JPH04350559A - 特異抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的凝集反応を利用
した特異抗体の測定法に関し、更に詳細には測定しよう
とする特異抗体による凝集反応のみを増幅させることに
より、高感度で特異抗体を選択的に検出することのでき
る測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血清中免疫グロブリンには様々なクラス
（例えばＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＤ　）
やサブクラスに属する特異抗体が共存するが、特定のク
ラス及び／又はサブクラス（以下、単に「特定のクラス
」という）の特異抗体のみを測定することは、疾病の診
断に極めて重要である。例えば、特異ＩｇＧ　抗体の測
定は、過去にその抗原、細菌あるいはウイルスなどに感
作されたかどうかを調べるために有用であるが、十分な
時間が経過していないと、抗体価は上がってこない。し
かし、このとき特異ＩｇＭ　抗体を測定することにより
、数日〜２週間程度前の感作を知ることができる。また
、種々のアレルギー疾患では、アレルゲンに対する特異
抗体を測定することは非常に有用であるが、各クラスの
抗体それぞれで診断の意義が異なる。すなわち、特異Ｉ
ｇＥ　抗体は即時型アレルギーの原因アレルゲンの検索
に有用であり、特異ＩｇＧ　抗体は遅発型アレルギーの
原因アレルゲンの検索と重症度の把握に、有用であり、
また特異ＩｇＡ　抗体はアレルギー発症の予防に関与し
ていると言われている。

【０００３】アレルギー，３３，１５８，（１９８４）
，伊藤幸治他等に示されるように、従来この様な各クラ
ス別の特異抗体は主に各クラスに特異的な第二抗体の酵
素標識体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ　法）によっ
て測定されていた。しかし、このＥＩＡ　法による測定
は、測定操作のステップが多く煩雑で、測定時間もかか
るという欠点がある。

【０００４】一方、不溶性担体粒子を用いた免疫学的凝
集反応は簡便でかつ測定時間も短く、また感度も高い方
法として広く利用されている。検出方法としても、比濁
法（Ｃｒｏａｔ．　Ｃｈｅｍ．　Ａｃｔａ，　４２，　
４５７（１９７０），　Ｄｅｚｅｌｉｃ，　Ｎ．　ｅｔ
　ａｌ．　）、比ろう法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，　１３，　９６３（１９７６），　Ｃｏｈｅｎ，
　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．）、ＤＡＬＩＡ　法（Ｃｈ
ｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，　３７，　３０１０
（１９８９），　Ｓａｋａｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．）
、ＰＡＣＩＡ　法（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ，　１８，　３３（１９７７），　Ｃａｍｂｉａ
ｓｏ，　Ｃ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．）など種々のものが
ある。

【０００５】しかし、これらの不溶性担体粒子を用いた
免疫学的凝集反応を利用して、血清中の特定のクラスに
含まれる特異抗体のみを測定するためには、いくつかの
問題点がある。すなわち、血清中には抗原に対する様々
なクラスの特異抗体が存在することから、抗原を感作さ
せた不溶性担体粒子を用いた免疫学的凝集反応を利用し
て、直接的に特定のクラスに含まれる特異抗体のみを測
定することは原理上からも不可能である。これを解消す
る方法として、予め不要なクラスの抗体を除去する方法
があるが、この方法は前処理として煩雑な操作が必要で
あるという欠点があった。このような前処理をすること
なく、特定のクラスの特異抗体を他のクラスの抗体の干
渉を受けずに測定することは、前述の如く診断上極めて
有用である。

【０００６】ところで、血清中に存在する特定クラス中
の特異抗体の濃度は、特定クラス抗体のｔｏｔａｌ　濃
度に比較すると更に格段に低く、たとえ前述のような他
のクラスの抗体の干渉を受けずに測定できたとしても、
測定感度が足りないために特異抗体を測定できない場合
が多い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は抗原を感作させた不溶性担体を用いた免疫学的凝集反
応を利用して、測定しようとする特定の免疫グロブリン
クラス中の抗原に対する特異抗体のみを高感度で測定す
る方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは上記
目的を達成すべく鋭意研究した結果、第二抗体として３
価以上の抗体、すなわち測定しようとする特異抗体に対
する結合部位を３個以上有する抗体を用いれば、測定し
ようとする特異抗体による凝集反応が増幅され、被検特
異抗体の検出感度が飛躍的に向上することを見出し、本
発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は抗原を感作した不溶性
担体粒子及び免疫グロブリンの特定のクラスに特異的な
第二抗体を用いる免疫学的凝集反応を利用した免疫学的
測定法において、第二抗体として免疫グロブリンの特定
のクラスに特異的な３価以上の抗体を用いることを特徴
とする、特定の免疫グロブリンクラス中の抗原に対する
特異抗体の測定法を提供するものである。

