CH627187A5 - - Google Patents

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CH627187A5
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CH1116776A
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Masaru Ishii
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Eisai Co Ltd
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Description

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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung des Antikörpers zum Neo-plasma-Embryo-Antigen (NEA), dadurch gekennzeichnet, dass Tiere mit NEA oder mit einem NEA-NEA-Antikörper-komplex immunisiert werden und dass das entsprechende Antiserum mit dem Antikörper gewonnen wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Kaninchen immunisiert werden.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper aus dem Antiserum mittels Affinitätschromatographie an immobilisiertem NEA rein dargestellt wird, wobei das verwendete NEA mittels einem oder mehreren der folgenden Behandlungsstufen gereinigt worden ist: Chromatographie an einem basischen Anionen-tauscherharz, Affinitätschromatographie an immobilisiertem NEA-Antikörper, Gel-Filtration und Elektrophorese.
4. Antikörper zum Neoplasma-Embryo-Antigen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
5. Antikörper gemäss Patentanspruch 4, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 3.
Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des Antikörpers zum Neoplasma-Embryo-Antigen (NEA).
In jüngster Zeit haben verschiedene Forscher versucht, spezifische Antigene in Neoplasma zu finden. Verschiedene Berichte über solche Antigene sind in der einschlägigen Literatur beschrieben worden. Beispielsweise wurde im primären Tumor von Leberzellen das a-Phetoprotein als Antigen festgestellt. Ebenso das Carcinoembryo-Antigen (CEA) im Adenocarcinom gefunden. Noch eine Anzahl weiterer solcher spezifischer Antigene sind beschrieben worden. All diese Antigene jedoch sind beschränkt auf spezielle Neoplasma von einzelnen inneren Organen, Systemorganen oder von der Morphologie von Krankheitshistologie.
Aus diesem Grunde scheint es ein epochemachender Fortschritt in der Diagnose, der Verhütung und der Behandlung verschiedener menschlicher Neoplasma zu sein, entsprechende Antigene zu finden, welche verschiedenen menschlichen Neoplasmen und der Morphologie von krankhafter Histologie gemeinsam sind, die Antikörper in den genannten Antigenen zu gewinnen und ein Verfahren zur Feststellung von Antigenen mittels der genannten monospezifischen Antikörper zu entwickeln.
Wir haben nun ein neues Neoplasma-Embryo-Antigen (im folgenden als NEA bezeichnet) gefunden. Die Entdek-kung wurde aufgrund von Nachforschungen auf Anwesenheit von Antigenen gemacht, welche sowohl in verschiedenen Neoplasmen vorkommen und auch als Verbindung einander ähnlich sind.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung des Antikörpers zum Neoplasma-Embryo-Antigen (NEA) ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.
Das in dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete NEA ist eine Abkürzung für Neoplasma-Embryo-Antigen. Sowohl der Name wie auch die entsprechende Abkürzung stammen vom Erfinder.
Das NEA ist ein monospezifisches Antigen, welches sowohl dem Embryo wie auch verschiedenen Neoplasmen gemeinsam ist. Das genannte Antigen kann aus verschiedenen Tumorgeweben gewonnen werden. Beispielsweise eignen sich dafür sowohl Gewebe von der Brust, vom Magen, von der Leber und von ähnlichen Organen.
