DE69200460T2 - Agglutinationskomplex zum Nachweis von Blutgruppen. - Google Patents
Agglutinationskomplex zum Nachweis von Blutgruppen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft einen agglutinierenden Komplex oder Agglutinationskomplex zur Identifikation von Antigenen auf Erythrozyten, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er durch Affinitätskupplungen zwischen einem nicht-agglutinierenden Antikörper des Typs IgG gebildet ist, der für das zu identifizierende Antigen spezifisch ist, einem Protein, das dazu in der Lage ist, sich an mindestens zwei Stellen des Fc-Teils der Antikörper zu binden, und einem Anti-Immunoglobulin-Antikörper und Fragmenten davon gebildet worden ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen agglutinierenden Komplex und ihn enthaltende Reagenzien sowie deren Verwendung für die Identifizierung von Antigenen von Erythrozyten, insbesondere seltenen Antigenen, in einem schnellen Agglutinationstest.
- Im Bereich der Blutgruppenuntersuchung wird ein Reagens oder ein Serumtest als agglutinierend bezeichnet, wenn es bzw. er dazu in der Lage ist, in Salzlösung eine Agglutination von Zellen zu bewirken, die Antigene tragen, welche für den in dem Serumtest enthaltenen Antikörper spezifisch sind. Diese Wirkung wird am häufigsten bei Reagenzien beobachtet, welche Antikörper des Typs IgM enthalten, während im Gegensatz dazu die Antikörper des Typs IgG selbst nach einer gewissen Inkubationsdauer im allgemeinen nicht-agglutinierend sind.
- In diesem Fall und insbesondere bei Membranantigenen, die entweder in geringer Zahl auf jeder Zelle vorliegen oder für die Antikörper wenig zugänglich sind, muß die Agglutination mit Hilfe von Kunstgriffen, wie der Zugabe von proteolytischen Enzymen oder hohen Konzentrationen von Proteinen im Medium oder schließlich durch Verwendung von chemisch modifiziertem IgG, wie es in WO 90/07118 und EP-A-022 669 beschrieben ist, provoziert werden.
- Die Beispiele von auf den Blutzellen vorliegenden Antigenen, die schwierig nachzuweisen sind, sind vielfältig. Für die roten Blutkörperchen kann man die Antigene der Systeme Rhesus (Rh), Lutheran, Kell (K), Duffy, Kidd, Diego und andere nennen.
- Es ist wünschenswert, diese Antigene auch in Notfällen vor einer Blutübertragung, zumindest in den Fällen, bei denen Mehrfachübertragungen vorgenommen werden, und vorjeglicher Organtransplantation oder auch wenn ein Risiko einer Fötus-Mutter-Alloimmunisierung besteht, nachzuweisen. Außerdem besteht ein starkes Interesse für eine schnelle, einfach durchzuführende und wenig kostspielige Technik, wie jene, die es ermöglichen, direkt das Vorliegen einer immunologischen Reaktion als Folge des Auftretens einer Agglutination festzustellen, und zwar unter Verwendung eines agglutinierenden Reagens, welches spezifisch, stabil und kostengünstig ist.
- Es ist bekannt, daß man eine Erythrozyten-Gruppierungsuntersuchung mit verschiedenen einfachen und schnellen Verfahren durchführen kann, die sogar automatisiert werden können, wenn das Reagens agglutinierend ist. Zur Beschreibung dieser Verfahren kann auf das Werk von P. Rouger und C. Salmon in: Techniques de Laboratoire 6, S. 25-26, Hrgb. Masson (1981), verwiesen werden, welches insbesondere Reaktionen auf Opalglasplättchen, Röhrchen oder Mikroplatten beschreibt.
- Die bei diesen Methoden verwendbaren Reagenzien müssen jedoch auf der Grundlage von Antikörpern des Typs IgM aufgebaut sein, da jene des Typs IgG nicht-agglutinierend sind. Darüber hinaus ist festzustellen, daß die derzeit im Handel erhältlichen Reagenzien ausschließlich die ABO- oder Rhesus-Gruppierung ermöglichen, d. h. Systeme, bei denen die polyklonalen Antikörper des Typs IgM beim Menschen in natürlichen Maß in großer Menge vorhanden sind und für die man darüber hinaus monoklonale Antikörper durch Hybridoma-Kultur gewinnen kann.
