JP3216473B2 - 抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 - Google Patents
抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗梅毒トレポネマ抗体
の検出及び定量方法に関する。
の検出及び定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】梅毒は、梅毒トレポネマ（トレポネマ・
パリダム（Treponema pallidum) 、以下、「Ｔｐ」とい
うことがある）により引き起こされる疾病である。梅毒
に感染しているか否かは、血液中に抗Ｔｐ抗体が存在す
るか否かを免疫分析により検査することにより診断され
ている。Ｔｐの細胞表面には、多数の表面抗原が存在し
ており、この表面抗原と検体中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗
体反応を利用して上記免疫分析が行われている。この免
疫分析に現在用いられているＴｐの表面抗原としては、
Ｔｐを培養し、生菌を砕いたものを用いている。しかし
ながら、Ｔｐの培養はウサギの睾丸を用いて行われてお
り、不純物の混入により感度及び再現性が低く、また、
大量にＴｐを得ることが困難である。
パリダム（Treponema pallidum) 、以下、「Ｔｐ」とい
うことがある）により引き起こされる疾病である。梅毒
に感染しているか否かは、血液中に抗Ｔｐ抗体が存在す
るか否かを免疫分析により検査することにより診断され
ている。Ｔｐの細胞表面には、多数の表面抗原が存在し
ており、この表面抗原と検体中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗
体反応を利用して上記免疫分析が行われている。この免
疫分析に現在用いられているＴｐの表面抗原としては、
Ｔｐを培養し、生菌を砕いたものを用いている。しかし
ながら、Ｔｐの培養はウサギの睾丸を用いて行われてお
り、不純物の混入により感度及び再現性が低く、また、
大量にＴｐを得ることが困難である。
【０００３】この問題を解決するため、Ｔｐの表面抗原
をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に
該表面抗原を大量生産し、これを上記の免疫分析に用い
ることが提案されている。例えば、特表平２−５００４
０３号公報には、Ｔｐの分子量４７ｋＤａの抗原を遺伝
子工学的に調製し、これを用いて抗Ｔｐ抗体を免疫測定
することが記載されている。
をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に
該表面抗原を大量生産し、これを上記の免疫分析に用い
ることが提案されている。例えば、特表平２−５００４
０３号公報には、Ｔｐの分子量４７ｋＤａの抗原を遺伝
子工学的に調製し、これを用いて抗Ｔｐ抗体を免疫測定
することが記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】特表平２−５００４０
３号公報に記載された方法により抗Ｔｐ抗体の測定を行
うことは可能であるが、より高い感度で抗Ｔｐ抗体を測
定することができれば梅毒の診断にとって有利である。
３号公報に記載された方法により抗Ｔｐ抗体の測定を行
うことは可能であるが、より高い感度で抗Ｔｐ抗体を測
定することができれば梅毒の診断にとって有利である。
【０００５】従って、本発明の目的は、従来の方法より
も高い感度で抗Ｔｐ抗体を測定することができる抗Ｔｐ
抗体の測定方法を提供することである。
も高い感度で抗Ｔｐ抗体を測定することができる抗Ｔｐ
抗体の測定方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、Ｔｐの表面抗原のうち、分子量１５ｋＤａの
抗原又は分子量１７ｋＤａの抗原のＮ末端にグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼを融合したＧ１５抗原及び
／又はＧ１７抗原を抗原として用いることにより、従来
の方法よりも有意に高い感度で抗Ｔｐ抗体を測定できる
ことを見出し本発明を完成した。
究の結果、Ｔｐの表面抗原のうち、分子量１５ｋＤａの
抗原又は分子量１７ｋＤａの抗原のＮ末端にグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼを融合したＧ１５抗原及び
／又はＧ１７抗原を抗原として用いることにより、従来
の方法よりも有意に高い感度で抗Ｔｐ抗体を測定できる
ことを見出し本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、梅毒トレポネマの分
子量１５ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼが融合したタンパク質から成るＧ
１５抗原と、梅毒トレポネマの分子量１７ｋＤａの表面
抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
が融合したタンパク質から成るＧ１７抗原とのいずれか
一方又は両方と、検体中の抗梅毒トレポネマ抗体との抗
原抗体反応を利用する免疫分析法により検体中の抗梅毒
トレポネマ抗体を測定する、抗梅毒トレポネマ抗体の測
