JP3936678B2 - 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
梅毒は、梅毒トレポネーマ菌(トレポネーマ・パリダム、Treponemapallidum)の感染により引き起こされる疾患である。梅毒に罹患しているか否かは血液中に抗梅毒トレポネーマ抗体が存在するか否かを免疫分析により検査することにより診断されている。梅毒トレポネーマの表面には多数の表面抗原が存在しており、この表面抗原と検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応を利用する方法により免疫分析が行われている。かかる梅毒トレポネーマ菌の細胞表面に存在する表面抗原のうち主なものとしては、分子量47kDa、42kDa、37kDa、17kDa及び15kDaのものが知られている(Jouma1 of Immunology,vol.129,pp.1287−1291,1992)。
【0003】
現在、この免疫分析に用いられている梅毒トレポネーマの表面抗原としては、梅毒トレポネーマ菌を家兔睾丸で培養し、界面活性剤等で可溶化・抽出し、更に種々の方法を用いて不要物の除去・必要成分の精製を行ったものが用いられている。しかし、このような家兔を用いた製造方法は、動物を宿主とすることから収量が限られているうえ、動物により梅毒トレポネーマ菌の増殖状態がばらつくことから、大量の安定した収量を確保するのが困難であるという問題があった。一方、現時点では、梅毒トレポネーマ菌を直接人工培養することには成功していない。
【0004】
これに対して、梅毒トレポネーマの表面抗原をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に表面抗原を大量生産して免疫分析に用いる方法が提案されている。例えば、特表平2−50040号公報には、梅毒トレポネーマの分子量47kDaの抗原を遺伝子工学的に調製し、これを用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫測定する方法が記載されている。また、特開平7−63365号公報には、15kDa及び17kDaの表面抗原のN末端にグルタチオン−S−トランスフェラーゼが融合したタンパク質を用いる方法が開示されている。更に、この他にも特定の方法で調製した特定の分子量の抗原を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法等が報告されている。
しかしながら、このような方法で調製された梅毒トレポネーマの表面抗原を用いても、抗梅毒トレポネーマ抗体の測定を行うことは可能であるものの、感度及び精度の点では必ずしも満足できるものではなかった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供することを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、梅毒トレポネーマの表面抗原のうち、分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を抗原として用いることにより、従来の方法よりも有意に高い感度で、しかも極めて高い精度で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0007】
本発明は、抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を含有する抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬である。
以下に本発明を詳述する。
【0008】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬は、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を含有するものである。
これらの抗原のうち、いずれか一方が含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。特に両方が含まれる場合には、検出感度が更に高まるので好ましい。
【0009】
上記梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原及び分子量17kDaの表面抗原については、既にコードする遺伝子がクローニングされており、また、これらのアミノ酸配列も決定されている(INFECTION AND IMMUNITY,vol.57,NO.12,pp.3708−3714,1989;Molecular Microbiology,vo.4,NO.8,pp1371−1379,1990;INFECTION AND IMMUNITY,vol.61,NO.4,pp.1202−1210,1993)。したがって、これらを常法により遺伝子工学的に生産して用いることができる。
【0010】
上記梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原及び分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合させる方法としては特に限定されず常法を用いることができる。
β−ガラクトシダーゼはラクトースの分解及び合成を行う酵素であり、大腸菌では古くからラクトースによって誘導される誘導酵素の典型として研究されている。
β−ガラクトシダーゼは分子量約116kDaであり4量体を形成する。その構造遺伝子はlacZと呼ばれ、その遺伝子配列は既知であり(EMBO J 1963;2(4):593−597)、各種のプラスミドに含まれる形で市販されている。市販されているもののうち代表的なものとしては、例えば、pUC18、pUC19(いずれも東洋紡社製)等が挙げられるが、外来タンパク質とβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質が発現し得るものであれば特に限定されない。また、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原及び分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼを融合させる際には、C末端或いはN末端のいずれからでも良く、特には限定されない。
上記梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原及び分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼを融合させる方法しては、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原又は分子量17kDaの表面抗原の構造遺伝子をlacZ遺伝子に導入すればよく、その方法は当業者にとっては既知の遺伝子組み換え技術で可能であり、特に限定されない。
梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原又は分子量17kDaの表面抗原とβ−ガラクトシダーゼとが融合した融合タンパク質を精製する方法としては特に限定されず、例えば、p−アミノベンジル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシドが結合したアガロースカラム(例えば、シグマ社製)、又は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体(例えば、プロメガ社製)等を用いて精製する方法等が挙げられる。
なお、上記梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原及び分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質は、一般に販売されているので、これらの市販品を用いることもできる。
【0011】
これらの梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原は、ラテックス粒子等の適当な担体に固定化してもよい。かかる担体に固定化することにより本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を免疫凝集法等に供することができる。
上記固定化の方法としては特に限定されず、例えば、物理的吸着法、担体表面に設けた官能基と化学結合する方法等が挙げられる。
【0012】
上記梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原と梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原とはいずれも公知のものであったが、驚くべきことに、これらを用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫測定すると、その感度はβ−ガラクトシダ−ゼと融合していない表面抗原を用いた場合よりも飛躍的に向上し、かつ、非特異的反応による検出精度の低下を抑制することができる。
抗原抗体反応を利用して検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法であって、抗原として、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を用いる抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法もまた、本発明の1つである。