Das in dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete NEA weist die folgenden Eigenschaften nach:
1) Es kann mittels der Ouchterlony-Methode (d.h. durch Gebrauch eines Antikörpers für NEA) nachgewiesen werden, dass NEA sowohl im Gewebe (vor allem Dünn-, aber auch Dickdarm), im Serum, im Ascites wie auch in den Exkrementen von Embryonen vorkommt. Das gleiche NEA kommt aber auch in den Geweben von verschiedenen Neoplasmen (hauptsächlich bösartigen Neoplasmen), aber auch im Serum und im Ascites von Neoplasma-Patienten vor. Das NEA ist aber nicht nachzuweisen in Nichtneoplasma-Geweben von Neoplasma-Patienten, im Serum von gesunden Menschen und im Serum und im Ascites von Nichtneoplasma-Patienten. Zudem kann der NEA-Antikörper weder deaktiviert noch in seiner Aktivität eingeschränkt werden, wenn NEA-Antiserum neutralisiert oder absorbiert wird, wobei dazu Antigene aus Geweben von Nichtneoplasma-Patienten, Serum von gesunden Menschen und Serum von Nichtneoplasma-Patienten verwendet wird. Wiederum mittels der Ouchterlony-Methode kann jedoch gezeigt werden, dass der NEA-Antikörper deaktiviert oder zumindest in seiner Aktivität eingeschränkt wird, wenn das Antiserum der Absorption unterworfen wird, wobei Extrakte von Embryogeweben, Embryoserum, ein Extrakt aus dem Gewebe von irgendeinem bösartigen Neoplasma oder Serum eines Neoplasma-Patienten verwendet werden. Aus den angegebenen Tatsachen wird abgeleitet, dass das NEA ein monospezifisches Antigen ist, welches sowohl dem Embryo wie auch dem Neoplasma zugehört.
2) Wiederum mittels der Ouchterlony-Methode und mittels Immunoelektrophorese kann gezeigt werden, dass NEA mittels Elektrophorese zu y-Globulinteilchen gebracht werden kann. Dazu wird eine Barbitallösung verwendet, welche eine Acetatzellulosemembrane, Pebicon C-870 (Vinylchlorid-Vinylacetatkomplex), Agar-Agar-Gel und Stärke oder ähnliche Substanzen als Trägermedium enthält. Die Barbitallösung selbst weist einen pH von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,025 - 0,1 auf. Die NEA unterscheidet sich darin von den genannten Immunoglobulinen (Immunoglobulin G, A, M, D und E) und anderem y-Giobulin aus dem Serum in bezug auf die Immunologie.
3) Der Photoabsorptionskoeffizient von NEA ist EÇ.1% 280 = 0,936. Die Proteinmenge wurde mittels der Lowry-Methode gemessen, in der das Serumalbumin der Kuh als Standard gewählt worden war.
4) Die Molmasse von NEA wurde mittels Kolonnenchromatographie auf Sephadex G-200 (Handelsmarke der Firma Pharmacia AB) gemessen; sie ergab sich zu lOO'OOO ± 20'000.
5) Wenn NEA, welches in einer Pufferlösung mit der Ionenstärke von 0,05 und dem pH von 7,0 entwickelt worden ist, auf einen basischen Anionen-Tauscher aufgebracht wird, wird es auf dem Ionen-Tauscher nicht absorbiert, sondern mit Immunoglobulin G eluiert.
6) Der isoelektrische Punkt von NEA zeigt einen pH zwischen 9,1 und 9,4.
7) Das NEA fällt aus 2,6 M Ammoniumsulfatlösungen bei pH 7,0 aus.
Wie weiter oben ausgeführt worden ist, stellt das NEA ein monospezifisches Antigen dar. Die Diagnose auf Neoplasma kann daher durch die Bestimmung auf Vorhandensein von NEA im Serum ausgeführt werden.
Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete NEA kann sowohl in der Rohform wie auch in einer gereinigten Form verwendet werden.
Beispielsweise können also verwendet werden: Embryoserum, Embryo-Ascites, Serum von Neoplasma-Patienten,
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Ascites von Neoplasma-Patienten, Extrakte aus Neoplasma-Geweben und Extrakte von Embryoexkrementen. Ebenso können aber auch die entsprechenden raffinierten Produkte verwendet werden. Diese Raffinate können mittels der bekannten Reinigungsverfahren für Proteine erhalten werden.
Diese bekannten und in der Immunologie zur Reinigung von Proteinfraktionen oft verwendeten Methoden umfassen beispielsweise Aussalzmethode, Elektrophorese, Gelfiltration, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie, Trennung mittels Zentrifugieren, Ultrafiltration, Fraktionierung mittels isoelektrischem Punkt, Lösungsmittelfraktionierung mittels organischen Lösungsmitteln, Cohn's Fraktionierung und die modifizierte Spiro-Methode. Die letztere Methode umfasst die Zugabe des NEA-Antikörpers zur NEA-Lösung, wobei ein NEA-NEA-Antikörperkomplex gewonnen werden kann. Aus dem Komplex kann hierauf das NEA isoliert werden. Die gleiche Methode kann aber auch durch Zugabe von Antikörpern zu allen andern Stoffen (Verunreinigung) ausgeführt werden. Dadurch werden die Verunreinigungen entfernt. Selbstverständlich können die oben erwähnten Methoden auch in Kombinationen angewendet werden. Beispielsweise kann der NEA-NEA-Antikörperkomplex dadurch erhalten werden, dass NEA mit NEA-Antikörpern in einer Lösung gemischt wird.
