JP2001526393A - マイコバクテリウム種の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ａ）マイコバクテリウム種の少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分をヒトまたは動物個体の体液サンプルと接触させる工程と、ｂ）マイコバクテリウム抗原と反応し得る少なくとも一つの抗体を該体液サンプルと接触させる工程と、ｃ）抗原−抗体複合体の存在を検出し、該体液サンプルに存在するマイコバクテリウム種を同定する工程とを含んでなることを特徴とするマイコバクテリウム種の同定方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はヒトまたは動物におけるマイコバクテリア感染症の原因となるマイコ
バクテリウム（Mycobacterium）種の同定方法、および該方法に使用する診断用 キットに関する。

【０００２】 マイコバクテリウム属は約５０の種を含む。この属は、総括してマイコバクテ
リア症として知られる多くの疾患の原因となる。もっともよく知られ、広く蔓延
している疾患は、癩菌（M.leprae）が原因である癩病、および結核菌（M.tuberc
ulosis）が原因となる結核である。これらの疾患は両方とも世界中で一千万人以
上の人々を冒している。他の殆どのマイコバクテリアは、通常、環境内腐生菌と
して存在する。しかし、それらも日和見的疾患の原因となることがあり、排他的
なものではないが、その免疫系に問題を抱えた生体、例えば、エイズ（ＡＩＤＳ
）の患者あるいは免役抑制を受けている人達などにそれらの疾患がしばしば起こ
る。日和見型とは緩慢に増殖するエム・アビウム（M.avium）種、および密接に 関連するエム・イントラセルラーレ（M.intracellulare）およびエム・スクロフ
ラセウム（M.scrofulaceum）（場合によりともにＭＡＩＳコンプレックスともい
う）、エム・カンサイ（M.kansai）、エム・マリナム（M.marinum）、エム・ウ ルセランス（M.ulcerans）、および急速に増殖するエム・ケローネ（M.chelonae
）およびエム・フォーチュイタム（M.fortuitum）を含む。この数十年間、西欧 世界では極めて稀であるが、日和見的マイコバクテリア疾患および結核はエイズ
の発生とともに有意な増加を示している。マイコバクテリアまたはマイコバクテ
リアの抗原が、他の多くの疾患の病因、例えば、類肉腫症およびクローン病、な
らびに異なる自己免役疾患、例えば、自己免役皮膚炎、リウマチ様関節炎および
糖尿病などで一つの役割を果たしていることが報告されている。この役割はマイ
コバクテリアのエピトープと宿主生体エピトープ間の構造的疑似性に帰すことが
できる。

【０００３】 マイコバクテリアの細胞壁は非常に複雑であり、多くの異なる脂質を含んでい
て、その一部はこの属に特有の構造をもっている。これらの構造はミコール酸と
エステル、ペプチド−糖脂質、アラビノ−ガラクタンおよびリポ−アラビノマン
ナンを含んでなる。マイコバクテリア細胞の脂質富有細胞壁は、マイコバクテリ
アの顕著な着色特性の原因となっている。それらはまた、マイコバクテリアが宿
主生体免疫系による攻撃に遭遇するのを可能とする。多くの種が、マクロファー
ジに取込まれた後、分泌された脂質の厚い層でそれ自体を取り囲む。

【０００４】 マイコバクテリアの異なる成分の多くが、宿主生体の免疫系と相互作用する。
これらの成分はタンパク質と炭化水素抗原を含んでなり、マイコバクテリアによ
って活発に分泌されるか、あるいは細胞壁または細胞膜の一部を形成する。さら
に、これらは細胞質、例えば、細胞質のマトリックス、リボソームおよび酵素に
存在する。マイコバクテリアはさらに免疫調節成分、例えば、免疫抑制化合物お
よびアジュバントをも保有する。その結果、単一のマイコバクテリウム種は、様
々な特異性を有する異なる形態で多様な免疫応答を誘導する。このことが、上記
の疾患、特に結核に対する高感度、高特異診断テストを基準として、種特異的体
液性応答の検出に適したタンパク質抗原の誘導を非常に困難なものとしている。
マイコバクテリアの存在頻度が高いために、ヒトおよび動物双方の体液は、殆ど
常時、抗マイコバクテリア抗体を含んでいる。

【０００５】 過去、研究者は、マイコバクテリア症に対する十分な感度の診断試験法を開発
しようとしてきた。これら試行の焦点は、殆どの場合、特異体液性免疫応答検出
のための種特異糖脂質抗原を見出すことにあったが、その理由はその問題がタン
パク質抗原の特異性にあるからであった。

【０００６】 国際特許出願９４／１４０６９には、マイコバクテリア感染症の診断試験法を
開発するために、免疫優性マイコバクテリア交差反応性抗原成分（以下、Ｉｍ−
ＣＲＡＣという）に対する抗体応答を使用することが開示されている。Ｉｍ−Ｃ
ＲＡＣは特異的マイコバクテリア病原体の免疫認識およびそれへの応答の性質に
関し間接の情報を提供すると信じられている。

