JP3186831B2 - 血液型試薬としての凝集複合体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は凝集性複合体および、そ
の複合体を含む試薬および、赤血球抗原、特に珍しい抗
原の同定のための迅速凝集試験における使用法に関す
る。
の複合体を含む試薬および、赤血球抗原、特に珍しい抗
原の同定のための迅速凝集試験における使用法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】血液
型の分類おいて、食塩水中において、試験血清中に存在
する抗体に特異的である抗原をもつ細胞の凝集誘起し得
るとき、試薬または試験血清は凝集性であるといわれ
る。このことはＩｇＭ型抗体を含む試薬について最も頻
繁に観察される行動である。対照的に、ＩｇＧ型抗体
は、一般にある期間のインキュベーション後でさえ凝集
しない。この場合、各々の細胞上に少数しかないかまた
は、抗体に非常に近づきにくい膜抗原について特に、蛋
白分解酵素の添加または、媒質への高蛋白質濃度の付与
のような方法を使用して、または、別法としてＷＯ９０
／０７１１８およびヨーロッパ特許出願０２２，６６９
に記載の化学的修飾ＩｇＧ分子の使用により、凝集を引
き起こさなければならない。
型の分類おいて、食塩水中において、試験血清中に存在
する抗体に特異的である抗原をもつ細胞の凝集誘起し得
るとき、試薬または試験血清は凝集性であるといわれ
る。このことはＩｇＭ型抗体を含む試薬について最も頻
繁に観察される行動である。対照的に、ＩｇＧ型抗体
は、一般にある期間のインキュベーション後でさえ凝集
しない。この場合、各々の細胞上に少数しかないかまた
は、抗体に非常に近づきにくい膜抗原について特に、蛋
白分解酵素の添加または、媒質への高蛋白質濃度の付与
のような方法を使用して、または、別法としてＷＯ９０
／０７１１８およびヨーロッパ特許出願０２２，６６９
に記載の化学的修飾ＩｇＧ分子の使用により、凝集を引
き起こさなければならない。
【０００３】血液細胞上で検出され難い抗原の多数の例
がある。赤血球において、ルーサス（Ｒｈ）、ルーテラ
ン、ケル（Ｋ）、ダッフィ、キッド、ディーゴ型の抗原
等は挙げられる。これらの抗原の同定は、少なくとも多
数の輸血の受容体において、ときどき緊急時でさえ、輸
血の前に、および臓器移植の前に、または胎児母体同種
免疫の危険があるときに望ましい。したがって、特異的
であり、安定で生産コストが低い凝集試薬を使用する、
凝集の発生により直接的に確認される免疫反応の存在を
可能にする方法のような、使用が簡便であり、経済的で
迅速な技術は、非常に重要である。赤血球の型の検出
は、試薬が凝着剤であるとき、自動化され得る様々な簡
便で迅速な方法を使用して行われるということは知られ
ている。これらの方法を記述するものとして、ルージャ
ー Ｐとサーモン Ｃによるマニュアル：テクニック・
ド・ラボラトワール（Techniques de Laboratoire）６
頁、２５−２６版、マソン（１９８１）が挙げられる
が、そこには特に乳白色ガラス板上、チューブまたはミ
クロプレート中での反応を記載する。
がある。赤血球において、ルーサス（Ｒｈ）、ルーテラ
ン、ケル（Ｋ）、ダッフィ、キッド、ディーゴ型の抗原
等は挙げられる。これらの抗原の同定は、少なくとも多
数の輸血の受容体において、ときどき緊急時でさえ、輸
血の前に、および臓器移植の前に、または胎児母体同種
免疫の危険があるときに望ましい。したがって、特異的
であり、安定で生産コストが低い凝集試薬を使用する、
凝集の発生により直接的に確認される免疫反応の存在を
可能にする方法のような、使用が簡便であり、経済的で
迅速な技術は、非常に重要である。赤血球の型の検出
は、試薬が凝着剤であるとき、自動化され得る様々な簡
便で迅速な方法を使用して行われるということは知られ
ている。これらの方法を記述するものとして、ルージャ
ー Ｐとサーモン Ｃによるマニュアル：テクニック・
ド・ラボラトワール（Techniques de Laboratoire）６
頁、２５−２６版、マソン（１９８１）が挙げられる
が、そこには特に乳白色ガラス板上、チューブまたはミ
クロプレート中での反応を記載する。
【０００４】しかし、この技術において使用され得る試
薬は、ＩｇＭ型抗体、凝着剤でないＩｇＧ型の抗体を基
礎としなければならない。したがって、現在市販されて
いる試薬は単にＡＢＯまたはＲｈ型に適用することがわ
かるが、これらの系ではＩｇＭ型ポリクローナル抗体は
ヒトである生物体中に天然に豊富であり、特に、モノク
ローナル抗体はハイブリドーマの培養によって得られ得
る。
薬は、ＩｇＭ型抗体、凝着剤でないＩｇＧ型の抗体を基
礎としなければならない。したがって、現在市販されて
いる試薬は単にＡＢＯまたはＲｈ型に適用することがわ
かるが、これらの系ではＩｇＭ型ポリクローナル抗体は
ヒトである生物体中に天然に豊富であり、特に、モノク
ローナル抗体はハイブリドーマの培養によって得られ得
る。
【０００５】一方、検出し難い抗原の場合には、血液型
試薬に関する市場の要求にあうに十分な量のＩｇＭ型ポ
リクローナル抗体の製造は、血液サンプルから回収され
るべき抗原に特異的であるＩｇＭ抗体をもたらすため多
数の人々の志願による免疫化が必要である。これらの特
異的ＩｇＭ抗体は、更に、使用する前に共存する他の全
ＩｇＭ抗体から分離されなければならない。更に、これ
らの不経済な操作は、ＩｇＭ型モノクローナル抗体がこ
れらの抗体の大部分において製造法が不明なので、再現
できる方法において際限なく繰り返されなければならな
い。
試薬に関する市場の要求にあうに十分な量のＩｇＭ型ポ
リクローナル抗体の製造は、血液サンプルから回収され
るべき抗原に特異的であるＩｇＭ抗体をもたらすため多
数の人々の志願による免疫化が必要である。これらの特
