JPH10197533A - 不溶性担体を用いた免疫化学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】測定対象物質の濃度に応じた十分な感度を有
し、低濃度から高濃度にわたる広い測定範囲に於いて、
高精度にその濃度を測定することが可能な抗体感作不溶
性担体を用いる測定対象物質の免疫化学的測定方法及び
これに用いる免疫化学的測定法用試薬の提供。 【解決手段】感作させる抗体として、測定対象物質に対
するモノクローナル抗体と、該物質に対するポリクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする、抗体感作不溶性担
体を用いる測定対象物質の免疫化学的測定方法、及びこ
れに用いる免疫化学的測定法用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗体感作不溶性担
体を用いた免疫化学的測定法及び免疫化学的測定法用試
薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、病院、検査センター等に於いて
は、人手不足、コスト削減、或いは多数検体処理の要請
等の面から、臨床検査等の諸検査の自動化または測定時
間の短縮が図られてきた。現在、免疫化学的測定方法に
於いては、このような自動化に適した方法として、測定
対象物質に対する抗体を担持させた不溶性担体粒子が測
定対象物質と反応して起こる凝集反応を利用して、測定
対象物質を測定する凝集法等が注目され、一般に広く使
用されている。

【０００３】凝集法は、例えば血液、血漿、血清等の体
液や尿中の、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ
５、Ｃ１ｑ）、Ｃ−反応性タンパク質、Ｂ型肝炎ウイル
ス、癌胎児性抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不
全ウイルス抗体、リウマチ因子、抗ストレプトリジン−
Ｏ抗体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等、免疫化学的に抗
原又は抗体に属する物質の測定等に利用されている。

【０００４】凝集法の原理は、例えば、特公昭58-11575
号公報に記載されているように、試料中の測定対象物質
（抗原）を測定する場合であれば、該抗原に特異的に結
合する抗体若しくはその抗原結合部位を有するフラグメ
ント〔Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメン
ト、Ｆａｂ'フラグメント等〕を担持させた例えばラテ
ックス粒子等の不溶性担体と目的の試料を混合して、測
定対象抗原と不溶性担体に担持させた抗体との抗原抗体
反応の結果生ずる凝集の程度を測定することにより、該
抗原を検出または定量するというものである。

【０００５】この方法により試料中の抗原を測定する場
合に使用する、該抗原に特異的に結合する抗体として
は、ポリクローナル抗体（以下、ＰＣＡと略記する。）
やモノクローナル抗体（以下、ＭＣＡと略記する。）が
用いられる。しかし、ＰＣＡを用いた場合、抗原抗体反
応による凝集度が高く、濁りの度合が強すぎるため、抗
原の低濃度域での測定には適しているが、高濃度域の測
定には適さず、広い測定範囲を有する測定系の確立は困
難であった。また、ＭＣＡを用いた場合、親和力の高い
抗体を選択することが可能となるものの、ＰＣＡを使用
した場合と異なり、三次元的網目構造の発達する凝集反
応を行わせることが困難であるため、その凝集力が弱く
低濃度域での充分な測定感度が得られないという問題点
があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、測定対象物質の濃度に応
じた充分な測定感度を有し、低濃度から高濃度にわたる
広い測定範囲に於いて、高精度にその濃度を測定するこ
とが可能な抗体感作不溶性担体を用いる測定対象物質の
免疫化学的測定方法及びこれに用いる免疫化学的測定法
用試薬を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、感作させる抗
体として、測定対象物質に対するＭＣＡと、該物質に対
するＰＣＡを用いることを特徴とする、抗体感作不溶性
担体を用いる測定対象物質の免疫化学的測定方法の発明
である。

【０００８】また、本発明は、感作させる抗体として、
測定対象物質に対するＭＣＡと、該物質に対するＰＣＡ
を用いて調製された、抗体感作不溶性担体を含んで成る
免疫化学的測定法用試薬の発明である。

