
(1)抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液の調製
抗ヒトCRP−MCA〔和光純薬工業(株)製〕1.8mgを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1mlと、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業(株)〕を2%(W/V)となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1mlとを混合し、4℃で2時間反応させた。その後遠心分離により分離したラテックスを50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)で洗浄し、ラテックス濃度が0.2%(W/V)となるように、牛血清アルブミン(以下、BSAと略記する。)を0.5%(W/V)含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.3)に再懸濁して、抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液とした。
【0028】
(2)抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液の調製
抗ヒトCRP山羊PCA(International Immunology Corp.製)1.8mgを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1mlと、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業(株)〕を2%(W/V)となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1mlとを混合し、4℃で2時間反応させた。その後遠心分離により分離したラテックスを50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)で洗浄し、ラテックス濃度が0.2%(W/V)となるように、BSAを0.5%(W/V)含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.3)に再懸濁して、抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液とした。
【0029】
(3)ラテックス試液の調製
(1)で調製した抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して、(2)で調製した抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.05, 0.11, 0.25, 0.67, 1.5, 又は4容量を夫々混合し、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液(以下、混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液と略記する。)とした。
【0030】
(4)試料の調製
生理食塩水〔0.3%(W/V)アジ化ナトリウム及び150mM塩化ナトリウム含有〕に、ヒトCRP〔和光純薬工業(株)製〕を所定濃度となるように溶解したものを試料とした。
【0031】
(5)測定方法
アジ化ナトリウムを0.1%(W/V)、BSAを0.1%(W/V)及び塩化ナトリウムを500mM含有する50mM N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)緩衝液(pH8.6)250μlと、上記(4)で調製した試料 5μlとを混合し、37℃で5分間予備加温を行った後、これに更に上記(3)で調製した混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液 125μlを加えて反応を開始させ、該ラテックス試液添加直後からの5分間の吸光度変化量(ΔE)を測定した。
尚、測定装置は、自動汎用測定機日立7070形〔日立製作所(株)製〕を使用し、測定波長660nm、測定温度 37℃で測定を行った。
結果を図1及び図2に夫々示す。尚、図1中、−○−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.05容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−◇−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.11容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−△−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.25容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−×−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.67容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を夫々示す。また、図2中、−×−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.67容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−●−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液1.5容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−◆−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液4容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を夫々示す。
また、対照として、(1)で調製した抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を−□−として図1に、また、(2)で調製した抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を−▽−として図2に併せて示す。
【0032】
(結果)
図1の結果から明らかなように、抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックスと抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックスを併用することにより、MCA単独感作ラテックスのみの使用では困難であった低濃度域での測定感度が上昇することが判る。また、低濃度域での測定感度の上昇は、PCA単独感作不溶性担体の割合が増すにつれてより上昇することも判る。また、図2の結果より、PCA単独感作ラテックスのみの使用でみられる検量線の落ち込み(検量線のプロゾーン現象)は、MCA単独感作ラテックスとPCA単独感作ラテックスとを併用することにより改善され、プロゾーン現象の改善の程度は、MCA単独感作ラテックスの割合が増すにつれ、より高くなることが判る。
以上のことから、本発明の方法は、従来の方法に比べて、測定対象物質の濃度に応じて高感度で、しかも広い測定範囲にわたって、高精度にその濃度を測定し得ることが判る。
【0033】
実施例.2
(1)抗ヒトCRP抗体混合感作ラテックス試液の調製