異的ＩｇＭ抗体は、更に、使用する前に共存する他の全
ＩｇＭ抗体から分離されなければならない。更に、これ
らの不経済な操作は、ＩｇＭ型モノクローナル抗体がこ
れらの抗体の大部分において製造法が不明なので、再現
できる方法において際限なく繰り返されなければならな
い。
【０００６】単にＩｇＧ型抗体すなわち非凝集試薬のみ
が十分な量で得られる抗原を考慮に入れた赤血球の型の
検出は、非凝集試薬は、十分な量を利用され得り、上記
のマニュアル３３−３４頁と４９−６５頁に記載される
複雑な技術を使用しないと実行できない。それらのうち
に、４０℃で、高濃縮蛋白質またはアルブミンのような
他のポリマーの存在下の乳白色ガラス板上の反応、パパ
インを含む蛋白分解酵素の存在下の反応、または、いわ
ゆる抗グロブリン反応（クームス試験）および類似反応
があり得る。またＩｇＧ型抗体からの凝集試薬の製造方
法もを提案されている。
が十分な量で得られる抗原を考慮に入れた赤血球の型の
検出は、非凝集試薬は、十分な量を利用され得り、上記
のマニュアル３３−３４頁と４９−６５頁に記載される
複雑な技術を使用しないと実行できない。それらのうち
に、４０℃で、高濃縮蛋白質またはアルブミンのような
他のポリマーの存在下の乳白色ガラス板上の反応、パパ
インを含む蛋白分解酵素の存在下の反応、または、いわ
ゆる抗グロブリン反応（クームス試験）および類似反応
があり得る。またＩｇＧ型抗体からの凝集試薬の製造方
法もを提案されている。
【０００７】例えば、２−メルカプトエタノールによる
ＩｇＧの還元はそれを凝集剤にするということがプロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad. Scien.）に開示されてい
る。しかし、この方法は化学反応を含むため、複雑（全
体として）であり、非常に融通性がないか、Ｋ抗体のよ
うな細胞あたり少数の部位においてしか存在しない抗原
について所望する結果を提供しない。更に、チューブ中
で実行される方法は２時間インキュベート後、顕微鏡読
み取りを伴う。プロテインＡに対してＦｃ領域により固
定されたＩｇＧ抗体を含む凝集試薬はＧＢ−２１０３３
６０に開示されているが、この場合において、凝集は直
ちには起こらない。それは３７℃で４５分間のインキュ
ベーション後にしかチューブ中で観察されない。さらに
細菌の全菌体をもって製造され得る試薬の非均一性は、
特に自動設備において、容易な使用を許さない。一方、
プロテインＡがその細菌細胞から分離されると、Ｋ抗原
のような珍しい抗原が凝集を生成しない。
ＩｇＧの還元はそれを凝集剤にするということがプロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad. Scien.）に開示されてい
る。しかし、この方法は化学反応を含むため、複雑（全
体として）であり、非常に融通性がないか、Ｋ抗体のよ
うな細胞あたり少数の部位においてしか存在しない抗原
について所望する結果を提供しない。更に、チューブ中
で実行される方法は２時間インキュベート後、顕微鏡読
み取りを伴う。プロテインＡに対してＦｃ領域により固
定されたＩｇＧ抗体を含む凝集試薬はＧＢ−２１０３３
６０に開示されているが、この場合において、凝集は直
ちには起こらない。それは３７℃で４５分間のインキュ
ベーション後にしかチューブ中で観察されない。さらに
細菌の全菌体をもって製造され得る試薬の非均一性は、
特に自動設備において、容易な使用を許さない。一方、
プロテインＡがその細菌細胞から分離されると、Ｋ抗原
のような珍しい抗原が凝集を生成しない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】第一の特徴によれば、本
発明は、ＩｇＭ型抗体を使用して実行され得る簡便で迅
速な凝集技術により赤血球抗原の同定ための凝集性複合
体およびそれを含む凝集試薬に関する。本発明の複合体
は明白に複合体中で使用されるが、感受性常用試験の使
用は疑わしい結果の確認が要求される。本発明の凝集性
複合体は、同定または分析されるべき抗原に特異的であ
るＩｇＧ型抗体、抗体のＦｃ部位上の少なくとも２つの
部位において結合可能な蛋白質、および抗免疫グロブリ
ン抗体の間の親和性カップリングからもたらされるもの
である。ＩｇＧ型抗体はモノクローナルまたはポリクロ
ーナルであり得る。
発明は、ＩｇＭ型抗体を使用して実行され得る簡便で迅
速な凝集技術により赤血球抗原の同定ための凝集性複合
体およびそれを含む凝集試薬に関する。本発明の複合体
は明白に複合体中で使用されるが、感受性常用試験の使
用は疑わしい結果の確認が要求される。本発明の凝集性
複合体は、同定または分析されるべき抗原に特異的であ
るＩｇＧ型抗体、抗体のＦｃ部位上の少なくとも２つの
部位において結合可能な蛋白質、および抗免疫グロブリ
ン抗体の間の親和性カップリングからもたらされるもの
である。ＩｇＧ型抗体はモノクローナルまたはポリクロ
ーナルであり得る。
【０００９】モノクロナール抗体を使用する場合、望ま
しくは清澄化した腹水または適当なハイブリドーマ細胞
の培地の上清から常用方法で得る。同定し難い血液型に
特異的であるＩｇＧモノクローナル抗体は市販されてい
る。その他のものは文献に記載されている。ＩｇＧポリ
クローナル抗体は、例えば、ボックス・サンギンス(Vo
x.Sang.)３３巻、２８０頁（１９７７）記載の吸着・溶
離法により免疫されたヒト被験者の血清または血漿から
抽出され得る。それらは珍しく、高価である。それを含
む本発明の複合体と試薬は、検出し難い赤血球抗原の同
定、特に、自然に免疫化されＩｇＭをもつヒトが少ない
ケル、ダッフィ、キッド型の同定および血液細胞の認識
可能とするに十分な量であるＩｇＭ型モノクローナル抗
体が知られていないものの同定に有用である。
しくは清澄化した腹水または適当なハイブリドーマ細胞