- Darüber hinaus macht die Gewinnung von polyklonalen Antikörpern des Typs IgM in ausreichender Menge zur Zufriedenstellung der Bedürfnisse der technischen Herstellung eines Reagens zur Blutgruppenbestimmung im Fall von schwierig nachzuweisenden Antigenen es erforderlich, eine freiwillige Immunisierung einer großen Vielzahl von Menschen durchzuführen, um über die entnommenen Blutproben für das Antigen spezifische IgM zu gewinnen, welche darüber hinaus anschließend von sämtlichen anderen vorhandenen IgM getrennt werden müssen, bevor sie verwendet werden können. Diese kostspieligen Maßnahmen müssen stets in reproduzierbarer Weise wiederholt werden, da es für die Mehrzahl dieser Antigene derzeit nicht bekannt ist, wie man monoklonale Antikörper des Typs IgM herstellen könnte.
- Eine Erythrozytengruppierung unter Berücksichtigung von Antigenen, für die nur Antikörper des Typs IgG und damit nichtagglutinierende Reagenzien zur Verfügung stehen, kann nur mit komplizierten Methoden durchgeführt werden, die in dem oben angesprochenen Werk auf S. 33 - 34 und 49 bis 65 beschrieben worden sind, wofür man die Reaktionen auf Opalglasplättchen bei 40ºC in Gegenwart von starken Konzentrationen von Proteinen oder anderen Polymeren, wie Albumin, Reaktionen in Gegenwart von proteolytischen Enzymen, darunter Papain, oder sogenannte Antiglobulin-Reaktionen (Coombs-Test) und analoge Methoden nennen kann.
- Es wurden auch Maßnahmen vorgeschlagen zur Gewinnung eines agglutinierenden Reagens ausgehend von Antikörpern des Typs IgG.
- So ist beispielsweise in Proc. Natl. Acad. Scien., USA74(6), (1977), S. 2531 - 2535 beschrieben, daß die Reduktion von IgG mit 2-Mercaptoethanol das Material agglutinierend macht. Dieses Verfahren bleibt jedoch kompliziert, da es eine chemische Reaktion erforderlich macht und für wenig flexible Antigene oder solche, die auf einer geringen Anzahl der Stellen pro Zelle vorliegen, wie das Antigen K, nicht das erwartete Ergebnis liefert. Darüber hinaus macht das in einem Röhrchen durchgeführte Verfahren es erforderlich, nach einer 2-stündigen Inkubationsdauer eine Untersuchung mit dem Mikroskop durchzuführen.
- In der GB-A-2 103 360 ist ein agglutinierendes Reagens beschrieben, welches aus Antikörpern IgG gebildet ist, die über ihren Fc-Bereich an das Protein A gebunden sind. Die Agglutination ist jedoch auch in diesem Fall nicht augenblicklich und kann nur im Reagenzglas nach einer Inkubationsdauer von 45 Minuten bei 37ºC beobachtet werden. Darüber hinaus ermöglicht das nichthomogene Aussehen des Reagens, welches mit ganzen Bakterien hergestellt wird, keine einfache Anwendung insbesondere in automatisierten Vorrichtungen. Andererseits ergibt das Protein A, wenn es von seiner Bakterienzelle isoliert wird, im Fall von seltenen Antigenen, wie dem Antigen K, keine Agglutinierung.
- Die EP-A-0 321 604 beschreibt einen agglutinierenden Komplex, der zwei Moleküle IgG und einen Anti-IgG-Antikörper enthält zur Identifizierung von Antigenen des Rhesus-Systems.
- Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einer erstenAusführungsform einen agglutinierenden Komplex und ihn enthaltende agglutinierende Reagenzien für die Identifizierung von Erythrozyten-Antigenen mit Hilfe von einfachen und schnellen Agglutinationsmethoden, welche nur mit Antikörpern des Typs IgM bewirkt werden können.
- Der erfindungsgemäße Komplex kann ersichtlich auch bei komplizierteren, jedoch empfindlicheren klassischen Methoden angewandt werden, deren Anwendung manchmal notwendig ist, um zweifelhafte Ergebnisse zu bestätigen.