【０００７】 ＷＯ−Ａ−９４／１４０６９に提案されている方法は、マイコバクテリア疾患
の臨床的徴候が、異なるマイコバクテリアの免疫交差反応性抗原成分（Ｉｍ−Ｃ
ＲＡＣ）に対する体液応答を生じる個々宿主の多様な能力に関係しているという
発見にもとづいている。各マイコバクテリア感染症は多くの特異抗原に対しそれ
自身の特異抗体応答を生じる。抗体応答の分析、例えば、免疫ブロッティングに
よる分析は、免疫優性Ｉｍ−ＣＲＡＣがマイコバクテリア疾患の免疫病理学的徴
候に対応して変化することを証明している。該分析は、異なるマイコバクテリウ
ム種に感染している異なる個体に対して、マイコバクテリア抗原の異なる、かつ
識別し得るバンドパターンを与える。このバンドパターンは免疫ブロットの結果
として得られるが、アンチゲン・バー・コードとして参照することができる。バ
ーコードに示されている抗原−抗体反応は、一緒にした場合、ある種のマイコバ
クテリウム種に独特のものである。

【０００８】 本発明は、診断試験法においてマイコバクテリウム種を同定する改良された方
法を提供することを目的とする。殆どの点で満足すべきものではあるが、ＷＯ−
Ａ−９４／１４０６９に記載されている方法よりも、さらにより感度の高い診断
試験法をもつことがなお望まれている。さらに、以前になされた予防接種の確定
に、また、マイコバクテリウム種に感染した生体の治療をモニターするために使
用し得る診断試験法に対する要請がある。治療の間、低レベルのある種抗体が存
在する場合があり、それが、上記に概括したように、抗体−抗原交差反応を使用
する試験法の精度および／または感度をかき乱す可能性がある。

【０００９】 高感度診断試験法は、体液サンプルを抗体および抗原の両方と接触させること
により実施し得ることが判明している。動物およびヒトの体液中には、抗体の他
に、数種のマイコバクテリア成分が存在することが分かっており、その存在は、
選択したセットの抗体との交差反応を用いることにより、信頼し得る方法で定量
することができる。

【００１０】 したがって、本発明は、マイコバクテリウム種の同定方法において、 ａ）マイコバクテリウム種の少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分をヒト
または動物個体の体液サンプルと接触させる工程と、 ｂ）マイコバクテリウム抗原と反応し得る少なくとも一つの抗体を該体液サン
プルと接触させる工程と、 ｃ）抗原−抗体複合体の存在を検出し、該体液サンプルに存在するマイコバク
テリウム種を同定する工程とを含んでなることを特徴とするマイコバクテリウム
種の同定方法を提供する。

【００１１】 驚くべきことに、信頼性の高い試験法が上に概説した概念にもとづき開発され
た。本発明の方法を用いることにより、マイコバクテリア疾患の治療の異なる段
階をモニターすることが可能である。

【００１２】 また、個体がマイコバクテリア疾患に対して予防接種されているか、またどの
マイコバクテリア疾患に対して予防接種されているかを決定することが可能であ
る。マイコバクテリウム種に感染した生物体のいずれもが該感染に対して同じ反
応を示すわけではないので、非常に信頼性の高い試験法が提供されると、存在す
る可能性のある広い領域の抗原と抗体がこの試験方法によりカバーすることが可
能である。

【００１３】 本方法はヒトまたは動物個体の体液のいずれのサンプルにも適用し得る。勿論
、もっとも信頼性のある結果はマイコバクテリウム種の存在が最高頻度である体
液サンプルに遭遇したときに得られる。適切な体液の例は、血清、血液および、
喀痰、唾液、ＣＳＦ（脳脊髄液）または涙液などの分泌液などを包含する。これ
らの体液は直接本発明による方法に付してもよく、あるいはある種形態の前処理
を受けてもよい。通常、体液は診断試験に先立ってバッファー溶液に溶解するこ
とにより希釈される。

【００１４】 好適な態様において、唾液またはその溶液もしくは調製品をマイコバクテリウ
ム種同定のための診断試験に付す。要すれば、唾液の粘液様構造物を、たとえば
、キシロメタソリンでの処理により、あるいは他の既知の方法により除去するこ
とができる。本発明はまた、マイコバクテリウム種を同定する診断試験方法をも
提供するが、その場合、唾液サンプルをマイコバクテリウム種の少なくとも一つ
の免役交差反応性抗原成分および／またはマイコバクテリウム抗原と反応し得る
少なくとも一つの抗体と接触させ、抗原−抗体複合体の存在を検出し、そして唾
液サンプル中に存在するマイコバクテリウム種を同定する。驚くべきことに、唾
液中高含量の種々酵素は、実質的な程度で診断試験の信頼性を乱すことがない。
代替法においては、試験結果への酵素の影響を適当に打ち消すことができる。