【００１０】本発明に用いられるヒト体液試料としては
、測定しようとする特定のクラスの特異抗体（以下、「
被測定特異抗体」と略す）を含む試料、例えば血漿、血
清、鼻汁、唾液、涙、髄液などが挙げられる。これらの
ヒト体液試料中には被測定特異抗体とともに、測定しよ
うとする特定のクラス以外の特異抗体（以下、「競合抗
体」と略す）が存在する。従って、試料は、試料中の被
測定特異抗体及び競合抗体のみでは抗原を感作した不溶
性担体粒子を凝集させない程度に希釈して（以下、「希
釈検体」と略す）用いるのが好ましい。

【００１１】不溶性担体粒子としては、ポリアミド系、
ポリ塩化ビニリデン系、ポリ塩化ビニル系、アクリル系
、ポリ酢酸ビニル系、ポリスチレン系、ポリプロピレン
系、ポリエポキシ系、ウレタン系、ポリエチレン系、ア
ガロース系、キトサン系、またはプルラン系などの高分
子担体粒子を用いることができる。これらの不溶性担体
粒子は、一定割合でカルボキシル基、スルホン酸基また
は、アミノ基等の活性基をその表面に有することが好ま
しい。また、その粒径としては、好ましくは０．１〜３
．０μｍ、特に０．１〜１．２μｍの範囲のものを用い
ることができる。

【００１２】不溶性担体粒子に感作させる抗原は、被測
定特異抗体に対応する抗原であり、具体例としてはダニ
、スギ花粉、米、カンジダ、卵白などの各種アレルゲン
や、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルスなどのウイルス
抗原、クラジミア、梅毒などの細菌抗原、アスペルギル
スなどの真菌抗原、トキソプラズマ、リケッチアなどの
寄生虫抗原などをそのまま、あるいは常法による抽出等
により部分精製した画分などを用いることができる。

【００１３】不溶性担体粒子に抗原を感作するには、常
法に従えばよい。例えば、緩衝液に懸濁した不溶性担体
粒子液中に緩衝液に溶解した抗原液を加え、３０分から
一昼夜放置後遠心分離等の手段により未感作の抗原を除
去する物理吸着法により実施される。また、公知の二架
橋試薬や結合剤を用いて、抗原を不溶性担体粒子に感作
させる化学的共有結合法により実施される。感作にあた
っての抗原濃度は、一般に０．１　〜２重量％程度が適
当であるが、当然抗原の種類やその特性、不溶性担体粒
子の材質、表面に存在する活性基の性質などの諸条件に
より適宜変更することもできる。こうして得られる抗原
で感作された不溶性担体粒子（以下、「不溶性抗原試薬
」と略す）は、必要により抗原性を有さないタンパク質
や種々の界面活性剤などで処理した後、緩衝液中に懸濁
させたり、あるいは凍結乾燥することにより保存するこ
ともできる。

