DE2934757C2 - Zusammensetzung und Verfahren zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G - Google Patents
Zusammensetzung und Verfahren zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-GInfo
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Description
2. Zusammensetzung nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen Stabilisator aus
der Gruppe von Aminosäuren und Dextran enthält.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Latex
vorliegt.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines getrockneten
Latexproduktes vorliegt.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen des synthetischen
Polymerlatex vom Styroltyp einen mittleren Teilchendurchmesser von 0.01 bis 10 μπι besitzen.
6. Verfahren zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G (IgG) im menschlichen Urin oder Serum unter
Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Teilchen eines synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp
und einem als Überzug auf die Teilchen aufgebrachten Human-IgG-Antikörper. gekennzeichnet durch
die Kombination folgender Merkmale:
(a) das Polymerlatexmaterial ist ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren. Styrolcopolymeren und
den carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon;
(b) das Polymerlatexmaterial weist ein spezifisches Gewicht von 1.1 bis 1.4 auf.
(c) die Bestimmung des Humanimmunglobulin-G erfolgt nach einem Mikrotitrationsverfahren.
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G (abgekürzt
Jj IgG). bestehend aus Teilchen eines synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp und einem als Überzug auf die
Teilchen aufgebrachten Human-IgG-Antikörper sowie ein Verfahren zur Bestimmung von IgG unter Verwendung
einer derartigen Zusammensetzung.
Human-lgG ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 und ist in einer Konzentration von
1.1 bis 1.7 g/dl in den Seren von gesunden Menschen enthalten. Es ist als eine der wichtigen Komponenten
bekannt, die einen Hauptfaktor der Humoralimmunität eines Tieres darstellen.
Da der Spiegel oder die Konzentration von Human-lgG im Blut oder Urin bei Hypogammaglobulinämie
(Hypogammagloburinemia) G-Typ-Myeloma. Glomerularerkrankung und dergleichen variiert, ist die Bestimmung
des Human-lgG-Spiegels für die Diagnose sehr wichtig. Das Human-lgG ist ein Protein, welches die
Glomerulo-Basal-Membran kaum durchdringt, jedoch wenn der Grad der Erkrankung der Glomerulo-Basal-Membran
größer ist. sickert das Human-lgG in größerer Menge in den Urin. Demgemäß kann der Grad der
Störung der Glomeruli der Nieren beispielsweise durch Bestimmung der Konzentration des Human-lgG im
Urin erkannt werden. Durch die Bestimmung des Verhältnisses von Albumin/lgG kann dies noch genauer
beurteilt werden. Somit ist das Albumin/IgG-Verhältnis eine wichtige Information für die Diagnose der Funktion
der Glomeruli der Nieren. Aus dem vorstehenden ist klar ersichtlich, daß die Bestimmung von Human-lgG
für die Diagnose von Nierenerkrankungen insbesondere von Glomerulonephritis, das Beobachten und Verfolgen
des klinischen Verlaufes von diesen Erkrankungen, die Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und
für die Prognose wichtig ist.
Die bisher angewendeten Arbeitsweisen zur Bestimmung von Human-lflG erwiesen sich nicht als zufriedenstellend.
Diese bisherigen Arbeitsweisen umfassen z. B. ein Einzeiradiai-Immunodiffusionsverfahren (Single
Radial Immunodiffusion Method), bei welchem man in einer Agarplatte mit einem Gehalt an einem Human-IgG-Antikörper
Vertiefungen vorsieht, eine Versuchsprobe in diese Vertiefungen einfüllt und die Konzentration von
Human-lgG aus einem Ausfällungsband mißt, das mit der Diffusion von dem Human-lgG in der Versuchsprobe
erzeugt wird, die Elektrophorese auf verschiedenen Trägern und ein Verfahren, das ein Aussalzen einer Versuchsprobe
und die nachfolgende Bestimmung des Human-lgG-Spiegels nach einem Kjeldahl-Verfahren um-
bO faßt. \
Das Einzelradial-Immunoglobulin-Verfahren hat eine niedrige Empfindlichkeit und daher den Nachteil, daß es
Human IgG in einer Konzentration unterhalb einer bestimmten Grenze in einer Versuchsprobe nicht mehr
bestimmen kann. Das elektrophoretische Verfahren erfordert eine Konzentration des Human-lgG oberhalb
einer bestimmten Grenze und ferner ist eine kostspielige Einrichtung einschließlich einer Elektrophorese-Ein-
tö richtung und einer Bestimmungseinricluung erforderlich. Das Kjeldahl-Verfahren hat den Nachteil, daß der
Arbeitsgang kompliziert ist.
