JPH09196921A - モノクローナル抗体担持不溶性担体及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 モノクローナル抗体の使用量は少ないが、従
来と同等以上の反応性を有するモノクローナル抗体担持
不溶性担体とその調製方法、並びに、該モノクローナル
抗体担持不溶性担体を用いる免疫学的測定方法及び測定
用試薬の提供。 【解決手段】 モノクローナル抗体と該モノクローナル
抗体以外の免疫グロブリンとを担持した不溶性担体とそ
の調製方法、並びに、該モノクローナル抗体及び該免疫
グロブリン担持不溶性担体を用いる免疫学的測定方法、
及び、該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリン担持
不溶性担体を含んでなる免疫学的測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば免疫学的測
定法等に用いられるモノクローナル抗体担持不溶性担体
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、病院、検査センター等に於ては、
人手不足、コスト削減、或は多量検体処理の要請等の面
から、臨床検査等の諸検査の自動化又は測定時間の短縮
化が図られてきた。現在、免疫化学分野に於ては、この
ような自動化に適した方法として、測定対象物質に対す
る抗体を担持させた不溶性担体粒子が測定対象物質と反
応して起こる凝集反応を利用して、測定対象物質を測定
する凝集法等が注目され、一般に広く使用されている。

【０００３】凝集法は、例えば血液、血漿、血清等の体
液や尿中の、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、癌胎児性抗
原、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ−反応性タンパク質、Ｂ
型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体、リウ
マチ因子、抗ストレプトリジン−Ｏ抗体、ヒト繊毛性ゴ
ナドトロピン等、免疫学的に抗原又は抗体に属する物質
の測定等に利用されている。

【０００４】凝集法の原理は、例えば、特公昭58-11575
号公報に記載されているように、生体試料中の抗原（測
定対象物質）を測定する場合であれば、該抗原に特異的
に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有するフラ
グメント〔Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂フラグメ
ント、Ｆａｂ'フラグメント等〕を担持させた例えばラ
テックス粒子等の不溶性担体と目的の生体試料を混合し
て、測定対象抗原と不溶性担体に担持させた抗体との抗
原抗体反応の結果生ずる凝集の程度を測定することによ
り、該抗原を検出又は定量するというものである。

【０００５】生体試料中の抗原を測定する場合に使用す
る、該抗原に特異的に結合する抗体としては、ポリクロ
ーナル抗体やモノクローナル抗体が用いられる。しか
し、ポリクローナル抗体は、種々の抗原決定基に対する
抗体を多種含む不均一なものであるため、ポリクローナ
ル抗体を使用した場合、免疫学的交差反応が生じ易く、
測定対象物質である抗原を正確に測定することができな
い場合もあった。

【０００６】また、ポリクローナル抗体は、種々の抗原
決定基に対する抗体を多種含むため、一定の品質のもの
を常に得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での
該抗体の損失も大きいという問題もあった。これに対し
て、モノクローナル抗体は、測定対象物質である抗原の
特定の抗原決定基に対して特異性の高いものを得ること
ができ、また、一定した品質のものを得ることが可能で
あるため、免疫学的測定用試薬を大量生産するための原
料として有利である。

【０００７】従って、免疫学的測定法に於て使用する試
薬を調製するに当たっては、このような品質の安定性の
面からポリクローナル抗体を用いるよりも、モノクロー
ナル抗体を用いた方が有利である。そこで、測定対象物
質である抗原に特異的に結合する抗体として、モノクロ
ーナル抗体を使用する方法が提案されている（例えば、
特開平2-66458号公報等）。

【０００８】しかしながら、このようなモノクローナル
抗体の作製には、細胞融合技術や遺伝子組換え技術の利
用が不可欠であり、また、抗体を大量に得るためには多
大な労力と時間を必要とするため、原価がポリクローナ
ル抗体に比べ相当高いという問題があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、モノクローナル抗体の使
用量は少ないが、従来と同等以上の反応性を有するモノ
クローナル抗体担持不溶性担体とその調製方法、並び
に、該モノクローナル抗体担持不溶性担体を用いる免疫
学的測定方法及び測定用試薬を提供することを目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体と該モノクローナル抗体以外の免疫グロブリンと
を担持してなる不溶性担体の発明である。

【００１１】また、本発明は、モノクローナル抗体と該
モノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとを含有する
溶液を用いて、物理的又は化学的に、不溶性担体に該モ
ノクローナル抗体及び該免疫グロブリンを担持させるこ
とを特徴とする上記不溶性担体の調製方法の発明であ
る。

【００１２】更に、本発明は、モノクローナル抗体と該
モノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとを担持して
なる不溶性担体を用いることを特徴とする免疫学的測定
方法の発明である。

【００１３】更にまた、本発明は、モノクローナル抗体
と該モノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとを担持
してなる不溶性担体を含んでなる免疫学的測定用試薬の
発明である。