【０００９】即ち、本発明者らは、測定対象物質の濃度
に応じた充分な測定感度を有し、低濃度から高濃度にわ
たる広い測定範囲に於いて高精度にその濃度を測定し得
る、抗体感作不溶性担体を用いる免疫化学的測定法を求
めて鋭意研究を重ねた結果、感作させる抗体として、測
定対象物質に対するＭＣＡと、該物質に対するＰＣＡと
を用いて調製された抗体感作不溶性担体を使用して、免
疫化学的測定を行えば、意外にも、ＭＣＡのみ又はＰＣ
Ａのみを用いた場合の問題点、即ち、ＰＣＡのみを用い
た場合の高濃度域の測定には適さないという問題点、ま
た、ＭＣＡのみを用いた場合の低濃度域での測定感度が
得られないという問題点等、従来の技術では解決出来な
かった問題点を一挙に解決し、低濃度から高濃度にわた
る広い測定範囲に於いて高精度にその濃度を測定し得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】本発明に於いて使用される、測定対象物質
に対するＭＣＡとしては、測定対象物質との反応性を有
するものであれば良く、特に限定されない。これらＭＣ
Ａの由来は特に限定されず、市販品、或いは細胞融合技
術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eu
r.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生された、
上記した如き性質を有するＭＣＡは全て使用可能であ
る。また、本発明に於いて使用される測定対象物質に対
するＭＣＡには、パパイン等で部分分解して得られるＦ
ａｂフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られる
Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント
を還元処理して得られるＦａｂ'フラグメント等の、所
謂抗体フラグメントも全て包含される。尚、このような
フラグメントとして使用した方が、目的の測定対象物質
測定時に於ける非特異的反応を回避し易くなるのでより
望ましい。また、該ＭＣＡは、２種以上を適宜混合して
用いても良い。

【００１１】本発明に於いて使用される、測定対象物質
に対するＰＣＡとしては、測定対象物質との反応性を有
するものであれば良く、特に限定されない。また、該Ｐ
ＣＡの由来についても特に限定されないが、例えば、
兎、馬、羊、山羊、ラット、マウス等に由来する、上記
した如き性質を有するものが挙げられる。これらＰＣＡ
は、市販のものを使用しても良いし、また、動物抗血清
から公知の方法（例えば、「タンパク質精製法，Rober
t.K.Scopes著，シュプリンガー・フェアラーク東京株式
会社，1985年，37頁〜179頁」等に記載された方法
等。）で取得されるＰＣＡを使用しても良い。また、本
発明に於いて使用される測定対象物質に対するＰＣＡに
は、ＰＣＡの一部、例えば、ＰＣＡをパパイン等で部分
分解して得られるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部
分分解して得られるＦ（ａｂ'）₂フラグメント、Ｆ（ａ
ｂ'）₂フラグメントを還元処理して得られるＦａｂ'フ
ラグメント等の、所謂抗体フラグメントも全て包含され
る。尚、このような抗体フラグメントとして使用した方
が、目的の測定対象物質測定時に於ける非特異的反応を
回避し易くなるのでより望ましい。また、該ＰＣＡは、
２種以上を適宜混合して用いても良い。

【００１２】本発明に於いて用いられる不溶性担体とし
ては、通常の免疫化学的測定法で用いられる不溶性担体
であれば何れも使用可能であるが、例えば、ポリスチレ
ン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
アミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレ
ン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカー
ボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成
高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、
シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が好ま
しく挙げられる。また、これら不溶性担体は、チュー
ブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子、ラテックス粒子、
マイクロプレート等多種多様の形態で使用し得る。なか
でも、ラテックス粒子は、人工担体であり、目的に応じ
て担体表面を化学的処理し易いこと、また非特異反応が
起こりにくいこと等の点から特に好ましく用いられる。
その材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラ
テックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテ
ックス等が好ましく挙げられる。尚、これらラテックス
粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られ
るポリスチレンラテックス粒子等は、表面の疎水性が強
いため、タンパク質或いはペプチドをスムーズに吸着
し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なし
でも溶液中で安定に分散するという性質を有しているの
で、特に好ましい。尚、種々の変性ラテックス（例え
ば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカ
ルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子
を内包させたラテックス）等も必要に応じて使用できる
ことは言うまでもない。また、本発明に於いて用いられ
るラテックス粒子としては、市販のものが使用できる
が、ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単
位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体を効率良く
感作させることができるので好ましく用いられる。より
具体的には、通常0.05〜2.4μｍ、好ましくは0.05〜1.0
μｍの平均粒径のものが好ましく用いられる。

【００１３】本発明に於いて使用される、抗体感作不溶
性担体としては、上記した如き不溶性担体に感作させる
抗体として、前述した如き、測定対象物質に対するＭＣ
Ａと、該物質に対するＰＣＡの両方を用いる以外は、特
に限定されない。