Zur Reinigung des NEA werden hauptsächlich zwei Verfahrensgruppen gewählt. Diese sind (A) affinitätschromato-graphische Methoden und (B) Methoden, welche die Behandlung des Materials mit basischem Anionenaustausch-harz umfassen, und ähnliche. Die beiden Methoden werden im folgenden detailliert beschrieben.
Das NEA oder der NEA-Antikörper wird mit einem Trägermedium kombiniert. Ein solches Trägermedium ist z.B. Cepharose (Handelsmarke der Firma Pharmacia AB), Sephadex (Handelsmarke der Firma Pharmacia AB) und ähnliche Stoffe. Speziell werden solche Kombinationsprodukte dadurch erreicht, dass das genannte Trägermedium, welches zuvor mittels Cyanbromid aktiviert worden ist, zur Lösung von NEA oder des NEA-Antikörpers gegeben wird und die resultierende Mischung bei tiefer Temperatur gerührt wird. Das resultierende Kombinationsprodukt wird als Agent für die Trennung oder als Trennmittel verwendet. Ein Kombinationsprodukt von NEA-Antikörpern und einem Trägermedium wird für die Reinigung von NEA verwendet, eine Kombination von NEA und dem Trägermedium für die Reinigung des NEA-Antikörpers. In der praktischen Ausführung des Verfahrens wird das Kombinationsprodukt von NEA und Trägermedium in eine Kolonne gegeben. Auch das Kombinationsprodukt von NEA-Anti-körper und Trägermedium wird in eine Kolonne gegeben. Die Lösungen, welche das NEA oder den NEA-Antikörper enthalten, und die gereinigt werden sollen, werden auf die Kolonne aufgegeben. Durch diesen Schritt werden nur jeweils entweder das NEA mit dem NEA-Antikörper oder der NEA-Antikörper mit dem NEA reagiert. Dadurch werden die beiden genannten Substanzen jeweils mit dem Trä-germedium kombiniert und bilden so einen Komplex. Die anderen Verbindungen werden wie Verunreinigungen ausgewaschen. Der gebildete NEA-Komplex wird hierauf gelöst, um so das gesuchte NEA oder den NEA-Antikörper zu erhalten. Diese Dissoziation des Komplexes kann z.B. durch Eluieren der Kolonne mit einer 3-5 M-Salzlösung oder mit einer wässrigen Lösung von pH 2-3 geschehen.
Gemäss der beschriebenen Methode zur Reinigung kann das NEA oder der NEA-Antikörper in hoher Reinheit erhalten werden. Dabei muss nicht von Ausgangslösungen mit hoher NEA oder NEA-Antikörperkonzentration ausgegangen werden, auch Ausgangslösungen mit tiefer Konzentration der genannten Verbindungen können verwendet werden. Die geschilderte Methode hat weithin den Vorteil, dass die Trennkolonne für viele Trennvorgänge benutzt werden kann, da sie zwischen den einzelnen Trennungen regeneriert wird.
Als basisches Anionenaustauschharz können verschiedene auf dem Markt erhältliche Produkte verwendet werden. Beispiele dafür sind QAE-Sephadex (Handelsmarke der Firma Pharmacia AB), DEAE-Zellulose (Handelsmarke der Firma Celula Co.), TEAE-Zellulose (Handelsmarke der Firma Celuba Co.) und ähnliche Produkte.
Als NEA-enthaltende Ausgangslösung kann irgendeine flüssige Mischung eingesetzt werden, die NEA enthält. Beispielsweise können dafür verwendet werden: embryonisches Serum, Serum von Neoplasma-Patienten, Epcesis von Neoplasma-Patienten, Gewebeextrakte von Neoplasma-Extirpa-tionen, Exkrementextrakte von Embryonen wie auch teilweise vorgereinigte NEA-Lösungen, welche aus den im voraus genannten Rohsubstanzen mittels Vorreinigung der Proteinfraktionen gewonnen werden.
