JPH0325366A - 特異抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特異抗体の免疫学的測定法に関し、更に詳細に
は測定しようとする特異抗体のみを正確かつ容易に定量
できる免疫学的測定法に関する。

〔従来の技術〕

近年アレルギー疾患の増加は著しく、その診断および治
療もより正確で確実であることが要求されている。特に
種々の花粉、ダニ、ハウスダストなどを抗原（アレルゲ
ン）とするアレルゲン特異ＩｇＥ抗体が主原因であるＩ
型アレルギーにおいては、このアレルゲン特異ＩｇＥ抗
体を測定することは、アレルギー疾患の原因となるアレ
ルゲンを検知する上で重要な事項であり、この測定結果
を正確にかつ迅速に知ることは、臨床上非常に重要なこ
とでもある。

従来アレルゲンを同定する方法として、皮内反応、ＰＫ
テスト、ｃｈｏｐｐｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇを用い
た方法などがあるが、これらの方法は、直接生体自身に
アナフラキシーショック等の不利な反応を起こす危険性
があり、また、治療中は時として、反応自体が不安定に
なるという欠点があるため、臨床上あまり使用されてい
ない。ところで、インビトロでの血清学的診断法として
１９６７年Ｗｉｄｅらによって開発されたｒａｄｉｏａ
ｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ　ｔｅｓｔ　（ＲＡＳＴ）
法［Ｗｉｄｅ，　　Ｌ．　　Ｌａｎｃａｔ　　２　　　
　１１０５−１１０７　　　（１９６７）　　）　　は
、抗原（アレルゲン）に対する特異［ｇＢ抗体を測定す
る方法として日常診療の中で広く応用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、免疫グロブリン各クラスの血清濃度は表
１のごとくかなりの差があり、とりわけＩｇＥは他のク
ラスの免疫グロブリンに比較して約１万倍濃度が低い。

表１ 「免疫学２」山村雄一監修　中山書店 従って従来のＲＡＳＴ法による特異１ｇＥｌ抗体の測定
法では、当然のことながら特異１ｇＧや特異１ｇ八ある
いは特異ＩｇＭの妨害を受けることになる。実際、この
ことは多くの文献等により指摘されでいるところである
〔アレルギー．２４（４）．　２１７−２２１（１９７
５）　；　Ｊ．＾ｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ，　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ，，　６工（２），８　７　−　８　９　（１９
８１）］。また最近ではロＬ　Ｉ　Ｓ八等による特異１
ｇＧ抗体や特異１ｇＡ抗体の測定も試みられているが、
原理的にはＩｇＥ−ＩＩＡＳＴ法と同じであるので他の
クラスの特異抗体の妨害を受けることば必至であり、正
確な特異抗体濃度定量の大きな問題点となっている。

一方アレルギー治療法の一つとして古くより実施されて
きた特異的減感作療法は、作用機序の一部に遮断抗体（
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　）すなわち特異
１ｇＧ抗体の産生が関与していることが明らかとなった
。さらに最近では特異１ｇＧ抗体が遮断抗体としてだけ
ではなくアナフィラキシー性抗体としても働くことが指
摘され、また特異１ｇ＾抗体がアレルギーの発症を抑制
している等、血清中のあらゆるクラスの抗体がアレルギ
ー反応に何らかの関与をしていることが明らかとなって
きている。従って各クラスの特異抗体を正確に測定する
ことは、アレルギーの診断および治療に極めて重要であ
る。

またアレルギーの診断、治療を目的とする特異抗体の測
定法の満たすべき要件としては、操作の簡便性、迅速性
もまた重要である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記課題を解決すべく種々検討してきたと
ころ、極めて単純なことではあるが測定しようとする特
異抗体のクラス以外の免疫グロブリンを予め除去すれば
、そのような抗体の妨害を受けないばかりでなく、日常
の診療に応用され得る操作の簡便性や大量供給の可能性
をも満足しうろことを見出し、本発明を完或した。

すなわち、本発明はヒト体液試料中の免疫グロブリンの
うち特定のクラスの特異抗体を免疫学的に測定するに際
し、測定しようとする特定のクラス以外の免疫グロブリ
ンを予め除去することを特徴とする特異抗体の測定法を
提供するものである。