【００１５】 唾液での試験実施は、驚くべきことに、非常に成功率が高く、信頼性のあるこ
とを証明した。明らかに、マイコバクテリア感染は唾液にて十分に証明される。
唾液の採集と使用は、より一般的な体液、例えば、血清または血液などの使用よ
りも多くの利点を有する。唾液の採集は比較的容易であり、結核と癩病の発生率
の高い第三世界の国々でしばしば遭遇する困難な野外条件下においてさえ可能で
ある。さらに、唾液は非浸襲的であり、試験されるべき個々人の応諾率を高め、
採集に必要な訓練は最小であり、採集、運搬および試験に際しての、特に高いＨ
ＩＶ感染発生率が存在する領域でのバイオハザードの危険度を減少させる。

【００１６】 すでに述べたように、本発明に従えば、体液サンプルは、抗原またはその調製
品と、および抗体またはその調製品との両方に接触させる。体液サンプルを、マ
イコバクテリア抗原と反応し得る抗体またはその調製品のみと接触させた場合、
その試験では非常に良好な結果が得られた。したがって、本発明は、マイコバク
テリウム種の同定方法であって、マイコバクテリア抗原と反応し得る少なくとも
一つの抗体と接触させる工程と、該抗体とマイコバクテリウム種の一つ以上の抗
原成分との間に形成される抗体−抗原複合体の存在を検出する工程と、該体液サ
ンプル中に存在するマイコバクテリウム種を同定する工程とを含むマイコバクテ
リウム種の同定方法を包含する。

【００１７】 本発明によると、体液サンプルは先ず抗原と接触させ、次いで抗体と接触させ
るか、あるいはその逆順にすることが可能である。しかし、体液サンプルは抗原
と抗体に対し同時に接触させることが好ましい。例えば、この操作は体液サンプ
ルを２つの面に通過させることにより実施するが、該面の一方には抗原またはそ
の調製品が結合し、他方には抗体またはその調製品が結合している。この原理に
もとづき、当業者は診断試験を実施する種々の方法を開発することが可能である
。明瞭なことは、抗原またはその調製品と抗体またはその調製品が互いに接触す
るように方法を選択する場合、使用する抗原と抗体はそれらが互いに反応しない
ように選択しなければならないということである。

【００１８】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分は、マイコバクテリウム成分の全
部またはフラクション、またはマイコバクテリウム培地の全部またはフラクショ
ンを含んでもよい。原則として、マイコバクテリウムまたはその培地のいずれの
フラクションも使用することができる。かかるフラクションは常套の方法で得る
ことが可能であり、すでにＷＯ−Ａ−９４／１４０６９に記載されているように
、本発明による方法に先立って、電気泳動により有利に分離され、該試験を実施
した後にバンド形成パターンが提供される。通常、抗原成分は主としてリポ多糖
類を含む。本発明によると、リポ多糖およびタンパク質はともに抗原作用をもち
、別個にまたは組合わせて使用することができる。

【００１９】 好適な抗原成分は、非網羅的な群、ＫＡＴＧ、ＭＰＴ６３（＝１８ｋＤ）、Ｍ
ＰＴ６４（＝２４ｋＤ）、ＭＰＴ５１、ＭＴＣ２８、Ａｇ８５ａ（＝３０〜３１
ｋＤ）、Ａｇ８５ｂ（＝Ａｇ６）、Ａｇ８５ｃ、Ａｇ５（＝ＣＩＥ Ａｇ７８お よび＝３８ｋＤ）、ＤＥＳ、ＭＢＰ７０、８０（＝２２／２３ｋＤ）、リポオリ
ゴ糖（ＬＯＳ）、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）、ＰＭＢ６７（６７ｋＤ）、
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、２，３−ジアシ
ル−トレハロース（ＤＡＴ）、フェノール性糖脂質（ＰＧＬ）、ＥＳＡＴ６（＝
６ｋＤ）、ｈｓｐ７０＝Ｄｎａｋ＝Ａｇ６３（＝７１ｋＤ）、ＣＩＥ Ａｇ８２ ＝ＧｒｏＥＬおよび同族体（＝６５ｋＤ）、ＧｒｏＥＳおよび同族体＝ＢＣＧａ
（＝１０ｋＤ）、アンチゲン６０、ならびに分子量６ｋＤ、１０／１２ｋＤ、１
６ｋＤ、（多くの場合１４ｋＤという）、１８ｋＤ、１９ｋＤ、２１ｋＤ、２２
ｋＤ、２３ｋＤ、２４ｋＤ、２８ｋＤ、２９ｋＤ、３０ｋＤ、３０ｋＤ、３２ｋ
Ｄ領域、３３ｋＤ、３４ｋＤ、３６ｋＤ、３８ｋＤ、４２ｋＤ、５０〜５５ｋＤ
、６０ｋＤ，６５ｋＤ、６７ｋＤ、７１ｋＤ、８８ｋＤ、および９５ｋＤを有す
るものから選択される。