【００１４】本発明に用いる免疫グロブリンの特定のク
ラスに特異的な第二抗体は、被測定特異抗体に対する結
合部位を３個以上有する抗体、すなわち３価以上の抗体
（以下、「多価第二抗体」という）である。本発明にお
いては、多価第二抗体を用いることにより、不溶性抗原
試薬−被測定特異抗体複合体が多価第二抗体を介して架
橋化、多量化される。従って、特異的な凝集反応が増幅
され、検出感度が向上するものである。このような多価
第二抗体としては、３価以上であれば特に制限されない
が、６価以上、特に６〜３０価の抗体が好ましい。この
ような多価第二抗体としては、ポリクローナルであると
モノクローナルであるとを問わない。好ましくは、Ｉｇ
Ｍ　タイプの抗体、またはＩｇＧ　タイプの抗体を人工
的に多量化した抗体などを用いる。ＩｇＧ　タイプの抗
体を人工的に多量化するには、公知の結合剤などを用い
て行なわれる。 例えば、ビオチン・アビジンシステム（ＶＥＣＴＯＲ　
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．；　フナコシ薬品
（株）取り扱い）を用いる場合、公知の方法によりＩｇ
Ｇタイプの抗体にビオチンを共有結合させる。こうして
得たビオチン化抗体に適当量のアビジンを反応させるこ
とによりこの抗体は多量化され、多価第二抗体となる。

【００１５】また、ポリクローナル抗体を用いる場合、
アフィニティークロマトにより精製したものを用いるの
が好ましい。モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリ
ンの特定のクラスをマウス等に免疫した後、細胞融合な
どの常法により調製される。

【００１６】本発明の測定法は、第二抗体として多価第
二抗体を用いる以外は通常の免疫学的凝集反応を利用し
た免疫学的測定法に従って行なわれる。すなわち、例え
ば不溶性抗原試薬と第二抗体の混合液中に希釈検体を加
え、インキュベートし、次いで生じた凝集物の凝集程度
を計測すればよい。インキュベートは通常、２０〜４５
℃程度で１０〜３０分間行なえばよい。非凝集粒子及び
凝集粒子を検出する原理には、レーザー散乱法あるいは
電気抵抗法などが用いられる。凝集程度を計測する手段
としては、不溶性抗原試薬に対応する粒径の粒子量とこ
れが凝集してできる凝集粒子に対応する粒径の粒子量を
求めればよい。より具体的には、例えば、予め濃度既知
の被測定抗体試料を用いて凝集粒子量と非凝集粒子量の
比率（反応率）等を求めて検量線を作成し、これに基づ
いて検体試料中の被測定特異抗体量を求めることができ
る。 なお、従来の電気抵抗法（コールター原理）による粒子
測定機器で本発明方法を実施する場合には、そのアパチ
ャーのオリヒュス径を２０〜５０μｍとすればよく、本
発明方法により被測定特異抗体量を正確に測定すること
ができる。このように本発明においては、凝集反応が増
幅され、凝集粒子と非凝集粒子を明確に区別して定量で
きるため、第二抗体を標識することなく測定することが
できる。

【００１７】

【作用及び発明の効果】本発明によれば、第二抗体とし
て多価第二抗体を用いることにより、不溶性抗原試薬−
被測定特異抗体複合体が多価第二抗体を介して架橋され
、多量化されるため凝集反応が増幅する。この結果、検
出感度が飛躍的に向上し、特定のクラスの特異抗体量を
正確に定量することが可能となった。更に、感度が良好
なばかりでなく操作が簡単であり、測定時間も採血から
１時間以内と迅速に終了し、医療、臨床検査等の分野に
おいて極めて有用である。

【００１８】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明は何らこれに限定されるものではない。 実施例１：ダニアレルゲン感作ラテックス試薬の調製０
．０１％（Ｗ／Ｖ）界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０を含む５０ｍＭ　リン酸緩衝液、（ｐＨ７．０）（以
下、プレブロッキングバッファー）に懸濁した、粒径　
１．０μｍの１．０　％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテッ
クス液１０ｍｌに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
に溶解された１００ｍＭ　のジスクシンイミジル　　グ
ルタレート（ＢＩＳＨＯＸ）０．２５ｍｌを添加し、攪
拌後３７℃で５分間保温した。次に遠心法により余分な
ＢＩＳＨＯＸを洗浄除去し、１０ｍｌのプレブロッキン
グバッファーに再懸濁した。これに０．１５Ｍ　の塩化
ナトリウムを含む０．１Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液、（
ｐＨ８．３　）（以下、カップリングバッファー）に溶
解した１．０ｍｇ／ｍｌのダニアレルゲン溶液１０ｍｌ
を加えてよく混合し、４℃で３０分間保温した。遠心法
によりアレルゲン液及び緩衝液を洗浄除去し、最終的に
１０．０％（Ｗ／Ｖ）スクロース、０．２　％（Ｗ／Ｖ
）牛血清アルブミン（ＢＳＡ　）及び０．１　％（Ｗ／
Ｖ）アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝
液、（ｐＨ６．８　）（以下、ファイナルバッファー）
５０ｍｌに再懸濁して４℃で保存した。