Das basische Anionenaustauschharz wird in eine Kolonne eingefüllt. Hierauf wird die oben beschriebene, NEA enthaltende Lösung auf die Kolonne aufgegeben. Dadurch kann das NEA gereinigt werden, weil es als einziges durch die Kolonne durchgeht, ohne auf dem Harz absorbiert zu werden. Die genannte Reinigung kann auch im Batch-Verfahren ausgeführt werden. Dabei wird kein Kolonnensystem, wie es oben beschrieben worden ist, benötigt.
Das Antiserum bildet sich, wie gesagt, in den mit NEA oder NEA-NEA-Antikörperkomplex immunisierten Tieren (nicht in Menschen). Das Blut der immunisierten Tiere wird nach einer vorgegebenen Zeitspanne nach der Immunisierung gewonnen. Tiere, welche sich für diese Immunisierung gut eignen, sind z.B. Kaninchen, Ziegen, Pferde und Kühe. Die Immunisierung wird mit Vorteil mit NEA oder mit dem NEA-NEA-Antikörperkomplex ausgeführt, die zuvor mittels Freund-Perfekt-Zusatz («Freund perfect adjuvant») in eine Emulsion umgewandelt worden sind. Wichtig ist auch, dass nicht nur einmal immunisiert wird, sondern verschiedene Male; dadurch wird erreicht, dass Antiserum einen hohen Antikörperwert aufweist.
Zur Trennung des NEA-Antikörpers von allen andern Antikörpern im erhaltenen Antiserum können verschiedene Trennmethoden verwendet werden. Die wichtigsten davon werden im folgenden beschrieben.
— Immuno-Adsorptionsmethode, bei der das Antigen aus dem Serum von gesunden Menschen, dem Ascites und dem Serum von Nichtneoplasma-Patienten oder dem Extrakt von Neoplasma-Gewebe verwendet wird.
— Affinitätschromatographische Methode, bei der das genannte Antigen fixiert wird.
— Affinitätschromatographische Methode, bei der das NEA fixiert wird, und
— eine Methode, bei der das NEA zum Antiserum gegeben wird, worauf der sich dabei bildende NEA-NEA-Anti-körperkomplex abgeschieden wird. Dieser abgeschiedene Komplex kann hierauf mittels bekannter Methoden dissoziiert werden, wodurch der NEA-Antikörper gewonnen werden kann.
Die Diagnose auf Neoplasma (Feststellung der Anwesenheit von NEA) durch Verwendung von NEA-Antikör-pern, welche gemäss den oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurden, kann beispielsweise mittels folgender Methoden geschehen:
1) Ouchterlony-Methode und die entsprechend modifizierte Cohn-Methode,
2) Single radial-Immunodiffusionsmethode (S.R.I.D.),
3) Elektrophorese-Methode (Counter-Elektrophorese, Im-munoelektro-Osmophorese, Immunoelektrodiffusions-
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phorese) (Bei Anwendung dieser Methode muss berücksichtigt werden, dass sowohl das NEA wie auch der NEA-Antikörper leicht zur Bildung von Y-Globulin-fraktionen neigen. Die Verbindungen müssen also dementsprechend carbamyliert werden, so dass sie eher zur Bildung von Albuminen neigen. Trotz dieser Carb-amylierung zeigen jedoch weder das NEA noch der NEA-Antikörper irgendwelche Deaktivierung in ihrer immunologischen Aktivität als Antikörper oder Antigen.),
4) Radioimmunoprüfung (RIA),
5) Enzymimmunoprüfung (ELISA),
6) Bakteriophag-Methode,
7) komplementäre Fixationsmethode (CF),
8) Hämaglutinierungsmethode (PHA, RPHA) oder
9) Immunohaft-Hämaglutination (IA).
Irgendeine der genannten Methoden kann für die eigentliche Diagnose auf Neoplasma verwendet werden.