定方法を提供する。
子量１５ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼが融合したタンパク質から成るＧ
１５抗原と、梅毒トレポネマの分子量１７ｋＤａの表面
抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
が融合したタンパク質から成るＧ１７抗原とのいずれか
一方又は両方と、検体中の抗梅毒トレポネマ抗体との抗
原抗体反応を利用する免疫分析法により検体中の抗梅毒
トレポネマ抗体を測定する、抗梅毒トレポネマ抗体の測
定方法を提供する。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】Ｔｐの細胞表面には種々の分子量の表面抗
原が存在することが知られており、主なものとして分子
量４７ｋＤａ、４２ｋＤａ、１７ｋＤａ及び１５ｋＤａ
の抗原が知られている。これらは電気泳動により互いに
明瞭に分離される（Journalof Immunology, Vol. 129,
pp.1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiolo
gy, Vol. 21, pp.82-87, 1985; Journal of Clinical M
icrobiology, Vol. 30, pp.115-122, 1992 ）。分子量
４７ｋＤａの表面抗原のみならず、１７ｋＤａ及び１５
ｋＤａの表面抗原をコードする遺伝子は既にクローニン
グされており、遺伝子工学的に抗原が生産されている。
また、これらのアミノ酸配列も決定されている（INFECT
ION AND IMMUNITY, Vol. 57, No. 12, pp.3708-3714, 1
989; Molecular Microbiology (1990) 4(8), 1371-137
9; INFECTION AND IMMUNITY, Vol.61, No. 4 pp.1202-1
210, 1993)。
原が存在することが知られており、主なものとして分子
量４７ｋＤａ、４２ｋＤａ、１７ｋＤａ及び１５ｋＤａ
の抗原が知られている。これらは電気泳動により互いに
明瞭に分離される（Journalof Immunology, Vol. 129,
pp.1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiolo
gy, Vol. 21, pp.82-87, 1985; Journal of Clinical M
icrobiology, Vol. 30, pp.115-122, 1992 ）。分子量
４７ｋＤａの表面抗原のみならず、１７ｋＤａ及び１５
ｋＤａの表面抗原をコードする遺伝子は既にクローニン
グされており、遺伝子工学的に抗原が生産されている。
また、これらのアミノ酸配列も決定されている（INFECT
ION AND IMMUNITY, Vol. 57, No. 12, pp.3708-3714, 1
989; Molecular Microbiology (1990) 4(8), 1371-137
9; INFECTION AND IMMUNITY, Vol.61, No. 4 pp.1202-1
210, 1993)。
【００１０】本発明の方法に用いられるものは、Ｔｐの
上記１５ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」ということが
ある）が融合した融合タンパク質（Ｇ１５抗原）及び／
又はＴｐの上記１７ｋＤａの表面抗原のＮ末端にＧＳＴ
が融合した融合タンパク質（Ｇ１７抗原）である。これ
らの融合タンパク質自体及びそれらの遺伝子工学的な調
製方法は公知である（INFECTION AND IMMUNITY, Apr. 1
993, pp.1202-1210)。しかしながら、Ｇ１５及びＧ１７
を用いて抗Ｔｐ抗体を免疫測定した場合に、その感度が
ＧＳＴと融合していない表面抗原を用いた場合よりも有
意に高まるという驚くべき効果は本願発明者らが初めて
見出したものである。
上記１５ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」ということが
ある）が融合した融合タンパク質（Ｇ１５抗原）及び／
又はＴｐの上記１７ｋＤａの表面抗原のＮ末端にＧＳＴ
が融合した融合タンパク質（Ｇ１７抗原）である。これ
らの融合タンパク質自体及びそれらの遺伝子工学的な調
製方法は公知である（INFECTION AND IMMUNITY, Apr. 1
993, pp.1202-1210)。しかしながら、Ｇ１５及びＧ１７
を用いて抗Ｔｐ抗体を免疫測定した場合に、その感度が
ＧＳＴと融合していない表面抗原を用いた場合よりも有
意に高まるという驚くべき効果は本願発明者らが初めて
見出したものである。
【００１１】本発明の方法に用いるＧ１５抗原及びＧ１
７抗原は図１に示す構造を有する。これらＧ１５抗原及
びＧ１７抗原は上記の文献に記載された方法により調製
することもできるし、より好ましい調製方法が下記実施
例に詳述されている。
７抗原は図１に示す構造を有する。これらＧ１５抗原及
びＧ１７抗原は上記の文献に記載された方法により調製
することもできるし、より好ましい調製方法が下記実施
例に詳述されている。
【００１２】本発明の方法は、上記のＧ１５抗原及びＧ