【００１４】不溶性担体に抗体を感作させる方法として
は、ＭＣＡ又は／及びＰＣＡと不溶性担体とを接触させ
て、該不溶性担体に該ＭＣＡ又は／及び該ＰＣＡを感作
させ得る方法であれば良く、特に限定されない。このよ
うな感作方法としては、通常この分野で利用される自体
公知の感作方法は全て挙げられ、例えば、ＭＣＡ又は／
及びＰＣＡを不溶性担体に物理的に吸着させて該ＭＣＡ
又は／及び該ＰＣＡを不溶性担体に感作させる、所謂物
理的吸着法〔特公平5-41946号公報、スミロン テクニ
カルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮＥＬＩＳＡシリーズ １
ＥＬＩＳＡ測定法の紹介，住友ベークライト（株）発
行、スミロン テクニカルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮ
ＥＬＩＳＡシリーズ ２ＥＬＩＳＡ製品の固相表面，住
友ベークライト（株）発行等〕が、代表的なものとして
挙げられる。該方法は、通常、例えば、ポリスチレン，
ポリプロピレン，ポリ塩化ビニール，ポリエチレン，ポ
リクロロカーボネート等の合成高分子化合物、活性炭、
例えば多孔性ガラス，スリガラス，アルミナ，シリカゲ
ル，金属酸化物，ヒドロキシアパタイト等の無機物質を
不溶性担体として用いた場合に好ましく用いられる方法
である。なかでも、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビ
ニール等を、例えばチューブ、ビーズ、ディスク片、微
粒子、ラテックス粒子、マイクロプレート等の形態とし
た不溶性担体を用いた場合に、特に好ましく用いられる
方法である。より具体的には、例えば、測定対象物質
に対するＭＣＡを通常0.1μg／ml〜20mg／ml、好ましく
は１μg／ml〜５mg／mlの範囲で含む溶液と不溶性担体
とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させて調製さ
れたＭＣＡ単独感作不溶性担体と、測定対象物質に対す
るＰＣＡを通常0.1μg／ml〜20mg／ml、好ましくは１μ
g／ml〜５mg／mlの範囲で含む溶液と不溶性担体とを接
触させ、適当な温度で所定時間反応させて調製されたＰ
ＣＡ単独感作不溶性担体とを夫々別々に調製し、該ＭＣ
Ａ単独感作不溶性担体と該ＰＣＡ単独感作不溶性担体と
を混合し、目的の抗体感作不溶性担体を調製する方法
（以下、調製法１と略記する。）や、例えば、測定対
象物質に対するＭＣＡと、該ＭＣＡ１重量に対して、通
常0.02〜２重量、好ましくは0.04〜１重量のＰＣＡと
を、ＭＣＡ量とＰＣＡ量の総和量として通常0.1μg／ml
〜20mg／ml、好ましくは１μg／ml〜５mg／mlの範囲で
含む溶液と、不溶性担体とを接触させ、適当な温度で所
定時間反応させて目的の抗体感作不溶性担体を調製する
方法（以下、調製法２と略記する。）等が挙げられる。
尚、上記調製法１及び２に於いて、ＭＣＡ又は／及びＰ
ＣＡ含有溶液と不溶性担体との使用比率は、感作が充分
に行われるものであれば特に限定されない。そして、例
えば不溶性担体としてラテックス粒子を使用する場合
は、ＭＣＡ又は／及びＰＣＡを通常0.2〜40mg／ml、好
ましくは１〜10mg／mlの範囲で含む溶液と、通常0.05〜
2.4μm、好ましくは0.05〜1.0μmの平均粒径を有するラ
テックス粒子を、通常0.1〜20％（W/V）、好ましくは0.
1〜２％（W/V）懸濁させた懸濁液とを等量用いれば良
い。また、上記調製法１に於いて、ＭＣＡ単独感作不溶
性担体とＰＣＡ単独感作不溶性担体とを混合する割合
は、測定対象物質、使用する不溶性担体及び使用する抗
体の種類等により異なるため一概に言えないが、例えば
不溶性担体としてラテックス粒子を使用する場合は、夫
々ほぼ等濃度の不溶性担体を懸濁させた、ＭＣＡ単独感
作不溶性担体懸濁液と、ＰＣＡ単独感作不溶性担体懸濁
液とを調製し、該ＭＣＡ単独感作不溶性担体懸濁液１容
量に対して、通常0.02〜２容量、好ましくは0.04〜１容
量の該ＰＣＡ単独感作不溶性担体懸濁液とを適宜混合す
れば良い。