【００２０】 好ましくは、該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分は、マイコバクテリ
ウム種のＫＰ９０，ＫＳ９０、アンチゲン６、ＫＰ１００、またはＳＰ１００フ
ラクション、または培地のフラクションまたは調製品を含む。これらの抗原調製
品は非常に信頼性のある試験結果を与える。さらに、長期間の貯蔵に十分に安定
であり、診断試験の信頼性に影響することはない。

【００２１】 本発明に従って体液サンプルを接触させるマイコバクテリウム種に対する少な
くとも一つの抗体は、一定のマイコバクテリア抗原と反応し得るいずれかの抗体
であってよい。かかる抗体またはその調製品は、当業者既知の方法により得るこ
とができる。本発明によると、ポリクローナル抗体の使用も適切であることが証
明されたが、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。好ましくは、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはその組合わせが抗体として使用される。これらの抗体
は診断試験での取扱いが非常に簡便で、大いに満足し得る結果に導くことが証明
された。

【００２２】 好適な態様において、該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分、またはマ
イコバクテリウム種に対する該少なくとも一つの抗体は、支持体上に固定する。
非固形の支持体および固形支持体、両方が使用できる。好ましくは、固形支持体
を使用する。

【００２３】 特に好ましい態様は、抗原成分および抗体、両方を支持体に固定した場合であ
る。工程ａ）およびｂ）を同時に実施する場合、特に有用な試験法は、抗原成分
および抗体を同じ支持体に固定化する場合の本発明の態様であることを証明した
。上に述べたように、その場合、該抗体が該少なくとも一つの免役交差反応性抗
原成分と反応しないことが必要である。有利には、該少なくとも一つの免役交差
反応性抗原成分の層を該少なくとも一つの抗体の層の上に置くか、またはその逆
である。好ましくは、先ず、該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分の層を
個体支持体にコートし、次いで、その上に該少なくとも一つの抗体の層をコート
する。

【００２４】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分は、一般に、０．１〜２０μｇ／
ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で使用する。抗原成分を支持体にコ
ートするときの該成分の量は、試験方法と選択した支持体に依存する。該少なく
とも一つの抗体は、一般に、０．１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ
／ｍｌの濃度で使用する。該抗体成分を支持体にコートする際の該成分の量は、
試験方法と選択した支持体に依存する。少なくとも一つの免役交差反応性抗原成
分と少なくとも一つの抗体を用いる場合の比は、通常、１：１０〜１０：１、好
ましくは１：２〜２：１である。

【００２５】 好適な固形支持体は、膜、例えば、ニトロセルロース膜、浸漬スティック、フ
ィルター、球状物、顆粒およびマイクロタイタープレートからなる非網羅的群か
ら選択される。抗原成分および／または抗体は、技術上既知の方法でこれらの支
持体に固定化する。

【００２６】 体液サンプルを少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分と、少なくとも一つ
の抗体とに接触させた結果として、抗体−抗原複合体が形成される場合とされな
い場合がある。これらの複合体は２つのタイプのものである；これら複合体の抗
体または抗原成分のいずれかが体液からのものである。これら複合体の両方また
は一方のタイプのみが存在する。２つのタイプの複合体検出は、別個にまたは一
緒に実施することができる。好ましくは、これらは同時に実施する。適切な検出
方法は、ＷＯ−Ａ−９４／１４０６９に開示されているような免疫ブロッティン
グ、ならびに技術上既知の通常の直接および間接標識法のいずれかである。適切
な標識は、ビオチン、ビオシチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン
、ストレプトアビジン、コロイド状染料物質、ローダミンなどの蛍光色素、エオ
シンまたはエリスロシンなどの還元性物質、（着色）ラテックスゾル、炭素ゾル
、金属、金属ゾルまたは他の微粒子ゾル、ダンシルリシン、赤外線染料、クマリ
ン、酵素、およびヨウ化物ラベルからなる非網羅的群から選択することができる
。特に好ましくは、金標識、コロイド標識、ラテックスゾル、および酵素の使用
である。これら標識の使用は、いわゆる迅速試験において本発明による方法の実
施を可能とする。

【００２７】 この分析により、マイコバクテリウム種を適切に同定することができる。通常
の同定手法を用いることもできるが、好ましくは、１つまたはそれ以上の参照パ
ターンにもとづきマイコバクテリウム種を同定する。