【００１９】実施例２：ＩｇＧ　抗体を用いた多価第二
抗体の調製法 ビオチンとＩｇＧ　型の抗ヒトＩｇＧ　モノクローナル
抗体を常法（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１
００，　３５８５（１９７８），　Ｈｏｆｍａｎｎ，　
Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．）に従って結合させ、ビオチン化抗
ヒトＩｇＧ　抗体を調製した後、これに分子量比で４倍
量または１５倍量のストレプトアビジンを反応させた後
、液体カラムクロマトグラフィーを用いて多量化した抗
体を分離し、抗体価が平均８価（４分子相当）と３０価
（１５分子相当）の抗ヒトＩｇＧ多価第二抗体を調製し
た。次にこれをファイナルバッファーで透析し４℃で保
存した。

【００２０】実施例３：ダニ特異ＩｇＧ　抗体の測定に
おける、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果）の
差５．０　％（Ｗ／Ｖ）スクロース、１．０　％（Ｗ／
Ｖ）ＢＳＡ　、０．５　％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、
０．１　％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８　）（以下、ダイリュ
ウションバッファー）で希釈した試料５０μｌと実施例
１で調製したダニアレルゲン感作ラテックス試薬２５μ
ｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、ファイナル
バッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ　型の
抗ヒトＩｇＧ　抗体液、実施例２で調製した抗体価８価
、もしくは抗体価３０価の抗ヒトＩｇＧ　多価抗体液各
０．０２ｍｇ／ｍｌ　、あるいはファイナルバッファー
に溶解した０．０２ｍｇ／ｍｌ　のＩｇＭ型の抗ヒトＩ
ｇＧ　モノクローナル抗体液２５μｌを混合させ、３７
℃で３０分間保温した。次に０．１　％（Ｗ／Ｖ）アジ
化ナトリウムを含む５０ｍＭ　Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ　緩衝
液、（ｐＨ６．３　）（以下、ストッパーバッファー）
５．０ｍｌ　を添加して反応を停止させた後、電解液で
更に３０倍希釈した。この希釈された反応凝集物の粒度
分布を粒子測定器（商品名：ＰＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）で
測定し凝集反応の程度（ＲＶ：未凝集ラテックスと凝集
ラテックスの総体積の比率）を算出した。希釈率を横軸
にＲＶを縦軸にブロットした試料中のダニアレルゲン特
異ＩｇＧ　抗体の希釈反応曲線を、図１に示した。 その結果、第二抗体を使用しないときには反応が認めら
れないが、人工的に多量化した第二抗体やＩｇＭ型の第
二抗体（多価第二抗体）を用いた時の測定感度（凝集反
応の増幅効果）は、ＩｇＧ　型（２価）の第二抗体より
格段に高いことが判明した。

【００２１】実施例４：ダニ特異ＩｇＡ　抗体の測定に
おける、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果）の
差ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌ
と実施例１で調製したダニアレルゲン感作ラテックス試
薬２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、フ
ァイナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇ　型の抗ヒトＩｇＡ　抗体液、実施例２に準じて調製
した０．０２ｍｇ／ｍｌ　の抗ヒトＩｇＡ　多価抗体（
８価）、あるいはファイナルバッファーに溶解した０．
０３ｍｇ／ｍｌ　のＩｇＭ　型の抗ヒトＩｇＡ　モノク
ローナル抗体（１０価）液２５μｌを混合させ、３７℃
で３０分間保温した。次にストッパーバッファー５．０
ｍｌ　を添加して反応停止させた後、電解液で更に３０
倍希釈した。この希釈された反応凝集物の粒度分布を粒
子測定器（商品名：ＰＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）で測定し凝
集反応の程度（ＲＶ：未凝集ラテックスと凝集ラテック
スの総体積の比率）を算出した。希釈率を横軸にＲＶを
縦軸にブロットした試料中のダニアレルゲン特異ＩｇＡ
　抗体の希釈反応曲線を、図２に示した。 その結果、第二抗体を使用しないときには反応が認めら
れないが、人工的に多量化した第二抗体やＩｇＭ　型の
第二抗体（多価第二抗体）を用いた時の測定感度（凝集
反応の増幅効果）は、ＩｇＧ　型（２価）の第二抗体よ
り格段に高いことが判明した。