Insbesondere muß bei der Bestimmung von Human-lgG im Urin der Urin auf das 100- bis lOOOfache
konzentriert werden, wenn diese üblichen Arbeitsweisen angewendet werden, da der Gehalt an Human-lgG im
Urin geriing ist. Hierfür ist ein großer Aufwand an Arbeit und Zeit erforderlich.
Ein weiteres Beispiel einer bisherigen Technik ist eine Arbeitsweise, bei welcher eine passive Umkehr-Hämagglutinaüonsreaktion
(RPHA) zur Anwendung gelangt, womit Human-IgG mit einer äquivalenten Empfindlichkeit
wie bei dem Radioimmunoassay-Verfahren mühelos bestimmt werden kann. Da rote Blutkörperchen
von einem Tier als Träger verwendet wurden, hat diese Arbeitsweise den Nachteil, daß bei der Herstellung der
mit Antiköiper sensibilisierten roten Blutkörperchen, Vorbehandlungen der roten Blutkörperchen wie Fixierung
der ro:en Blutkörperchen und Behandlung der roten Blutkörperchen mit Kupplungsmittel^ z. B. Glutaraldehyd
oder Gerbsäure, erforderlich sind. Da außerdem eine nicht spezifische Reaktion bei der praktischen
Bestimmung häufig auftritt, die einem Antikörper für die als Träger verwendeten roten Blutkörperchen zugeschrieben
w ird, ist es erforderlich, eine Absorptionsbehandlung an den verwendeten roten Blutkörperchen und
einen Konti ollversuch unter Verwendung von gebräunten oder gegerbten Zellen auszuführen.
Die US-PS 30 88 875 beschreibt eine Zusammensetzung zur Bestimmung von immunologisch aktiven Proteinen,
u. a. auch von IgG, bestehend aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp und einem als Überzug
auf die Oberflächen der Latexteilchen aufgebrachten, gegen das zu bestimmende Protein gerichteten Antikörper.
Diese Zusammensetzung wurde in einem komplizierten mühsamen und zeitraubenden Objektträgerverfahren
verwendet (vgl. Spalte 8, Zeilen 52 bis 71). Die gemäß diesem St. d. T. verwendeten Polystyrol-Latexteilchen
mit dem Haadelsnamen »Lytron 615« haben ein spezifisches Gewicht von 1,03.
Bekanntlich muß bei einer quantitativen Bestimmung nach dem Objektträgerverfahren eine Vielzahl von
Proben hergestellt werden, wobei es erforderlich ist. im Hinblick auf die Erzielung von genauen quantitativen
Bestimmun^sergcbnissen gewünschte Konzentrationen in vielen Reihen genau zu kontrollieren. Aus diesem
Grunde wunde <fe Qbjekurägermeihode bisher hauptsächlich für qualitative oder semiquantitative Bestimmungen
verwendet.
Eine brauchbare Zusammensetzung für die Bestimmung des Humanimmunglobulin-G nach einem Mikrotitrationsverfahren
ist bisher nicht beschrieben worden.
Es wurdwi nunmehr Untersuchungen durchgeführt, um ein Mittel zur Bestimmung von Human-IgG zu
schaffen, das von den Mängeln und Nachteilen der gebräuchlichen Arbeitsweisen, wie vorstehend beschrieben,
frei ist und zuverlässige Ergebnisse mit einem hohen Niveau an Genauigkeit liefern kann, wobei ein einfaches
Gerät und eine einfache Bestimmungsarbeitsweise zur Anwendung gelangen können.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer neuen Zusammensetzung zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G,
die eine gute Lagerstabilität besitzt und zur raschen Bestimmung der Konzentration von
Human-IgG in eirsr Versuchsprobe in einem Mikrotitrationsverfahren mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit
und einer guten Reproduzierbarkeit unter Anwendung eines einfachen Meßgerätes und einer einfachen
BestimmunijsweiGe ohne Störung -^urch andere Proteine, die in der Versuchsprobe enthalten sein können,
geeignet ist
[/ Die Lösung dieser Aufgabe erfolg- gemäß der Erfindung bei einer Zusammensetzung zur Bestimmung von
ji- Humanimmunglobulin-G (IgG), bestehend aus Teilchen eines synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp und
ty einem als Überzug auf die Teilchen aufgebrachten Human-lgG-Antikörper. durch die Vereinigung der folgen-
i>! den Merkmale:
ΐ\ (a) das Potymerlatexmaterial ist ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren. Styrolcopolymeren und den
Ä carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon;
in (b) das Polymerlatexmaterial weist ein spezifisches Gewicht von 1,1 bis 1,4 auf;
i« (c) die Zusammensetzung ist für eine Bestimmung des Humanimmunglobulin-G nach einem Mikrotitrations-
jij verfahren vorgesehen.