実施例.1の(1)で使用した抗ヒトCRP−MCA1.71mg及び実施例.1の(2)で使用した抗ヒトCRP山羊PCA0.09mgを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1ml(MCA1重量に対し、山羊PCAを0.05重量の比率)と、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業(株)〕を2%(W/V)となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)1mlとを混合し、4℃で2時間反応させた。その後遠心分離により分離したラテックスを50mMホウ酸緩衝液(pH7.1)で洗浄し、ラテックス濃度が0.2%(W/V)となるように、BSAを0.5%(W/V)含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.3)に再懸濁して、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液(以下、抗ヒトCRP抗体混合感作ラテックス試液と略記する。)とした。
【0034】
(2)試料の調製
実施例.1の(4)と同じ。
【0035】
(3)測定方法
実施例.1の(5)と同じ。
また対照として、実施例.1の(1)〜(3)で調製したヒト抗CRP−MCA単独感作ラテックス、ヒト抗CRP−PCA単独感作ラテックス及び混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液(抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液1容量に対し、抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液0.05容量を混合したもの)を用いた結果も、図3に併せて示す。尚、図3中、−□−は抗ヒトCRP−MCA単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、−▽−は抗ヒトCRP−PCA単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、−○−は混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−+−は抗ヒトCRP抗体混合感作ラテックス試液を用いた場合の測定結果を夫々示す。
【0036】
(結果)
図3の結果から明らかなように、MCA及びPCAとを感作させた抗ヒトCRP抗体混合感作ラテックスを用いると、MCA単独感作ラテックスのみの使用では困難であった低濃度域での測定感度を上昇させることが可能となることが判る。一方、PCA単独感作ラテックスのみの使用でみられる検量線の落ち込み(プロゾーン現象)も、混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックスを用いることにより改善されることが判る。以上のことから、混合抗ヒトCRP抗体感作ラテックスを用いることにより低濃度域での測定感度が高い試薬が得られることが判る。
【0037】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、抗体感作不溶性担体を用いる改良された免疫化学的測定方法及びその試薬を提供するものであり、本発明の方法を用いることにより、従来の方法に比べて、測定対象物質の濃度に応じて充分な測定感度を有し、しかも低濃度域から高濃度域にわたる広い測定範囲に於いて、高精度にその濃度を測定し得るという効果を奏するので、斯業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1で得られた、各種ラテックス試液を用いた場合の検量線を示す。
【図2】実施例1で得られた、各種ラテックス試液を用いた場合の検量線を示す。
【図3】実施例1及び2で得られた、各種ラテックス試液を用いた場合の検量線を示す。
【符号の説明】
図1〜3に於いて、−□−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、−○−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液0.05容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−◇−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液0.11容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−△−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液0.25容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−×−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液0.67容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−●−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液1.5容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−◆−は抗ヒトCRPモノクローナル抗体単独感作ラテックス試液1容量に対して抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液4容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−▽−は抗ヒトCRPポリクローナル抗体単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、また、−+−は抗ヒトCRP抗体混合感作ラテックス試液を用いた場合の測定結果を夫々示す。
Claims (7)
- 抗体感作不溶性担体として、測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスと、当該モノクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作不溶性ラテックス1容量に対して、0.11〜0.67容量の当該測定対象物質に対するポリクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスとを混合させて得られるものを用いることを特徴とする、当該測定対象物質の免疫学的測定方法。
- 抗体感作不溶性ラテックスが、グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液に懸濁して用いられる、請求項1記載の測定方法。
- 測定対象物質が、C反応性タンパク質(CRP)である請求項2記載の測定方法。
- 測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスと、当該モノクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作ラテックス1容量に対して、0.11〜0.67容量の当該測定対象物質に対するポリクロ−ナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスとを含んで成る当該測定対象物質の免疫化学的測定法用試薬。
- 測定対象物質に対するモノクローナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスと当該測定物質に対するポリクローナル抗体を感作させた抗体感作ラテックスが予め混合されたものである、請求項4に記載の免疫化学的測定法用試薬。
- 抗体感作ラテックスが、グリシン緩衝液又は/及びホウ酸緩衝液に懸濁されたものである、請求項4又は5に記載の免疫化学的測定法用試薬。
- 測定対象物質が、C反応性タンパク質(CRP)である請求項6記載の免疫化学的測定法用試薬。
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