【００１５】尚、調製法１と調製法２の何れが好ましい
のかは、測定対象物質と用いる不溶性担体の形態により
異なり、特に限定されない。例えばラテックス粒子等を
用いて調製された抗体感作不溶性担体を用いて本発明の
測定方法を行う場合には、検量範囲の広さ、プロゾーン
限定が生じにくい点や、測定感度を調整し易い点等を考
慮すると、上記調製法１により得られた抗体感作不溶性
担体が好ましく用いられる。これに対して、調製法２に
より得られた抗体感作不溶性担体を用いた測定法は、低
濃度域での測定感度が高いという効果を有している。従
って、目的とする測定対象物質とその好ましい測定範囲
とを考慮し、これら調製法を適宜選択して抗体感作不溶
性担体を調製して本発明の測定方法を実施することが望
ましい。

【００１６】ＭＣＡ又は／及びＰＣＡ含有溶液又は不溶
性担体懸濁液を調製するための溶媒としては、該ＭＣＡ
又は／及び該ＰＣＡが不溶性担体上に吸着或いは結合す
るのを妨げる性質を有するものでなければ良く、例えば
精製水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の
中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩
衝液等が好ましく挙げられる。また、これらの緩衝液中
の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10
〜300mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中
には、該ＭＣＡ又は／及び該ＰＣＡが不溶性担体上に吸
着或は結合するのを妨げない量であれば、例えば糖類、
ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等
が含まれていても良い。

【００１７】尚、上記した如き物理的感作方法によって
は、感作させたいＭＣＡ又は／及びＰＣＡを不溶性担体
に安定に担持させることができない場合は、該物理的感
作方法以外の自体公知の感作方法、例えば共有結合法
〔特公平5-41946号公報、スミロン テクニカルレポー
ト，ＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡシリーズ ２ ＥＬＩ
ＳＡ製品の固相表面，住友ベークライト（株）発行、代
謝，第８巻，696頁，1971年、及びJ.Biochemd.,第80巻,
895頁,1976年等〕等の化学的感作方法を利用して該ＭＣ
Ａ又は／及び該ＰＣＡを不溶性担体に感作させることが
できる。

【００１８】以下に、不溶性担体としてラテックス粒子
を使用し、本発明に係る調製法１により、本発明に於い
て使用される抗体感作不溶性担体を調製する方法をより
具体的に説明する。即ち、先ず、ＭＣＡを通常0.2〜40m
g／ml、好ましくは１〜10mg／mlの範囲で含む10〜500mM
の上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）と、ＰＣＡを通
常0.2〜40mg／ml、好ましくは１〜10mg／mlの範囲で含
む含む10〜500mMの上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）
とを夫々別々に調製し、これらを夫々ラテックス粒子
（粒径0.05〜2.4μｍ）を通常0.1〜20％（W/V）、好ま
しくは0.1〜２％（W/V）懸濁させた10〜500mMの上記し
た如き緩衝液（pH5.0〜10.0）と、等量混合し、通常0〜
56℃、好ましくは2〜40℃で通常0.5〜24時間、好ましく
は0.5〜5時間反応させる。その後、夫々の反応懸濁液を
遠心分離し、得られたラテックス粒子を10〜500mMの上
記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）で夫々洗浄し、更
に、得られたラテックス粒子を夫々等濃度となるよう
に、適当な緩衝液に再度懸濁する。次いで、得られたＭ
ＣＡ単独感作ラテックス粒子懸濁液とＰＣＡ単独感作ラ
テックス粒子懸濁液とを、上記した如き比率となるよう
に混合すれば、目的の抗体感作ラテックス粒子の懸濁液
が得られる。

【００１９】次に、不溶性担体としてラテックス粒子を
使用し、本発明に係る調製法２により、本発明に於いて
使用される抗体感作不溶性担体を調製する方法をより具
体的に説明する。即ち、先ず、ＭＣＡ及びＰＣＡを上記
した如き割合で、ＭＣＡ量とＰＣＡ量との和が通常0.2
〜40mg／ml、好ましくは１〜10mg／mlの範囲で含む10〜
500mMの上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）と、ラテッ
クス粒子（粒径0.05〜2.4μｍ）を通常0.1〜20％（W/
V）、好ましくは0.1〜２％（W/V）懸濁させた10〜500mM
の上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）とを、等量混合
し、通常0〜56℃、好ましくは2〜40℃で通常0.5〜24時
間、好ましくは0.5〜5時間反応させる。その後、反応懸
濁液を遠心分離し、得られたラテックス粒子を10〜500m
Mの上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）で洗浄し、適当
な緩衝液に再度懸濁することにより、目的の抗体感作ラ
テックス粒子の懸濁液が得られる。