y
';' Human-IgG ist eine Hauptkomponente des Serumproteins und wird auch im Urin gefunden. Das Ausgangshu-
man-IgG, das zur Herstellung eines Human-IgG-Antikörpers in der Zusammensetzung gemäß der Erfindung
verwendet wird, kann nach an sich bekannten Arbeitsweisen hergestellt werden. Es kann z. B. in gereinigter
Form nach einem gebräuchlichen Verfahren erhalten werden, bei welchem nun eine Äthanolfraktion aus
;i menschlichem Serum mit Trichloressigsäure und Ammoniuvnsulfat behandelt, und durch Ionenaustauschern-
!a matographie oder dergleichen. Im Handel erhältliches Human-IgG kann ebenfalls verwendet werden.
"■ Ein Antikörper gegen das Human-IgG, das unter Anwendung der vorstehend beschriebenen bekannten
'' Arbeitsweise erhalten werden kann, kann hergestellt werden, indem man das IgG als ein Antigen an ein Tier mit
Ci der Fähigkeit zur Erzeugung eines Antikörpers, z. B. Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, in einer gebräuchlichen
Weise zu seiner Immunisierung verabreicht. Blut von dem immunisierten Tier entnimmt, und den
• Humen- IgG-Antikörper aus dem so erhaltenen Blut abtrennt.
:; Das bei diesem Verfahren zur Anwendung gelangende Tier kann irgendein Tier mit der Fähigkeit zur
', Erzeugung von Antikörpern sein. Um jedoch eine große Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung
eines großen Tieres bevorzugt. Üblicherweise sind Kaninchen oder Ziegen geeignet, wobei jedoch das zu
li verwendende Tier nicht darauf beschränkt ist. Die Abtrennung von einem Human-lgG-Antikörper aus dem w
'i-
diesen enthaltenden Antiserum kann unter Anwendung von bekannten Maßnahmen durchgeführt werden.
Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Adsorptions-Eluierung unter Anwendung eines
unlöslichen Antigens wird wiederholt.
Beispiele von für die synthetischen Latexteilchen geeigneten Polymeren oder Copolymeren sind Polystyrol,
carboxyliertes Polystyrol, aminohaltiges carboxyliertes Polystyrol, Styrol/Butadien-Copolymeres. carboxyliertes t>i
Siyrol/Buu.dien-Copolymeres und Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres.
Als Copolymere von Styrol sind z. B. Monomere aus der Gruppe von Chlorstyrol. Methylmethacrylat und
Vinylidenchlorid und carboxylierte oder aminohaltige carboxylierie Produkte hiervon geeignet. Diese syntheti-
sehen Polymerlatexteilchen können nach Vorbehandlung ihrer Oberflächen mit einem nicht ionischen oberflächenaktiven
Mittel verwendet werden. Beispielsweise werden diese Teilchen vorzugsweise verwendet, nachdem
ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxidtyp zur Adsorption daran gebracht wurde. Ein
solches Verfahren ist bekannt, vgl. die japanische Offenlegungsschrift 9716/76. Beispiele für geeignete niciit
ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxidtyp sind ein Blockcopolymeres von Äthylenoxid und Polyo.xypropylenglykol.
Polyoxyäthylenalkyläther und Polyoxyäthyienalkylaryläther.