【００１４】即ち、本発明者らは、モノクローナル抗体
を不溶性担体に担持させるに際して、抗原との反応性を
低下させることなく比較的高価なモノクローナル抗体の
使用量を減少させ得る方法を見出すべく鋭意研究を重ね
た結果、モノクローナル抗体と該モノクローナル抗体以
外の免疫グロブリンとを含有する溶液を用いて、不溶性
担体に該モノクローナル抗体と該免疫グロブリンとを担
持させれば、抗原に対する反応性は、従来の、モノクロ
ーナル抗体のみを用いて不溶性担体に担持させる方法に
より得られた担持不溶性担体と同程度以上の担持不溶性
担体が得られ、且つ使用する該モノクローナル抗体の量
を大幅に減少させることができるため、経費の削減が可
能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】本発明に於て使用される、担持させたいモ
ノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとしては、該モ
ノクローナル抗体に対する抗原、即ち測定対象物である
目的の抗原に対する反応性がないもの、或は反応性が低
いもの（即ち、実用上該モノクローナル抗体を使用した
免疫学的測定法に影響を及ぼさないようなもの）が挙げ
られ、例えばヒト、馬、羊、山羊、ラット、マウス等に
由来する、例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＧ等の免疫グロブリンのなかから適宜選択された、前
述の如き性質を有するものが挙げられる。より好ましく
は、ＩｇＧのなかから選択された、前述の如き性質を有
するものが挙げられる。これら免疫グロブリンは、市販
のものを使用しても良いし、また、動物血清から公知の
方法（例えば、「タンパク質精製法，Robert.K.Scopes
著，シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社，1985
年」等に記載された方法。）で取得される免疫グロブリ
ンを使用しても良い。また、これら免疫グロブリンを使
用するに当たっては、これら免疫グロブリンの一部、例
えば、免疫グロブリンをパパイン等で部分分解して得ら
れるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部分分解して得
られるＦ（ａｂ'）₂フラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂フラグ
メントを還元処理して得られるＦａｂ'フラグメント等
（以下、これらを総称して免疫グロブリンフラグメント
と略記する。）として使用しても良い。尚、このような
フラグメントとして使用した方が、目的の抗原測定時に
於ける非特異的反応を回避し易くなるのでより好まし
い。また、これら免疫グロブリンや免疫グロブリンフラ
グメントは２種以上を適宜混合して用いても良い。尚、
免疫学的測定法に用いた場合の測定感度を考慮すると、
ＩｇＧ及び免疫グロブリンフラグメントが、目的の抗原
を高感度に測定し得るのでより好ましい。これら免疫グ
ロブリン又は免疫グロブリンフラグメントを使用して目
的の担持不溶性担体を調製するには、目的の抗原に対す
るモノクローナル抗体のみを使用して、不溶性担体に該
モノクローナル抗体を担持させる場合に使用する担持用
溶液中のモノクローナル抗体量のうち、通常50〜95％、
好ましくは70〜90％を、これら免疫グロブリン又は免疫
グロブリンフラグメントに置き換えた溶液を使用して、
目的のモノクローナル抗体担持不溶性担体を調製すれば
良い。尚、該溶液中のモノクローナル抗体量と該モノク
ローナル抗体以外の免疫グロブリン量の総和量（以下、
本発明に係る総抗体タンパク質量と略記する。）は、使
用する不溶性担体の表面積や抗体の大きさ等によって異
なるため一概には言えないが、通常0.1μg/ml〜20mg/m
l、好ましくは１μg/ml〜５mg/mlの範囲から適宜選択さ
れる。より具体的には、例えば不溶性担体としてラテッ
クス粒子を使用した場合の本発明に係る総抗体タンパク
質量は、通常0.1〜20mg/ml、好ましくは0.5〜５mg/mlで
あり、また、不溶性担体としてマイクロプレートを使用
した場合は、通常0.1〜100μg/ml、好ましくは１〜50μ
g/mlである。

【００１６】本発明に於て使用される目的の抗原に対す
るモノクローナル抗体としては、その由来は特に限定さ
れず、市販品、或は細胞融合技術や遺伝子組み換え技術
等を利用した自体公知の方法〔Eur.J Immunol,6,511
（1976）〕等によって産生されたモノクローナル抗体等
が全て使用可能である。また、これら目的の抗原に対す
るモノクローナル抗体は、パパイン等で部分分解して得
られるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部分分解して
得られるＦ（ａｂ'）₂フラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂フラ
グメントを還元処理して得られるＦａｂ'フラグメント
等（以下、これらを総称して、モノクローナル抗体フラ
グメントと略記する。）として使用することも可能であ
る。

【００１７】本発明に於て用いられる不溶性担体として
は、通常の免疫学的測定法で用いられる不溶性担体であ
れば何れも使用可能であるが、例えば、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポ
リクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラ
バー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラ
ス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無
機物質等が好ましく挙げられる。また、これら不溶性担
体は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子、ラテ
ックス粒子、マイクロプレート等多種多様の形態で使用
し得る。なかでも、ラテックス粒子は、人工担体であ
り、目的に応じて担体表面を化学的処理し易いこと、ま
た非特異反応が起こりにくいこと等の点から特に好まし
く用いられる。その材質は特に限定されないが、例えば
ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、ア
クリル酸系ラテックス等が好ましく挙げられる。尚、こ
れらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合
によって得られる、ポリスチレンラテックス粒子等は表
面の疎水性が強いため、タンパク質或はペプチドをスム
ーズに吸着し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、
乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有
しているので、特に好ましい。尚、種々の変性ラテック
ス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテッ
クス（磁性粒子を内包させたラテックス）等も必要に応
じて使用できることは言うまでもない。また、本発明に
於て用いられるラテックス粒子としては、市販のものが
使用できるが、ラテックス粒子の平均粒径が小さいも
の、即ち、単位重量あたりの表面積が大きいものの方
が、抗体を効率良く担持させることができるので好まし
く用いられる。より具体的には、通常0.05〜2.4μｍ、
好ましくは0.05〜1.0μｍの平均粒径のものが好ましく
用いられる。