１７抗原のいずれか一方又は両方を抗原として用い、検
体中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を利用した免疫分析
により検体中の抗Ｔｐ抗体を測定するものである。種々
の免疫分析法が当業者にとって周知であり、本発明にお
いてはこれら従来より公知の免疫分析法のいずれをも採
用することができる。すなわち、反応形式で分類すれば
サンドイッチ法や凝集法等を採用することができ、ま
た、標識で分類すれば、酵素免疫分析、蛍光免疫分析、
放射免疫分析等を採用することができる。これらのう
ち、大掛かりな設備を必要とせず、操作が簡便で感度も
良好であり、かつ、多数の検体の処理に適している酵素
免疫分析によるサンドイッチ法（サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ）が特に好ましい。すなわち、例えば、ヒトの抗Ｔｐ
抗体を測定する場合、Ｇ１５抗原若しくはＧ１７抗原又
はこれら両方を例えば９６穴マイクロタイタープレート
のウェルに不動化する。非特異的吸着部位をブロッキン
グ後、洗浄し、検体を加えて反応させ、洗浄後、ペルオ
キシダーゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗
体を反応させる。洗浄後、標識酵素の基質を加えて酵素
反応を行い発色させる。反応停止後、発色の程度を吸光
度測定により測定することにより検体中の抗Ｔｐ抗体を
測定することができる。なお、このサンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法自体はこの分野において周知であり、下記実施例
においても具体例が詳細に記載されている。さらに、フ
ェライト磁性粒子等の粒子にＧ１５抗原若しくはＧ１７
抗原又はこれら両方を不動化し、前記した酵素標識した
抗ヒト免疫グロブリン抗体と化学発光基質とを用いる化
学発光酵素免疫分析法（ＣＬＥＩＡ）により検体中の抗
Ｔｐ抗体の測定を行うこともできる。なお、本発明の方
法は、この酵素分析法に限定されるものではなく、Ｇ１
５抗原及び／又はＧ１７抗原を凝集免疫分析法に用いら
れる例えば水溶性多糖類、ゼラチン及びメタリン酸ナト
リウムを含みアルデヒド系架橋剤により架橋され不溶化
された粒子状の人工担体（特公昭６３−２９２２３号参
照）、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物赤
血球、ラテックス粒子等の粒子担体に不動化し、この粒
子の懸濁液に検体を加えて粒子が凝集するか否かを測定
する、凝集免疫分析法等によっても行うことができる。
１７抗原のいずれか一方又は両方を抗原として用い、検
体中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を利用した免疫分析
により検体中の抗Ｔｐ抗体を測定するものである。種々
の免疫分析法が当業者にとって周知であり、本発明にお
いてはこれら従来より公知の免疫分析法のいずれをも採
用することができる。すなわち、反応形式で分類すれば
サンドイッチ法や凝集法等を採用することができ、ま
た、標識で分類すれば、酵素免疫分析、蛍光免疫分析、
放射免疫分析等を採用することができる。これらのう
ち、大掛かりな設備を必要とせず、操作が簡便で感度も
良好であり、かつ、多数の検体の処理に適している酵素
免疫分析によるサンドイッチ法（サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ）が特に好ましい。すなわち、例えば、ヒトの抗Ｔｐ
抗体を測定する場合、Ｇ１５抗原若しくはＧ１７抗原又
はこれら両方を例えば９６穴マイクロタイタープレート
のウェルに不動化する。非特異的吸着部位をブロッキン
グ後、洗浄し、検体を加えて反応させ、洗浄後、ペルオ
キシダーゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗
体を反応させる。洗浄後、標識酵素の基質を加えて酵素
反応を行い発色させる。反応停止後、発色の程度を吸光
度測定により測定することにより検体中の抗Ｔｐ抗体を
測定することができる。なお、このサンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法自体はこの分野において周知であり、下記実施例
においても具体例が詳細に記載されている。さらに、フ
ェライト磁性粒子等の粒子にＧ１５抗原若しくはＧ１７
抗原又はこれら両方を不動化し、前記した酵素標識した
抗ヒト免疫グロブリン抗体と化学発光基質とを用いる化
学発光酵素免疫分析法（ＣＬＥＩＡ）により検体中の抗
Ｔｐ抗体の測定を行うこともできる。なお、本発明の方
法は、この酵素分析法に限定されるものではなく、Ｇ１
５抗原及び／又はＧ１７抗原を凝集免疫分析法に用いら
れる例えば水溶性多糖類、ゼラチン及びメタリン酸ナト
リウムを含みアルデヒド系架橋剤により架橋され不溶化
された粒子状の人工担体（特公昭６３−２９２２３号参
照）、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物赤
血球、ラテックス粒子等の粒子担体に不動化し、この粒
子の懸濁液に検体を加えて粒子が凝集するか否かを測定
する、凝集免疫分析法等によっても行うことができる。