Die synthetischen Polymerlatexteilchen besitzen vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser von 0.01
bis 10 um. insbesondere 0.1 bis 1 μίτι. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse einer Bestimmung
wird es bevorzugt. Teilchen mit einem relativ engen Bereich der Größenverteilung zu verwenden. Das spezifi-■
o sehe Gewicht der Latexteilchen beträgt erfindungsgemäß 1.1 bis 1.4. vorzugsweise 1.1 bis etwa 1.3.
Gemäß der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Humanimmur.g!obu!in-G (IgG) im
menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Teilchen eines
synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp und einem als Überzug auf die Teilchen aufgebrachten Huroan-lgG-Antikörper
geschaffen, welches gekennzeichnet ist durch die Kombination folgender Merkmale:
(a) das Polymerlatexmaterial ist ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren. Styrolcopolymeren und den
carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon:
(b) das Polymerlatexmateriai weist ein spezifisches Gewicht von 1.1 bis 1.4 auf.
(c) die Bestimmung des Humanimmunglobulin-G erfolgt nach einem Mikrotitrationsverfahren.
:o
:o
Die erfindungsgemäß geschaffene Zusammensetzung kann in einfacher Weise hergestellt werden und kann
nicht nur als Latex, sondern auch als getrocknetes Produkt gelagert werden. Diese Zusammensetzung besitzt
eine überlegene Lagerstabilität und ist ff·.- die rasche Bestimmung der Konzentration von Hum^n-IgG in einer
Versuchsprobe mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit und einer guten Reproduzierbarkeit unter Anwen-
:s dung eines einfachen Meßgerätes und einer einfachen Bestimmungsarbeitsweise ohne Störung durch andere
Proteine, die in der Versuchsprobe enthalten sein können, sehr brauchbar.
Beispielsweise kann die Zusammensetzung hergestellt werden, indem man einen synthetischen Polymerlatex
gemäß der Erfindungsdefinition in einer Konzentration von 0.05 bis 5% mit einem Human-IgG-Aniikörper in
einer Konzentration von 0.0001 bis 1% in einem Puffer bei einem pH-Bereich von etwa 5 bis etwa 10. insbesondere
etwa 6.5 bis etwa 8 bei einer Temperatur von etwa 4 bis etwa 40:C in Berührung bringt Das Inberührungbringen
kann unter sanftem Rühren während etwa 30 min bis etwa 24 h ausgeführt werden.
Der verwendete Puffer kann z. B. eine phosphatgepufferte Salzlösung (M/60 Phosphatpuffer (pH 7.2) mit
einem Gehalt von 0.15 M NaCI. abgekürzt mit PBS) und eine glycingepufferte Salzlösung sein. Erwünschtenfalls
können 0.01 bis 0.1% eines Proteins, z. B. Rinderserumalbumin (abgekürzt mit BSA) bevorzugt einer Antikörperlösung
zugesetzt werden, um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern. Nach der Beschichtungs-
oder Überzugsreaktion wird die Reaktionsmischung mehrmals durch Zentrifugieren in einer neutralen Salzlösung,
z. B. einer glycingepufferten Salzlösung oder PBS gewaschen. Schließlich können die Latexteilchen mit
dem darauf als Überzug aufgebrachten Human-lgG-Antikörper in Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel
gelagert werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die durch den Zusatz von
»o etwa 0.1% von BSA zu einer mit Glycin gepufferten Salzlösung oder von PBS erhalten wurde. Außerdem wird es
bevorzugt.0.01 bis 0.5% Natriumazid (NaN))dem Verdünnungsmittel zuzusetzen.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-lgC gemäß der Erfindung kann, wie vorstehend angegeben,
in Form eines Latex und auch in Form eines getrockneten Produktes vorliegen. Die Zusammensetzung in
Form eines getrockneten Produktes kann erhalten werden, indem man einen Stabilisator, z. B. eine Aminosäure
ij (beispielsweise Glycin oder Natriiimglutamat) oder Dextran dem vorstehend beschriebenen Verdünnungsmittel
zusetzt, die Laiexzusammensetzung mit dem als Überzug aufgebrachten Human-lgG-Antikörper in dem Verdünnungsmittel
suspendiert und die Suspension gefriertrocknet. Die Mengen der Aminosäure und von Dextran
betragen etwa 1.2 bis etwa 4 Gew .-Teile bzw. etwa 1,6 bis etwa 6 Gew .-Teile je I Gew.-Teil der Latexteilchen.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-lgG gemäß der Erfindung besi'zt eine gute Stabilität
sowohl in Form einer Latex-Suspension als auch in Form eines gefriergetrockneten Produkts. Das gefriergetrocknete
Produkt i^ann in stabiler Weise während einer längeren Zeitdauer, z. B. in der Größenordnung von
mehreren Jahren, gelagert werden.