本発明においては、測定しようとする特定のクラス以外
の免疫グロブリン（以下、「競合抗体」と略す）を、検
体であるヒト体液試料より予め除去するものであるが、
除去すべき競合抗体は原則的には■測定しようとする特
異抗体（以下、「被測定抗体」と略す）がＩｇＥである
場合は、ＩｇＧ　、ＩｇＡおよびｔｇＭであり；■被測
定抗体がＩｇＭの場合は、ＩｇＧ　ＳＩｇＡおよ．びＩ
ｇＥであり；■被測定抗体がＩｇ八の場合は、ＩｇＧ　
，　ＩｇＭおよびｉｇＢであり：■被測定抗体がＩｇＧ
の場合は、Ｉｇ八、ＩｇＭおよびＩ　ｇＥｌである。し
かし、前記表ｌから明らかに、これら免疫グロブリンの
血清濃度は、ＩｇＧ　＞ＩｇＡ＞ＩｇＭ＞ＩｇＥである
。従って、被測定抗体の測定値に影響を与える可能性が
大きい他のクラスの免疫グロブリンのみを除去すれば充
分である。

また、本発明の被測定抗体はＩｇＥ　、ＩｇＡ　，　Ｉ
ｇＭおよびＩｇＧであるが、このうち、前記表１より競
合抗体の影響を受けやすいＩｇＥ　，　ＩｇＡ　，　Ｉ
ｇＭが、特にＩｇＥが好ましい。

本発明に用いられるヒト体液試料としては、被測定抗体
を含む試料、例えば血漿、血清、鼻汁、涙、髄液などが
挙げられる。

これらのヒト体液試料から競合抗体を除去する方法とし
ては、競合抗体と特異的に反応する活性物質でヒト体液
試料を処理する方法が挙げられる。

かかる活性物質としては、プロテインＡ１プロテインＧ
１リコンビナントプロテインＡ１リコンビナントプロテ
インＧ１抗免疫グロブリン抗体（モノクローナル抗体を
含む）、免疫グロブリン・レセブターなどが挙げられる
。これらの活性物質は二種以上を組み合せて用いること
もできる。ここで、プロテインＡとプロテインＧの各種
免疫グロブリンとの結合能を表２に示す。

表２　免疫グロブリンとの結合能 このような活性物質でヒト体液試料を処理するには、ヒ
ト体液試料中の競合抗体を除去する必要性から、活性物
質を結合せしめた担体を用いるのが好ましい。具体的に
は二１・ロセルロース、セルロースアセテート、ナイロ
ン等のメンブラン；あるいは、アガロース、セファロー
ス、デキストラン、ポリアクリルアミド等のゲルにあら
かじめ活性物質を結合せしめたアフィニティー担体とヒ
ト体液試料を接触させることにより、当該試料から競合
抗体が除去される。

なお、上記担体への活性物質の結合は、例えば物理的吸
着法あるいはＣＮＢｒ法をはじめとする種々の公知な方
法（「アフィニティクロマトとアフィニティラベル」蛋
白質核酸酵素別冊Ｎα２　２　　１９８０）により化学
的に結合することができる。

かくして競合抗体の除去されたヒト体液試料（以下、「
競合抗体除去検体Ｊと略す）中には、被測定抗体と同じ
クラスの免疫グロブリンのみが含有されており、通常の
免疫学的測定法により被測定抗体を正確に定量すること
ができる。好ましい免疫学的測定法としては、ラジオイ
ムノアッセイ法（「新版ラジオイムノアッセイ」鎮目和
夫、熊原雄一編、朝倉書店）エンザイムイムノアッセイ
法（「酵素免疫測定法第３版」石川栄治ら編、医学書院
）ラテックス免疫比濁法あるいは粒度分布解析ラテック
ス免疫測定法等が挙げられる。

被測定抗体がアレルゲン特異ＩｇＥ抗体である場合、特
にアレルゲンを感作させた不溶性担体と抗ＩｇＥ特異抗
体との混合物を競合抗体除去検体と反応させ、次いでそ
の凝集程度を計測する方法が好ましい。以下、この好ま
しい態様について詳細に説明する。