の培地の上清から常用方法で得る。同定し難い血液型に
特異的であるＩｇＧモノクローナル抗体は市販されてい
る。その他のものは文献に記載されている。ＩｇＧポリ
クローナル抗体は、例えば、ボックス・サンギンス(Vo
x.Sang.)３３巻、２８０頁（１９７７）記載の吸着・溶
離法により免疫されたヒト被験者の血清または血漿から
抽出され得る。それらは珍しく、高価である。それを含
む本発明の複合体と試薬は、検出し難い赤血球抗原の同
定、特に、自然に免疫化されＩｇＭをもつヒトが少ない
ケル、ダッフィ、キッド型の同定および血液細胞の認識
可能とするに十分な量であるＩｇＭ型モノクローナル抗
体が知られていないものの同定に有用である。
【００１０】抗体のＦｃ部分に固定できる蛋白質および
検出されるべき抗原との免疫反応の間に、高分子格子構
造を形成するために少なくとも２つの固定部位をもつ蛋
白質として、微生物起源の蛋白質および、特に非常に周
知のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus
aureus)からのプロテインＡまたは、スタフィロコッカ
ス。エピデルミデイス（Staphylococcus epidermidis）
およびスタフィロコッカス・ピオゲネス(Staphylococcus
pyogenes)からのもの、またはストレプトコッカス・ス
ペシズ(Streptococcus species)からのプロテインＧを
挙げることができる。これらの蛋白質は多数の結合部位
をもつ。天然蛋白質またはそのフラグメントは好ましく
は細菌細胞から分離され、再生産されるバッチをもつよ
うに精製されるが、それらは組換え体蛋白質でもまたあ
り得る。様々な蛋白質は、一般に凍結乾燥形態であり、
特にシグマ社またはピアース社により市販されている。
検出されるべき抗原との免疫反応の間に、高分子格子構
造を形成するために少なくとも２つの固定部位をもつ蛋
白質として、微生物起源の蛋白質および、特に非常に周
知のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus
aureus)からのプロテインＡまたは、スタフィロコッカ
ス。エピデルミデイス（Staphylococcus epidermidis）
およびスタフィロコッカス・ピオゲネス(Staphylococcus
pyogenes)からのもの、またはストレプトコッカス・ス
ペシズ(Streptococcus species)からのプロテインＧを
挙げることができる。これらの蛋白質は多数の結合部位
をもつ。天然蛋白質またはそのフラグメントは好ましく
は細菌細胞から分離され、再生産されるバッチをもつよ
うに精製されるが、それらは組換え体蛋白質でもまたあ
り得る。様々な蛋白質は、一般に凍結乾燥形態であり、
特にシグマ社またはピアース社により市販されている。
【００１１】複合体のもう一つの構成要素である抗グロ
ブリン抗体は、全ての抗免疫グロブリン、多価抗体、ま
たはＩｇＧに特異的である抗体から選択され得る。モノ
クローナルまたはポリクローナル起源の抗体であり得
り、多少とも精製されている。Ｆ（ａｂ）部分またはＦ
（ａｂ'）２部分を含むフラグメントもまた使用され得
る。同定されるべき抗原に向けられるＩｇＧ抗体がヒト
起源である場合、抗グロブリン抗体はヒト起源の免疫グ
ロブリンに向けられる。種間親和性反応が可能でないの
なら複合体の２つの抗体において同じ種特異性をもつこ
とは重要である。本発明の凝集複合体は、好ましくはＰ
Ｈ５〜９、このましくは６.５〜７.５に緩衝化された水
性媒質、または実質的に等張で所望により緩衝化された
食塩水中において、検出されるべき抗原に向けられるＩ
ｇＧ抗体の溶液に抗体のＦｃ部分に結合可能な蛋白質を
添加することにより製造され得る。反応は特に濃度と、
一般に４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃のインキュ
ベーションの温度によって異なる期間後、完了する。後
者の温度範囲において、結合の形成のために必要な時間
は５分〜１時間である。
ブリン抗体は、全ての抗免疫グロブリン、多価抗体、ま
たはＩｇＧに特異的である抗体から選択され得る。モノ
クローナルまたはポリクローナル起源の抗体であり得
り、多少とも精製されている。Ｆ（ａｂ）部分またはＦ
（ａｂ'）２部分を含むフラグメントもまた使用され得
る。同定されるべき抗原に向けられるＩｇＧ抗体がヒト
起源である場合、抗グロブリン抗体はヒト起源の免疫グ
ロブリンに向けられる。種間親和性反応が可能でないの
なら複合体の２つの抗体において同じ種特異性をもつこ
とは重要である。本発明の凝集複合体は、好ましくはＰ
Ｈ５〜９、このましくは６.５〜７.５に緩衝化された水
性媒質、または実質的に等張で所望により緩衝化された
食塩水中において、検出されるべき抗原に向けられるＩ
ｇＧ抗体の溶液に抗体のＦｃ部分に結合可能な蛋白質を
添加することにより製造され得る。反応は特に濃度と、
一般に４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃のインキュ
ベーションの温度によって異なる期間後、完了する。後
者の温度範囲において、結合の形成のために必要な時間
は５分〜１時間である。
【００１２】抗体溶液に添加される蛋白質の量は抗体の
濃度に依存するだけでなく、蛋白質上の抗体結合部位の
密度に依存する。抗体が実質的に全ての部位を飽和する
ことが望ましい。例として、抗体の重量対純粋なプロテ
インＡまたはＧの重量の比は一般に３〜３０、好ましく
は５〜２０であることおよび、結合媒質の抗体濃度は５
０μｇ／ｍｌより濃いということがいえる。
濃度に依存するだけでなく、蛋白質上の抗体結合部位の
密度に依存する。抗体が実質的に全ての部位を飽和する
ことが望ましい。例として、抗体の重量対純粋なプロテ
インＡまたはＧの重量の比は一般に３〜３０、好ましく