【００１８】本発明に於て、モノクローナル抗体と該モ
ノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとを含有する溶
液を用いて、不溶性担体に該モノクローナル抗体及び該
免疫グロブリンを担持させる方法としては、通常この分
野で利用される方法は全て挙げられる。具体的には、物
理的担持方法、即ち、該モノクローナル抗体及び該免疫
グロブリンを不溶性担体に物理的に吸着させて該モノク
ローナル抗体及び該免疫グロブリンを不溶性担体に担持
させる、所謂物理的吸着法〔特公平5-41946号公報、ス
ミロン テクニカルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩ
ＳＡシリーズ１ ＥＬＩＳＡ測定法の紹介，住友ベーク
ライト（株）発行、スミロン テクニカルレポート，Ｓ
ＵＭＩＬＯＮ ＥＬＩＳＡシリーズ ２ ＥＬＩＳＡ製
品の固相表面，住友ベークライト（株）発行等〕が、代
表的なものとして挙げられる。該方法は、通常、例え
ば、ポリスチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニー
ル，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート等の合成高
分子化合物、活性炭、例えば多孔性ガラス，スリガラ
ス，アルミナ，シリカゲル，金属酸化物，ヒドロキシア
パタイト等の無機物質を不溶性担体として用いた場合に
好ましく用いられる方法である。なかでも、ガラス、ポ
リスチレン、ポリ塩化ビニール等を、例えばチューブ、
ビーズ、ディスク片、微粒子、ラテックス粒子、マイク
ロプレート等の形態とした不溶性担体を用いた場合に、
特に好ましく用いられる方法である。また、物理的担持
方法によっては、担持させたいモノクローナル抗体を不
溶性担体に安定に担持させることができない場合は、該
物理的担持方法以外の自体公知の担持方法、例えばモノ
クローナル抗体（又は該モノクローナル抗体フラグメン
ト）及び該モノクローナル抗体以外の免疫グロブリン
（又は該免疫グロブリンフラグメント）の官能基と不溶
性担体上の官能基とを共有結合によって結合させて該モ
ノクローナル抗体及び該免疫グロブリンを不溶性担体に
担持させる、所謂共有結合法〔特公平5-41946号公報、
スミロン テクニカルレポート，ＳＵＭＩＬＯＮ ＥＬ
ＩＳＡシリーズ ２ ＥＬＩＳＡ製品の固相表面，住友
ベークライト（株）発行等〕等の化学的担持方法を利用
して該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンを不溶
性担体に担持させることができる。該化学的担持方法に
よってモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体以
外の免疫グロブリンを不溶性担体に担持させる際に関与
する官能基としては、α−又はε−アミノ基、α−、β
−、又はγ−カルボキシル基、メルカプト基、水酸基、
イミダゾリル基、ヒドロキシフェニル基などが挙げられ
る。これらの官能基は、ジアゾニウム基、酸アジド、イ
ソシアナート、或は活性型のハロゲン化アルキル等と反
応するため、これらとの反応性を利用することによっ
て、モノクローナル抗体（又は該モノクローナル抗体フ
ラグメント）及び該モノクローナル抗体以外の免疫グロ
ブリン（又は該免疫グロブリンフラグメント）と不溶性
担体とを共有結合させることが可能となる（代謝，第８
巻，696頁，1971年等）。更に、使用する不溶性担体が
ガラス等の無機物質の場合には、例えば、これをγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシラン等の反応性に富んだ官
能基（例えば、アミノ基等）を有するトリアルコキシシ
ラン誘導体で処理すれば、該不溶性担体に反応性の官能
基を導入することができる。また、不溶性担体として
は、不溶性担体表面に上記した如き官能基が導入されて
いる市販の不溶性担体〔例えば、住友ベークライト
（株）製、ＳＵＭＩＬＯＮ アミノ，ＳＵＭＩＬＯＮ
カルボ等〕を用いることもできる。このような官能基が
導入された不溶性担体、例えばアミノ基導入不溶性担体
に、モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体以外
の免疫グロブリンを共有結合させる方法としては、例え
ば以下のような方法が挙げられる。即ち、例えば、アミ
ノ基導入不溶性担体をグルタルアルデヒドで処理して反
応性に富んだアルデヒド基を導入し、これを該モノクロ
ーナル抗体及び該モノクローナル抗体以外の免疫グロブ
リンのアミノ基と結合させる方法（J.Biochemd.,第80
巻,895頁,1976年）がそれである。この他、モノクロー
ナル抗体及び該モノクローナル抗体以外の免疫グロブリ
ンの種類と、結合させる不溶性担体上の官能基の種類に
よって、種々の架橋試薬を用いることにより、不溶性担
体とモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体以外
の免疫グロブリンとを共有結合させることができる。こ
のような架橋試薬としては、例えば、アミノ基とアミノ
基とを結合させる場合には、前述のグルタルアルデヒド
の他、サクシンアルデヒド、マロンアルデヒド等が、ま
た、アミノ基とメルカプト基とを結合させる場合には、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミド
エステル、４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル
等が、更に、メルカプト基とメルカプト基とを結合させ
る場合には、ｏ−フェニレンビスマレイミド等が、更に
また、アミノ基とカルボキシル基とを結合させる場合に
は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩等のカルボジイミド化合物等が挙げられる。