Im folgenden wird nun eine detaillierte Darlegung des Prozesses für die Produktion des Diagnosereagenz auf Neoplasma beschrieben, welches für die Diagnose mittels Elektrophoresemethoden gemäss Punkt 3 der obigen Liste verwendet werden kann.
Die Immunoelektro-Osmophorese beruht auf folgendem Prinzip: In einer Agar-Agar-Platte werden zwei Öffnungen vorbereitet. In eine dieser Öffnungen, die nachträglich als Anode benutzt wird, wird Antiserum injiziert. In die andere Öffnung, welche nachher als Kathode Verwendung findet, wird Antigen injiziert. Nun wird zwischen den beiden Öffnungen eine elektrische Spannung angelegt, welche einen Stromfluss zu Folge hat. Dieser Stromfluss wird eine bestimmte Zeit lang aufrechterhalten. Das Antigen wird dabei einer Phorese gegen die Anode unterworfen, der Antikörper einer entsprechenden elektrischen Osmose gegen die Kathode. Die beiden Verbindungen treffen sich irgendwo zwischen den beiden Elektroden und bilden nun dort die sogenannte Fällungsreaktionslinie, welche im Gel gut sichtbar ist. Für allfällige Details dieser Methode verweisen wir auf die Biochim. Biophys. Acta, 34: 258, 1959. Diese Methode hat den grossen Vorteil, dass das Resultat innerhalb relativ kurzer Zeit ersichtlich ist. Ebenso ist die Empfindlichkeit der Methode relativ gross. Um die Anwesenheit des Antigens oder des Antikörpers jedoch eindeutig feststellen zu können, ist es nötig, dass die genannten Körper bei Anlegen der elektrischen Spannung gegensätzlich bewegt werden. Da aber das NEA in der Elektrophorese gegen die Kathode bewegt wird und der NEA-Antikörper unter den genannten Bedingungen in die gleiche Richtung sich bewegt, kann das NEA neben dem NEA-Antikörper durch die genannte Methode nicht festgestellt werden. Um die genannte Methode jedoch trotzdem anwenden zu können, muss entweder das NEA oder der NEA-Antikörper chemisch so geändert werden, dass er in der Elektrophorese gegen die Anode hin bewegt wird. Der andere Reaktionsteilnehmer in der Fällungsreaktion muss in seinem normalen Zustand beibehalten werden, d.h. er muss sich in der Elektrophorese weiterhin gegen die Kathode bewegen.
Dies wird dadurch erreicht, dass der NEA-Antikörper carbamyliert wird. Dadurch wird erreicht, dass der NEA-Antikörper seine Eigenschaften ändert und während der Elektrophorese eindeutig und leicht sich gegen die Anode bewegt. Um nun den beschriebenen Vorteil bei der Feststellung auf Anwesenheit von Antigen in einem Serum praktisch ausnützen zu können, ist es klar, dass der Einsatz von carbamyliertem Antikörper leichter und in Praxis einfacher ist, als wenn das Antigen im entsprechenden Serum zuerst carbamyliert werden muss, um es im beschriebenen Text einzusetzen. Die Carbamylierung des NEA-Antikörpers kann z.B. dadurch geschehen, dass der NEA-Antikör-
per in eine wässrige Kaliumcyanatlösung gegeben wird, die Mischung eine gewisse Zeit lang inkubiert wird und anschliessend die gleiche Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt wird.
Der carbamylierte NEA-Antikörper gemäss dieser Methode weist gleiche Antikörperaktivität auf wie vor der Umsetzung. Auch nach vier Monaten bei 4°C weist der carbamylierte NEA-Antikörper die gleiche Aktivität auf, wie er vor dem Lagern zeigte.
Die eigentliche Feststellung der Anwesenheit von NEA im Serum eines Patienten, d.h. die praktische Diagnose auf Neoplasma, kann nun mittels Immunoelektro-Osmophorese durch Verwendung des carbamylierten NEA-Antikörpers geschehen.
Im folgenden wird nun eine detailierte Darlegung des Verfahrens zur Bereitstellung eines Diagnosereagenz auf Neoplasma gegeben, welches in der Diagnose nach der Hä-maglutinationsmethode (PHA oder RPHA), Punkt 8 der obigen Liste, eingesetzt werden kann.