【００２０】尚、通常この分野で行われているブロッキ
ング処理、即ち、上述の如くして得られたＭＣＡ又は／
及びＰＣＡを感作させた不溶性担体を、更に該ＭＣＡ及
び該ＰＣＡとは無関係のタンパク質、例えば牛血清アル
ブミン、乳タンパク質、卵白アルブミン等を含有する溶
液中に浸漬する処理を行うことは、測定時の非特異的反
応を防ぐ点から望ましい。

【００２１】上記の如くして得られた抗体感作不溶性担
体は、本発明の測定方法に供されるまで、凍結処理や凍
結乾燥処理等を施した状態、或いは懸濁液等の状態等、
多種の形態で保存し得ることは言うまでもない。尚、こ
れらのうち、懸濁液状態で保存する場合に用いられる溶
液としては、例えば感作されたＭＣＡ又は／及びＰＣＡ
の抗体価を低下させる性質等、本発明の抗体感作不溶性
担体の安定性に悪影響を与える性質を有するものでなけ
れば良く、例えば精製水、例えばpH5.0〜10.0、好まし
くはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えば
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン
緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましく挙げられる。また、
これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10〜500m
M、好ましくは10〜300mMの範囲から適宜選択される。ま
た、この溶液中には、該ＭＣＡ又は／及び該ＰＣＡの抗
体価を低下させない量であれば、例えば糖類、タンパク
質、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤等が含まれ
ていても良い。

【００２２】本発明の測定方法は、上記した如き方法に
より調製された抗体感作不溶性担体を用いる免疫化学的
測定法であり、該抗体感作不溶性担体を用いる以外は特
に限定されない。このような免疫化学的測定法として
は、例えば、逆受身凝集反応法（東京化学同人 続生化
学実験講座５ 免疫生化学研究法 p.36-37、金原出版
株式会社臨床検査法提要 第30版 p.844-845等）等の
凝集反応を利用した測定法、例えば、比ろう法（金原出
版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.851-853
等）、免疫比濁法（金原出版株式会社 臨床検査法提要
第30版 p.853-854等）等の凝集反応を応用した光学
的測定法、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）（東京化
学同人 続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法 p.57
-61、金原出版株式会社臨床検査法提要 第30版 p.856
-862等）、イムノラジオメトリックアッセイ法（ＩＲＭ
Ａ）（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.
856-862等）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）
（東京化学同人 続生化学実験講座５免疫生化学研究法
p.62-65、金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30
版 p.862-865、特開昭56-106154号公報、特開昭58-237
96号公報等）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（金
原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.1145-114
9等）、蛍光・発光免疫測定法（金原出版株式会社 臨
床検査法提要 第30版p.865-867等）等の抗体感作不溶
性担体上での抗原抗体反応を利用した自体公知の免疫化
学的測定方法は全て挙げられる。

【００２３】また、測定対象物質としては、通常この分
野に於ける測定対象であれば特に限定されることなく挙
げられるが、例えば血液、血漿、血清等の体液や尿中
の、例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、
ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ１
ｑ）、Ｂ型肝炎ウイルス、癌胎児性抗原、Ｃ−反応性タ
ンパク質（以下、ＣＲＰと略記する。）、ヒト繊毛性ゴ
ナドトロピン、ヒト免疫不全ウイルス抗体、リウマチ因
子、抗ストレプトリジン−Ｏ抗体等が挙げられる。

【００２４】本発明の免疫化学的測定法用試薬は、種々
の免疫化学的測定法に於いて使用されるものであって、
前述した如き抗体感作不溶性担体を含有するものであ
り、その構成要件の好ましい態様及び具体例は上で述べ
た通りである。また、免疫学的測定法の例示は、先に述
べた通りであり、本発明の免疫化学的測定法用試薬は、
これら何れの免疫化学的測定法にも使用し得るが、なか
でもＭＣＡ又は／及びＰＣＡを感作させる不溶性担体と
してラテックス粒子を用いた測定法（金原出版株式会社
臨床検査法提要 第30版 p.854-856、特開昭59-1250
64号公報等）に於いて、本発明の免疫化学的測定法用試
薬を使用すれば、検査の自動化又は測定時間の短縮に適
した、経済的且つ充分な測定感度を有し、しかも広い測
定範囲の免疫化学的測定用試薬を得ることができるとい
う点で特に好ましい。