- Der erfindungsgemäße agglutinierende Komplex ist das Ergebnis von Affinitätskupplungen in einer ersten Stufe zwischen Antikörpern des Typs IgG, die spezifisch für das zu identifizierende oder bestimmende Antigen sind, und Proteinen, die dazu in der Lage sind, sich an mindestens zwei Stellen des Fc-Teils der Antikörper zu binden, und dann in einer zweiten Stufe mit Anti-Immunoglobulin-Antikörpern.
- Die Antikörper des Typs IgG können monoklonal oder polyklonal sein.
- Wenn man monoklonale Antikörper verwendet, werden sie in klassischer Weise ausgehend von Aszitesflüssigkeit oder vorzugsweise geklärten überstehenden Flüssigkeiten von Zellkulturen von geeigneten Hybridomen erhalten. Man findet auf dem Markt monoklonale Antikörper IgG, die für schwierig zu identifizierende Blutgruppen spezifisch sind, während andere in der Literatur beschrieben worden sind. Die polyklonalenAntikörper IgG können aus dem Serum oder dem Plasma von immunisierten Menschen gewonnen werden, beispielsweise mit dem in Vox. Sang. 33, (1977) S. 280 beschriebenen Absorptions-Elutions-Verfahren. Diese Materialien sind allerdings seltener und kostspieliger
- Der erfindungsgemäße Komplex und ihn enthaltende erfindungsgemäße Reagenzien sind besonders geeignet für die Identifizierung von Erythrozyten-Antigenen, die schwierig nachzuweisen sind, und insbesondere jenen der Systeme Kell, Duffy oder Kidd, für die man nur selten Menschen findet, die spontan immunisiert sind und IgM tragen und für die man keine monoklonalen Antikörper des Typs IgM in ausreichender Qualität kennt, um solche Blutzellen zu erkennen.
- Als Proteine, die dazu geeignet sind, sich an den Fc-Teil von Antikörpern zu binden und die mindestens zwei Bindungsstellen aufweisen, um bei der immunologischen Reaktion mit dem nachzuweisenden Antigen die Bildung eines makromolekularen Netzwerks ermöglichen, kann man jene mikrobiologischen Ursprungs nennen, und insbesondere das Protein A von Staphylococcus aureus, das gut bekannt ist, oder jene von Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus pyogenes oder schließlich auch das Protein G von Streptococcus species, welche Proteine zahlreiche Bindungsstellen aufweisen.
- Die natürlichen Proteine oder ihre Fragmente werden vorzugsweise von den Bakterienkörpern isoliert und gereinigt, insbesondere um reproduzierbare Ansätze zu erhalten, sie können jedoch auch rekombinante Proteine sein. Verschiedene Proteine sind im Handel von den Firmen SIGMA oder PIERCE im allgemeinen in gefriergetrockneter Form in den Handel gebracht.
- Der Antiglobulin-Antikörper, d. h. der andere Bestandteil des Komplexes, kann aus sämtlichen Typen von Anti-Immunoglobulin-Antikörpern ausgewählt werden, die polyvalent oder für IgG spezifisch sind. Er kann monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein und mehr oder weniger rein sein. Man kann auch Fragmente, welche die Teile F(ab) oder F(ab')&sub2; enthalten, verwenden. Wenn der gegen das zu identifizierende Antigen gerichtete IgG-Antikörper menschlichen Ursprungs ist, ist auch der Antiglobulin-Antikörper gegen Immunoglobuline menschlichen Ursprungs gerichtet. Es ist in der Tat wesentlich, die gleiche Artspezifität für die beiden Antikörper des Komplexes vorliegen zu haben, da Affinitätsreaktionen zwischen den Spezies möglich sind. Der erfindungsgemäße agglutinierende Komplex kann durch Zugabe des Proteins, welches dazu in der Lage ist, sich an den Fc-Teil des Antikörpers zu binden, zu einer Lösung des gegen das nachzuweisende Antigen gerichteten IgG-Antikörpers in wäßrigem, vorzugsweise auf einen pH-Wert zwischen 5 und 9, noch bevorzugter zwischen 6,5 und 7,5, gepufferten Medium oder in einem im wesentlichen isotonischen Salzmedium, das gegebenenfalls gepuffert ist, hergestellt werden. Die Reaktion ist nach einer Zeitdauer beendet, die insbesondere von den Konzentrationen und der Inkubationstemperatur abhängt, die im allgemeinen zwischen 4ºC und 50ºC, vorzugsweise zwischen 20ºC und 40ºC liegt. Bei Anwendung einer Temperatur in diesem zuletzt erwähnten Temperaturbereich liegt die zur Bildung der Bindungen erforderliche Zeitdauer zwischen 5 Minuten und 1 Stunde.