【００１３】サンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用する場
合、測定感度は、発色色素が測定されない波長における
吸光度と、発色色素を測定する波長における吸光度との
差をとることによりさらに高められる。例えば、下記実
施例で示されるように、標識酵素としてペルオキシダー
ゼを用い、発色基質としてＡＢＴＳ（2,2'-azino-bis(3
-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）を用いる場
合、測定感度は４０５ｎｍにおける吸光度と４９２ｎｍ
における吸光度との差（４０５／４９２）を測定するこ
とによりさらに高められる。
合、測定感度は、発色色素が測定されない波長における
吸光度と、発色色素を測定する波長における吸光度との
差をとることによりさらに高められる。例えば、下記実
施例で示されるように、標識酵素としてペルオキシダー
ゼを用い、発色基質としてＡＢＴＳ（2,2'-azino-bis(3
-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）を用いる場
合、測定感度は４０５ｎｍにおける吸光度と４９２ｎｍ
における吸光度との差（４０５／４９２）を測定するこ
とによりさらに高められる。
【００１４】また、本発明の方法においては、Ｇ１５抗
原とＧ１７抗原のいずれか一方のみを用いることもでき
るし、両方を同時に抗原として用いてもよい。後者の場
合には測定感度がさらに高まるので好ましい。
原とＧ１７抗原のいずれか一方のみを用いることもでき
るし、両方を同時に抗原として用いてもよい。後者の場
合には測定感度がさらに高まるので好ましい。
【００１５】本発明の方法によれば、抗Ｔｐ抗体を測定
することができ、ひいては梅毒の診断を行うことができ
る。従って、検体としては、梅毒の診断を行うべきヒト
や動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げることがで
きる。
することができ、ひいては梅毒の診断を行うことができ
る。従って、検体としては、梅毒の診断を行うべきヒト
や動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げることがで
きる。
【００１６】
【発明の効果】本発明によれば、従来から提案されてい
る方法に比べてより高い測定感度で抗Ｔｐ抗体を測定す
ることができる。
る方法に比べてより高い測定感度で抗Ｔｐ抗体を測定す
ることができる。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１８】参考例１ Ｇ１５抗原及びＧ１７抗原の調製 梅毒菌継代ウサギ睾丸より、梅毒菌を精製し、そこから
ジェノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、す
でに既知のＤＮＡ配列をもとにＤＮＡ合成装置を用いて
作製したプライマーを使用してＰＣＲ法により１５ｋ、
１７ｋ抗原のＤＮＡ断片を得た。なお、各ＤＮＡ断片に
は、ｎａｔｉｖｅ抗原では切除されているＮ末端のペプ
チドに相当する５’側ＤＮＡ配列は含まれていない。Ｇ
ＳＴとの融合型タンパクを発現するために構築されたベ
クターｐＷＧ６Ａに、これらのＤＮＡ断片を挿入し、で
きたベクターを各々、ｐＷＧ６Ａ−１５ｋ、ｐＷＧ６Ａ
−１７ｋと命名した。これらを大腸菌に導入し、各々Ｇ
１５抗原、Ｇ１７抗原の発現を誘導した。各抗原発現後
の大腸菌を超音波処理し、遠心操作後その上清を順にＤ
ＥＡＥセファロース（ファルマシア社製）を用いたイオ
ン交換クロマトグラフィー、フェニルセファロース（フ
ァルマシア社製）を用いた疎水クロマトグラフィーにて
精製した。最終的にＧ１５抗原、Ｇ１７抗原ともに、純
度９５％以上で１リットルの培養液からおよそ６０ｍｇ
得ることができた。得られたＧ１５抗原、Ｇ１７抗原を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、ウサギ抗梅毒
血清を一次抗体としてウェスタンブロットを行ったとこ
ろ強い発色が認められた。また、ウサギ睾丸から精製し
た梅毒菌をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、Ｇ
１５抗原、Ｇ１７抗原をマウスに感作して作製した抗Ｇ
１５モノクローナル抗体、抗Ｇ１７モノクローナル抗体
を一次抗体としてウェスタンブロットを行うと、各々ｎ
ａｔｉｖｅの１５ｋ抗原、ｎａｔｉｖｅの１７ｋ抗原に
強い発色が認められた。これにより免疫学的に組換え抗
原Ｇ１５、Ｇ１７は、それぞれｎａｔｉｖｅ抗原１５
ｋ、１７ｋと同一であることがわかった。
ジェノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、す
でに既知のＤＮＡ配列をもとにＤＮＡ合成装置を用いて
作製したプライマーを使用してＰＣＲ法により１５ｋ、
１７ｋ抗原のＤＮＡ断片を得た。なお、各ＤＮＡ断片に
は、ｎａｔｉｖｅ抗原では切除されているＮ末端のペプ
チドに相当する５’側ＤＮＡ配列は含まれていない。Ｇ
ＳＴとの融合型タンパクを発現するために構築されたベ
クターｐＷＧ６Ａに、これらのＤＮＡ断片を挿入し、で
きたベクターを各々、ｐＷＧ６Ａ−１５ｋ、ｐＷＧ６Ａ
−１７ｋと命名した。これらを大腸菌に導入し、各々Ｇ
１５抗原、Ｇ１７抗原の発現を誘導した。各抗原発現後