【００２８】 勿論、本発明はまた、上記の方法に用いる診断用キットをも包含する。該キッ
トは、支持体であって、マイコバクテリウム種の少なくとも一つの免役交差反応
性抗原成分と、マイコバクテリア抗原と反応するが、該少なくとも一つの免役交
差反応性抗原成分とは反応しない少なくとも１種の抗体とが結合している支持体
と、抗原−抗体複合体の存在を検出する手段とを含む。該支持体は、好適には、
膜、浸漬スティック、フィルター、球状物、顆粒およびマイクロタイタープレー
トからなる群から選択される。該検出手段は上記の方法において検出する手段を
含んでもよい。

【００２９】 本発明を以下の非制限的実施例により説明する。 （実施例） ＫＰ９０／ＫＳ９０の調製 ＫＰ９０はＷＯ−Ａ−９４／１４０６９（その内容を参照により本明細書に取
込む）に記載のごとき粗製のマイコバクテリア集団からの出発物質から調製した
。凍結乾燥細菌１ｇから調製した出発原料を、９０，０００×ｇ、４℃で２時間
遠心分離した。ペレットをＰＢＳで二度洗浄した。洗浄工程の間に、サンプルを
氷上１０秒間隔で６×３０秒間超音波処理し、４℃で２時間、９０，０００×ｇ
、遠心分離した。ぺレットを採取し、０．０５Ｍトリスバッファー食塩水（ＰＢ
Ｓ）ｐＨ７．４に再懸濁した。ＫＳ９０と命名した上清は、抗原としても用いる
ことができる。ペレットを１０秒間隔で氷上６×１５秒間超音波処理した。この
調製品をＫＰ９０の名称で呼称する。タンパク質濃度を定量した後、１．７ｍｌ
量を２５ｍＭ ＴＢＳ／５０％グリセリン中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で凍結し、− ２０℃に貯蔵した。以下の成分がＫＰ９０に存在することが示された：ＬＡＭ（
＋＋）、１０ｋＤ（＋）、１６ｋＤ（＋）、２１ｋＤ（＋）、２４ｋＤ（？）、
３０ｋＤ（＋／−）、３１ｋＤ（−）、３４ｋＤ（＋／−）、３８ｋＤ（−）、
６５ｋＤ（＋＋）、および９５ｋＤ（＋）。

【００３０】 培養液フラクションの調製 結核菌を３週間培養した後、該細菌を遠心分離および濾過により除去した。培
養液からの成分を０〜４５％の硫酸アンモニウム沈殿法により沈殿させた。遠心
分離後、沈殿物を透析し、さらにイオン交換クロマトグラフィーにより精製した
。このフラクションを抗原６と呼称する。さらなる精製を疎水性相互作用クロマ
トグラフィーにより実施することができる。

【００３１】 モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の調製 ＩｇＧモノクローナル抗体を文献に従い調製した（Clin.Exp.Immunol. （1984
）58：511〜521）。

【００３２】 唾液の調製 唾液をオムニ−サル（Omni-Sal）（商標）唾液採取用具（サリバ・ディアグノ
スティック・システムズ）を用いて採取し、−２０℃にて貯蔵した。チューブに
は保存溶液１ｍｌを容れてある。パッドは飽和状態で液体１ｍｌを保持し、唾液
が１：２の希釈液となるように設計する。使用前、唾液サンプルをプロテアーゼ
インヒビターとトリトンＸおよびＰ４０（０．０１％）で前処理した。

【００３３】 血清の調製 血液を静脈穿刺により採取し、標準方法により処理加工し血清とした。ＥＩＡ
被覆 被覆処理前に、ＫＰ９０を氷上１０秒間隔で５×１０秒間、超音波処理した。
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳｐＨ８．０に数段階希釈したＫＰ９０にて
３７℃２２時間、またはＰＢＳｐＨ８．０に数段階希釈した結核菌成分に対する
１種以上のＭｏＡｂにて４℃一夜、被覆した。試験したＭｏＡｂはａ．ｏ．であ
った：結核菌の３８ｋＤタンパク質に対するＭｏＡｂおよびＬＡＭに対するＭｏ
Ａｂ。ＭｏＡｂとＫＰ９０の組合わせ被覆処理は、先ずＫＰ９０で被覆し、次い
で１種以上のＭｏＡｂで被覆するか、あるいはマイクロタイタープレートを傾斜
させて置き、プレートウエルの半分を先ずＫＰ９０で被覆し、次いでプレートを
１８０°回転させて１種以上のＭｏＡｂにて被覆することにより実施した。 被
覆処理後、プレートを３％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックし、３７℃で乾燥
、４℃に保存した。

【００３４】 試験 血清を１：２００および１：４００の希釈で試験した。唾液サンプルは１：１
〜１：１００にわたる数段階の希釈にて試験した。

【００３５】 １００μｌをマイクロタイタープレートの被覆ウエルにピペットで入れ、３７
℃にて１時間培養した。未結合血清成分をＰＢＳでの洗浄工程にて洗い流す。第
二段階の培養は、接合体、ペルオキシダーゼ標識した抗−Ｈｕ−ＩｇＡまたは抗
−Ｈｕ−ＩｇＭのいずれか、またはペルオキシダーゼ標識した、モニターすべき
結核菌の同一成分に対する他のＭｏＡｂ、またはこれら２つの組合わせにより、
３７℃にて１時間実施する。過剰の接合体を洗い流す。