- Die zu der Lösung des Antikörpers zugesetzte Proteinmenge hängt von der Konzentration der Antikörper ab, jedoch auch von der Dichte der Bindungsstellen für die Antikörper auf dem Protein, da es bevorzugt ist, daß die Antikörper im wesentlichen sämtliche Stellen absättigen. Beispielsweise ist zu bemerken, daß das Verhältnis des Gewichts der Antikörper zum Gewicht des reinen Proteins A oder G im allgemeinen zwischen 3 und 30 und vorzugsweise zwischen 5 und 20 liegt und daß die Konzentration der Antikörper in dem Bindungsmedium vorzugsweise mehr als 50 ug/ml beträgt.
- Die Zugabe von Anti-IgG kann nach Beendigung der ersten Inkubation erfolgen oder später, wenn das Medium bei +4ºC oder besser in gefrorenem Zustand aufbewahrt wird. Wie bei der ersten Stufe hängen das Volumen und die Konzentration der zuzugebenden Antikörper-Lösung insbesondere von der Spezifität des Antikörpers und der angestrebten Empfindlichkeit ab. Beispielsweise kann man für eine Kell- oder Rhesus-Gruppenbestimmung zur Bildung des erfindungsgemäßen Komplexes Mengen von Antikörpern des Typs IgG und des Anti-Immunoglobulins verwenden, die im wesentlichen identisch sind.
- Die Temperatur und die Dauer der zweiten Inkubation zur Bindung der Anti-Antikörper sind nicht kritisch und können innerhalb der gleichen Grenzen variieren, wie sie für die Bindung von Protein und erstem Antikörper angegeben worden sind. Der Fachmann ist dazu in der Lage, sämtliche Parameter zur Herstellung des Komplexes anhand von Vorversuchen zu ermitteln.
- Man kann auch, wenngleich diese Methode nicht bevorzugt ist, eine Mischung der beiden Antikörper und des Proteins in geeigneten Mengenverhältnissen inkubieren, um den agglutinierenden Komplex zu erhalten.
- Die am Ende der Affinitätskupplungen erhaltene Lösung des agglutinierenden Komplexes ist im allgemeinen konzentrierter als jene, die bei den schnellen Routineidentifizierungsverfahren verwendet wird, für welche die Konzentration des IgG-Komplexes in dem Reagens in vorteilhafter Weise im Bereich von 1 bis 50 ug/ml liegt. Darüber hinaus kann man diese Lösung nach ihrer Herstellung bei einer Temperatur unterhalb 10ºC oder aber auch in gefrorenem Zustand bis zu einer späteren Verdünnung aufbewahren oder man kann sie in verdünnter anwendungsbereiter Form bei den gleichen Bedingungen aufbewahren nach der Aufteilung in mehrere Einzeldosierungen. Die geeignete Verdünnung erfolgt im allgemeinen in der Weise, daß man zu dem Herstellungsmedium des Komplexes eine Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9 auf der Grundlage von TRIS oder eines Phosphats zusetzt, der auch wasserlösliche Salze, Aminosäuren sowie Makromoleküle, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, Antikörper-Lösungen zu stabilisieren und Agglutinationsreaktionen zu verstärken, in niedrigen Konzentrationen enthalten, d. h. im allgemeinen in einer Konzentration unterhalb 5 % und in niedrigen Konzentrationen, bei denen sich in dem zu untersuchenden Serum in Gegenwart von IgO keine falschen positiven Ergebnisse einstellen. Als Makromoleküle dieser Art kann man nennen Polyvinylpyrrolidon, neutrale Polysaccharide, wie Dextran, oder Proteine, wie Albumin, die dem Fachmann gut bekannt sind.
- Für eine längere Aufbewahrung gibt man vorzugsweise ein bakteriostatisches Mittel, wie Natriumazid zu.