Die Bestimmung von Human-lgG erfolgt erfindungsgemäß nach einem Mikrotitrationsverfahren. Bei diener
Arbeitsweise wird beispielsweise eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend angegebej;
nen An anteilsweise auf eine Mikroplatte gegossen, worauf eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe,
beispielsweise Serum oder Urin, in die erste Vertiefung der Platte eingeführt und allmählich mit einem Verdünnungsmittel
verdünnt wird. Ebenfalls wird eine Verdünnungsreihe in der gleichen Weise unter Verwendung
eines Standardantigens hergestellt. Eine bestimmte Menge von einem mit Human-lgG-Antikörper sensibilisiertem
Latex wird jeder zu bestimmenden Probe zugegeben und damit gemischt. Nach Stehenlassen während einer
do bestimmten Zeitdauer bei Raumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutination beobachtet und die absolute
Menge von IgG kann durch Vergleich mit der Standardantigenreihe bestimmt werden.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von Human-lgG in Form des Latex oder des getrockneten Produktes
ist den Zusammensetzungen überlegen, die durch Überziehen von roten Blutkörperchen oder cintm anderen
Träger mit Human-lgG erhalten wurden, da aufgrund des Fehlens einer Antigenizität des Trägers nicht-spezifio>
sehe Reaktionen flicht stattfinden können.
Ferner kanr, Her Human-lgG-Antikörper als Überzug auf den Latex müh«i!os durch einfaches Vermischen des
Latex mit einer Antikörperlösung ohne Verwend-ing eines Bindemittels aufgebracht werden, wobei diese
Zusammensetzung «ine ausgezeichnete Lagerbeständigkeit besitzt.
Das Verfahren zur Bestimmung von IgG unter Verwendung des mit dem HumanlgG-Antikörper sensibilisierten
Lat^x erlaubt die Bestimmung von mehr als I ng (I χ IO-"" g) von IgG je mi. und kann eine äquivalente
oder ?ine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu derjenigen der Radioimmunoassas Methode erreichen, bei
welcher die höchste Empfindlichkeit unter den gebräuchlichen Analysen angenommen wird.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Herstellungsbeispielen und Arbeitsbeispielen näher erläutert. ;
Herstellungsbeispiel 1
Herstellung von einem Human-lgG-Antikörper
Herstellung von einem Human-lgG-Antikörper
Hiaman-fgG wurde in physiologischer Salzlösung in einer Konzentration von 4 mg je ml gelöst. Die Lösung
wurde mit einer gleichen Menge von vollständigem Freund'schcn Hilfsmittel gemischt. Die Mischung wurde
intramuskulär in einer Menge von 0.2 ml auf 5 Teile jedes von 4 gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von 2.0
bis 2.5 kg injiziert und 3 Wochen später wurde eine Injektion in gleicher Weise vorgenommen. Nach 2 Wochen
wurde 1 ml einer 0.2%igen Human-lgG-Salzlösung intravenös jedem der Kaninchen injiziert. 3 Wochen nach
der letzten Injektion wurde das Gesamtblut aus der Halsschlagader der Kaninchen abgenommen und in üblicher
Weise zentrifugiert. Das so erhaltene Antiserum wurde bei 56 C während 30 min gehalten, wobei etwa 200 ml
Antiserum erhalten wurden. Aufgrund der Tatsache, daß das Antiserum ein einziges Band mit einem Antigen
gemäß einer Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrophorese bildete, wurde festgestellt, daß das erhaltene
Antiserum ein einziger Antikörper war.
Herstellungsbeispiel 2
Herstellung von unlöslichem Human-lgG
Herstellung von unlöslichem Human-lgG
250 mg von Human-lgG wurden in 5 ml eines 0.1 M Phosphatpuffers (pH 7.0) gelöst und 2.5%iger Glutaraldehyd
wurde tropfenweise der IgG-Lösung unter Rühren zugegeben, bis ein gelbliches Gel sich bildete. Die
Mischung wurde während 3 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Ausfällung wurde gesammelt, homogenisiert,
mit PBS gewaschen, dann mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer {pH 2.8) und ferner mit PBS gewaschen und
danach bei unterhalb — 20cC aufbewahrt.