は５〜２０であることおよび、結合媒質の抗体濃度は５
０μｇ／ｍｌより濃いということがいえる。
【００１３】抗ＩｇＧの付加は、第一のインキュベーシ
ョンの直後、またはもし培地が＋４℃、好ましくは凍結
状態であるならば、より遅れて起こり得る。第一段階と
して、添加される抗体の溶液の濃度および容積は、具体
的に抗体の特異性および所望の感度に依存する。例え
ば、ケルまたはリーサス型において、ＩｇＧ型抗体およ
び抗免疫グロブリンの実質的に同一の量が、本発明記載
の複合体の形成に使用され得る。抗−抗体に結合する第
二のインキュベーションの温度および持続時間は重大で
はない。それらは蛋白質／第一抗体結合につき示される
のと同じ制限内で変化し得る。当技術の熟練者は予備試
験により複合体の製造のための全てのパラメーターを決
定することができるであろう。
ョンの直後、またはもし培地が＋４℃、好ましくは凍結
状態であるならば、より遅れて起こり得る。第一段階と
して、添加される抗体の溶液の濃度および容積は、具体
的に抗体の特異性および所望の感度に依存する。例え
ば、ケルまたはリーサス型において、ＩｇＧ型抗体およ
び抗免疫グロブリンの実質的に同一の量が、本発明記載
の複合体の形成に使用され得る。抗−抗体に結合する第
二のインキュベーションの温度および持続時間は重大で
はない。それらは蛋白質／第一抗体結合につき示される
のと同じ制限内で変化し得る。当技術の熟練者は予備試
験により複合体の製造のための全てのパラメーターを決
定することができるであろう。
【００１４】この方法は好ましくないけれども、２種の
抗体と蛋白質の混合物を、適当な割合でインキュベート
して、凝集複合体を得るのは可能であり得る。親和性カ
ップリングの終点で得られた凝集複合体の溶液は、試薬
中の複合ＩｇＧの濃度が約１〜５０μｇ／ｍｌであるの
が有利であり、迅速常用同定方法において使用される濃
度より一般に濃縮されている。更に、製造するとすぐ
に、１０℃より低い温度および凍結で保存することがで
き、その後使用直前希釈するか、または、多種類の単位
投与量の包装後、すぐに使用できる希釈状態で、同条件
下で保管され得る。このように、概して、適当な希釈
は、複合体製造培地への、水溶性塩、アミノ酸、抗体溶
液を安定化し、通常より低い濃度（すなわち、５％より
低い濃度、このような濃度では、ＩｇＧの存在下、被験
血清中、偽陽性が生成しない）で、凝集濃度を強化する
性質で知られる高分子物質を含み得る、トリスまたはり
ん酸を基本とするＰＨ５〜９を基礎とする緩衝液の添加
により得られる。これらの高分子中、専門家が周知であ
るポリビニルピロロリドン、デキストランまたはアルブ
ミンのような蛋白質のような中性多糖類を挙げ得る。
抗体と蛋白質の混合物を、適当な割合でインキュベート
して、凝集複合体を得るのは可能であり得る。親和性カ
ップリングの終点で得られた凝集複合体の溶液は、試薬
中の複合ＩｇＧの濃度が約１〜５０μｇ／ｍｌであるの
が有利であり、迅速常用同定方法において使用される濃
度より一般に濃縮されている。更に、製造するとすぐ
に、１０℃より低い温度および凍結で保存することがで
き、その後使用直前希釈するか、または、多種類の単位
投与量の包装後、すぐに使用できる希釈状態で、同条件
下で保管され得る。このように、概して、適当な希釈
は、複合体製造培地への、水溶性塩、アミノ酸、抗体溶
液を安定化し、通常より低い濃度（すなわち、５％より
低い濃度、このような濃度では、ＩｇＧの存在下、被験
血清中、偽陽性が生成しない）で、凝集濃度を強化する
性質で知られる高分子物質を含み得る、トリスまたはり
ん酸を基本とするＰＨ５〜９を基礎とする緩衝液の添加
により得られる。これらの高分子中、専門家が周知であ
るポリビニルピロロリドン、デキストランまたはアルブ
ミンのような蛋白質のような中性多糖類を挙げ得る。
【００１５】好ましくは、アジ化ナトリウムのような静
菌剤も、長期保存のために添加される。この試薬と本発
明の凝集複合体はまた凍結乾燥状態で保管され得る。そ
の場合、それらを使用時に蒸留水中、またはこの技術領
域において通常であるりん酸塩型緩衝化食塩水中に入れ
る。本発明の特徴のもう一つによると、本発明は、赤血
球および適当な培地と接触させ、凝集が起こるかどうか
を観察することからなる、赤血球上の抗体の同定および
測定方法に関する。
菌剤も、長期保存のために添加される。この試薬と本発
明の凝集複合体はまた凍結乾燥状態で保管され得る。そ
の場合、それらを使用時に蒸留水中、またはこの技術領
域において通常であるりん酸塩型緩衝化食塩水中に入れ
る。本発明の特徴のもう一つによると、本発明は、赤血
球および適当な培地と接触させ、凝集が起こるかどうか
を観察することからなる、赤血球上の抗体の同定および
測定方法に関する。
【００１６】凝集が起こり得る培地の組成は重大ではな
い；しかし、その細胞は、影響を受けずに存在せねばな
らず、一般に無機塩の存在が必要である；更に、少量
の、５％より少ない高分子の存在は反応率を増大さるこ
とが観察された；これらの高分子物質の性質と濃度は抗
体の性質、複合体、濃度、操作条件に依存するが、当技
術の熟練者は予備試験によってそれらを選択し得る。こ
の方法は有利に赤血球の型の分類、およびＲｈ、ダッフ
ィ、キッド、ケル系の抗原の存在を調査するために行わ
れる。これにより、現在、研究所、病院、輸血センター
で使用される大部分の方法に等しい結果を得る簡便で迅
速な方法である。
い；しかし、その細胞は、影響を受けずに存在せねばな
らず、一般に無機塩の存在が必要である；更に、少量
の、５％より少ない高分子の存在は反応率を増大さるこ
とが観察された；これらの高分子物質の性質と濃度は抗
体の性質、複合体、濃度、操作条件に依存するが、当技
術の熟練者は予備試験によってそれらを選択し得る。こ
の方法は有利に赤血球の型の分類、およびＲｈ、ダッフ