- Die erfindungsgemäßen Reagenzien und der erfindungsgemäße, agglutinierende Komplex können auch in gefriergetrockneter Form aufbewahrt werden. Diese Materialien werden dann zum Zeitpunkt ihrer Verwendung in destilliertes Wasser oder einen Phosphatsalzpuffer, wie sie auf diesem technischen Gebiet üblich sind, eingebracht.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und Bestimmung von Antigenen auf roten Blutkörperchen, welches darin besteht, die Erythrozyten und den erfindungsgemäßen agglutinierenden Komplex in einem geeigneten Medium in Kontakt zu bringen und zu beobachten, ob eine Agglutination auftritt.
- Die Zusammensetzung des Mediums, in dem die eventuelle Agglutination erfolgt, ist nicht kritisch; jedoch müssen die Zellen darin intakt bleiben, was im allgemeinen die Anwesenheit von Mineralsalzen voraussetzt. Im übrigen hat sich gezeigt, daß die Anwesenheit von Makromolekülen in geringer Menge von weniger als 5 % die Reaktionsgeschwindigkeit verbessert, wobei die Art dieser Makromoleküle und ihre Konzentration von der Art des Antikörpers, des Komplexes, seiner Konzentration und den Verfahrensbedingungen abhängt, wobei der Fachmann jedoch dazu in der Lage ist, sie nach vorausgehenden Untersuchungen auszuwählen.
- Dieses Verfahren wird mit Vorteil für die Erythrozytengruppierung angewandt und insbesondere für den Nachweis der Anwesenheit von Antigenen der Systeme Rh, Duffy, Kidd oder Kell, für welche dieses einfache und schnelle Verfahren Ergebnisse liefert, die äquivalent sind mit jenen der Mehrzahl der derzeit in Laboratorien, Krankenhäusern und Blutspendezentren angewandten Methoden.
- Zur Durchführung der immunologischen Reaktion und zur Beobachtung der Agglutination entweder auf Opalglasplättchen oder im Röhrchen oder auf Mikroplatten kann man irgendeine der bekannten Methoden für die Blutgruppenbestimmung auf der Grundlage von IgM anwenden. Man kann bei einer Temperatur zwischen 10ºC und 37ºC arbeiten, wobei die Raumtemperatur wegen der einfachen Anwendung bevorzugt ist. Dabei beobachtet man die Agglutination sehr schnell im Verlaufe von 1 Minute bis zu einigen Minuten in Abhängigkeit von den angewandten Verfahrensbedingungen, der Affinität der Antikörper, der Art des Antigens und seiner Konzentration in der Probe.
- Im folgenden werden Beispiele von agglutinierenden Komplexen und Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung sowie die Ergebnisse der Durchführung des erfindungsgemäßen Identifikationsverfahrens zur Bestimmung von seltenen Antigenen im Vergleich zu jenen erläutert, die mit agglutinierenden polyklonalen Reagenzien erhalten worden sind, die reich an Antikörpern des Typs IgM sind.
- Die in den Beispielen angewandten verschiedenen Agglutinationsreaktionen wurden wie folgt durchgeführt:
- Man gibt einen Tropfen des Reagens und einen Tropfen des zu untersuchenden Blutkügelchen-Zentrifugenrückstands, den man gegebenenfalls gewaschen hat, auf das Plättchen und vermischt mit einem Glasstab zur Bildung eines Kreises mit einem Durchmesser von 2 cm. Man beobachtet die eventuelle Agglutination nach 2 Minuten.
- Man vermischt einen Tropfen einer 2 %-igen Erythrozyten-Suspension und einen Tropfen des Reagens und beobachtet eventuell gebildete Agglutinate nach einer Sedimentationsdauer von 1 oder 2 Stunden.
- Man gibt einen Tropfen einer Suspension der zu untersuchenden roten Blutkörperchen in physiologischem Serum, die man gegebenenfalls gewaschen hat, in ein Kahn-Röhrchen, welches einen Tropfen des Reagens enthält, und läßt während 15 Minuten bei 37ºC inkubieren, bevor man dreimal mit physiologischem Serum wäscht. Zu dem Dekantierungsrückstand gibt man 1 Tropfen Antiglobulin und zentrifugiert während 1 Minute nach dem erneuten Suspendieren des Zentrifugenrückstands. Man beobachtet anschließend eine eventuelle Agglutination unter schwachem Bewegen des Röhrchens.