Herstellungsbeispiel 3
Reinigung von einem Human-lgG-Antikörper
Reinigung von einem Human-lgG-Antikörper
Eine gleiche Menge einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde dem Antiserum zugegeben, worauf
gründlich gemischt wurde. Die Mischung wurde während 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die sich
ergebende Ausfällung wurde miiicis Zentrifuge gesarr.iueli. mit 0.5 gesättigter Arnmcniiirrisiilfatlösurig gewaschen
und dann gegen PBS dialysiert. Dann wurde unlösliches Human-lgG dem Dialysat zugegeben und die
Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 min stehengelassen und dann in eine überstehende Flüssigkeit
und eine Ausfällung zentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit wurde erneut unlösliches Human-lgG
zugegeben und die Mischung wurde in gleicher Weise behandelt. Die beiden Ausfäliungen wurden vereinigt, und
mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2.8) zugegeben. Die Mischung wurde während
5 min geschüttelt und zentrifugal aufgetrennt. Die Ausfällung wurde erneut mit dem Glycin-Salzsäure-Puffer
behandelt. Die sich ergebenden überstehenden Flüssigkeiten wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert. wobei
ein gereinigter Antikörper erhalten wurde.
Arbeitsbeispiel 1
Herstellung von einem mit Human-lgG-Antikörper sensibilisierten Latex
Herstellung von einem mit Human-lgG-Antikörper sensibilisierten Latex
Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Industry Co, Ltd.; SDL 59; spezifisches Gewicht 1,14;
Teüchendurchmesser 0,9 um) wurde mit PBS so verdünnt, daß die Konzentration der Teilchen 0,25% erreichte,
und dann wurde eine gleiche Menge eines mit PBS auf das 60fache verdünnten gereinigten Antikörpers
zugegeben. Die Mischung wurde bei 37°C zwei Stunden lang gehalten und dann zentrifugiert Die Latexteilchen
wurden gesammelt, mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel gewaschen. Dann wurden die Latexteilchen
auf eine Konzentration von 0,25% unter Verwendung eines Verdünnungsmittels suspendiert, um einen mit
Human-lgG-Antikörper sensibilisierten Latex zu bilden.
Wenn dem sensibilisierten Latex eine Human-IgG-Lösung zugesetzt wurde, trat eine Agglutination auf. Es
fand jedoch keine Agglutination statt, wenn Albumin-./^-Mikroglobulin-, Immunglobulin-M- und Immunglobu- μ
iin-A-Lösungen jeweils zugegeben wurden.
Das verwendete Verdünnungsmittel war PBS mit einem Gehalt von 0,07% BSA und 0,1 % Natriumazid.
Arbeitsbeispiel 2
Bestimmung von Human-lgG
Bestimmung von Human-lgG
Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0.025 ml wurde jeweils in eine Bohrung einer Mikroplatte vom
V"Typ gegossen und 0,025 ml Serum oder eines mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnten Serums
wurden der ersten Bohrung zugesetzt, und allmählich mit einem Verdünnungsmittel nach einem Serienzweifachver'iunnungsverfahren
verdünnt. Ebenfalls wurden 0,025 ml einer Standardlösung mit einem Gehalt von 0,1 μg
von Human-lgG je ml der ersten Bohrung einer anderen Reihe zugegeben und in ähnlicher Weise verdünnt.
ίο Dann wurden 0,025 ml des mit Human· IgG-Antikörpers sensibilisierten Latex in jede der Bohrungen gegossen
und nach ausreichendem Vermischen vvirde bei Raumtemperatur während mehr als 10 h stehengelassen, um
den Endpunkt der Agglutination zu beobachten. Wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion auftrat, wurden die
Latexteilchen auf der gesamten Oberfläche des Bodens einer Bohrung dispergiert. Wenn keine Antigen-Antikörper-Reaktion
stattfand, sammelten sich die Latexteilchen in der Mitte von jeder Bohrung. Auf diese Weise
kann der Endpunkt einer Agglutination beurteilt werden.