【００２５】また、各種試料中の測定対象物質を測定す
る目的で使用される、本発明の免疫化学的測定法用試薬
には、抗体感作不溶性担体として上記した如き方法によ
って調製された本発明に係る抗体感作不溶性担体を含ん
でなる以外に、自体公知の免疫化学的測定法用試薬に使
用される試薬類を含んでいても良く、これら試薬類の使
用濃度としては、通常この分野で使用される範囲内から
適宜選択される。例えば、不溶性担体としてラテックス
粒子を用いて調製された本発明に係る抗体感作不溶性担
体を含んでなる免疫化学的測定法用試薬は、該不溶性担
体を緩衝液等の溶液に懸濁させた懸濁液の形態で免疫化
学的測定に供される場合がある。このような懸濁液を調
製するために用いられる緩衝液としては、通常この分野
で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH
5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作
用を有するもの、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、グッド緩衝液等が好ましく挙げられる。尚、使用す
る不溶性担体の性質によっては、懸濁液の状態で放置し
ておくと自然凝集を起こしやすいものもあるが、このよ
うな場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝液、ホウ酸
緩衝液等を使用して懸濁液を調製する方が保存安定性の
面から好ましい。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度と
しては、通常10〜500mM、好ましくは10〜300mMの範囲か
ら適宜選択される。上記のような緩衝液に、本発明に係
る抗体感作不溶性担体を懸濁させる場合の、不溶性担体
の濃度としては、通常0.05〜10％（W/V）、好ましくは
0.05〜1％（W/V）の範囲から適宜選択される。尚、該懸
濁液には、通常この分野で使用されている、例えば、糖
類，タンパク質，界面活性剤等の安定化剤、ＮａＣｌ等
の塩類、防腐剤等が、通常この分野で使用される範囲内
で添加されていてもよい。

【００２６】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定
されるものではない。

【００２７】

【実施例】

実施例．１ （１）抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液の
調製 抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ〔和光純薬工業（株）製〕1.8mg
を含む50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlと、ポリスチレ
ンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業（株）〕を
２％（W/V）となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液
（pH7.1）１mlとを混合し、４℃で２時間反応させた。
その後遠心分離により分離したラテックスを50mMホウ酸
緩衝液（pH7.1）で洗浄し、ラテックス濃度が0.2％（W/
V）となるように、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと
略記する。）を0.5％（W/V）含有する50mMホウ酸緩衝液
（pH7.3）に再懸濁して、抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感
作ラテックス試液とした。

【００２８】（２）抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテ
ックス試液の調製 抗ヒトＣＲＰ山羊ＰＣＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．製）1.8mgを含む5
0mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlと、ポリスチレンラテッ
クス〔粒径0.12μm、積水化学工業（株）〕を２％（W/
V）となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）
１mlとを混合し、４℃で２時間反応させた。その後遠心
分離により分離したラテックスを50mMホウ酸緩衝液（pH
7.1）で洗浄し、ラテックス濃度が0.2％（W/V）となる
ように、ＢＳＡを0.5％（W/V）含有する50mMホウ酸緩衝
液（pH7.3）に再懸濁して、抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独
感作ラテックス試液とした。

【００２９】（３）ラテックス試液の調製 （１）で調製した抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテッ
クス試液１容量に対して、（２）で調製した抗ヒトＣＲ
Ｐ−ＰＣＡ単独感作ラテックス試液0.05, 0.11, 0.25,
0.67, 1.5, 又は4容量を夫々混合し、抗ヒトＣＲＰ抗体
感作ラテックス試液（以下、混合抗ヒトＣＲＰ抗体感作
ラテックス試液と略記する。）とした。

【００３０】（４）試料の調製 生理食塩水〔0.3％（W/V）アジ化ナトリウム及び150mM
塩化ナトリウム含有〕に、ヒトＣＲＰ〔和光純薬工業
（株）製〕を所定濃度となるように溶解したものを試料
とした。