の大腸菌を超音波処理し、遠心操作後その上清を順にＤ
ＥＡＥセファロース（ファルマシア社製）を用いたイオ
ン交換クロマトグラフィー、フェニルセファロース（フ
ァルマシア社製）を用いた疎水クロマトグラフィーにて
精製した。最終的にＧ１５抗原、Ｇ１７抗原ともに、純
度９５％以上で１リットルの培養液からおよそ６０ｍｇ
得ることができた。得られたＧ１５抗原、Ｇ１７抗原を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、ウサギ抗梅毒
血清を一次抗体としてウェスタンブロットを行ったとこ
ろ強い発色が認められた。また、ウサギ睾丸から精製し
た梅毒菌をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、Ｇ
１５抗原、Ｇ１７抗原をマウスに感作して作製した抗Ｇ
１５モノクローナル抗体、抗Ｇ１７モノクローナル抗体
を一次抗体としてウェスタンブロットを行うと、各々ｎ
ａｔｉｖｅの１５ｋ抗原、ｎａｔｉｖｅの１７ｋ抗原に
強い発色が認められた。これにより免疫学的に組換え抗
原Ｇ１５、Ｇ１７は、それぞれｎａｔｉｖｅ抗原１５
ｋ、１７ｋと同一であることがわかった。
【００１９】実施例１ プラスチックプレート（Falcon 39 Micro Test 111 Fle
xible assay plate)のウェルに、参考例１で調製したＧ
１５抗原又はＧ１７抗原を種々の感作濃度で不動化し
た。比較のため、Ｔｐの分子量４７ｋＤａの表面抗原で
ある４７Ｃ4 抗原（アミノ酸番号１のＭｅｔから４３４
のＧｌｎまで）をNorgard らの方法（INFECTION AND IM
MUNITY Apr. 1992, pp.1568-1576) に準じて調製し、ま
た、電気泳動法にて精製後、別のウェルに種々の感作濃
度で不動化した。非特異的吸着部位を市販のブロッキン
グ剤でブロッキングし、洗浄後検体５０μｌを加えた。
検体は、梅毒患者の血清を、１％スキムミルク及び０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含む１０ｍＭＰＢＳ
で５００倍に希釈したものを用いた。検体を加えた後、
３７℃で１．５時間インキュベートした。洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ溶液５０μｌを加え、３
７℃、１．５時間インキュベートし、洗浄後、発色色素
であるＡＢＴＳの溶液５０μｌを加えて３０分間インキ
ュベートした。１００μｌのシュウ酸を加えて反応を停
止後、分光光度計（Titerteck Multiskan Plus) で４０
５ｎｍ及び４９２ｎｍにおける吸光度差を測定し、結果
を図２に示す。
xible assay plate)のウェルに、参考例１で調製したＧ
１５抗原又はＧ１７抗原を種々の感作濃度で不動化し
た。比較のため、Ｔｐの分子量４７ｋＤａの表面抗原で
ある４７Ｃ4 抗原（アミノ酸番号１のＭｅｔから４３４
のＧｌｎまで）をNorgard らの方法（INFECTION AND IM
MUNITY Apr. 1992, pp.1568-1576) に準じて調製し、ま
た、電気泳動法にて精製後、別のウェルに種々の感作濃
度で不動化した。非特異的吸着部位を市販のブロッキン
グ剤でブロッキングし、洗浄後検体５０μｌを加えた。
検体は、梅毒患者の血清を、１％スキムミルク及び０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含む１０ｍＭＰＢＳ
で５００倍に希釈したものを用いた。検体を加えた後、
３７℃で１．５時間インキュベートした。洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ溶液５０μｌを加え、３
７℃、１．５時間インキュベートし、洗浄後、発色色素
であるＡＢＴＳの溶液５０μｌを加えて３０分間インキ
ュベートした。１００μｌのシュウ酸を加えて反応を停
止後、分光光度計（Titerteck Multiskan Plus) で４０
５ｎｍ及び４９２ｎｍにおける吸光度差を測定し、結果
を図２に示す。
【００２０】図２から明らかなように、抗原の感作濃度
が１０μｇ／ｍｌの場合、従来の４７Ｃ4 抗原を用いた
場合の吸光度を１とすると、Ｇ１５抗原を用いた場合約
６倍、Ｇ１７抗原を用いた場合約４倍であり、Ｇ１５抗
原、Ｇ１７抗原を用いた方が４７Ｃ4 抗原を用いた場合
よりも有意に測定感度が高い。
が１０μｇ／ｍｌの場合、従来の４７Ｃ4 抗原を用いた
場合の吸光度を１とすると、Ｇ１５抗原を用いた場合約
６倍、Ｇ１７抗原を用いた場合約４倍であり、Ｇ１５抗
原、Ｇ１７抗原を用いた方が４７Ｃ4 抗原を用いた場合
よりも有意に測定感度が高い。
【００２１】実施例２ 参考例１で調製したＧ１７抗原、及び、比較のため、Ｇ
ＳＴが融合していない分子量１７ｋＤａのMature 17 抗
原（遺伝子組換えにより作製、ｎａｔｉｖｅ抗原とほぼ
同じ、Norgard らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Ap
r. 1993, pp.1202-1210)に準じて調製し、また抗１７ｋ
モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーにて精製）を用い、実施例１と同様にして抗Ｔ
ｐ抗体の測定を行った。結果を図３に示す。図３に示さ