【００１９】モノクローナル抗体と該モノクローナル抗
体以外の免疫グロブリンとを含有させる溶液としては、
該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンが不溶性担
体上に吸着或は結合するのを妨げる性質を有するもので
なければ良く、例えば精製水、例えばpH5.0〜10.0、好
ましくはpH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリ
シン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が好ましく挙げられる。ま
た、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10〜
500mM、好ましくは10〜200mMの範囲から適宜選択され
る。また、この溶液中には、該モノクローナル抗体及び
該免疫グロブリンが不溶性担体上に吸着或は結合するの
を妨げない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩
類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていて
も良い。

【００２０】モノクローナル抗体及び該モノクローナル
抗体以外の免疫グロブリンを不溶性担体に担持（吸着或
は結合）させるために使用する溶液中に、該モノクロー
ナル抗体と該モノクローナル抗体以外の免疫グロブリン
とを含有させる方法としては、最終的にモノクローナル
抗体以外の免疫グロブリンを該モノクローナル抗体を含
む溶液中に含有させることが出来る方法であればよく、
特に限定されない。

【００２１】本発明に於て、モノクローナル抗体と該モ
ノクローナル抗体以外の免疫グロブリンとを含有する溶
液を用いて、物理的又は化学的に、不溶性担体に該モノ
クローナル抗体及び該免疫グロブリンを担持させる方法
としては、従来の担持方法で用いられていたモノクロー
ナル抗体を含有する溶液の代わりに、上記の如くして調
製された該モノクローナル抗体と該モノクローナル抗体
以外の免疫グロブリンとを上述した如き割合となるよう
に含有させた溶液を用いて、上述の如き担持方法によ
り、該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンを不溶
性担体に担持させればよい。具体的には、例えば、モノ
クローナル抗体と該モノクローナル抗体以外の免疫グロ
ブリンとを含有する溶液と、上記した如き不溶性担体を
懸濁させた懸濁液とを混合させる方法、例えば、モノク
ローナル抗体と該モノクローナル抗体以外の免疫グロブ
リンとを含有する溶液に不溶性担体を懸濁させる方法等
により、該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンと
不溶性担体とを接触させ、上述の如き担持方法により、
該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンを不溶性担
体に担持させることができる。尚、この不溶性担体を懸
濁させるための溶液としては、モノクローナル抗体及び
免疫グロブリンが該不溶性担体上に吸着或は結合するの
を妨げる性質を有するものでなければ良く、例えば精製
水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性
付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス
緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液
等が好ましく挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩
衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜200
mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、
該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリンが不溶性担
体上に吸着或は結合するのを妨げない量であれば、例え
ば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タン
パク質等が含まれていても良い。

【００２２】以下に、不溶性担体としてラテックス粒子
を使用する場合を例にとり、本発明の方法をより具体的
に説明する。

【００２３】即ち、先ず、モノクローナル抗体（又はモ
ノクローナル抗体フラグメント）と該モノクローナル抗
体以外の免疫グロブリン（又は該免疫グロブリンフラグ
メント）とを上記した如き割合で含む10〜500mMの上記
した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）と、ラテックス粒子
（粒径0.05〜2.4μｍ）を通常0.05〜10％（W/V）、好ま
しくは0.05〜１％（W/V）懸濁させた、10〜500mMの上記
した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）とを、等量混合し、通
常０〜56℃、好ましくは２〜40℃で通常0.5〜24時間、
好ましくは0.5〜５時間反応させる。尚、モノクローナ
ル抗体（又はモノクローナル抗体フラグメント）と該モ
ノクローナル抗体以外の免疫グロブリン（又は該免疫グ
ロブリンフラグメント）とを含む緩衝液と、ラテックス
粒子を懸濁させた緩衝液との混合液中の本発明に係る総
抗体タンパク質量の通常５〜50％（W/V）、好ましくは1
0〜30％（W/V）はモノクローナル抗体（又はモノクロー
ナル抗体フラグメント）であり、通常95〜50％（W/
V）、好ましくは90〜70％（W/V）は該モノクローナル抗
体以外の免疫グロブリン（又は該免疫グロブリンフラグ
メント）である。該混合液中の本発明に係る総抗体タン
パク質量は、ラテックス粒子の表面積や抗体の大きさ等
によって異なるため一概には言えないが、通常0.1〜20m
g/ml、好ましくは0.5〜５mg/mlである。その後反応懸濁
液を遠心分離し、得られたラテックス粒子を10〜500mM
の上記した如き緩衝液（pH5.0〜10.0）で洗浄すれば、
目的の該モノクローナル抗体及び該免疫グロブリン担持
ラテックス粒子が得られる。尚、通常この分野で行われ
ているブロッキング処理、即ち、上述の如くして得られ
たモノクローナル抗体及び免疫グロブリン担持不溶性担
体を、更にモノクローナル抗体とは無関係のタンパク
質、例えば牛血清アルブミン、乳タンパク質、卵白アル
ブミン等を含有する溶液中に浸漬する処理を行うこと
は、測定時の非特異的反応を防ぐ点から望ましい。