不溶性担体としては、ボリアミド系、ポリ塩化ビニリデ
ン系、ポリ塩化ビニル系、アクリル系、ポリ酢酸ビニル
系、ポリスチレン系、ボリプロビレン系、ポリエポキシ
系、ウレタン系、ポリエチレン系、アガロース系、キト
サン系またはプルラン系などの高分子担体を用いること
ができる。これらの不溶性担体は、一定割合でカルボキ
シル基、スルホン酸基等の酸基を有することが好ましく
、かかる高分子の調製は、酸基を有さないモノマーと酸
基を有するモノマーを共重合させることが望ましい。こ
の不溶性担体は粒子が好ましく、その粒径としては、好
ましくは０．１−３μｍ５特に０．６−１．２μｍの範
囲のものを用いることができる。

不溶性担体に感作させるアレルゲンは、ダニ、ハウスダ
スト、アルテルナリア、カンジダ、猫毛、牛乳、卵白、
大豆、スギ花粉などの各種アレルゲンをそのまま、ある
いは、常法による抽出等により部分精製した画分、また
は、更にアレルゲン特異的な物質まで精製した両分を用
いることができる。

不溶性担体をアレルゲンで感作するには、常法に従えば
良い。

例えば、不溶性担体の緩衝液懸濁液中にアレルゲンの緩
衝液を加え、３０分から一昼夜放置後遠心分離等の手段
により未感作のアレルゲンを除去する物理吸着法により
実施される。また、公知の二架橋試薬や結合剤を用いて
、アレルゲンを不溶性担体に感作させる化学的共有結合
法により実施することもできる。感作に当たってのアレ
ルゲンの濃度は、０．１−２重量％程度が一般に適当で
あるが、当然アレルゲンの種類やその特性、不溶性担体
の材質、粒径および酸基による変性度合によってこれを
適宜変更することもできる。

斯くして得られるアレルゲンで感作された不溶性担体（
以下、「不溶性アレルゲン試薬」と略す）は、必要によ
り牛血清アルブミン（以下、「８Ｓ＾」と路す）や種々
の界面活性剤などで処理した後、緩衝液中に懸濁させた
り、あるいは凍結乾燥することより保存することもでき
る。

抗ＩｇＥ特異抗体としては、抗ＩｇＥ特異モノクローナ
ル抗体あるいはアフィニティークロマトニヨり精製した
抗ＩｇＥ特異ポリクローナル抗体を用いるのが好ましい
。抗ＩｇＥ特異モノクローナル抗体は、ヒＨｇＢ抗体を
マウス等に免疫した後、細胞融合などの常法によって調
製される。

アレルゲン特異ＩｇＥ抗体測定法を実施するには、例え
ば不溶性アレルゲン試薬と抗ＩｇＥ特異抗体の混合液中
に競合抗体除去検体を加え、インキコベートシ、次いで
生じた凝集物の凝集程度を計測すれば良い。

インキュベートは通常、２０−４５℃程度で１０−３０
分間行なえば良い。非凝集粒子および凝集粒子を検出す
る原理には、レーザー散乱法あるいは電気抵抗法などが
用いられる。凝集程度を計測する手段としては、不溶性
アレルゲン試薬に対応する粒径の粒子量とこれが凝集し
てできる凝集粒子に対応する粒径の粒子量を求めれば良
い。

より具体的には、例えば、予め濃度既知のアレルゲン特
異ＩｇＥ抗体試料を用いて凝集粒子量と非凝集粒子量の
比率（反応率）等を求めて検量線を作或し、これに基づ
いて検体試料中のアレルゲン特異ＩｇＥ抗体量を定める
ことができる。なお、従来の電気抵抗法（コールター原
理）による粒子測定機器で本発明方法を実施する場合に
は、そのアパチャーのオリヒイス径を２　０−５　０μ
田とすればよく、本発明方法によりアレルゲン特異Ｉｇ
Ｅ抗体量を正確に測定することができる。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば簡便な操作で被測定抗体とクラスの
異なる免疫グロブリンの影響がなく正確に測定すべき特
異抗体を定量することができる。

特にアレルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定においては、感度
が良好なばかりでなく操作が簡単であり、測定時間が採
血から１時間以内と迅速に終了し、医療、臨床検査等の
分野において極めて有用である。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１　競合抗体除去用アフィニティーメンプランの
調製； （１）　　プロテインＧ結合メンプランの調製リコンビ
ナントプロテインＧ　（　Ｇｅｎｅｘ社製：コスモバイ
オ社販売）４ｌＩＩｇを２５ｍＭｔＪン酸緩衡生理食塩
液、ｐＨ７．０　　（ＰＢＳ）５　０ｍｌに溶解した。

この液に１０Ｘ１０ｃｍのイムノダインメンプラン（孔
径０．２μｍ．日本ポール社）を浸し、室温で３時間振
盪した後反応液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。

次に５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン及び０．０５％
Ｔｗｅｅｎ　２　０を含むＰＢＳ　（ロＳＡＰＢＳ）　
　５　０　ｍｌに浸し、室温で一夜振盪した後ＢＳＡＰ
ＢＳを除去し、１　０　０ｍｌの５０ｍＭグリシンＸＩ
衝液、ｐＨ８．２　（６Ｂ）で５回洗浄した。こうして
調製されたプロテインＧ結合メンプランは、風乾後径２
５ｍｍの円形に切抜きメンプランホルダー（スウィネク
ス，２５ｍｍ；ミリポア社〉にセットして試料の処理に
供した。

（２）抗ヒ｝Ｉｇ＾抗体結合メンプランの調製抗ヒトＩ
ｇ＾モノクローナル抗体（Ａ−０１．ヤマサ醤油＠）５
■をＰＢ３５０ｍｊ！に溶解した。この液に１０Ｘ１０
ｃｍのイムノダインメンプランを浸し、室温で３時間振
盪した後反応液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に
ＢＳＡＰＢＳ５　０　ｒｎｌに浸し、室温で一夜振盪し
た後ＢＳＡＰＢＳを除去し、１００−のＧＢで５回洗浄
した。こうしてｌ！ＩＩＩされた抗ヒＨｇ＾抗体結合メ
ンプランは、風乾後径２５ｍｍの円形に切抜きメンプラ
ンホルダーにセットして試料の処理に供した。

（３）抗ヒ｝ＩｇＭ抗体結合メンプランの調製抗ヒトＩ
ｇＭモノクローナル抗体（Ｍ−０１−ＡＳ，ヤマサ醤油
＠）５■をＰＦＩＳ　５　０−に溶解した。この液に１
０Ｘ１０ｃｍのイムノダインメンブランを浸し、室温で
３時間振盪した後反応液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し
た。次いでＢＳＡＰＢＳ５　０−に浸し、室温で一夜振
盪した後ＢＳＡＰ日Ｓを除去し、１００ｍｆのＧＯで５
回洗浄した。こうして調製された抗ヒＮｇＭ抗体結合メ
ンプランは、風乾後径２５ｍｍの円形に切抜きメンプラ
ンホルダーにセットして試料の処理に供した。

実施例２　競合抗体除去用アフィニティーゲルの調製： （１）　　プロテインＧセファロースのｍ製リコンビナ
ントプロテインＧをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　　（ファルマシア社）に定法
により結合させて調製した。すなわち、プロテインＧ１
０＋ｇを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸
！ｌｔＩｉ液、ｐＨ８．３　　（カップリングバッファ
一）１ロ一に溶解した。この溶液に！ｍＭ塩酸で膨潤後
カップリングバッファーでよく洗浄したＣＮＢｒ−ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　５　ｍ
ｌを加え、ゆるやかに攪拌しながら室温で３時間反応さ
せた。次に力ップリングパッファ−を除去し、０．１Ｍ
ＩＪス塩酸緩衝液、ｐＨ８．　０を加えて室温で２時間
ゆるやかに攪拌した後、０．５Ｍ塩化ナ｝　ＩＪウムを
含む０．１−酢酸緩衝液、ｐＨ４．０と０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Ｍ｝Ｕス塩酸緩衝液、ｐＨ８．　
０で洗浄し、最終的に５０ｍＭグリシンＩｔｌ衡液、Ｐ
Ｈ８．　２に再懸濁して４℃で保存した。また本プロテ
インＧセファロースは、ファルマシア社のプロテインＧ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗで代用
することもできる。