れるように、Ｇ１７抗原、Mature17 抗原（アミノ酸番
号２２のＣｙｓから１５６のＬｙｓまで）の最大吸光度
２．５の半分の値を与える濃度は、Ｇ１７抗原を用いた
場合の方がMature 17 抗原を用いた場合よりも約１０倍
低かった。このことから、ＧＳＴが融合したＧ１７抗原
を用いた場合には、対応するMature 17 抗原を用いた場
合よりも有意に高い感度で測定を行うことができること
が確認された。
ＳＴが融合していない分子量１７ｋＤａのMature 17 抗
原（遺伝子組換えにより作製、ｎａｔｉｖｅ抗原とほぼ
同じ、Norgard らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Ap
r. 1993, pp.1202-1210)に準じて調製し、また抗１７ｋ
モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーにて精製）を用い、実施例１と同様にして抗Ｔ
ｐ抗体の測定を行った。結果を図３に示す。図３に示さ
れるように、Ｇ１７抗原、Mature17 抗原（アミノ酸番
号２２のＣｙｓから１５６のＬｙｓまで）の最大吸光度
２．５の半分の値を与える濃度は、Ｇ１７抗原を用いた
場合の方がMature 17 抗原を用いた場合よりも約１０倍
低かった。このことから、ＧＳＴが融合したＧ１７抗原
を用いた場合には、対応するMature 17 抗原を用いた場
合よりも有意に高い感度で測定を行うことができること
が確認された。
【００２２】参考例２ 従来法によりＴｐから部分精製した（純度８０％以上）
４７ｋＤａの抗原（native 47)と、これに対応する、遺
伝子組換えにより作製した抗原（47C2、Ｍｅｔに続いて
アミノ酸番号２１のＧｌｙから４３４のＧｌｎまで、特
表平２−５００４０３号公報に記載の方法により調製）
とを用い、実施例１と同様にして測定を行った。結果を
図４に示す。図４には、native 47 を用いた場合でも遺
伝子組換えにより調製された47C2を用いた場合でも最大
吸光度はそれぞれｎａｔｉｖｅ４７で０．４６、４７Ｃ
2 で０．３であり、測定感度には大差がないことが示さ
れている。これと図２の結果を比較することにより、Ｇ
１５抗原又はＧ１７抗原を用いる本発明の方法は、Ｔｐ
から調製したｎａｔｉｖｅ４７の抗原を用いた場合と比
較してもより測定感度が高いことが示唆される。
４７ｋＤａの抗原（native 47)と、これに対応する、遺
伝子組換えにより作製した抗原（47C2、Ｍｅｔに続いて
アミノ酸番号２１のＧｌｙから４３４のＧｌｎまで、特
表平２−５００４０３号公報に記載の方法により調製）
とを用い、実施例１と同様にして測定を行った。結果を
図４に示す。図４には、native 47 を用いた場合でも遺
伝子組換えにより調製された47C2を用いた場合でも最大
吸光度はそれぞれｎａｔｉｖｅ４７で０．４６、４７Ｃ
2 で０．３であり、測定感度には大差がないことが示さ
れている。これと図２の結果を比較することにより、Ｇ
１５抗原又はＧ１７抗原を用いる本発明の方法は、Ｔｐ
から調製したｎａｔｉｖｅ４７の抗原を用いた場合と比
較してもより測定感度が高いことが示唆される。
【００２３】実施例３ Ｇ１５抗原、Ｇ１７抗原及び参考例２に記載した47C2抗
原を１０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに感作したプラスチ
ックプレートを用い、種々の倍率で希釈した血清検体を
用い、実施例１と同様にして測定した。結果を図５に示
す。図５から明らかなように、４７Ｃ2 抗原を用いた場
合の測定感度と同じ感度を得るために必要な血清量はＧ
１５抗原を用いた場合で約１／１０量、Ｇ１７抗原を用
いた場合で約１／６量であった。このことから、Ｇ１５
抗原又はＧ１７抗原を用いる本発明の方法は、４７Ｃ2
を用いる従来法よりも測定感度が高いことがここでも確
認された。
原を１０μｇ／ｍｌの濃度でウェルに感作したプラスチ
ックプレートを用い、種々の倍率で希釈した血清検体を
用い、実施例１と同様にして測定した。結果を図５に示
す。図５から明らかなように、４７Ｃ2 抗原を用いた場
合の測定感度と同じ感度を得るために必要な血清量はＧ
１５抗原を用いた場合で約１／１０量、Ｇ１７抗原を用
いた場合で約１／６量であった。このことから、Ｇ１５
抗原又はＧ１７抗原を用いる本発明の方法は、４７Ｃ2
を用いる従来法よりも測定感度が高いことがここでも確
認された。
【００２４】参考例３ ４７ｋＤａ相当の３種類の組換え抗原、４７抗原（アミ
ノ酸番号６８のメチオニンから４３４のＧｌｎまで、No
rgard らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Apr. 1992,
pp.1568-1576)に準じて調製し、ハイドロキシアパタイ
トにて精製）、４７Ｃ2 抗原及び４７Ｃ4 抗原をプレー
トのウェルにそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で感作し、種
々の倍率で希釈した血清検体を用いて実施例１と同様に
して測定を行った。結果を図６に示す。図６より、これ
ら３種類の抗原のいずれを用いた場合でも測定感度には
大差がないことがわかる。また、３５例のＴｐ陽性血清
について測定したところ、４７Ｃ2 に対するＧＳＴ融合