【００２２】 実施例５：スギアレルゲン感作ラテックス試薬の調製プ
レブロッキングバッファーに懸濁した、粒径１．０　μ
ｍの１．０　％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス液１
０ｍｌに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解さ
れた１００ｍＭ　のジスクシンイミジル　　グルタレー
ト（ＢＩＳＨＯＸ）０．２５ｍｌを添加し、攪拌後３７
℃で５分間保温した。次に遠心法により余分なＢＩＳＨ
ＯＸを洗浄除去し、１０ｍｌのプレブロッキングバッフ
ァーに再懸濁した。これにカップリングバッファーに溶
解した２．０ｍｇ／ｍｌのスギアレルゲン溶液１０ｍｌ
を加えてよく混合し、４℃で３０分間保温した。遠心法
によりアレルゲン液及び緩衝液を洗浄除去し、最終的に
ファイナルバッファー５０ｍｌに再懸濁して４℃で保存
した。

【００２３】実施例６：スギ特異ＩｇＧ　抗体の測定に
おける、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果）の
差ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌ
と実施例５で調製したスギアレルゲン感作ラテックス試
薬２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、フ
ァイナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇ　型の抗ヒトＩｇＧ　抗体液、実施例２で調製した０
．０２ｍｇ／ｍｌ　の抗ヒトＩｇＧ　多価抗体（８価）
、あるいはファイナルバッファーに溶解した０．０２ｍ
ｇ／ｍｌ　のＩｇＭ　型の抗ヒトＩｇＧ　モノクローナ
ル抗体（１０価）液２５μｌを混合させ、３７℃で３０
分間保温した。次にストッパーバッファー５．０ｍｌ　
を添加して反応を停止させた後、電解液で更に３０倍希
釈した。この希釈された反応凝集物の粒度分布を粒子測
定器（商品名：ＰＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）で測定し凝集反
応の程度（ＲＶ：未凝集ラテックスと凝集ラテックスの
総体積の比率）を算出した。希釈率を横軸にＲＶを縦横
にブロットした試料中のスギアレルゲン特異ＩｇＧ　抗
体の希釈反応曲線を、図３に示した。その結果、第二抗
体を使用しないときには反応が認められないが、人工的
に多量化した第二抗体やＩｇＭ　型の第二抗体（多価第
二抗体）を用いた時の測定感度（凝集反応の増幅効果）
は、ＩｇＧ　型（２価）の第二抗体より格段に高いこと
が判明した。

【００２４】 実施例７：コメアレルゲン感作ラテックス試薬の調製プ
レブロッキングバッファーに懸濁した。粒径１．０　μ
ｍの１．０　％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス液１
０ｍｌに、ＤＭＳＯに溶解された１００ｍＭ　のＢＩＳ
ＨＯＸ　０．２５ｍｌ　を添加し、攪拌後３７℃で５分
間保温した。次に遠心法により余分なＢＩＳＨＯＸを洗
浄除去し、１０ｍｌのプレブロッキングバッファーに再
懸濁した。これにカップリングバッファーに溶解した２
．０ｍｇ／ｍｌのコメアレルゲン溶液１０ｍｌを加えて
よく混合し、４℃で３０分間保温した。遠心法によりア
レルゲン液及び緩衝液を洗浄除去し、最終的にファイナ
ルバッファー５０ｍｌに再懸濁して４℃で保存した。