【００２４】本発明の、モノクローナル抗体及び該モノ
クローナル抗体以外の免疫グロブリン担持不溶性担体
（以下、「本発明の担持不溶性担体」と略記する。）
を、各種試料中の測定対象物質等を免疫学的測定法によ
り測定する際に利用すれば、測定対象物質を従来法に於
ける場合よりも高感度に測定することが可能である。ま
た、本発明の担持不溶性担体は、凍結処理や凍結乾燥処
理等を施した状態、或は懸濁液等の溶液状態等、多種の
形態で保存し得ることは言うまでもない。尚、これらの
うち、溶液状態で保存する場合に用いられる溶液として
は、例えば担持されたモノクローナル抗体の抗体価を低
下させる性質等、本発明の担持不溶性担体の安定性に悪
影響を与える性質を有するものでなければ良く、例えば
精製水、例えばpH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の
中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩
衝液等が好ましく挙げられる。また、これらの緩衝液中
の緩衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10
〜200mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中
には、該モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体
以外の免疫グロブリンが不溶性担体上に吸着或は結合す
るのを妨げない量であれば、例えば糖類、タンパク質、
ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤等が含まれてい
ても良い。

【００２５】本発明の担持不溶性担体を用いる本発明の
免疫学的測定方法は、モノクローナル抗体担持不溶性担
体を使用し得る免疫学的測定方法であれば何れの方法で
も良く、特に限定されない。このような免疫学的測定方
法としては、例えば、逆受身凝集反応法（東京化学同人
続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法 p.36-37、
金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.844-84
5等）等の凝集反応を利用した測定法、例えば、比ろう
法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.85
1-853等）、免疫比濁法（金原出版株式会社 臨床検査
法提要 第30版p.853-854等）等の溶液内沈降（凝集）
反応を応用した光学的測定法、例えば、ラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩＡ）（東京化学同人 続生化学実験講座
５ 免疫生化学研究法 p.57-61、金原出版株式会社
臨床検査法提要 第30版 p.856-862等）、イムノラジ
オメトリックアッセイ法（ＩＲＭＡ）（金原出版株式会
社臨床検査法提要 第30版 p.856-862等）、エンザイ
ムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）（東京化学同人 続生化
学実験講座５ 免疫生化学研究法 p.62-65、金原出版
株式会社 臨床検査法提要 第30版 p.862-865、特開
昭56-106154号公報、特開昭58-23796号公報等）、固相
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（金原出版株式会社 臨
床検査法提要 第30版 p.1145-1149等）、蛍光・発光
免疫測定法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30
版 p.865-867等）等の抗体担持不溶性担体上での抗原
抗体反応を利用した自体公知の免疫学的測定方法は全て
挙げられる。

【００２６】各種試料中の測定対象物質を測定する目的
で使用される、本発明の免疫学的測定用試薬は、抗体担
持不溶性担体として上記した如き方法によって調製され
た本発明の担持不溶性担体を含んでなる以外は、自体公
知の免疫学的測定用試薬に使用される試薬類を、この分
野で使用される範囲内で含有するように調製すれば足り
る。例えば不溶性担体としてラテックス粒子を用いて調
製された本発明の担持不溶性担体を含んでなる免疫学的
測定用試薬は、該不溶性担体を緩衝液等の溶液に懸濁さ
せた懸濁液の形態で免疫学的測定に供される。このよう
な懸濁液を調製するために用いられる緩衝液としては、
通常この分野で使用されるものであれば特に限定されな
いが、通常pH5.0〜10.0、好ましくはpH6.5〜8.5の中性
付近に緩衝作用を有するもの、例えば、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましく挙げられる。
尚、使用する不溶性担体の性質によっては、懸濁液の状
態で放置しておくと自然凝集を起こしやすいものもある
が、このような場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝
液、ホウ酸緩衝液等を使用して懸濁液を調製する方が保
存安定性の面から好ましい。また、これらの緩衝液の緩
衝剤濃度としては、通常10〜500mM、好ましくは10〜200
mMの範囲から適宜選択される。上記のような緩衝液に、
本発明の担持不溶性担体を懸濁させる場合の、不溶性担
体の濃度としては、通常0.05〜10重量％、好ましくは0.
05〜１重量％の範囲から適宜選択される。尚、該懸濁液
には、通常この分野で使用されている、例えば、糖類，
タンパク質，界面活性剤等の安定化剤、ＮａＣｌ等の塩
類、防腐剤等が、通常この分野で使用される範囲内で添
加されていてもよい。

【００２７】本発明の担持不溶性担体、若しくは本発明
の免疫学的測定用試薬は、種々の免疫学的測定法に於て
使用することが可能である。これら免疫学的測定法の例
示は、先に述べた通りであり、本発明の担持不溶性担体
若しくは免疫学的測定用試薬は、これら何れの免疫学的
測定方法にも使用し得るが、なかでもモノクローナル抗
体を担持させる不溶性担体としてラテックス粒子を用い
た測定法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版
p.854-856、特開昭59-125064号公報等）に於て、本発
明の担持不溶性担体（即ち、担持ラテックス粒子）を使
用すれば、検査の自動化又は測定時間の短縮化に適した
経済的且つ高感度な免疫学的測定用試薬を得ることがで
きるという点で特に好ましい。また、測定対象として
は、通常この分野に於ける測定対象であれば特に限定さ
れることなく挙げられるが、例えば血液、血漿、血清等
の体液や尿中の、例えばＢ型肝炎ウイルス、癌胎児性抗
原、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ−反応性タンパク質（以
下、ＣＲＰと略記する。）、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、ヒ
ト免疫不全ウイルス抗体、リウマチ因子、抗ストレプト
リジン−Ｏ抗体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等が挙げら
れる。