ィ、キッド、ケル系の抗原の存在を調査するために行わ
れる。これにより、現在、研究所、病院、輸血センター
で使用される大部分の方法に等しい結果を得る簡便で迅
速な方法である。
【００１７】ＩｇＭを基礎とする血液型分類のために周
知の迅速技術は免疫反応行うものを用い、乳白色ガラス
板上、チューブ内、ミクロプレート内のいずれかにおい
て凝集を視覚化するものである。製造は１０〜３７℃の
温度で実行され得る、しかし使用がより簡単な室温が望
まれる。この場合、凝集は、操作条件、抗体への親和
性、抗原の性質、サンプル中の濃度に依存して、１〜数
分以内で迅速に観察される。以下記載において、本発明
の凝集複合体の例、試薬の例、珍しい抗原の同定のため
の本発明の方法を行った結果を、ＩｇＭ型抗体中凝集ポ
リクローナル試薬を強化したものを用いた結果と比較し
て、記載する。
知の迅速技術は免疫反応行うものを用い、乳白色ガラス
板上、チューブ内、ミクロプレート内のいずれかにおい
て凝集を視覚化するものである。製造は１０〜３７℃の
温度で実行され得る、しかし使用がより簡単な室温が望
まれる。この場合、凝集は、操作条件、抗体への親和
性、抗原の性質、サンプル中の濃度に依存して、１〜数
分以内で迅速に観察される。以下記載において、本発明
の凝集複合体の例、試薬の例、珍しい抗原の同定のため
の本発明の方法を行った結果を、ＩｇＭ型抗体中凝集ポ
リクローナル試薬を強化したものを用いた結果と比較し
て、記載する。
【００１８】実施例中で用いられた種々の凝集反応は、
以下のように行われる。 １） 室温での乳白ガラス板上反応 試薬の一滴、および洗浄または不洗浄の被験球状ペレッ
トの一滴を板上に置き、直径２ｃｍの円を形成するよう
にガラス棒で掻き混ぜる。起こり得るとすれば凝集は２
分後検出される。 ２） チューブ内の反応 ２％赤血球の懸濁液の一滴と試薬の一滴を混合し、沈降
１または２時間後形成し得る凝集を観察する。 ３） 抗グロブリン反応（またはクームス試験）： 生理食塩水中、洗浄または不洗浄の被験赤血球の懸濁液
１滴を、試薬の一滴を含むカーンチューブに加え、混合
物を、１５分間３７℃でインキュベートし、生理食塩水
で３回洗浄する。抗グロブリンの一滴を傾斜ペレットに
加え、ペレットを再懸濁後１分間遠心分離する。つい
で、起こり得る凝集を静かにチューブを振盪することに
より観察する。反応のタイターと成績を、ルージャー，
ｐ．およびサーモン，Ｃ．３１−３２頁による上記の手
引中に具体的に記載される常用方法により計算する。
以下のように行われる。 １） 室温での乳白ガラス板上反応 試薬の一滴、および洗浄または不洗浄の被験球状ペレッ
トの一滴を板上に置き、直径２ｃｍの円を形成するよう
にガラス棒で掻き混ぜる。起こり得るとすれば凝集は２
分後検出される。 ２） チューブ内の反応 ２％赤血球の懸濁液の一滴と試薬の一滴を混合し、沈降
１または２時間後形成し得る凝集を観察する。 ３） 抗グロブリン反応（またはクームス試験）： 生理食塩水中、洗浄または不洗浄の被験赤血球の懸濁液
１滴を、試薬の一滴を含むカーンチューブに加え、混合
物を、１５分間３７℃でインキュベートし、生理食塩水
で３回洗浄する。抗グロブリンの一滴を傾斜ペレットに
加え、ペレットを再懸濁後１分間遠心分離する。つい
で、起こり得る凝集を静かにチューブを振盪することに
より観察する。反応のタイターと成績を、ルージャー，
ｐ．およびサーモン，Ｃ．３１−３２頁による上記の手
引中に具体的に記載される常用方法により計算する。
【００１９】実施例１ 抗ケル凝集試薬 ａ）製造：Ｋ抗原に向けられたヒト起源のＩｇＧ型抗ケ
ルモノクローナル抗体１５０μｇ／ｍｌを含む、細胞培
地の澄明な上清を、１００μｇ／ｍｌの抗体濃度までリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＨ７.４）を加えることにより希釈
する。同じ緩衝液中、ｐ６０３１の表示の下にシグマよ
り市販されるプロテインＡ１０μｇ／ｍｌを含む溶液の
一容積をこの溶液に加える。混合物を３７℃で６０分間
撹拌し、ついで、多価抗グロブリンの溶液の１容積を加
え、混合物を３７℃で６０分間撹拌し、２０℃で室温に
再平衡化する。多価抗グロブリンはアルブミンを含む等
張食塩水に希釈されるヤギ血清から製造された試薬であ
り、該ヤギはヒト免疫グロブリンと補体で高免疫化され
ている。ミニストリィ・オブ・ソシアル・アフェアーズ
−赤血球免疫学において用いられる試薬の特徴および標
準（付録２−２５９６頁）の標題の下、１９８４年３月
１７日のジ・オフィシャル・ジャーナル・オブ・ザ・フ
レンチ・リパブリック表示に対応するこの試薬の特徴、
この試薬は、２１１２０の下にを参照してダイアグノス
チィックス トランスヒュージョン（ＦＲ）より市販さ
れる。以下の試験でその結果が示される試験のために、
こうして得られた混合物を、グリコール（２％）および
デキストリン（１％）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＨ
７.４）の同量を使用する前に希釈した。高濃度ヒト血
清から製造され、高分子に富む引用試薬は表示２１０８
３の下にダイアグノスチィック トランスヒュージョン
より市販される。
ルモノクローナル抗体１５０μｇ／ｍｌを含む、細胞培
地の澄明な上清を、１００μｇ／ｍｌの抗体濃度までリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＨ７.４）を加えることにより希釈
する。同じ緩衝液中、ｐ６０３１の表示の下にシグマよ
り市販されるプロテインＡ１０μｇ／ｍｌを含む溶液の
一容積をこの溶液に加える。混合物を３７℃で６０分間
撹拌し、ついで、多価抗グロブリンの溶液の１容積を加
え、混合物を３７℃で６０分間撹拌し、２０℃で室温に
再平衡化する。多価抗グロブリンはアルブミンを含む等
張食塩水に希釈されるヤギ血清から製造された試薬であ