Gemäss dieser Methode wird das NEA oder der NEA-Antikörper mit einer Substanz aus feinen Teilchen kombiniert. Beispiele solcher feiner Teilchen, welche in dieser Methode verwendet werden können, sind diejenigen Teilchen, welche normalerweise in PHA-Methoden oder RPHA-Methoden eingesetzt werden. Speziell vorzuziehende Teilchen sind Blutzellen von Säugetieren und von Vögeln. Es können aber auch feine Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 1-10 |J.m verwendet werden, wie z.B. Polystyrollatex, Polyesterlatex, Vinylchlorid, Bentonit, Glas-kügelchen und ähnliche Substanzen.
Das darin verwendete NEA kann durch Reinigung der weiter oben beschriebenen NEA-enthaltenden, flüssigen Mischungen erhalten werden. Diese Reinigung kann mittels konventioneller Methoden für die fraktionierte Reinigung von Proteinen ausgeführt werden.
Für die Kombination von NEA oder von NEA-Antikörpern mit den kleinen Teilchen kann irgendein dafür bekanntes Reagenz verwendet werden. Als Beispiele können folgende Verbindungen aufgezählt werden: Glutalaldehyd, Formaldehyd, Tanninsäure, bis-diazotiertes Benzidin, Chromchlorid, Carbodiimid und ähnliche Verbindungen.
Im folgenden wird nun ein allgemeines Verfahren für die Herstellung des Diagnose-Reagenz beschrieben, worin Erythrocyten von Schafen verwendet werden.
Erythrocyten von Schafen werden in einer phosphat-haltigen, physiologischen Salzpufferlösung in Suspension gebracht, so dass sie in einer Konzentration von ungefähr 5 % vorliegen.
Zur Suspension wird hierauf ein Fünftel ihres Volumens Glutalaldehyd-Lösung gegeben, welche im voraus zubereitet worden ist. Dadurch ergibt sich eine physiologische Salzpufferlösung, welche 1 - 5 % Phosphat enthält. Die erhaltene Lösung wird hierauf 3-7 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird das erhaltene Produkt mit einer physiologischen, wässrigen Salzlösung gewaschen, in eine frische, phosphathaltige physiologische Salzpufferlösung gegeben, so dass schliesslich eine Lösung mit 5 % Glutalaldehyd-Schafserythrocyten erhalten wird. Zu dieser Mischung wird hierauf eine äquivalente Menge von 0,001 - 0,02% Tanninsäurelösung gegeben. Nachdem die Mischung 5-20 Minuten lang anschliessend gerührt worden ist, wird sie wiederum mit einer wässrigen, physiologischen Salzlösung gewaschen. Zum erhaltenen Produkt wird wiederum eine physiologische Salzpufferlösung mit Phosphat gegeben, um schliesslich die 5% ige, mit Aldehyd und Tanninsäure behandelten Schafserythrocyten zu erhalten. Um nun die so präparierten Erythrocyten mit dem NEA-Antikörper zu kombinieren, werden zu den Erythrocyten 5 [ig
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bis lmg/mi des gereinigten NEA-Antikörpers gegeben. Diese Menge entspricht dem Äquivalent der Erythrocyten. Die Mischung wird bei Raumtemperatur anschliessend 10 - 60 Minuten lang gerührt.
Im folgenden wird nun eine Methode zur Feststellung der Anwesenheit von NEA in einem Serum illustriert, welche das NEA oder den NEA-Antikörper, mit feinen Partikeln kombiniert, wie es oben beschrieben ist, benutzt.
