KR20070051284A - 점착성 미세소포의 제거 방법 - Google Patents
점착성 미세소포의 제거 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액 유래 시료의 알부민 전처리에 의한 인위적 조작에 의해 활성화된 혈소판으로부터 방출되는 미세소포만을 배제하여 혈액 중 미세소포만을 측정하는 방법에 관한 것이다.
점착성 미세소포, 혈액 유래 시료, 알부민
Description
본 발명은 미세소포 측정용 혈액 유래 시료 중에서 발생하는 점착성 미세소포(microvesicle)를, 채혈 전의 혈액 중에 존재하는 순환성 미세소포의 측정에 영향을 주지 않도록 전처리하는 방법 및 순환성 미세소포의 적정한 측정 방법, 및 그의 측정 시약 또는 측정 키트에 관한 것이다.
미세소포는 아테롬 경화증, 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군 등의 혈전 형성시에 활성화된 혈소판으로부터 방출된다. 그러나, 상기 미세소포는, 막 표면의 인지질에 대한 응고 인자가 결합ㆍ농축되는 것에 의한 혈액 응고 촉진 작용, 단구ㆍ혈소판ㆍ혈관 내피 세포의 활성화 작용, 또는 백혈구-혈소판ㆍ백혈구-백혈구ㆍ내피 세포-백혈구의 접착 촉진 작용 등이 알려져 있고, 단순한 혈소판 활성화의 마커가 아니라 혈전 형성, 동맥 경화 진전에 깊이 관여하고 있다고 생각되었다(비특허 문헌 1 참조). 따라서, 혈액 중의 미세소포의 양을 측정하는 것은, 상기질환의 병상을 경시적으로 추정하기 위한 유력한 진단 수법 중 하나로서 중요한 위치를 차지하고 있다. 그러나, 혈소판은 물리적 자극 등에 의해 용이하게 활성화되고, 이에 따라 미세소포도 활성화 후의 혈소판으로부터 방출된다. 예를 들면, 채혈시의 물리적 쇼크나 혈장 또는 혈청의 분리 조작 중에, 혼재하는 혈소판의 활성화 등에 의해 임상 상태를 반영하지 않은 미세소포가 채혈 후의 혈액 유래 시료 중에 증가하는 경우가 있다. 이러한 미세소포는 혈액 유래 시료 중의 미세소포량을 상승시켜, 환자의 병상을 정확하게 판정하는 데에 장해가 된다. 따라서, 채혈 후에 발생하는 미세소포의 영향을 배제하여, 채혈 전의 혈액 중 미세소포를 정확하게 측정하는 방법이 요구되었다.
[비특허 문헌 1] Nomura S. Int. J. Hematol. 74, 397-404, (2001)
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은 상기 채혈 후의 혈액 유래 시료의 제조시에 발생하는 미세소포(점착성 미세소포)에 의한 문제점을 해결하기 위해서, 상기 점착성 미세소포의 제거 방법, 이것을 이용한 혈액 중의 순환성 미세소포의 적정한 측정 방법 및 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 이러한 실정을 감안하여 예의 연구한 결과, BSA(소혈청 알부민)을 대표로 하는 알부민이 채혈 후에 발생하는 미세소포(점착성 미세소포)와 특이적으로 상호 작용하여 면역학적 측정에서의 그의 영향을 배제하고, 채혈 전에 존재한 미세소포(순환성 미세소포)만을 면역학적 수법에 의해 적정하게 측정할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 상술한 성과에 기초하여 완성된 것이고, 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
항 1. 혈액 유래 시료 중에 알부민을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하기 위한 혈액 유래 시료의 전처리 방법.
항 2. 알부민이 BSA인 항 1에 기재된 방법.
항 3. 혈액 유래 시료에 알부민을 첨가하여 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하는 공정, 및 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포를 면역학적으로 측정하는 공정을 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
항 4. 순환성 미세소포에 대한 항체를 미세소포에 특이적인 표면 에피토프에 결합시키고, 그 결과, 결합된 항체 수준을 측정함으로써 순환성 미세소포의 면역학적 측정을 행하는 항 3에 기재된 방법.
항 5. 상기 표면 에피토프가 순환성 미세소포의 당 단백질 상에 있는 항 4에 기재된 방법.