り、該ヤギはヒト免疫グロブリンと補体で高免疫化され
ている。ミニストリィ・オブ・ソシアル・アフェアーズ
−赤血球免疫学において用いられる試薬の特徴および標
準（付録２−２５９６頁）の標題の下、１９８４年３月
１７日のジ・オフィシャル・ジャーナル・オブ・ザ・フ
レンチ・リパブリック表示に対応するこの試薬の特徴、
この試薬は、２１１２０の下にを参照してダイアグノス
チィックス トランスヒュージョン（ＦＲ）より市販さ
れる。以下の試験でその結果が示される試験のために、
こうして得られた混合物を、グリコール（２％）および
デキストリン（１％）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＨ
７.４）の同量を使用する前に希釈した。高濃度ヒト血
清から製造され、高分子に富む引用試薬は表示２１０８
３の下にダイアグノスチィック トランスヒュージョン
より市販される。
【００２０】ｂ）凝集試験 １） 室温での乳白色ガラス板上の反応 Ｋ+表現型で知られる供血者から２００血液サンプルの
その８％は、１００％陽性表現型偽陽性または陰性をも
たない本発明の試薬および参考試薬使用して同定した。
この研究の間、本発明の試薬を用いて得た凝集像の４５
％はより明白であり、５０％は同価であったということ
を観察した。２試薬を用いての最初の凝集の形成にかか
る時間は短かった。この実施例の生成物では５秒、参考
例では６秒。この実施例の生成物においてタイターは
８、スコアは２０、参考例ではタイターは４、スコアは
１４であった。本発明による複合体の代わりに、試薬が
製造に使用されるＩｇＧまたはプロテインＡ単一に結合
するＩｇＧを含むなら、凝集はこの条件下で観察されな
い。 ２）チューブ中での反応と光学顕微鏡を使用しての読み
取り 結果： タイター スコア 実施例１の試薬 ２５６ ６６ 参考試薬 １２８ ５６ ３）凝集反応 タイター スコア 実施例１の試薬 １２８ ５７ 参考試薬 ２５６ ７１
その８％は、１００％陽性表現型偽陽性または陰性をも
たない本発明の試薬および参考試薬使用して同定した。
この研究の間、本発明の試薬を用いて得た凝集像の４５
％はより明白であり、５０％は同価であったということ
を観察した。２試薬を用いての最初の凝集の形成にかか
る時間は短かった。この実施例の生成物では５秒、参考
例では６秒。この実施例の生成物においてタイターは
８、スコアは２０、参考例ではタイターは４、スコアは
１４であった。本発明による複合体の代わりに、試薬が
製造に使用されるＩｇＧまたはプロテインＡ単一に結合
するＩｇＧを含むなら、凝集はこの条件下で観察されな
い。 ２）チューブ中での反応と光学顕微鏡を使用しての読み
取り 結果： タイター スコア 実施例１の試薬 ２５６ ６６ 参考試薬 １２８ ５６ ３）凝集反応 タイター スコア 実施例１の試薬 １２８ ５７ 参考試薬 ２５６ ７１
【００２１】実施例２ 抗ケル凝集試薬 試薬は実施例１記載の方法により製造されるが、プロテ
インＡを純粋な商業的に利用できるプロテインＧと置換
する。乳白色ガラス板上反応において、試薬は８タイタ
ーと２０スコアであり、チューブ中タイターは１２８、
スコアは５２である。抗グロブリン反応において、タイ
ターは１２８、スコアは５６である。
インＡを純粋な商業的に利用できるプロテインＧと置換
する。乳白色ガラス板上反応において、試薬は８タイタ
ーと２０スコアであり、チューブ中タイターは１２８、
スコアは５２である。抗グロブリン反応において、タイ
ターは１２８、スコアは５６である。
【００２２】実施例３ 抗ケル凝集試薬 試薬は実施例１記載の方法によりプロテインＡと表示Ｂ
Ｉ２０１５下にバイオシス フランスにより販売される
ヒト起源の重鎖と軽鎖に向けられた抗ＩｇＧ抗免疫グロ
ブリンＨ＋Ｌを使用して製造される。乳白色ガラス板
上、タイターは８、２０スコアであり、チューブ中タイ
ターは１２８、スコアは４９である。抗グロブリン反応
において、タイターは６４、スコアは４６である。
Ｉ２０１５下にバイオシス フランスにより販売される
ヒト起源の重鎖と軽鎖に向けられた抗ＩｇＧ抗免疫グロ
ブリンＨ＋Ｌを使用して製造される。乳白色ガラス板
上、タイターは８、２０スコアであり、チューブ中タイ
ターは１２８、スコアは４９である。抗グロブリン反応
において、タイターは６４、スコアは４６である。
【００２３】実施例４ 表現型Ｄ（Ｒｈ+）調査のための試薬 試薬は、実施例１に記載される方法の適用により、抗原
Ｄ、多価ヒト抗免疫グロブリンおよびプロテインＡに向
けられたＩｇＧ型モノクローナル抗体を使用して製造さ
れた。乳白色ガラス板上反応において、出発モノクロー
ナル抗体のみを使用する同じ条件下で製造された試薬は
凝集を生成しない。しかし、本実施例はタイター１６ス
コア３０である。複合体抗グロブリン反応において、出
発モノクロナール抗体は本実施例の試薬よりわずかに高
いスコアをもつ。
Ｄ、多価ヒト抗免疫グロブリンおよびプロテインＡに向
けられたＩｇＧ型モノクローナル抗体を使用して製造さ
れた。乳白色ガラス板上反応において、出発モノクロー
ナル抗体のみを使用する同じ条件下で製造された試薬は
凝集を生成しない。しかし、本実施例はタイター１６ス
コア３０である。複合体抗グロブリン反応において、出
発モノクロナール抗体は本実施例の試薬よりわずかに高
いスコアをもつ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/53 G01N 33/80
Claims (11)
- 【請求項１】 赤血球上の抗原の同定のための凝集性複
合体であって、同定されるべき抗原に対して特異的であ
り、抗体のＦｃ部分上の少なくとも２部位に結合可能で
ある、プロテインＡおよびＧから選ばれる蛋白質と反応
している非凝集性ＩｇＧ型抗体、および抗−免疫グロブ
リン抗体またはそのフラグメントからなり、上記抗体お