Beim Mischen von Konglomerat aus NEA-Antikörpern und feinen Teilchen und dem Serum, in dem auf Anwesenheit von NEA-geprüft werden soll, reagiert das NEA bei Anwesenheit mit dem NEA-Antikörper zu einem Glutinat. Als Resultat der Untersuchung können am Boden des Reagenzrohres ausgefallene Substanzen oder ein Sediment festgestellt werden, welches durch die verschiedenen Glutinat-bildungen der Reaktionspartner in der üblichen oder spontanen Sedimentation entsteht. Wenn das Serum kein NEA enthält, oder wenn die Konzentration des NEA unter der Erfassungsgrenze der angegebenen Methode liegt, werden die NEA-Antikörper-Teilchenkonglomerate spontan ausgefällt. In diesem Fall kann dann unten im Reagenzglas ein ringähnlicher Niederschlag beobachtet werden. Bei der Zugabe von NEA-Partikelkonglomeraten wird die gleiche Glu-tination, wie sie oben beschrieben worden ist, auch bei Anwesenheit des NEA-Antikörpers festgestellt. Bei Anwesenheit von freiem NEA wird dieser Vorgang jedoch verhindert. Falls also freies NEA im Serum nachzuweisen ist,
muss der Lösung zuerst eine genügend grosse Menge NEA-Antikörper zugesetzt werden. Bei der nachträglichen Zuset-zung des Konglomerates aus NEA und feinen Partikeln kann dann beobachtet werden, ob die Glutination erfolgt oder nicht.
Mit den oben ausführlich beschriebenen zwei Diagnosemethoden sind verschiedene klinische Tests ausgeführt worden.
Als Resultat von Diagnosen auf Neoplasma mittels der Ouchterlony-Methode und unter Verwendung von NEA-Antikörper wurden 84 Tumor-Patienten untersucht. 27 davon zeigten positives Testresultat. Die untersuchten Patienten litten an Tumoren in ganz verschiedenen Organen: Magen, Kolon, Rektum, Pankreas, Leber, Uterus, Eierstöcken, Brust und Blut (Leukämie und Lymphosarcoma). Demgegenüber wurde in 111 Untersuchungen von gesunden Menschen kein einziger positiver Befund festgestellt. Bei diesen gesunden Menschen wurde das Serum geprüft. Bei Anwendung der zweiten Diagnose-Methode (Single radial-Immunodiffusions-methode S.I.R.D.) wiesen von 98 Tumor-Patienten deren 38 ein positives Testresultat und von 141 gesunden Patienten ein einziger ein positives Resultat auf.
Da bekannterweise die Ouchterlony-Methode und die S.R.I.D.-Methode relativ tiefe Empfindlichkeiten aufweisen, ist es anzunehmen, dass durch Anwendung von genaueren Methoden mit tieferen Erfassungsgrenzen die Effizienz der Diagnose stark gesteigert werden kann.
Im folgenden wird nun das Diagnosereagenz auf Neoplasma geschildert, welches zur Feststellung der Anwesenheit von NEA und somit zur Diagnose auf Neoplasma mittels der Elektroimmunodiffusionsmethode (Rauler-Methode) verwendet wird.
Gemäss dieser Methode wird der NEA-Antikörper zusammen mit einem Trägermedium aufgelöst, und die Lösung wird erstarren gelassen, um so die notwendigen Untersu-chungsplättchen zu erhalten.
Als Trägermedium können die für solche und ähnliche Verfahren bekannten Medien verwendet werden. Sie sind auch schon weiter oben in der «Single radial»-Immunodif-fusionsmethode beschrieben worden. Beispiele solcher Medien sind: Agar Agar, Agarose, Stärke, Polyacrylamid-Gel und ähnliche.
Solche Gel-Plättchen können mittels konventioneller Methoden hergestellt werden. Sie dienen im weiteren als Träger des NEA-Antikörpers. Beispielsweise wird die Trägersubstanz unter Erhitzen in eine Pufferlösung aufgelöst, zur Lösung wird anschliessend der NEA-Antikörper gegeben, und das Ganze wird gut gemischt. Die erhaltene Lösung wird auf eine Glasplatte oder in einem Kunststoffbehälter ausgebreitet und abgekühlt. Dabei verfestigt sich die Lösung, und die gesuchte Testplatte wird so erhalten.
Beim Diagnostizieren unter Verwendung der gemäss oben beschriebenem Verfahren erhaltenen Gel-Platten wird in die Gel-Platte eine Öffnung gemacht. In diese Öffnung wird anschliessend das Serum des Patienten injiziert.