【００２８】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定
されるものではない。

【００２９】

【実施例】

実施例．１ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体担持ラテックス試液の調
製 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体（日本バイオテ
スト研究所製）と兎ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．製）とを所定濃度含む50mMホウ酸緩衝液（pH
7.1）１mlと、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12μm、
積水化学工業（株）〕を２％（W/V）となるように懸濁
させた50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlとを混合し、４
℃で２時間反応させた。その後遠心分離により分離した
ラテックスを50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）で洗浄し、ラ
テックス濃度が0.2％（W/V）となるように、牛血清アル
ブミン（以下、ＢＳＡと略記する。）を0.5％（W/V）含
有する50mMホウ酸緩衝液（pH7.3）に再懸濁して、抗ヒ
トヘモグロビン抗体担持ラテックス試液とした。得られ
た７種のラテックス試液（１〜７）についての、抗ヒト
ヘモグロビンモノクローナル抗体担持ラテックス調製時
に於ける抗体含有溶液中の抗ヒトヘモグロビンモノクロ
ーナル抗体及び兎ＩｇＧの濃度を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】（２）試料の調製 0.1％（W/V）ＢＳＡを含有した生理食塩水〔0.3％（W/
V）アジ化ナトリウム及び150mM塩化ナトリウム含有〕
に、ヒトヘモグロビン（ＳＩＧＭＡ社製）を所定濃度と
なるように溶解したものを試料とした。 （３）測定方法 アジ化ナトリウムを0.1％（W/V）及び塩化ナトリウムを
150mM含有する50mM ２−［４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（以下、Ｈ
ＥＰＥＳと略記する。）緩衝液（pH7.0）200μlと、上
記（２）で調製した試料 25μlとを混合し、37℃で５分
間予備加温を行った後、これに更に上記（１）で調製し
た抗ヒトヘモグロビン抗体担持ラテックス試液 50μlを
加えて反応を開始させ、該ラテックス試液添加直後から
の15分間の吸光度変化量（ΔＥ）を測定した。尚、測定
装置は、自動汎用測定機ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（日本ロ
シュ製）を使用し、測定波長 660nm、測定温度 37℃で
測定を行った。結果を表２に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】（結果）表２の結果から明らかなように、
抗体担持ラテックス調製時の総抗体タンパク質量のうち
の50〜95％を兎ＩｇＧで置き換えてモノクローナル抗体
を担持させたラテックスを含有するラテックス試液（即
ち、ラテックス試液２〜６）を使用してヒトヘモグロビ
ンを測定すると、モノクロナール抗体のみを担持させた
ラテックスを含むラテックス試液（即ち、ラテックス試
液７）を使用した場合よりも高感度にヒトヘモグロビン
を測定し得ることが判る。即ち、本発明の方法を利用す
ることにより、モノクローナル抗体の使用量を、従来の
担持方法で行った場合の５〜50％に減少させることがで
きることと共に、従来の担持方法で得られたモノクロー
ナル抗体担持ラテックスを使用する場合よりも、本発明
の方法で得られたモノクローナル抗体担持ラテックスを
使用する場合の方が測定感度を大幅に上昇させることが
できることが判る。

【００３４】実施例.２ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体担持ラテックス試液の調
製 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体（日本バイオテ
スト研究所製）と、ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）、山羊Ｉ
ｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）及び羊ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社
製）から選ばれた水溶性タンパク質の一種とを所定濃度
含む50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlと、ポリスチレン
ラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業（株）〕を２
％（W/V）となるように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液（p
H7.1）１mlとを混合し、４℃で２時間反応させた。その
後遠心分離により分離したラテックスを50mMホウ酸緩衝
液（pH7.1）で洗浄し、ラテックス濃度が0.2％（W/V）
となるように、ＢＳＡを0.5％（W/V）含有する50mMホウ
酸緩衝液（pH7.3）に再懸濁して、抗ヒトヘモグロビン
抗体担持ラテックス試液とした。得られた５種のラテッ
クス試液（７〜11）についての、抗ヒトヘモグロビンモ
ノクローナル抗体担持ラテックス調製時に於ける抗体含
有溶液中の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体及び
水溶性タンパク質の濃度を表３に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】（２）試料の調製 実施例.１の（２）と同じ。 （３）測定方法 ポリエチレングリコール６０００を2.0％（W/V）、アジ
化ナトリウムを0.1％（W/V）及び塩化ナトリウムを150m
M含有する50mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.0）200μlと、
上記（２）で調製した試料 25μlとを混合し、37℃で５
分間予備加温を行った後、これに更に上記（１）で調製
した抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体担持ラテッ
クス試液 50μlを加えて反応を開始させ、該ラテックス
試液添加直後からの15分間の吸光度変化量（△Ｅ）を測
定した。尚、測定装置は、自動汎用測定機ＣＯＢＡＳ
ＭＩＲＡ（日本ロシュ製）を使用し、測定波長 660nm、
測定温度 37℃で測定を行った。結果を表４に示す。