【００３６】 ＫＰ９０に特異的に結合するサブタイプのＩｇＡまたはＩｇＭのヒト抗体の存
在、および／またはサンプル中の結核菌成分の存在の徴候は、ウエルにＴＭＢ（
テトラメチルベンジジン）を加えることにより示される。

【００３７】 結合した酵素は青色を生成させるが、この色は発色停止液の添加により、黄色
に変化する。この黄色は４５０ｎｍの吸収極大を示す。

【００３８】 試験結果の解釈は、いわゆるカットオフ・サンプルにもとづきなされる。試験
スコアにおいて結果がカットオフ・サンプルよりも高いと判明した場合、陽性と
みになすことができる。カットオフ・サンプルは大きなパネルの陽性および陰性
被検体による結果にもとづく。

【００３９】 結果 「試験」および「被覆」の項で上に説明した手法を遂行した後、唾液中抗体の
存在に関し、表１に示した結果を得た。抗−ＫＰ９０−ＩｇＡを定量するために
は、１：１００唾液希釈液が適当であると判明した。抗−ＫＰ９０−ＩｇＧを定
量するためには、１：２０唾液希釈液が適当であると思われた。表１において、
サンプル３８、３９、４０、４４、４、１８、２５、３１、および３３がＴＢ−
陽性である一方、他のサンプルはＴＢ−陰性であった。

【００４０】 抗−マイクロバクテリウムＩｇＡおよびＩｇＧ抗体検出の組合わせは唾液であ
り、この場合、異なるカットオフが採用されるが、診断においてはさらなる値を
示す。また、血清と組合わせた唾液の試験はマイクロバクテリウム診断において
さらなる値を示すことが判明した。

【００４１】

【表１】

【００４２】 唾液中ＬＡＭの存在を決定するために、唾液を先ず上記のように調製した。さ
らに、サンプル１ｍｌをトリトンと塩除去のために透析し、それに続いて凍結乾
燥し、ＰＢＳ２００μｌに取込んだ。このように得られたサンプル１００μｌを
、上記被覆を備えたマイクロタイタープレートの各ウエルにピペットで入れた。
ウサギ抗−結核菌抗体を用い、上記のように検出を実施し、該抗体を、抗ウサギ
−ＩｇＧ−ペルオキシド接合体を用い、その変化により検出した。結果を表２に
示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】 さらに、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＬＡＭにつき、唾液について上に記載したと
同様に、喀痰中に検出した。抗−結核菌抗体はＰＫ９０を用い喀痰中に定量した
。

【００４５】 喀痰中に抗体を検出するために、喀痰サンプルを血清希釈バッファー（クレア
テック（ＫＲＥＡＴＥＣＨ）ＩｇＡ ＥＩＡキットのもの）中に１：２０または １：２５（ＩｇＧおよびＩｇＭについて）または１：１００（ＩｇＡについて）
に希釈した。サンプルを少なくとも１時間激しく振盪した。次いで、サンプルを
上記のＥＬＩＳＡにより抗−結核菌抗体の存在につき試験した。

【００４６】 ＫＰ０をマイクロタイタープレートに被覆した。カットオフ比は、該比率を計
算するための対照とした血清８〜５９に対し、ＩｇＧおよびＩｇＭについては０
．８、ＩｇＡについては０．６であった。結果を表３に示す。

【００４７】

【表３】

【００４８】 ウエスタン・ブロット ゲル電気泳動法およびアッセイ用膜の調製は、ＷＯ−Ａ−９４／１４０６９、
１３ページ、項目２の記載どおりに実施した。

【００４９】 ストリップを、１：１〜１：１００の範囲のオムニ−サル（Omni-Sal）用具希
釈液で採取し、１：１００または１：２００に希釈したヒト血清または唾液と培
養した。

【００５０】 血清および唾液中の抗体を検出するために、ＷＯ−Ａ−９４／１４０６９に記
載したとおりに免疫検出を実施した。

【００５１】 ドット・ブロット・アッセイ 抗原（ＫＰ９０）１〜１０μｇ／ｍｌおよびＭｏＡｂ０．５〜５μｇ／ｍｌを
別々にニトロセルロース膜にスポットした。膜（ＢＳＡによりブロックまたは未
ブロック）をＰＢＳ／トゥイーン／ＢＳＡ中の血清（１：２００希釈）または唾
液サンプル（１：１〜１：１００希釈）と室温で１時間培養した。ＰＢＳ／トゥ
イーンで膜を洗浄した後、膜を接合体と培養した。