（２）抗ヒトＩｇＡ抗体セファロースの調製抗ヒトＩｇ
Ａモノクローナル抗体ヲＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
　Ｓｅｐｈａｒｏｓａ　４Ｂ　　（ファルマシア社〉に
定法により結合させて調製した。すなわち、抗ヒ｝＋ｇ
Ａモノクローナル抗体１５ｍｇを０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍ重炭酸ｌｔｌ衡液、ｐＨ８．３　　（
カップリングバッファ一）Ｉｏｍ１に溶解した。この溶
液に１ｍＭ塩酸で膨潤後カップリングパッファ一でよく
洗浄したＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　４　Ｂ５ｒｄを加え、ゆるやかに攪拌しながら
室温で３時間反応させた。次にカップリングバッファー
を除去し、０，ＩＭ＋−リス塩酸緩衝液、ｐＨ８．　０
を加えて室温で２時間ゆるやかに攪拌した後、０．５Ｍ
塩化ナ｝　ＩＪウムを含むＯ。ＩＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４
．０と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ｝ＩＪス
塩酸緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄し、最終的に５０ｍＭグ
リシン緩衝液、ｐ｝１８．　２に再懸濁１−て４℃で保
存した。

（３）抗ヒトＩｇＭ抗体セファロースの調製抗ヒトｚｇ
Ｍモノクローナル抗体をＣＮ８ｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
　Ｓｅｐｈｓｒｏｓｅ　４　Ｂ　　（　７　７　ル７　
シ７社）に定法により結合させて調製した。すなわち、
抗ヒＨｇＭモノクローナル抗体１５＠ｇを０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸緩衝液、ｐＨ８．３　
　（カップリングバッファ一）１０ｍｌに溶解した。こ
の溶液に１ｍＭ塩酸で膨潤後カツプリングバッファーで
よく洗浄したＣＮＩｌｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓａｐ
ｈａｒｏｓｅ　　４　Ｂ５−を加え、ゆるやかに攪拌し
ながら室温で３時間反応させた。次にカップリングバッ
ファーを除去し、０．１１４｝ＩＪス塩酸緩衝液、ｐＨ
８．０を加えて室温で２時間ゆるやかに攪拌した後、０
．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０，ＩＭ酢酸緩衝液、ｐＨ
４．０と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ｝ＩＪ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄し、最終的に５０ｍＭ
グリシン緩衝液、ｐ＋１８．２に再懸濁して４℃で保存
した。

実施例３　ダニアレルゲン特異１ｇｒ！抗体の測定：（
１）　　ダニアレルゲンの不溶性抗体への感作２０ｍＭ
リン酸緩衝液、ｐＨ７．０　（ＰＲ）に懸濁された粒径
１．０μ口の１％ボリスチレンラテックス液（Ｎ−４　
７　；日本合或ゴム社！Ｉｖｌ）１０−１．：、ジメチ
ルスルホキシド（ロＭＳＯ）に溶解されたＩＭ（Ｄジス
クシンイミジル　グルタレー｝　（ＢＩＳＩ｛ＯＸ；Ｉ
ｎｏｖａｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．　Ｉｎｃ，，フナコ
シ薬品■販売）０．１ｒｎ１を添加し、攪拌後室温で１
０分間静置した。

次にＰＢに溶解した０．４ｍｇ／ｍｌ！のダニアレルゲ
ン溶液１０ｍｌ！を加えてよく混合し室温で１時間静置
した後、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む５０ｍＭグリ
シン緩衝液、ｐＨ８．　２を２０ｒｎＩｌ加え、３７℃
で２時間保温した。遠心法によりアレルゲン液および緩
衝液を洗浄除去し、最終的に０．２％ＢＳＡ　，　０．
１％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシ
ン緩衝液１００−に再懸濁して４℃で保存した。