抗原（Ｇ４７Ｃ2 ）の吸光度比（４０５／４９２）が
０．４６±０．４５（平均±ＩＳＤ）であり、Ｇ４７Ｃ
2 は４７Ｃ2 に比べて同等以下の感度を示した。これと
図２及び図５の結果を比較すれば、本発明の方法によ
り、従来の４７ｋＤａのいずれの抗原を用いる場合より
も有意に高い測定感度で測定できることが示唆される。
ノ酸番号６８のメチオニンから４３４のＧｌｎまで、No
rgard らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Apr. 1992,
pp.1568-1576)に準じて調製し、ハイドロキシアパタイ
トにて精製）、４７Ｃ2 抗原及び４７Ｃ4 抗原をプレー
トのウェルにそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で感作し、種
々の倍率で希釈した血清検体を用いて実施例１と同様に
して測定を行った。結果を図６に示す。図６より、これ
ら３種類の抗原のいずれを用いた場合でも測定感度には
大差がないことがわかる。また、３５例のＴｐ陽性血清
について測定したところ、４７Ｃ2 に対するＧＳＴ融合
抗原（Ｇ４７Ｃ2 ）の吸光度比（４０５／４９２）が
０．４６±０．４５（平均±ＩＳＤ）であり、Ｇ４７Ｃ
2 は４７Ｃ2 に比べて同等以下の感度を示した。これと
図２及び図５の結果を比較すれば、本発明の方法によ
り、従来の４７ｋＤａのいずれの抗原を用いる場合より
も有意に高い測定感度で測定できることが示唆される。
【００２５】実施例４ Ｇ１５抗原５μｇ／ｍｌ、Ｇ１７抗原１μｇ／ｍｌ又は
４７Ｃ2 抗原５μｇ／ｍｌを感作したプラスチックプレ
ートを用い、３５例のＴｐ陽性血清（従来法により陽性
であることが確認されているもの）及び陰性血清を５０
０倍に希釈した血清検体について実施例１と同様に測定
を行った。結果を図７及び表１に示す。
４７Ｃ2 抗原５μｇ／ｍｌを感作したプラスチックプレ
ートを用い、３５例のＴｐ陽性血清（従来法により陽性
であることが確認されているもの）及び陰性血清を５０
０倍に希釈した血清検体について実施例１と同様に測定
を行った。結果を図７及び表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】図７に示されるように、測定の応答は、３
５例中３例を除いて、全てＧ１５、Ｇ１７＞＞４７Ｃ2
である。次にこの応答（Ｓ）を陰性検体の応答（Ｎ）で
除したＳ／Ｎ比を感度比較の指標として上記表１に示し
た。Ｓ／Ｎ比においてもＧ１７，Ｇ１５＞＞４７Ｃ2 で
あり、Ｇ１５／４７Ｃ2 比では平均約１０倍（３．１〜
３１．２倍）、Ｇ１７／４７Ｃ2 比では平均約３０倍
（３．８−９６．４倍）と、Ｇ１５抗原又はＧ１７抗原
を用いた方が有意に感度が高いことが確認された。
５例中３例を除いて、全てＧ１５、Ｇ１７＞＞４７Ｃ2
である。次にこの応答（Ｓ）を陰性検体の応答（Ｎ）で
除したＳ／Ｎ比を感度比較の指標として上記表１に示し
た。Ｓ／Ｎ比においてもＧ１７，Ｇ１５＞＞４７Ｃ2 で
あり、Ｇ１５／４７Ｃ2 比では平均約１０倍（３．１〜
３１．２倍）、Ｇ１７／４７Ｃ2 比では平均約３０倍
（３．８−９６．４倍）と、Ｇ１５抗原又はＧ１７抗原
を用いた方が有意に感度が高いことが確認された。
【図１】本発明の方法に用いられるＧ１５抗原及びＧ１
７抗原の構造を示す図である。
７抗原の構造を示す図である。
【図２】Ｇ１５抗原、Ｇ１７抗原及び４７Ｃ4 抗原を用
いサンドイッチＥＬＩＳＡで測定を行った結果を示す図
である。
いサンドイッチＥＬＩＳＡで測定を行った結果を示す図
である。
【図３】Ｇ１７抗原を用いた本発明の方法と、ＧＳＴを
有さないMature１７抗原を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａの測定結果を示す図である。
有さないMature１７抗原を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａの測定結果を示す図である。
【図４】４７Ｃ2 抗原とｎａｔｉｖｅの４７抗原とを用
いてサンドイッチＥＬＩＳＡで測定を行った結果を示す
図である。
いてサンドイッチＥＬＩＳＡで測定を行った結果を示す
図である。
【図５】Ｇ１５抗原、Ｇ１７抗原及び４７Ｃ2 抗原を用
いサンドイッチＥＬＩＳＡで種々の希釈率で希釈した血
清検体について測定を行った結果を示す図である。
いサンドイッチＥＬＩＳＡで種々の希釈率で希釈した血
清検体について測定を行った結果を示す図である。
【図６】３種類の４７ｋＤａ抗原を用いてサンドイッチ
ＥＬＩＳＡで種々の希釈率で希釈した血清検体について
測定を行った結果を示す図である。
ＥＬＩＳＡで種々の希釈率で希釈した血清検体について
測定を行った結果を示す図である。
【図７】Ｇ１５抗原、Ｇ１７抗原及び４７Ｃ2 抗原を用
いてサンドイッチＥＬＩＳＡで３５例のＴｐ陽性血清検
体について測定した結果を示す図である。
いてサンドイッチＥＬＩＳＡで３５例のＴｐ陽性血清検