【００３１】（５）測定方法 アジ化ナトリウムを0.1％（W/V）、ＢＳＡを0.1％（W/
V）及び塩化ナトリウムを500mM含有する50mM Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液（pH8.6）250μlと、上記
（４）で調製した試料 5μlとを混合し、37℃で５分間
予備加温を行った後、これに更に上記（３）で調製した
混合抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス試液 125μlを加
えて反応を開始させ、該ラテックス試液添加直後からの
５分間の吸光度変化量（ΔＥ）を測定した。尚、測定装
置は、自動汎用測定機日立７０７０形〔日立製作所
（株）製〕を使用し、測定波長660nm、測定温度 37℃で
測定を行った。結果を図１及び図２に夫々示す。尚、図
１中、−○−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテック
ス試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラ
テックス試液0.05容量を混合したラテックス試液を用い
た場合の測定結果を、−◇−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単
独感作ラテックス試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰ−Ｐ
ＣＡ単独感作ラテックス試液0.11容量を混合したラテッ
クス試液を用いた場合の測定結果を、−△−は抗ヒトＣ
ＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液１容量に対して抗
ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス試液0.25容量を
混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−
×−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液１
容量に対して抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス
試液0.67容量を混合したラテックス試液を用いた場合の
測定結果を夫々示す。また、図２中、−×−は抗ヒトＣ
ＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液１容量に対して抗
ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス試液0.67容量を
混合したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−
●−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液１
容量に対して抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス
試液1.5容量を混合したラテックス試液を用いた場合の
測定結果を、−◆−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラ
テックス試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独
感作ラテックス試液４容量を混合したラテックス試液を
用いた場合の測定結果を夫々示す。また、対照として、
（１）で調製した抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテッ
クス試液のみを用いた場合の測定結果を−□−として図
１に、また、（２）で調製した抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単
独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を−
▽−として図２に併せて示す。

【００３２】（結果）図１の結果から明らかなように、
抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックスと抗ヒトＣＲ
Ｐ−ＰＣＡ単独感作ラテックスを併用することにより、
ＭＣＡ単独感作ラテックスのみの使用では困難であった
低濃度域での測定感度が上昇することが判る。また、低
濃度域での測定感度の上昇は、ＰＣＡ単独感作不溶性担
体の割合が増すにつれてより上昇することも判る。ま
た、図２の結果より、ＰＣＡ単独感作ラテックスのみの
使用でみられる検量線の落ち込み（検量線のプロゾーン
現象）は、ＭＣＡ単独感作ラテックスとＰＣＡ単独感作
ラテックスとを併用することにより改善され、プロゾー
ン現象の改善の程度は、ＭＣＡ単独感作ラテックスの割
合が増すにつれ、より高くなることが判る。以上のこと
から、本発明の方法は、従来の方法に比べて、測定対象
物質の濃度に応じて高感度で、しかも広い測定範囲にわ
たって、高精度にその濃度を測定し得ることが判る。

【００３３】実施例.２ （１）抗ヒトＣＲＰ抗体混合感作ラテックス試液の調製 実施例.１の（１）で使用した抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ1.7
1mg及び実施例.１の（２）で使用した抗ヒトＣＲＰ山羊
ＰＣＡ0.09mgを含む50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１ml
（ＭＣＡ１重量に対し、山羊ＰＣＡを0.05重量の比率）
と、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学
工業（株）〕を２％（W/V）となるように懸濁させた50m
Mホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlとを混合し、４℃で２時間
反応させた。その後遠心分離により分離したラテックス
を50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）で洗浄し、ラテックス濃
度が0.2％（W/V）となるように、ＢＳＡを0.5％（W/V）
含有する50mMホウ酸緩衝液（pH7.3）に再懸濁して、抗
ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス試液（以下、抗ヒトＣＲ
Ｐ抗体混合感作ラテックス試液と略記する。）とした。

【００３４】（２）試料の調製 実施例.１の（４）と同じ。

【００３５】（３）測定方法 実施例.１の（５）と同じ。また対照として、実施例.１
の（１）〜（３）で調製したヒト抗ＣＲＰ−ＭＣＡ単独
感作ラテックス、ヒト抗ＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテッ
クス及び混合抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス試液（抗
ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感作ラテックス試液１容量に対
し、抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス試液0.05
容量を混合したもの）を用いた結果も、図３に併せて示
す。尚、図３中、−□−は抗ヒトＣＲＰ−ＭＣＡ単独感
作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、−▽
−は抗ヒトＣＲＰ−ＰＣＡ単独感作ラテックス試液のみ
を用いた場合の測定結果を、−○−は混合抗ヒトＣＲＰ
抗体感作ラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−
＋−は抗ヒトＣＲＰ抗体混合感作ラテックス試液を用い
た場合の測定結果を夫々示す。