- Die Titer und Bewertungen der Reaktionen werden in klassischer Weise berechnet, wie es insbesondere in dem Werk von P. Rouger und C. Salmon, wie es oben bereits genannt worden ist, S. 31 - 32, beschrieben ist.
- Man verdünnt die geklärte überstehende Flüssigkeit einer Zellkultur, die 150 ug/ml eines monoklonalen Anti-Kell-Antikörpers des Typs IgG menschlichen Ursprungs, der gegen das Antigen K gerichtet ist, durch Zugabe eines Phosphatsalzpuffers (mit einem pH-Wert von 7,4) auf eine Antikörperkonzentration von 100 ug/ml. Zu dieser Lösung gibt man ein Volumen einer 10 ug/ml-Lösung des Proteins A, welches von der Firma Sigma unter der Bezeichnung P 6031 vertrieben wird, in dem gleichen Puffer. Man hält diese Mischung während 60 Minuten unter Rühren bei 37ºC und gibt dann 1 Volumen einer Lösung von polyvalentem Antiglobulin zu und rührt während 30 Minuten bei 37ºC, bevor man die Temperatur auf Raumtemperatur, d. h. etwa 20ºC, bringt.
- Das polyvalente Antiglobulin ist ein Reagens, das aus dem Serum von mit menschlichen Immunoglobulinen und menschlichen Komplementen hyperimmunisierten Ziegen gewonnen worden ist, welches mit einem Albumin enthaltenden isotonischen Salzlösungsmittel verdünnt worden ist. Die Eigenschaften dieses Reagens entsprechen den Definitionen des Journal Officiel de la République Française vom 17. März 1984, Rubrik Ministère des Affaires Sociales - caractéristiques et normes des réactifs utilisés en immunohématologie érythrocytaire (Annex 2 - S. 2596) beschrieben sind. Dieses Reagens wird von Diagnostics Transfusion (FR) unter der Bezugsziffer 21120 vertrieben.
- Für die Untersuchungen, deren Ergebnisse im folgenden angegeben sind, wird die in dieser Weise erhaltene Mischung vor der Verwendung von den gleichen Volumen des Phosphatsalzpuffers (pH 7,4), der Glycin (2 %) und Dextran (1 %) enthält, verdünnt worden ist. Das ausgehend von den Seren von hyperimmunen Menschen gewonnene Vergleichsreagens, das mit Makromolekülen angereichert worden ist, wird von Diagnostics Transfusion unter der Bezeichnung 21083 vertrieben.
- - An 200 Proben von Spenderblut, von denen 8 % dafür bekannt sind, daß sie dem Phänotyp K&spplus; entsprechen, konnte man mit dem erfindungsgemäßen Reagens und dem Vergleichsreagens 100 % der positiven Phenotypen ohne jeglichen positiven oder negativen Spiegel feststellen. Im Verlaufe dieser Untersuchung hat sich gezeigt, daß 45 % der mit dem erfindungsgemäßen Reagens erhaltenen Agglutinationsbilder viel klarer waren und 50 % äquivalent waren.
- - Die Dauer der Bildung der ersten Agglutinate mit den beiden Reagenzien war kurz, sie betrug 5 Sekunden für das Produkt dieses Beispiels und 6 Sekunden für das Vergleichsmaterial.
- - Die Titer betrugen 8 bzw. 4 und die Bewertungsziffern 20 und 14 für das Produkt dieses Beispiels bzw. für das Vergleichsbeispiel.
- Wenn das Reagens anstelle des erfindungsgemäßen Komplexes das für seine Herstellung verwendete IgG oder dieses IgG, das lediglich an ein Protein A gebunden ist, verwendet, beobachtet man bei diesen Bedingungen keine Agglutination.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind: Titer Bewertung Reagens des Beispiels 1 Vergleichsreagens 3º) Antiglobulinreaktion: Titer Bewertung Reagens des Beispiels 1 Vergleichsreagens
- Man bereitet ein Reagens nach derVerfahrensweise des Beispiels 1, jedoch unter Ersatz des Proteins A durch das reine handelsübliche Protein G.