항 6. 상기 표면 당 단백질이 GpIb-IX인 항 5에 기재된 방법.
항 7. 항체의 검출을 항체에 결합된 표지 또는 효소에 기초하여 행하는 것을 특징으로 하는 항 6에 기재된 측정 방법.
항 8. 고정화된 GpIX에 대한 항체에 순환성 미세소포를 결합시킨 후, 상기 미세소포 상의 GpIb를 인식하는 항체를 작용시키는 순서를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 7에 기재된 방법.
항 9. 적어도 알부민, 항-GpIb 표지 항체 및 항-GpIX 항체를 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
항 10. 알부민이 BSA인 항 9에 기재된 키트.
항 11. 항-GpIX 항체를 플레이트에 코팅한 항 9 또는 10에 기재된 키트.
본 명세서에서 환자 혈액 중에 존재하는 미세소포를 「순환성 미세소포」라 부르고, 채혈시 또는 채혈 후에 인위적 조작에 의해 활성화된 혈소판으로부터 방출된 미세소포를 알부민에 대한 친화성 때문에 「점착성 미세소포」라 부른다.
본 발명에서 대상이 되는 혈액 유래 시료란, 혈액 또는 혈액으로부터 제조된 혈액 성분을 포함하는 용액을 가리키고, 혈소판의 제거 조작을 행한 시료가 바람직하다. 구체적으로는 혈장을 들 수 있고, 상기 혈액 분획을 측정상의 관점에서 생리 식염수 또는 완충액 등으로 희석한 용액도 포함한다.
알부민은 인간 또는 인간 이외의 포유 동물 또는 조류 유래 알부민을 가리키고, 인간 이외의 포유 동물로서는, 예를 들면 소, 말, 원숭이, 개, 토끼, 마우스 등을, 조류로서는 닭을 대표예로서 들 수 있다. 특히, 소혈청 알부민(BSA)을 대표예로서 들 수 있고, 이 외에도 인간 혈청 알부민(HSA), 난백 알부민 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, 알부민의 첨가 시기에 대해서는, 측정 전에 혈액 유래 시료에 첨가할 수도 있고, ELISA법을 예로 들면, 플레이트 상에 항체를 고정화시킨 후에 첨가할 수도 있다. 또한, 첨가 형태로서는 특별히 제한은 없지만, 액체 상태로 첨가하는 것이 바람직하고, 미리 생리 식염수 또는 등장 완충액에 용해시킨 후 첨가할 수 있다. 상기 알부민 첨가량으로서는, 최종 농도 5 % 이상인 것이 바람직하고, 예를 들면 최종 농도 5 내지 10 % 정도가 예시된다. 또한, 첨가 후 점착성 미세소포를 알부민에 흡착시키기 위해서 정치 또는 진탕 처리하는 것이 바람직하고, 처리 시간으로서는 1 시간 이상, 적합하게는 4 시간 이상 알부민 처리를 행하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여, 인위적으로 활성화된 혈소판으로부터 방출된 점착성 미세소포는 알부민과 상호 작용하고, 미세소포 막 표면 항원을 이용한 항체에 의한 면역학적 측정 방법에 대하여, 계밖으로 배제되어 순환성 미세소포의 측정에 실질적으로 영향을 주지 않게 된다.
본래의 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포에 대해서는, 상기 알부민 처리에 의해서는 실질적으로 영향을 주지 않고, 통상적인 미세소포의 특성을 이용한 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.
면역학적 측정 방법으로서는, 미세소포의 막 표면의 항원성 분자(에피토프)에 기초하고, 상기 에피토프에 대한 항체를 이용하여 상기 분자를 정량하는 것에 의해 미세소포를 측정ㆍ정량하는 수법이라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, ELISA법, RIA법 또는 응집법을 예시할 수 있다.
본 발명에 의한 바람직한 항체로서는, GpIb-GPIX 복합체 및/또는 개개의 당 단백질 GpIb 및 GpIX를 포함하는 당 단백질에 대한 항체를 들 수 있다. 미세소포 상에 볼 수 있는 다른 혈소판 특이적 당 단백질에는 GpIa-IIa , GpIIb-IIIa 및 GpIIIb가 포함된다.