【００３７】

【表４】

【００３８】（結果）表４の結果から以下のことが判
る。 ラテックス試液７及び８の結果から、単に抗体担持ラ
テックス調製時のモノクローナル抗体濃度を低下させた
だけ（他の共存タンパク質は無添加）では、得られるラ
テックス試液の測定感度が大幅に低下する。 ラテックス試液７、10及び11の結果から、免疫グロブ
リン（即ち、山羊ＩｇＧと羊ＩｇＧ）をモノクローナル
抗体との共存タンパク質とした場合には、モノクローナ
ル抗体濃度を20％まで低下させても、モノクローナル抗
体濃度を低下させないラテックス試液７と同等以上の測
定感度が得られることが判る。 これに対し、ＢＳＡをモノクローナル抗体との共存タ
ンパク質としたモノクローナル抗体溶液を用いて得られ
るラテックス試液（即ち、ラテックス試液９）の測定感
度は、同濃度のモノクローナル抗体のみを用いてＢＳＡ
不存在下に得られたラテックス試液８のそれよりは高い
が、ＢＳＡをモノクローナル抗体に置き換えたものに相
当するラテックス試液７のそれの半分以下である。従っ
て、ＢＳＡでは免疫グロブリンを使用した場合のような
効果、即ち、モノクローナル抗体の使用量を大幅に削減
でき且つ測定感度は従来のそれと同等以上であるという
効果は得られないことが判る。

【００３９】実施例.３ （１）羊Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントの調製 羊ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製）100
mgとペプシン〔和光純薬工業（株）製〕2.5mgとを、100
mMクエン酸緩衝液（pH3.8）５mlに溶解し、35℃で20時
間消化分解した。分解後、該反応液を１Ｎ 水酸化ナト
リウムで中和した後、遠心分離処理を行い、上清を集め
た。次いで該上清をSephacryl S-200HR（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ製）のカラムを用いてゲル濾過精製し、目的の羊
Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントを得た。 （２）抗ヒトＣＲＰ抗体担持ラテックス試液の調製 抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔和光純薬工業（株）
製〕と、羊ＩｇＧ又は上記（１）で得られた羊Ｆ（ａ
ｂ'）₂フラグメントとを所定濃度含む50mMホウ酸緩衝液
（pH7.1）１mlと、ポリスチレンラテックス〔粒径0.12
μm、積水化学工業（株）〕を２％（W/V）となるように
懸濁させた50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlとを混合
し、４℃で２時間反応させた。その後遠心分離により分
離したラテックスを50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）で洗浄
し、ラテックス濃度が0.2％（W/V）となるように、ＢＳ
Ａを0.5％（W/V）含有する50mMホウ酸緩衝液（pH7.3）
に再懸濁して、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体担持ラ
テックス試液とした。得られた３種のラテックス試液
（12〜14）についての、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗
体担持ラテックス調製時に於ける抗体含有溶液中の抗ヒ
トＣＲＰモノクローナル抗体及び、羊ＩｇＧ又は羊Ｆ
（ａｂ'）₂フラグメントの濃度を表５に示す。

【００４０】

【表５】

【００４１】（３）試料の調製 生理食塩水〔0.3％（W/V）アジ化ナトリウム及び150mM
塩化ナトリウム含有〕に、ヒトＣＲＰ〔和光純薬工業
（株）製〕を所定濃度となるように溶解したものを試料
とした。 （４）測定方法 アジ化ナトリウムを0.1％（W/V）及び塩化ナトリウムを
150mM含有する50mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.0）150μl
と、上記（３）で調製した試料 ５μlとを混合し、37℃
で５分間予備加温を行った後、これに更に上記（２）で
調製した抗ヒトＣＲＰ抗体担持ラテックス試液 50μlを
加えて反応を開始させ、該ラテックス試液添加直後から
の５分間の吸光度変化量（ΔＥ）を測定した。尚、測定
装置は、自動汎用測定機ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（日本ロ
シュ製）を使用し、測定波長 660nm、測定温度 37℃で
測定を行った。結果を表６に示す。

【００４２】

【表６】

【００４３】（結果）表６の結果から明らかなように、
担持ラテックス調製時の総抗体タンパク質量のうちの80
％を羊ＩｇＧ又は羊Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントで置き換
えてモノクローナル抗体を担持させたラテックスを含有
するラテックス試液（即ち、ラテックス試液13又はラテ
ックス試液14）を使用してヒトＣＲＰを測定すると、モ
ノクローナル抗体のみを担持させたラテックスを含むラ
テックス試液（即ち、ラテックス試液12）を使用した場
合よりも高感度にヒトＣＲＰを測定し得ることが判る。
また、担持ラテックス調製時の総抗体タンパク質量のう
ちの80％を羊Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントで置き換えてモ
ノクローナル抗体を担持させたラテックスを含有するラ
テックス試液（ラテックス試液14）は、羊ＩｇＧで置き
換えたもの（ラテックス試液13）の場合よりも高感度に
ヒトＣＲＰを測定し得ることが判る。即ち、本発明の方
法によりモノクローナル抗体担持不溶性担体を調製する
場合、該モノクローナル抗体と置き換えるものとして、
免疫グロブリンよりも免疫グロブリンフラグメントを用
いた方が、目的の抗原をより高感度に測定し得るモノク
ローナル抗体担持不溶性担体が得られることが判る。