よび上記蛋白質は親和性結合により結合していることを
特徴とする複合体。 - 【請求項２】 上記２種の抗体が同じ種特異性をもつ、
請求項１記載の複合体。 - 【請求項３】 上記抗−免疫グロブリン抗体がＩｇＧに
対して特異的である、請求項１または２記載の複合体。 - 【請求項４】 上記非凝集性抗体がケル、ダッフィ、ま
たはキッド型の抗原を認識する抗体である、請求項１〜
３のいずれか１項記載の複合体。 - 【請求項５】 上記抗原がケル型である、請求項４記載
の複合体。 - 【請求項６】 ＰＨ５〜９に緩衝化され、凝集試薬中で
使用され得る高分子物質０〜５％を含む食塩水中にＩｇ
Ｇ１〜５０μｇ／ｍｌに相当する濃度で請求項１〜５の
いずれか１項に記載の複合体を含むことを特徴とする凝
集試薬。 - 【請求項７】 ポリビニルピロリドン、中性の多糖類、
および蛋白質から選ばれる高分子物質を含む、請求項６
記載の試薬。 - 【請求項８】 第一段階において、同定されるべき抗原
に対して特異的な非凝集性抗体を、選ばれた蛋白質と親
和性カップリング形成条件下で接触させ、第二段階で、
得られたカップリング生成物を、抗免疫グロブリン抗体
と親和性カップリング形成条件下で接触させることを特
徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体
の製造方法。 - 【請求項９】 赤血球細胞壁上の抗原の同定方法であっ
て、請求項１〜７のいずれか１項に記載の凝集性複合体
または試薬を、確認すべき赤血球と接触させ、起こり得
る凝集を観察することを特徴とする方法。 - 【請求項１０】 血液サンプル中のケル型抗原の同定方
法であって、この血液サンプルを請求項５に記載の凝集
性複合体またはこれを含有する試薬と接触させ、起こり
得る凝集を観察することを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 プレート上で行われる、請求項９また
は１０記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9105410 | 1991-05-02 | ||
| FR919105410A FR2676123B1 (fr) | 1991-05-02 | 1991-05-02 | Complexe agglutinant et reactif d'identification d'antigenes sur les parois cellulaires. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05264543A JPH05264543A (ja) | 1993-10-12 |
| JP3186831B2 true JP3186831B2 (ja) | 2001-07-11 |
Family
ID=9412461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11289692A Expired - Lifetime JP3186831B2 (ja) | 1991-05-02 | 1992-05-01 | 血液型試薬としての凝集複合体 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5302512A (ja) |
| EP (1) | EP0512896B1 (ja) |
| JP (1) | JP3186831B2 (ja) |
| AT (1) | ATE112392T1 (ja) |
| CA (1) | CA2067584C (ja) |
| DE (1) | DE69200460T2 (ja) |
| ES (1) | ES2061324T3 (ja) |
| FR (1) | FR2676123B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5665558A (en) * | 1994-05-17 | 1997-09-09 | Gamma Biologicals, Inc. | Method and apparatus useful for detecting bloodgroup antigens and antibodies |
| US5905028A (en) * | 1994-05-17 | 1999-05-18 | Gamma Biologicals, Inc. | Method and apparatus useful for detecting bloodgroup antigens and antibodies |
| ATE513061T1 (de) * | 1994-11-10 | 2011-07-15 | New York Blood Ct Inc | Diagnostisches verfahren und kit zur bestimmung des kell-blutgruppengenotyps |
| US5589336A (en) * | 1994-11-10 | 1996-12-31 | New York Blood Center | Diagnostic method and kit for determining Kell blood group genotype |
| US5583004A (en) * | 1994-12-23 | 1996-12-10 | Pincus; Mathew R. | Direct detection of unexpected alloantibodies in the serum of prospective transfusion recipients using a new hemagglutination inhibition assay |