또한, 순환성 미세소포에 결합하는 항체를 그 자체 표지할 수도 있고, 또는 제2 항체, 예를 들면 마우스 모노클로날 항체(제1 항체)에 특이적으로 결합하는 표지된 항-마우스 면역 글로블린을 이용할 수도 있다. 특히, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 불문하지만, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
사용되는 표지는 신호를 발할 수 있는 임의의 성분, 예를 들면 효소(퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제 등), 발색단, 발형광단(FITC 등), 방사성 동위 원소, 착색 입자, 색소, 콜로이드형 금속 등일 수도 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일양태로서 BSA를 이용한 ELISA법을 예로 들어 이하에 상술한다.
상술한 바와 같이 제조한 혈액 유래 성분을, 미리 항-GpIX 항체를 코팅하여 스킴 밀크 등에 의해 블록킹 조작을 행한 96웰 플레이트의 각 웰 상에, 예를 들면 10 내지 150 ㎕ 첨가하고, 이어서 BSA 용액을 최종 농도 5 % 이상이 되도록 첨가한다. 그 후, 새롭게 발생한 점착성 미세소포를 BSA에 흡착시키기 위해서, 실온 또는 37 ℃에서 예를 들면 1 시간 이상, 바람직하게는 4 시간 이상 진탕하에 배양한다. 그 후, 세정액, 예를 들면 0.02 내지 0.1 % 정도의 트윈(Tween) 20/PBS로 충분히 세정을 행한다. 이어서, 퍼옥시다아제 표지 항-GpIb 항체를 첨가하고, 동일한 세정액으로 충분히 세정 후, 상기 효소에 대한 기질을 첨가하여 발색 조작을 행한다. 이렇게 하여, 순환성 미세소포의 양을 막 표면 에피토프 GpIb-GpIX 복합체에 기초하는 항체를 이용하여, 효소 반응에 의해 발생하는 발색 기질량으로서, 정량하는 것이 가능해진다. 상기 조작을 통해, 인위적 조작에 의해 발생한 점착성 미세소포는 BSA에 포획된 후에는, 상기 일련의 면역 조작을 통해, 사용 항체에는 미반응이 되고, 목적하는 본래 혈액 중에 존재하는 순환성 미세소포만을 측정하는 것이 가능해진다.
또한, 상술한 조작상 사용되는 각종 항체, 시약 등을 포함하는 순환성 미세소포 측정 키트를 제공할 수 있다. 구체적으로는, 인위적 조작에 의해 발생하는 점착성 미세소포를 효율적으로 제거하기 위해서, BSA를 대표로 하는 알부민, 또는 상기 용액, 또한 GpIb 및 GpIX에 대한 항체로 대표되는 미세소포 막 표면 단백질 복합체에 대한 인식 항체(상기 인식 항체는 어느 한쪽 또는 양쪽이 표지화되어 있음), 또한 필요에 따라서 2차 항체, 효소의 기질(표지로서 효소를 사용한 경우) 등이 상기 키트에 포함된다. 예를 들면, 인식 항체가 비오틴 결합 GpIb이면, 상기 측정 키트에는 2차 항체로서 퍼옥시다아제 표지 아비딘을 포함할 수 있다. 또한, 상기 퍼옥시다아제에 대한 기질 등을 포함하는 순환성 미세소포 측정 키트를 제공할 수 있다.
이하의 실시예로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 의해 종래 혈액 처리 조작의 단계에서, 혼재하는 혈소판의 활성화에 의해 방출되는 점착성 미세소포를 알부민으로 전처리함으로써 효율적으로 면역 측정계로부터 제거할 수 있고, 혈액 중에 원래 존재하는 순환성 미세소포를 측정할 수 있는 것으로 판명되었다.
도 1은 인위적으로 활성화시킨 시료, 미세소포의 값이 높은 환자 유래시료 및 정상 시료를 이용한 BSA에 의한 점착성 미세소포의 흡수 시험을 나타낸 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이상의 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 든다. 또한, 이들 실시예는 단순한 예시 목적으로 기재되어 있고, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 방법:
1. 의양성(擬陽性; pseudopositive)(활성화) 시료의 제조
순환성 미세소포(PDMP) 정상값을 나타내는 건강한 정상 성인 남성으로부터 3.8 % 시트르산(시트레이트)으로 채혈한 전혈을 4 ℃의 냉장고에 12 시간 보관하여 신생 PDMP(점착성 미세소포)를 생성시켰다. 냉장 전혈(2 ml)을 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하고, 활성화 시료로 하였다. 활성화 시료는 염수로 x2와 x4배로 희석하여 ELISA 측정을 행하였다.