【００４４】実施例.４ （１）抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フ
ラグメントの調製 抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体〔和光純薬工業（株）
製〕100mgとペプシン〔和光純薬工業（株）製〕2.5mg
を、100mMクエン酸緩衝液（pH3.8）５mlに溶解し、35℃
で20時間消化分解した。分解後、該反応液を１Ｎ 水酸
化ナトリウムで中和した後、遠心分離処理を行い、上清
を集めた。次いで該上清をSephacryl S-200HR（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ製）のカラムを用いてゲル濾過精製し、目
的の抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラ
グメントを得た。 （２）抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フ
ラグメント担持ラテックス試液の調製 上記（１）で得られた抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体
Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントと、羊ＩｇＧ又は実施例.３
の（１）で得られた羊Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントとを所
定濃度含む50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）１mlと、ポリス
チレンラテックス〔粒径0.12μm、積水化学工業
（株）〕を２％（W/V）となるように懸濁させた50mMホ
ウ酸緩衝液（pH7.1）１mlとを混合し、４℃で２時間反
応させた。その後遠心分離により分離したラテックスを
50mMホウ酸緩衝液（pH7.1）で洗浄し、ラテックス濃度
が0.2％（W/V）となるように、ＢＳＡを0.5％（W/V）含
有する50mMホウ酸緩衝液（pH7.3）に再懸濁して、抗ヒ
トＣＲＰモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント
担持ラテックス試液とした。得られた３種のラテックス
試液（15〜17）についての、抗ヒトＣＲＰモノクローナ
ル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント担持ラテックス調製時
に於ける抗体含有溶液中の抗ヒトＣＲＰモノクローナル
抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント及び、羊ＩｇＧ又は羊Ｆ
（ａｂ'）₂フラグメントの濃度を表７に示す。

【００４５】

【表７】

【００４６】（３）試料の調製 実施例.３の（３）と同じ。 （４）測定方法 ポリエチレングリコール６０００を2.0％（W/V）、アジ
化ナトリウムを0.1％（W/V）及び塩化ナトリウムを150m
M含有する50mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.0）150μlと、
上記（３）で調製した試料 ５μlとを混合し、37℃で５
分間予備加温を行った後、これに更に上記（２）で調製
した抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラ
グメント担持ラテックス試液 50μlを加えて反応を開始
させ、該ラテックス試液添加直後からの15分間の吸光度
変化量（ΔＥ）を測定した。尚、測定装置は、自動汎用
測定機ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ（日本ロシュ製）を使用
し、測定波長 660nm、測定温度 37℃で測定を行った。
結果を表８に示す。

【００４７】

【表８】

【００４８】（結果）表８の結果から明らかなように、
抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ'）₂フラグ
メントを用いた場合でも、抗体担持ラテックス調製時の
総抗体タンパク質量のうちの80％を羊ＩｇＧ又は羊Ｆ
（ａｂ'）₂フラグメントで置き換えて担持させたラテッ
クスを含有する試液（即ち、ラテックス試液16又はラテ
ックス試液17）を使用してヒトＣＲＰを測定すると、抗
ヒトＣＲＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ'）₂フラグメ
ントのみを担持させたラテックスを含む試液（即ち、ラ
テックス試液15）を使用した場合よりも高感度にヒトＣ
ＲＰを測定し得ることが判る。即ち、目的の抗原に対す
るモノクローナル抗体として、モノクローナル抗体フラ
グメントを使用した場合でも、本発明の方法を利用する
ことにより、モノクローナル抗体Ｆ（ａｂ'）₂フラグメ
ントの使用量を、従来の担持方法よりも低減できること
と共に、従来の担持方法で得られたモノクローナル抗体
Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント担持ラテックスを使用する場
合よりも、本発明の方法で得られた担持ラテックスを使
用する場合の方が測定感度を大幅に上昇させることがで
きることが判る。

【００４９】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、モノクロー
ナル抗体の使用量は少ないが、従来と同等以上の反応性
を有するモノクローナル抗体担持不溶性担体、及び、そ
の調製方法を提供するものであり、本発明によれば、モ
ノクローナル抗体を不溶性担体に担持させる際に、比較
的高価なモノクローナル抗体の使用量を従来の方法に比
べて大幅に低減することができるので、経費を削減する
ことができるという効果、更には、該モノクローナル抗
体担持不溶性担体を免疫学的測定法に使用すれば、測定
対象物質を従来のものと同等若しくはそれ以上に高感度
に測定し得るという効果をも奏するものであり、斯業に
貢献するところ大なる発明である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モノクローナル抗体と該モノクローナル
   抗体以外の免疫グロブリンとを担持してなる不溶性担
   体。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体と該モノクローナル
   抗体以外の免疫グロブリンとを含有する溶液を用いて、
   物理的又は化学的に、不溶性担体に該モノクローナル抗
   体及び該免疫グロブリンを担持させることを特徴とする
   請求項１に記載の不溶性担体の調製方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の不溶性担体を用いること
   を特徴とする免疫学的測定方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の不溶性担体を含んでなる
   免疫学的測定用試薬。