【００２５】実施例８：コメ特異ＩｇＧ　抗体の測定に
おける、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果）の
差ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌ
と実施例７で調製したコメアレルゲン感作ラテックス試
薬２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、フ
ァイナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇ　型の抗ヒトＩｇＧ　抗体液、実施例２で調製した０
．０２ｍｇ／ｍｌ　の抗ヒトＩｇＧ　多価抗体（８価）
、あるいはファイナルバッファーに溶解した０．０２ｍ
ｇ／ｍｌ　のＩｇＭ　型の抗ヒトＩｇＧ　モノクローナ
ル抗体（１０価）液２５μｌを混合させ、３７℃で３０
分間保温した。次にストッパーバッファー５．０ｍｌ　
を添加して反応を停止させた後、ストッパーバッファー
で更に１０倍希釈した。この希釈された反応凝集物の凝
集度を、波長６５０ｎｍ　における濁度（吸光度）の変
化で測定した。希釈率を横軸に、吸光度を縦軸にブロッ
トした試料中のコメアレルゲン特異ＩｇＧ　抗体の希釈
反応曲線を、図４に示した。その結果、第二抗体を使用
しないときには反応が認められないが、人工的に多量化
した第二抗体やＩｇＭ　型の第二抗体（多価第二抗体）
を用いた時の測定感度（凝集反応増幅効果）は、ＩｇＧ
　型（２価）の第二抗体より格段に高いことが判明した
。

【００２６】実施例９：コメ特異ＩｇＡ　抗体の測定に
おける、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果）の
差ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌ
と実施例７で調製したコメアレルゲン感作ラテックス試
薬２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、フ
ァイナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ
Ｇ　型の抗ヒトＩｇＡ　抗体液、実施例２に準じて調製
した０．０２ｍｇ／ｍｌ　の抗ヒトＩｇＡ　多価抗体（
８価）、あるいはファイナルバッファーに溶解した０．
０２ｍｇ／ｍｌ　のＩｇＭ　型の抗ヒトＩｇＧ　モノク
ローナル抗体（１０価）液２５μｌを混合させ、３７℃
で３０分間保温した。次にストッパーバッファー５．０
ｍｌ　を添加して反応を停止させた後、ストッパーバッ
ファーで更に１０倍希釈した。この希釈された反応凝集
物の凝集度を、波長６５０ｎｍ　における濁度（吸光度
）の変化で測定した。希釈率を横軸に、吸光度を縦軸に
ブロットした試料中のコメアレルゲン特異ＩｇＧ　抗体
の希釈反応曲線を、図５に示した。その結果、第二抗体
を使用しないときには反応が認められないが、人工的に
多量化した第二抗体やＩｇＭ　型の第二抗体（多価第二
抗体）を用いた時の測定感度（凝集反応の増幅効果）は
、ＩｇＧ　型（２価）の第二抗体より格段に高いことが
判明した。

【００２７】実施例１０：ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルスＳ
抗原）感作ラテックス試薬の調製 プレブロッキングバッファーに懸濁した、粒径１．０　
μｍの１．０　％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス液
１０ｍｌに、ＤＭＳＯに溶解された１００ｍＭ　のＢＩ
ＳＨＯＸ　０．２５ｍｌ　を添加し、攪拌後３７℃で５
分間保温した。次に遠心法により余分なＢＩＳＨＯＸを
洗浄除去し、１０ｍｌのプレブロッキングバッファーに
再懸濁した。これにカップリングバッファーに溶解した
５０μｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原溶液１０ｍｌを加えてよく
混合し、４℃で３０分間保温した。遠心法により抗原液
及び緩衝液を洗浄除去し、最終的にファイナルバッファ
ー５０ｍｌに再懸濁して４℃で保存した。