（２）　ダニア１／ルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定■０．
２％ＢＳ八および０．５％塩化ナトリウムを含む５０ｍ
Ｍグリシン緩衝液、ｐｌ１８．２で２０倍に希釈された
試料０．５ｒｎｌを、メンプランホルダーに各々１枚ず
つ重ねてセットされたプロテインＧ結合メンプラン、抗
ヒトＩｇ＾抗体結合メンプランおよび抗ヒＨｇＭ抗体結
合メンプランに通過させた。

■この試料５０μｌと（１）で調製したダニアレルゲン
感作ラテックス試薬５０μｌおよび０，ｌｍｇ／一の抗
ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（１３−０１；ヤマサ醤
油■）液５０μｌを混合させ、３７℃で３０分保温した
。３，ＯｍｌのＧＢで反応を停止させた後へ電解液（Ｉ
ｓｏｔｏｎＩ［　；コールタ−社）で更に１００倍希釈
した。

■この希釈された反応凝集物の粒度分布をコールターカ
ウンターＺＢＩ　＆Ｃ−１０００　（コールター社）で
計測し、ＰＣ９８０１　（日本電気＠）で未凝集ラテッ
クスと凝集ラテックスの総体積の比率（　ＲＶ）を算出
した。

■希釈率を横軸にＲＶを縦軸にしてダニアレルゲン特異
ＩｇＥ抗体陽性試料の希釈曲線を第ｌＩＩに示した。

実施例４　卵白アレルゲン特異１ｇＧ抗体の測定：（１
）卵白アレルゲンの不溶性担体への感作２０ｒｎＭグリ
シン緩衝液、ｐＨ８．　２　（ＧＢ）に懸濁された粒径
１．Ｑμｍの１％ボリスチレンラテックス液（ＳＦＬ１
４０Ｌ−１０；日本合戒ゴム社製）１０−に、ＧＢで溶
解した０．４ｍｇ／ｍｊ！の卵白アレルゲン溶液１〇一
を加えてよく混合し、水冷下２時間静置した。

次に０．５％（ｗ／ｖ）ＯＳ八を含む５０ｍＭグリシン
緩衝液、ｐＨ８．　２を２０ｒｎ！．加え、３７℃で４
時間保温した。遠心法によりアレルゲン液および緩衝液
を洗浄除去し、最終的に０．２％ＢＳ＾、０．１％アジ
化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシン緩衝液１００一に
再懸濁して４℃で保存した。

（２）卵白アレルゲン特異１ｇＧ抗体の測定■０．２％
ＢＳ＾及び０．５％塩化ナトリウムを含む５０ｔｔ＋樋
グリシンｒｊｋ衝液、ｐＨ８．　２で５０倍に希釈され
た試料０．５−を、メンプランホルダーに各々一枚ずつ
重ねてセットされた抗ヒ｝［ｇ＾抗体結合メンプランお
よび抗ヒＮｇＭ抗体結合メンプランに通過させた。

■この試料５０μぶと（１）で調魁した卵白アレＪレゲ
ン感作ラテックス試薬５０μｌおよびＯ．ｌｍｇ／一の
抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｇ−０１；ヤマサ醤
油＠）液５０μ２を混合させ、３７℃で２０分保温した
。３．０ｍｌのＧＢで反応を停止させた後、電解液で更
に１００倍希釈した。

■この希釈された反応凝集物の粒度分着をコールターカ
ウンターＺＢＩ　＆Ｃ−１０００で計測し、ＰＣ９８０
１で未凝集ラテックスと凝集ラテックス総体積の比率（
ＲＶ）を算出した。