In Übereinstimmung mit der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wurde die Menge von IgG bei 6 auf das
lOOfache verdünnten Urinproben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I: Agglutinationswert von Latex
Nr. Konzen-
1 2 3 4 5 6 7 8 traiion
Standard-lgGKonzeiitration (ng/ml) in der
50 25 12.5 6.25 3,12 1.56 0.78 0,39 Probe
Aggluiinationsmuster
(32 Jahre alt, männlich) + + (- + ----- 2
Gesunder Erwachsener
(43 Jahre alt. männlich) + + + + + --- 4
(43 Jahre alt. männlich) + + + + + --- 4
(22 jähre alt, männlich) + + + + ---- 2
männlich) + + + + + + + + über 32
alt, weiblich) + + + + + + + -16
männlich + + + + + + + -16
Anmerkung:+: positiv;—: negativ
und in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt von 05% Glycin und 0,7% Dextran T-10 (Produkt von
erreichte. Die Suspension wurde dann in üblicher Weise gefriergetrocknet, wobei eine Zusammensetzung von
Ein Verdünnungsmittel wurde der in Arbeitsbeispiel 3 erhaltenen Latexteilchenzusammensetzung mit einer
Empfindlichkeit gegenüber Human-IgG-Antikörper zugegeben. Dann wurde unter Anwendung der gleichen
Arbeitsweise wie in Arbeitsbeispiel 2 die Menge von IgG im Serum und Urin bestimmt Es wurden ähnliche
Ergebnisse erhalten.
Aus den in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daB die Menge von IgG in
dem Urin von an verschiedenen Krankheiten erkrankten Patienten einen offensichtlich höheren Wert zeigte als
derjenige von den Urinproben von gesunden Erwachsenen. Demgemäß ist die Bestimmung der Menge von IgG
im Urin äußerst wertvoll für die Diagnose von diesen Erkrankungen.
Getrennt wurde die Menge von IgG im Urin von Menschen unter Verwendung eines mit einem Human-lgG-Antikörper
sensibilisierten Latex gemessen, der in gleicher Weise wie bei dem Herstellungsbeispiel 3 und den
nachfolgenden Arbeitsbeispielen aus dem Antiserum einer Ziege hergestellt worden war. Die Ergebnisse waren
völlig die gleichen wie in der vorstehenden Tabelle angegeben. ί
Durch die Verwendung des mit Human-IgG-Antikörper sensibiiisierten Latices oder der Zusammensetzung,
die den sensibilisierten Latex enthält, gemäß der Erfindung kann die Menge von !gG innerhalb einer kürzeren
Zeitdauer gemessen werden, wenn eine Probe (menschliches Serum oder menschlicher Urin) in einer sehr
geringen Menge von weniger als 0,03 ml zur Verfügung steht. Die Empfindlichkeit ist äußerst hoch und 1 ng von
IgG kann .ie ml der Versuchsprobe bestimmt werden. Demgemäß gewährt die Zusammensetzung gemäß der io
Erfindung wichtige und wertvolle Informationen für die Diagnose von Hypogammaglobulinemia (Hypogammagloburinemia).
Myeloma vom G-Typ. glomerulare Erkrankung und verschiedene andere Erkrankungen und ihr
Anwendungsbereich ist sehr breit. Bei der Bestimmung von IgG im Urin war es bisher erforderlich, den Urin zu
konzentrieren. Jedoch ermöglicht die Verwendung des mit Human-IgG-Antikörper sensibilisierten Latices
gemäß der Erfindung die Verwendung von Urin ohne dessen Konzentrierung. Somit ist die Zusammensetzung 15
gemäß der Erfindung besonders geeignet für die Bestimmung von IgG im Urin.
Claims (1)
1. Zusammensetzung zur Bestimmung von Humanimmunglobulin-G (IgG), bestehend aus Teilchen eines
synthetischen Polymerlatex vom Styroltyp und einem als Überzug auf die Teilchen aufgebrachten HumanlgG-Antikörper,
gekennzeichnet durch die Vereinigung der folgenden Merkmale:
(a) das Polymerlatexmaterial ist ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren. Styrolcopolymeren und
den carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon:
(b) das Polymerlatexmaterial weist ein spezifisches Gewicht von 1.1 bis 1.4 auf:
(c) die Zusammensetzung ist für eine Bestimmung des Humanimmunglobulin-G nach einem Mikrotitrationsverfahren
vorgesehen.
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