【００２８】実施例１１：ＨＢｓ特異ＩｇＧ　抗体の測
定における、第二抗体の種類による測定感度（増幅効果
）の差 ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌと
実施例１０で調製したＨＢｓ感作ラテックス試薬２５μ
ｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、ファイナル
バッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ
　抗体液、実施例２で調製した０．０２ｍｇ／ｍｌ　の
抗ヒトＩｇＧ多価抗体（８価）、あるいはファイナルバ
ッファーに溶解した０．０２ｍｇ／ｍｌ　のＩｇＭ　型
の抗ヒトＩｇＧ　モノクローナル抗体（１０価）液２５
μｌを混合させ、３７℃で３０分間保温した。次にスト
ッパーバッファー５．０ｍｌ　を添加して反応を停止さ
せた後、電解液で更に３０倍希釈した。この希釈された
反応凝集物の粒度分布を粒子測定器（商品名：ＰＣＩＡ
　ｍｅｔｅｒ）で測定し凝集反応の程度（ＲＶ：未凝集
ラテックスと凝集ラテックスの総体積の比率）を算出し
た。希釈率を横軸にＲＶを縦軸にブロットした試料中の
ＨＢｓ特異ＩｇＧ　抗体の希釈反応曲線を、図６に示し
た。その結果、第二抗体を使用しないときには反応が認
められないが、人工的に多量化した第二抗体やＩｇＭ　
型の第二抗体（多価第二抗体）を用いた時の測定感度（
凝集反応の増幅効果）は、ＩｇＧ　型（２価）の第二抗
体より格段に高いことが判明した。

【００２９】 実施例１２：カンジダ抗原感作ラテックス試薬の調製プ
レブロッキングバッファーに懸濁した、粒径１．０　μ
ｍの１．０　％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス液１
０ｍｌに、ＤＭＳＯに溶解された１００ｍＭ　のＢＩＳ
ＨＯＸ　０．２５ｍｌ　を添加し、攪拌後３７℃で５分
間保温した。次に遠心法により余分なＢＩＳＨＯＸを洗
浄除去し、１０ｍｌのプレブロッキングバッファーに再
懸濁した。これにカップリングバッファーに溶解した１
ｍｇ／ｍｌ　のカンジダ抗原溶液１０ｍｌを加えてよく
混合し、４℃で３０分間保温した。遠心法により抗原液
及び緩衝液を洗浄除去し、最終的にファイナルバッファ
ー５０ｍｌに再懸濁して４℃で保存した。

【００３０】実施例１３：カンジダ特異ＩｇＧ　抗体の
測定における、第二抗体の種類による測定感度（増幅効
果）の差 ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌと
実施例１２で調製したカンジダ抗原感作ラテックス試薬
２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、ファ
イナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌの抗ヒト
ＩｇＧ　抗体液、実施例２で調製した０．０２ｍｇ／ｍ
ｌ　の抗ヒトＩｇＧ　多価抗体（８価）、あるいはファ
イナルバッファーに溶解した０．０２ｍｇ／ｍｌ　のＩ
ｇＭ　型の抗ヒトＩｇＧ　モノクローナル抗体（１０価
）液２５μｌを混合させ、３７℃で３０分間保温した。 次にストッパーバッファー５．０ｍｌ　を添加して反応
を停止させた後、電解液で更に３０倍希釈した。この希
釈された反応凝集物の粒度分布を粒子測定器（商品名：
ＰＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）で測定し凝集反応の程度（ＲＶ
：未凝集ラテックスと凝集ラテックスの総体積の比率）
を算出した。希釈率を横軸にＲＶを縦軸にブロットした
試料中のカンジダ特異ＩｇＧ　抗体の希釈反応曲線を、
図７に示した。その結果、第二抗体を使用しないときに
は反応が認められないが、人工的に多量化した第二抗体
やＩｇＭ　型の第二抗体（多価第二抗体）を用いた時の
測定感度（凝集反応の増幅効果）は、ＩｇＧ　型（２価
）の第二抗体より格段に高いことが判明した。

【００３１】実施例１４：カンジダ特異ＩｇＭ　抗体の
測定における、第二抗体の種類による測定感度（増幅効
果）の差 ダイリュウションバッファーで希釈した試料５０μｌと
実施例１２で調製したカンジダ抗原感作ラテックス試薬
２５μｌの反応液に、ファイナルバッファー単独、ファ
イナルバッファーに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌの抗ヒト
ＩｇＧ　抗体液、実施例２に準じて調製した０．０１ｍ
ｇ／ｍｌ　の抗ヒトＩｇＭ　多価抗体（８価）、あるい
はファイナルバッファーに溶解した０．０１ｍｇ／ｍｌ
　のＩｇＭ　型の抗ヒトＩｇＭ　モノクローナル抗体（
１０価）液２５μｌを混合させ、３７℃で３０分間保温
した。 次にストッパーバッファー５．０ｍｌを添加して反応を
停止させた後、電解液で更に３０倍希釈した。この希釈
された反応凝集物の粒度分布を粒子測定器（商品名：Ｐ
ＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）で測定し凝集反応の程度（ＲＶ：
未凝集ラテックスと凝集ラテックスの総体積の比率）を
算出した。希釈率を横軸にＲＶを縦軸にブロットした試
料中のカンジダ特異ＩｇＭ　抗体の希釈反応曲線を、図
８に示した。その結果、第二抗体を使用しないときには
反応が認められないが、人工的に多量化した第二抗体や
ＩｇＭ　型の第二抗体（多価第二抗体）を用いた時の測
定感度（凝集反応の増幅効果）は、ＩｇＧ　型（２価）
の第二抗体より格段に高いことが判明した。