体について測定した結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 政久 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富 士レビオ株式会社内 (56)参考文献 特開 平７−159408（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−59667（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−188067（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−286757（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500403（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，61（1993），ｐ．1202− 1210 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/571 G01N 33/53
Claims (3)
- 【請求項１】 梅毒トレポネマの分子量１５ｋＤａの表
面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼが融合したタンパク質から成るＧ１５抗原と、梅毒ト
レポネマの分子量１７ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合したタンパク
質から成るＧ１７抗原とのいずれか一方又は両方と、検
体中の抗梅毒トレポネマ抗体との抗原抗体反応を利用す
る免疫分析法により検体中の抗梅毒トレポネマ抗体を測
定する、抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法。 - 【請求項２】 前記Ｇ１５抗原及び／又は前記Ｇ１７抗
原を固相に不動化した酵素免疫分析法により行う請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 前記Ｇ１５抗原及び／又は前記Ｇ１７抗
原を粒子担体に不動化した凝集免疫分析法により行う請
求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06336595A JP3216473B2 (ja) | 1994-02-28 | 1995-02-27 | 抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5467294 | 1994-02-28 | ||
| JP6-54672 | 1994-02-28 | ||
| JP06336595A JP3216473B2 (ja) | 1994-02-28 | 1995-02-27 | 抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
| US08/395,507 US5578456A (en) | 1994-02-28 | 1995-02-27 | Anti-treponema pallidum antibody immunoassay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07287017A JPH07287017A (ja) | 1995-10-31 |
| JP3216473B2 true JP3216473B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=27295370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06336595A Expired - Fee Related JP3216473B2 (ja) | 1994-02-28 | 1995-02-27 | 抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3216473B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69617568T2 (de) * | 1995-09-08 | 2002-08-01 | Fujirebio Inc., Tokio/Tokyo | Immunoassay Vorrichtung und Testverfahren zu seiner Verwendung |
| WO2004113921A1 (ja) * | 2003-06-24 | 2004-12-29 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 |
| EP2565647B1 (en) | 2010-03-31 | 2015-11-04 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Reagent for assaying anti-treponema pallidum antibody |
-
1995
- 1995-02-27 JP JP06336595A patent/JP3216473B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６１（１９９３），ｐ．１２０２−１２１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07287017A (ja) | 1995-10-31 |
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