【００５２】 １．間接標識： ペルオキシダーゼ標識した抗−Ｈｕ−ＩｇＡまたは抗−Ｈｕ−ＩｇＧおよびペ
ルオキシダーゼ標識した、モニターすべき結核菌の同一成分に対するＭｏＡｂ（
ＩｇＧまたはＩｇＭ）の組合わせ。検出は、ＡＥＣバッファー（５０ｍＭ酢酸バ
ッファー、ｐＨ５．０、０．１％ウレウムペルオキシド）に１：１０希釈したＡ
ＥＣ基質（０．８％３−アミノ−９−エチルカルバゾール／ジメチルホルムアミ
ド溶液）、標準法によるＤＡＢ（３，３'−ジアミノ−ベンジジン・４塩酸塩） 、またはアマーシャムのＥＣＬ検出システムを用いて実施した。

【００５３】 ２．直接標識： 金標識した抗−ヒトＩｇＡまたは抗−ヒトＩｇＧおよび金標識した、モニター
すべき結核菌の同一成分に対するＭｏＡｂ（ＩｇＧ）の組合わせ。ＩｇＡ−金接
合体は市販品として入手するか、または、例えば、ＷＯ−Ａ−９６／３５６９６
に記載のとおりに作製した。ＭｏＡｂ−金接合体は以下のように作製した：金粒
子は市販品として得た。該接合体は標準手法によるか、または白金ベースのリン
カーの場合には、例えば、ＷＯ−Ａ−９６／３５６９６に記載のとおりに作製し
た。

【００５４】 迅速ストリップ試験 抗原（ＫＰ９０）１〜１０μｇ／ｍｌおよび１種以上のＭｏＡｂ（ＩｇＧ）０
．５〜５μｇ／ｍｌをニトロセルロース膜上の異なるレーンに固定した。検出す
るＡｂ（抗−ＩｇＡまたは抗−ＩｇＧ／タンパク質Ａ）に依る対照レーンも他の
線上に塗付する。ニトロセルロースは０．１％ＢＳＡでブロックして、または未
ブロックのままで使用する。取付けた吸収性パッド上に、抗−ＩｇＡ接合体とＭ
ｏＡｂ−金接合体（固定化したＭｏＡｂと同一の抗原に対するＭｏＡｂであるが
、他の決定因子を認識する）を乾燥する。ＩｇＡ−金接合体は市販品として入手
するか、またはＷＯ−Ａ−９６／３５６９６に記載のとおりに作製した。ＭｏＡ
ｂ−金接合体は上記のとおりに作製した。サンプル（血清または唾液）はガラス
チューブ中、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに希釈する。次いで、試験ストリップ
は、吸収パッドを下向きにしてチューブに落し込む。１５分ないし２時間後、対
照ラインが着色した時点で、結果を判定した。

【００５５】 第二手法：抗原（ＫＰ９０）１〜１０μｇ／ｍｌおよび１種以上のＭｏＡｂ（
ＩｇＧ）０．５〜５μｇ／ｍｌをニトロセルロース膜上の異なるレーンに固定し
た（図１参照）。検出するＡｂ（抗−ＩｇＡまたは抗−ＩｇＧ／タンパク質Ａ）
に依る対照レーンも他の線上に塗付する。吸収パッドを取付けた。全サンプルを
白金ベースのリンカーを介して金接合体で標識した（例えば、ＷＯ−Ａ−９６／
３５６９６参照）。次いで、サンプル内に吸収パッドを下向きにしてストリップ
を落し込んだ。１５分ないし２時間後、対照ラインが着色した時点で、結果を判
定した。

【００５６】 凝集試験 被覆操作 ラテックス粒子は、必要とする量によって濾過により、またはイオン交換樹脂
により、ホウ酸塩溶液（ｐＨ８．５）またはＰＢＳで数回洗浄する。抗原（ＫＰ
９０または抗原６）または抗体をラテックス粒子上に被覆するが、その際、０．
０１％トゥイーン−２０および５ｍｇ／ｍｌまでの最終タンパク質濃度を含むホ
ウ酸塩溶液（ｐＨ８．５）またはＰＢＳ中の適切な粒子の１％懸濁液１ｍｌを、
３７℃、２０℃または４℃で、１〜１６時間培養する。次いで、ラテックスを遠
心分離し、未吸収リガンドを含む上清は廃棄する。数回の洗浄工程の後（上記参
照）、被覆したラテックスを０．１％ＢＳＡ含有ＭＥＳバッファー中に再懸濁し
、ラテックス凝集試験に使用するか、または＋４℃で貯蔵することができる。

【００５７】 凝集 被覆したラテックス粒子は、血清または唾液サンプルの数段階希釈液のガラス
スライド上１滴に混合する。凝集は室温１時間ないし＋４℃１６時間後にアッセ
イする。凝集は目視（群れ外観）により、または混合物の濾過後に採点すること
ができる。後者の場合、膜の細孔サイズは未凝集ラテックス粒子を通過させ、凝
集粒子を把持するように選択する。着色した粒子を使用することにより、陽性反
応の場合には、膜が着色する。