2. 고가(高値) 검체의 제조
PDMP 고가를 나타내는 피험자(성인 남성)로부터 EDTA/ACD(시트르산-덱스트로스 용액) 채혈(2 ml)을 행하고, 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 실온에서 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하였다. 고가 검체는 염수로 x2와 x4배로 희석하여 ELISA 측정을 행하였다.
3. 정상 검체의 제조
PDMP 정상값을 나타내는 건강한 정상 성인 남성으로부터 EDTA/ACD 채혈(2 ml)을 행하고, 탁상 원심기로써 3000 rpm/20 분 실온에서 원심하여 상청(600 ㎕)을 회수하여 ELISA 측정을 행하였다.
4. ELISA 측정
미세소포 막 표면에 존재하는 당 단백질 중, 혈소판 특이적인 분자인 CD42b(GpIb)와 CD42a(GpIX)에 대한 항체(항 CD42b 항체; NNKY5-5, 항 CD42a 항체; KMP-9)를 이용한 샌드위치 ELISA 측정계를 제조하였다. 항 CD42a 항체를 코팅한 ELISA용 96웰 마이크로타이터 플레이트(코닝사 제조: MaxiSorb)에 활성화 시료 및 고가 검체 50 ㎕를 첨가 후, 각 시료에 50 ㎕의 PBS 및 2.5 %, 5 %, 7.5 %, 10 %의 BSA를 첨가하고, 최종 농도 1.25 %, 2.5 %, 3.75 %, 5 %의 BSA가 첨가된 웰을 제조하였다. 상기 플레이트를 실온에서 진탕하에 4 시간 인큐베이션한 후, 시료를 세정액(0.05 % Tween 20/PBS)으로 세정하였다. 비오틴화한 항 CD42b 항체를 첨가하고, 퍼옥시다아제 표지 아비딘으로 발색시켜 450 nm에서의 흡광도를 이뮤노리더(immunoreader)로 측정하였다(도 1).
결과:
의양성을 나타내는 활성화 시료는, 측정시에 웰에 첨가된 BSA 농도 의존적으로 측정값이 저하되고, 그 값은 BSA의 최종 농도가 5 %일 때 정상 검체에 가깝게까지 내려갔다. 한편, 원래 높은 PDMP값을 나타내는 고가 검체는 BSA의 농도에 관계없이 일정값을 나타내었다. 이들 결과로부터, 채혈 후의 조작에 의해 생기는 신생 PDMP만을, 측정시 최종 농도 5 %의 BSA를 첨가함으로써 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (11)
- 혈액 유래 시료 중에 알부민을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포(microvesicle)의 영향을 배제하기 위한 혈액 유래 시료의 전처리 방법.
- 제1항에 있어서, 알부민이 BSA인 방법.
- 혈액 유래 시료에 알부민을 첨가하여 채혈 후에 발생한 혈액 유래 시료 중의 점착성 미세소포의 영향을 배제하는 공정, 및 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포를 면역학적으로 측정하는 공정을 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포의 면역학적 측정 방법.
- 제3항에 있어서, 순환성 미세소포에 대한 항체를 미세소포에 특이적인 표면 에피토프에 결합시키고, 그 결과 결합된 항체 수준을 측정함으로써 순환성 미세소포의 면역학적 측정을 행하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 표면 에피토프가 순환성 미세소포의 당 단백질 상에 있는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표면 당 단백질이 GpIb-IX인 방법.
- 제6항에 있어서, 항체의 검출을 항체에 결합된 표지 또는 효소에 기초하여 행하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제7항에 있어서, 고정화된 GpIX에 대한 항체에 순환성 미세소포를 결합시킨 후, 상기 미세소포 상의 GpIb를 인식하는 항체를 작용시키는 순서를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 적어도 알부민, 항-GpIb 표지 항체 및 항-GpIX 항체를 포함하는, 혈액 유래 시료 중의 순환성 미세소포 측정 키트.
- 제9항에 있어서, 알부민이 BSA인 키트.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 항-GpIX 항체를 플레이트에 코팅한 키트.
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