【0013】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法としては、本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。
すなわち、反応形式で分類すればサンドイッチ法、凝集法等を利用することができ、また標識で分類すれば、酵素免疫測定法、蛍光分析測定法、放射免疫分析等を採用することができる。なかでも、操作が簡便で感度も良好であり、かつ多数の検体の処理に適しているラテックス免疫凝集法がより好ましい。
【0014】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法の具体例としては、例えば、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原をラテックス粒子に固定化し、所定の操作を得てラテックス試薬として調製した後、これに検体を加えて反応させ、所定の時間間隔での濁度変化を視覚的、光学的又は電気化学的に検出する方法が挙げられる。
【0015】
また、別の具体例としては、例えば、マイクロタイタープレート等のウェルに梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を固定化し、非特異的吸着部位をブロッキング後、洗浄し、これに検体を加えて反応させ、洗浄後、ペルオキシダ−ゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、洗浄後、標識抗体の基質を加えて酵素反応を行い発色させ、反応停止後の発色の程度を吸光度測定により測定する方法が挙げられる。
【0016】
更に、別の具体例としては、例えば、フェライト磁性粒子等の粒子に梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を固定化し、これに検体を加えて反応させ、ペルオキシダ−ゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体と化学発光基質とを反応させる化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)が挙げられる。
【0017】
この他にも、上記ラテックス粒子、プラスチックプレート、フェライト磁性粒子以外の不溶化担体、例えば、特公昭63−29223号公報に開示されているゼラチン等からなる人工担体;ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物赤血球等の粒子担体に固定化し、この担体の懸濁液に検体を加えて粒子が凝集するか否かを測定する凝集免疫分析法も挙げられる。
【0018】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法に供される検体としては特に限定されず、梅毒の診断を行うべきヒトや動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げることができる。
【0019】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法は、本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることにより、極めて高い感度・精度で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができ、より正確な梅毒の診断を行うことができる。
【0020】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0021】
(実施例1)
ラテックス液(積水化学工業社製:平均粒径0.3μm、固形分10%)0.05mLを試験管内で攪拌しながら、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液(Bios Pacific社製、100μg/mL)1mLを添加し、ラテックス粒子の表面に融合タンパク質を固定化した。
【0022】
得られた融合タンパク質固定化ラテックス粒子の抗原未吸着部分を1%ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin:以下、BSAともいう)を含むPBSバッファーにてブロッキングし、未吸着抗原を遠心洗浄にて除去し、充分攪拌した後、1%BSAを含むPBSバッファーにて0.1%に希釈して、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬とした。
【0023】
(実施例2)
梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液(Bios Pacific社製、100μg/mL)を用いた以外は実施例1と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【0024】
(比較例1)
梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原溶液(GST15抗原、Biokit社製、100μg/mL)を用いた以外は実施例1と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【0025】
(比較例2)
梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原溶液(GST17抗原、Biokit社製、100μg/mL)を用いた以外は実施例2と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【0026】
実施例1、2及び比較例1、2で調製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いて全自動分析装置(日立社製、7170形)により、梅毒陽性血清として臨床症状から梅毒と診断された患者血清20例を、梅毒陰性血清として各種血清検査等から非梅毒である正常ヒト血清20例を検体として試験を行った。
すなわち、検体希釈用緩衝液(1%BSAを含むPBSバッファー)120μL、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬60μL及び検体15μLを加え、20〜34分間の溶液の濁度の変化を700nmの吸光度の変化量として測定し、これを反応量とした。
結果を表1に示した。
【0027】
【表1】
【0028】
更に、表1のデータより縦軸を反応量として梅毒陽性血清の場合を図1に、梅毒陰性血清の場合を図2に示した。
【0029】
表1より、β−ガラクトシダーゼが融合した融合タンパク質を用いた実施例1、2で作製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いた場合には、β−ガラクトシダーゼを融合しない抗原を用いた比較例1、2作製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いた場合に比べ、高感度で梅毒患者血清を検出することができ、かつ、梅毒陰性血清群における非特異反応も低いことがわかった。
【0030】
【発明の効果】
本発明によれば、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例において梅毒陽性血清について行った抗梅毒トレポネーマ抗体測定試験の結果を示す図である。
【図2】実施例において梅毒陰性血清について行った抗梅毒トレポネーマ抗体測定試験の結果を示す図である。
Claims (2)
- 抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、担体と、前記担体に固定化された梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原のC末端にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原のC末端にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原とからなることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
- 免疫凝集法により抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法であって、担体に固定化された梅毒トレポネーマの分子量15kDaの表面抗原のC末端にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる15K抗原及び/又は梅毒トレポネーマの分子量17kDaの表面抗原のC末端にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる17K抗原を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法。
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