- Bei der Reaktion auf dem Opalglasplättchen zeigt das Reagens einen Titer von 8 und eine Bewertungsziffer von 20, während im Reagenzglas sein Titer 128 und seine Bewertungsziffer 52 betragen und bei der Antiglobulinreaktion der Titer 128 und die Bewertungsziffer 56 betragen.
- Man bereitet ein Reagens nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung des Proteins A und eines Antiimmunoglobulins Anti-IgG (H + L), welches gegen schwere und leichte Ketten menschlichen Ursprungs gerichtet ist und im Handel von Biosys France unter der Bezeichnung BI 2015 vertrieben wird.
- Auf dem Opalglasplättchen beträgt der Titer 8 und die Bewertungsziffer 20; im Reagenzglas betragen der Titer 128 und die Bewertungsziffer 49, während bei der Antiglobulinreaktion der Titer 64 und die Bewertungsziffer 46 betragen.
- Man bereitet das Reagens mit einem monoklonalen Antikörper des Typs IgG, der gegen das Antigen D gerichtet ist, ein polyvalentes menschliches Antiimmunoglobulin und das Protein A unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens.
- Ein unter den gleichen Bedingungen lediglich mit dem monoklonalen Ausgangs- Antikörper hergestelltes Reagens zeigt bei der Reaktion auf dem Opalglasplättchen keine Agglutination, während das Reagens des vorliegenden Beispiels einen Titer von 16 und eine Bewertungsziffer von 30 zeigt. Bei der komplexeren Antiglobulinreaktion zeigt der als Ausgangsmaterial eingesetzte monoklonale Antikörper eine Bewertungsziffer, die etwas höher ist als die des Reagens des vorliegenden Beispiels.
Claims (12)
1. Agglutinierender Komplex zur Identifikation von Antigenen auf
Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß er aus nicht-agglutinierenden Antikörpern
des Typs IgG gebildet ist, die für das zu identifizierende Antigen spezifisch sind,
welche man mit Proteinen, die in der Lage sind, sich an mindestens zwei Stellen
des Fc-Teils der Antikörper zu binden, und dann mit
Anti-Immunoglobulin-Antikörpern oder Fragmenten davon umgesetzt hat, wobei die Antikörper und die
Proteine über Affinitätsbindungen gebunden sind.
2. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine aus
Proteinen A und G ausgewählt sind.
3. Komplex nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die beiden Antikörper-Typen die gleiche Art-Spezifität besitzen.
4. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
der Anti-Immunoglobulin-Antikörper für IgG spezifisch ist.
5. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß
der nicht-agglutinierende Antikörper ein Antikörper ist, der Antigene der
Systeme Kell, Duffy oder Kidd erkennt.
6. Komplex nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen
zum Kell-System gehört.
7. Agglutinierendes Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es einen
Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einer 1 bis 50 ug/ml IgG entsprechenden
Konzentraton in einer Salzlösung, die auf einen pH-Wert zwischen 5 und 9
gepuffert ist und 0 bis 5% für Agglutinations-Reagenzien verwendbare Makromoleküle
enthält, umfaßt.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es aus
Polyvinylpyrrolidon, neutralen Polysacchariden und Proteinen ausgewählte
Makromoleküle enthält.
9. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1
bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe für das zu
identifizierende Antigen spezifische nicht-agglutinierende Antikörper und das
ausgewählte Protein unter Bedingungen der Bildung von Affinitäts-Kupplungen
vereinigt und in einer zweiten Stufe das erhaltene gekuppelte Produkt mit
Anti-Immunoglobulin-Antikörpern unter Bedingungen zur Bildung von
Affinitäts-Kupplungen zusammenbringt.
10. Verfahren zur Identifikation von Antigenen auf der Wand von Erythrozyten,
dadurch gekennzeichnet, daß man die zu identifizierenden Erythrozyten mit
einem agglutinierenden Komplex oder Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8
zusammenbringt und eine eventuelle Agglutination beobachtet.
11. Verfahren zur Identifikation von Antigen des Kell-Systems in einer
Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem agglutinierenden
Komplex nach Anspruch 6 oder einem ihn enthaltenden Reagens in Kontakt
bringt und eine eventuelle Agglutination beobachtet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es auf einem Plättchen durchgefühft wird.
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