| EP0805354A1 (en) * | 1996-04-29 | 1997-11-05 | Matthew R. Dr. Pincus | Direct detection of unexpected alloantibodies in the serum of prospective transfusion recipients using a new haemoglutination inhibition assay |
| US6830895B2 (en) | 2001-07-26 | 2004-12-14 | Kansas State University Research Foundation | Method and kit for typing feline blood |
| FR2829500B1 (fr) | 2001-09-13 | 2003-12-12 | Hemosystem | Procede de concentration et de detection de germes pathogenes a partir de produits sanguins et/ou de leurs derives et dispositif pour le mettre en oeuvre |
| FR2901281B1 (fr) * | 2006-05-19 | 2008-08-15 | Hemosystem Sa | Procede d'extraction des acides desoxyribonucleiques (adn)de microorganismes eventuellement presents dans un echantillon sanguin |
| KR20120072213A (ko) * | 2010-12-23 | 2012-07-03 | 한국전자통신연구원 | 혈구 응집을 통한 혈장 채취 방법 및 이를 위한 혈장 분리 기기 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB2103360A (en) * | 1981-08-07 | 1983-02-16 | Scottish Health Services Admin | Cell grouping reagent and process |
| GB2117514B (en) * | 1982-03-29 | 1985-08-29 | East Anglian Regional Health | Polyvalent antiglobulin reagent |
| NL8501219A (nl) * | 1985-04-29 | 1986-11-17 | Stichting Vrienden Van De Stic | Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan. |
| JPH0690206B2 (ja) * | 1986-06-16 | 1994-11-14 | 日本赤十字社 | 抗原抗体複合物及びその使用方法 |
| JPH037982A (ja) * | 1988-07-29 | 1991-01-16 | Mercian Corp | 血液型判定教習具 |
| EP0363510B1 (de) * | 1988-10-12 | 1993-12-15 | Biotest AG | Verfahren zur Suche und Identifizierung von erythrozytären Antikörpern mit Hilfe der Festphasen-Methode |
| FR2640143B1 (fr) * | 1988-12-13 | 1991-03-15 | Maes Ludo | Anticorps polymerises, diriges contre des immunoglobulines - leur utilisation dans des tests de diagnostic |
-
1991
- 1991-05-02 FR FR919105410A patent/FR2676123B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-04-29 CA CA002067584A patent/CA2067584C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-29 DE DE69200460T patent/DE69200460T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-29 AT AT92401221T patent/ATE112392T1/de active
- 1992-04-29 ES ES92401221T patent/ES2061324T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-29 EP EP92401221A patent/EP0512896B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-01 JP JP11289692A patent/JP3186831B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-04 US US07/877,718 patent/US5302512A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JPH05264543A (ja) | 1993-10-12 |
| FR2676123B1 (fr) | 1994-06-17 |
| DE69200460T2 (de) | 1995-05-11 |
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