■希釈率を横軸にＲｖを縦軸にして卵白アレルゲン特異
１ｇＧ抗体陽性試料の希釈曲線を第２図に示した。

実施例５　ハウスダストアレルゲン特異１ｇＡ抗体の測
定： （１）ハウスダストアレルゲンの不溶性担体への感作 ２０ｍＭホウ酸緩衝液．　ｐｔ１８．２　（ＢＢ）に懸
濁された粒径１．０μｍの１％ボリスチレンラテックス
液（Ｌ−０１０１；日本合或ゴム社製）１０ｍｌに、８
Ｂに溶解した１３．５ｍｇ／ｍｌ！のトエチルート（３
−ジメチルアミノブロピル）カルボジイミド塩酸塩（１
３ｃ’ＤＩ．；ＢＤＩ−１ｆ製）を３ｍｌ加えてよく混
合し、室温で１時間静置した。次に遠心法により余分な
ＢＣＤＩを洗浄除去し、１０ｒｎｌのＢＢに再懸濁した
。これにＢＢに溶解した０．５■／ｄのハウスダストア
レルゲン溶１１０ｒｎ１を加えてよく混合し、４℃で一
昼夜静置した。次いで０．５％ＢＳＡを含む５０ｍＭグ
リシン緩衝液、ｐＨ８．２を２０ｒｎｌ加え、３７℃で
２時間保温した。遠心法によりアレルゲン液及び緩衝液
を洗浄除去し、最終的に０．２％ＢＳＡ　，　Ｏ。１％
アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシン緩衝液１　０
　０ｍｊ！に再懸濁して４℃で保存した。

（２）ハウスダストアレルゲン特異１ｇ八抗体の測定■
プロテインＧセファロース０，４ｒｎｌおよび抗ヒトＩ
ｇＭ抗体セファロースＯＪ−を重層したミニカラムに試
料Ｑ，ＩＷ１ｌを添加し、０．２％ＢＳＡおよび０。５
％塩化ナトリウムを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．　２）　２，　Ｏ　ｍｊ！で溶出した（２０倍希釈
液）。

■この試料５０μｌと（１）で調製したノ１ウスダスト
アレルゲン感作ラテックス試薬５０μｌおよび０．１■
／ｄの抗ヒトＩｇＡモノクローナル抗体（＾−０１：ヤ
マサ醤油＠）液５０μｌを混合させ、３７℃で２０分保
温した。３．０−のＧＢで反応を停止させた後、電解液
で更に１００倍希釈した。

■この希釈された反応凝集物の粒度分布をコールターカ
ウンターＺＢＩ　＆Ｃ−１０００で計測し、Ｐ［ｌ’９
８０１で未凝集ラテックスと凝集ラテックスの総体積の
比率（ＲＶ）を算出した。

■希釈率を横軸にＲＶを縦軸にしてハウスダストアレル
ゲン特異１ｇ＾抗体陽性試料の希釈曲線を第３１！Ｉに
示した。

４．　　ＴＩ！Ｊ面の簡単な説明 第１図は実施例１で得られたダニア１／ルゲン特異Ｉｇ
Ｅ抗体の希釈曲線を示し、第２図は実施例２で得られた
卵白アレルゲン特異１ｇＧ抗体の希釈曲線を示し、第３
図は実施例３で得られたハウスダスト特異１ｇＡ抗体の
希釈曲線を示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒト体液試料中の免疫グロブリンのうち特定のクラ
   スの特異抗体を免疫学的に測定するに際し、測定しよう
   とする特定のクラス以外の免疫グロブリンを予め除去す
   ることを特徴とする特異抗体の測定法。 ２　測定しようとする特定のクラス以外の免疫グロブリ
   ンの除去を、その免疫グロブリンと特異的に反応する活
   性物質を用いて行うものである請求項１記載の特異抗体
   の測定法。 ３　免疫グロブリンと特異的に反応する活性物質が、プ
   ロテインＡ、リコンビナントプロテインＡ、プロテイン
   Ｇ、リコンビナントプロテインＧ、抗免疫グロブリン抗
   体および免疫グロブリンレセプターから選ばれた一種も
   しくは二種以上のものである請求項２記載の特異抗体の
   測定法。 ４　測定しようとする特異抗体が、アレルゲン特異Ｉｇ
   Ｅ抗体である請求項１記載の特異抗体の測定法。 ５　ヒト体液試料中のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを除
   去した後、アレルゲンを感作させた不溶性担体と抗Ｉｇ
   Ｅ特異抗体との混合物を当該ヒト体液試料と反応させ、
   次いでその凝集程度を計測することを特徴とする、アレ
   ルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定法。