【００３２】実施例１５：第二抗体を使用したアレルゲ
ン特異ＩｇＧ　抗体の測定における、アレルゲンに対す
る特異性の確認（ダニ特異ＩｇＧ　測定における反応の
ダニアレルゲンの添加による阻害） ダイリュウションバッファー単独、あるいはダイリュウ
ションバッファーで１００　倍希釈した試料２５μｌ、
ダイリュウションバッファーに溶解したダニアレルゲン
液、あるいはファイナルバッファーに溶解したヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ　）液２５μｌ、実施例１で調製し
たダニアレルゲン感作ラテックス試薬２５μｌ及びファ
イナルバッファーに溶解した０．０２ｍｇ／ｍｌ　の抗
ヒトＩｇＧ　モノクローナル抗体液２５μｌを混合させ
、３７℃で３０分間保温した。次にストッパーバッファ
ー３．０ｍｌ　を添加して反応を停止させた後、電解液
で更に３０倍希釈した。この希釈された反応凝集物の粒
度分布を粒子測定器（商品名：ＰＣＩＡ　ｍｅｔｅｒ）
で測定し、凝集反応の程度（ＲＶ：未凝集ラテックスと
凝集ラテックスの総体積の比率）を算出した。添加ダニ
アレルゲンまたはＨＳＡ濃度を横軸にブロットし、ＲＶ
を縦軸にして反応曲線を図９に示した。図に示されるよ
うにＨＳＡによる阻害は認められないが、ダニアレルゲ
ンでは添加濃度に依存して阻害が認められる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ダニ特異ＩｇＧ　希釈反応曲線を示す図である
。

【図２】ダニ特異ＩｇＡ　希釈反応曲線を示す図である
。

【図３】スギ特異ＩｇＧ　希釈反応曲線を示す図である
。

【図４】コメ特異ＩｇＧ　希釈反応曲線を示す図である
。

【図５】コメ特異ＩｇＡ　希釈反応曲線を示す図である
。

【図６】ＨＢｓ特異ＩｇＧ　希釈反応曲線を示す図であ
る。

【図７】カンジダ特異ＩｇＧ　希釈反応曲線を示す図で
ある。

【図８】カンジダ特異ＩｇＭ　希釈反応曲線を示す図で
ある。

【図９】ダニ抗原による阻害（ダニ特異ＩｇＧ　）反応
曲線を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗原を感作した不溶性担体粒子並びに
   免疫グロブリンの特定のクラス及び／又はサブブクラス
   に特異的な第二抗体を用いる免疫学的凝集反応を利用し
   た免疫学的測定法において、第二抗体として免疫グロブ
   リンの特定のクラス及び／又はサブクラスに特異的な３
   価以上の抗体を用いることを特徴とする、特定の免疫グ
   ロブリンクラス及び／又はサブクラス中の抗原に対する
   特異抗体の測定法。
2. 【請求項２】　　第二抗体が、ＩｇＧ　タイプのモノク
   ローナル抗体を人工的に多量化した抗体である請求項１
   記載の測定法。
3. 【請求項３】　　第二抗体が、ＩｇＭ　タイプのモノク
   ローナル抗体である請求項１記載の測定法。
4. 【請求項４】　　第二抗体が、アフィニティー精製され
   たポリクローナル抗体を人工的に多量化した抗体である
   請求項１記載の測定法。