【００３６】（結果）図３の結果から明らかなように、
ＭＣＡ及びＰＣＡとを感作させた抗ヒトＣＲＰ抗体混合
感作ラテックスを用いると、ＭＣＡ単独感作ラテックス
のみの使用では困難であった低濃度域での測定感度を上
昇させることが可能となることが判る。一方、ＰＣＡ単
独感作ラテックスのみの使用でみられる検量線の落ち込
み（プロゾーン現象）も、混合抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラ
テックスを用いることにより改善されることが判る。以
上のことから、混合抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックスを
用いることにより低濃度域での測定感度が高い試薬が得
られることが判る。

【００３７】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、抗体感作不
溶性担体を用いる改良された免疫化学的測定方法及びそ
の試薬を提供するものであり、本発明の方法を用いるこ
とにより、従来の方法に比べて、測定対象物質の濃度に
応じて充分な測定感度を有し、しかも低濃度域から高濃
度域にわたる広い測定範囲に於いて、高精度にその濃度
を測定し得るという効果を奏するので、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた、各種ラテックス試液を用
いた場合の検量線を示す。

【図２】実施例１で得られた、各種ラテックス試液を用
いた場合の検量線を示す。

【図３】実施例１及び２で得られた、各種ラテックス試
液を用いた場合の検量線を示す。

【符号の説明】

図１〜３に於いて、−□−は抗ヒトＣＲＰモノクローナ
ル抗体単独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定
結果を、−○−は抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体単独
感作ラテックス試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰポリク
ローナル抗体単独感作ラテックス試液0.05容量を混合し
たラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−◇−は
抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体単独感作ラテックス試
液１容量に対して抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体単独
感作ラテックス試液0.11容量を混合したラテックス試液
を用いた場合の測定結果を、−△−は抗ヒトＣＲＰモノ
クローナル抗体単独感作ラテックス試液１容量に対して
抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体単独感作ラテックス試
液0.25容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測
定結果を、−×−は抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体単
独感作ラテックス試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰポリ
クローナル抗体単独感作ラテックス試液0.67容量を混合
したラテックス試液を用いた場合の測定結果を、−●−
は抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体単独感作ラテックス
試液１容量に対して抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体単
独感作ラテックス試液1.5容量を混合したラテックス試
液を用いた場合の測定結果を、−◆−は抗ヒトＣＲＰモ
ノクローナル抗体単独感作ラテックス試液１容量に対し
て抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体単独感作ラテックス
試液４容量を混合したラテックス試液を用いた場合の測
定結果を、−▽−は抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体単
独感作ラテックス試液のみを用いた場合の測定結果を、
また、−＋−は抗ヒトＣＲＰ抗体混合感作ラテックス試
液を用いた場合の測定結果を夫々示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年７月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】また、測定対象物質としては、通常この分
野に於ける測定対象であれば特に限定されることなく挙
げられるが、例えば血液、血漿、血清等の体液や尿中
の、例えば免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、
ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ１
ｑ）、Ｂ型肝炎ウイルス、癌胎児性抗原、Ｃ−反応性タ
ンパク質（以下、ＣＲＰと略記する。）、ヒト繊毛性ゴ
ナドトロピン等が挙げられる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 感作させる抗体として、測定対象物質に
   対するモノクローナル抗体と、該物質に対するポリクロ
   ーナル抗体を用いることを特徴とする、抗体感作不溶性
   担体を用いる測定対象物質の免疫化学的測定方法。
2. 【請求項２】 抗体感作不溶性担体が、測定対象物質に
   対するモノクローナル抗体を感作させた不溶性担体と、
   該物質に対するポリクローナル抗体を感作させた不溶性
   担体とからなる、請求項１に記載の測定方法。
3. 【請求項３】 感作させる抗体として、測定対象物質に
   対するモノクローナル抗体と、該物質に対するポリクロ
   ーナル抗体を用いて調製された、抗体感作不溶性担体を
   含んで成る免疫化学的測定法用試薬。
4. 【請求項４】 抗体感作不溶性担体が、測定対象物質に
   対するモノクローナル抗体を感作させた不溶性担体と、
   該物質に対するポリクローナル抗体を感作させた不溶性
   担体とからなる、請求項３に記載の免疫化学的測定法用
   試薬。