【００５８】 抗原（ＫＰ９０または抗原６）および抗体に対し異なる着色ラテックス粒子を
使用することにより、両反応を別個にモニターすることができる。

【００５９】 結果 ５７ ＫＰ９０およびポリスチレン粒子を用い、上記の手法に従って血清を試
験した。試験の培養時間は室温５分からであった。結果を図１に示す。図１Ａは
陽性反応を示し、一方、図１Ｂは陰性反応を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは陽性反応を示し、図１Ｂは陰性反応を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｋｅｉｅｎｂｅｒｇｗｅｇ ３，Ａｍｓｔ ｅｒｄａｍ ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ (72)発明者 ファン デル ミューレン，レムコ オランダ国 アムステルダム ボフェノフ ェル 331 (72)発明者 フールダヤル，スーニタ オランダ国 ニーウエヘイン ズウォルセ フェステ 81 (72)発明者 コルク，アレント オランダ国 マイデルベルフ ヘラルトダ ウラーン ８ (72)発明者 ペレイラ アリアス−バウダ，レンカ オランダ国 アムステルフェーン フリュ ウェールボームラーン 79 (72)発明者 キュイペル，シャウキュエ オランダ国 アムステルダム ホフヘース ト 45

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マイコバクテリウム種の同定方法において、 ａ）マイコバクテリウム種の少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分をヒト
   または動物個体の体液サンプルと接触させる工程と、 ｂ）マイコバクテリウム抗原と反応し得る少なくとも一つの抗体を、該体液サ
   ンプルと接触させる工程と、 ｃ）抗原−抗体複合体の存在を検出し、該体液サンプルに存在するマイコバク
   テリウム種を同定する工程とを含んでなることを特徴とするマイコバクテリウム
   種の同定方法
2. 【請求項２】 該体液サンプルが血清、血液および、喀痰、唾液、ＣＳＦ（脳
   脊髄液）または涙液などの分泌液、ならびにこれらの溶液または調製物からなる
   群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分が支持体に結合し
   ていることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
4. 【請求項４】 マイコバクテリウム種に対する該少なくとも一つの抗体が支持
   体に結合していることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 工程ａ）およびｂ）を同時に実施することを特徴とする前記請
   求項のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分とマイコバクテリ
   ウム種に対する該少なくとも一つの抗体が同一の固形支持体に結合しており、か
   つ、その場合、該抗体が該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分とは反応し
   ないことを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 該支持体が、膜、浸漬スティック、フィルター、球状物、顆粒
   およびマイクロタイタープレートからなる群から選択されることを特徴とする請
   求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 マイコバクテリウム種に対する該少なくとも一つの抗体がモノ
   クローナル抗体であることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 抗原−抗体複合体存在の検出を、間接または直接標識法を用い
   ることにより実施することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 該検出操作を、ビオチン、ビオシチン、イミノビオチン、ジ
    ゴキシゲニン、アビジン、ストレプトアビジン、コロイド状染料物質、ローダミ
    ンなどの蛍光色素、エオシンまたはエリスロシンなどの還元性物質、（着色）ラ
    テックスゾル、炭素ゾル、金属、金属ゾルまたは他の微粒子ゾル、ダンシルリシ
    ン、赤外線染料、クマリン、酵素、およびヨウ化物ラベルからなる群から選択さ
    れるラベルを用いて実施することを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 マイコバクテリウム種を一つまたはそれ以上の対照パターン
    にもとづき同定することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分が、マイコバク
    テリウム種調製品の総体または該種培地の総体を含むことを特徴とする前記請求
    項のいずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】 該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分が、マイコバク
    テリウム種総調製品のＫＰ９０、ＫＳ９０、抗原６、ＫＰ１００もしくはＳＰ１
    ００フラクション、または該種培地の適切なフラクションを含むことを特徴とす
    る請求項１〜１１のいずれかに記載の方法
14. 【請求項１４】 マイコバクテリウム種に対する該少なくとも一つの抗体が、
    ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはそれらのいずれかの組合わせを含むことを特徴と
    する前記請求項のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 診断用キットにおいて、支持体であって、マイコバクテリウ
    ム種の少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分と、マイコバクテリア抗原と反
    応し得るが、該少なくとも一つの免役交差反応性抗原成分とは反応しない少なく
    とも１種の抗体とが結合している支持体と、抗原−抗体複合体の存在を検出する
    手段とを含んでなることを特徴とする診断用キット。
16. 【請求項１６】 該支持体が、膜、浸漬スティック、フィルター、球状物、顆
    粒およびマイクロタイタープレートからなる群から選択されることを特徴とする
    請求項１５記載の診断用キット。