Gemäss den Angaben in der «Single radial» -Immuno-diffusionsmethode wird nun die Platte eine gewisse Zeit lang stehengelassen. Nach dieser Zeit wird untersucht, ob ein Fällungs- oder Sedimentationsring um die Öffnung erscheint. Gemäss der Immunoelektrodiffusionsmethode kann auch eine elektrische Spannung angelegt werden, wodurch das Serum in eine bestimmte Richtung bewegt wird und sich die Fällung oder die Sedimentation als ein Band ausbildet.
Nach Beobachtung des beschriebenen Sedimentationsrings oder -bandes kann gefolgert werden, dass im Serum NEA vorliegt, dass also der Patient ein Neoplasma hat.
Im folgenden wird nun ein Reagenz detailliert beschrieben, welches zur Feststellung, ob NEA vorliegt oder nicht, gebraucht werden kann, d.h. welches zur Diagnose von Neoplasma gemäss der Radioimmunoprüfung (RIA), wie sie oben unter Punkt 4 angegeben worden ist, verwendet werden kann.
Das genannte Reagenz dieser Methode wird hergestellt, indem auf das NEA oder auf den NEA-Antikörper ein radioaktives Isotop aufgebracht wird. Das Einführen von Isotopen in die genannten Körper kann mittels der bekannten Methoden geschehen. Beispielsweise kann dazu die Chlor-amin-T-Methode oder die Peroxidase-Methode unter Verwendung von 125I oder mI angewandt werden.
Um auf Anwesenheit von NEA mittels der oben angegebenen Reagenzien in der RIA-Methode zu prüfen, können verschiedene konventionelle Methoden verwendet werden. Beispiele solcher Methoden sind die Doppelantikörpermethode, die Feststoffphasenmethode und ähnliche.
Wie weiter oben angegeben worden ist, kann mittels der Ouchterlony-Methode das NEA in menschlichen Sera nicht direkt bestimmt werden. Das NEA kann aber mittels der RIA-Methode in den genannten Flüssigkeiten direkt bestimmt werden. Der Konzentrationswert ist relativ tiefer als derjenige im Serum von Neoplasma-Patienten. Die Diagnose auf Neoplasma kann daher so ausgeführt werden,
dass die Konzentrationswerte von NEA im Serum als Indikationsstandard verwendet werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Antikörper können folgendermassen verwendet werden:
A) Ein Reagenz mit NEA-Antikörpern kann zur Diagnose von verschiedenen Neoplasmen angewendet werden.
B) Die Diagnose kann an einem kleinen Serum-Muster ausgeführt werden.
C) Es ist möglich, mit der angegebenen Methode viele Früherfassungstests auf Neoplasma auszuführen und auch den Fortschritt im Wachstum von Neoplasma zu beobachten.
Im folgenden wird die Teilreinigung von NEA aus einem Krebsgewebe erläutert.
Aus einem Brustkrebs entnommenem und tiefgefrorenem Gewebe wurden 100 g in kleine Würfel geschnitten. In einer Homogenisieranlage wurde zum Gewebe lOmal sein Volu5
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men physiologische, wässrige Salzlösung gegeben. Die Mischung wurde hierauf bei 4°C homogenisiert. Dies dauerte ungefähr 10 Minuten. Zur Mischung wurde die gleiche Menge wässrige physiologische Salzlösung gegeben, welche 0,05 % Natriumnitrid enthielt. Die so erhaltene Mischung wurde 48 Stunden lang bei 4°C gerührt. Das extrahierte Protein wurde darauf mittels Zentrifugierens der Mischimg bei 5000 g gewonnen. Die Zentrifugierung dauerte 30 Minuten. Von der zentrifugierten Lösung wurde vorerst die oberste fetthaltige Schicht entfernt und hierauf die über dem Feststoff liegende Lösung gewonnen. Die Lösung wurde noch einmal 30 Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert. Ein zweites Mal wurde die oberste Fettschicht entfernt und die über dem abgesetzten Feststoff sich befindende Lösung gewonnen. Diese Lösung wurde hierauf in ein Rohr aus Zellulose zum Zweck der Dialyse gegeben. Bei diesem Vorgang wurde das Volumen der Lösung auf ungefähr den 20. Teil des ursprünglichen Wertes reduziert. Dies geschah in der Lösung von Polyäthylenglycol mit einer mittleren Molmasse von ungefähr 15'000. Die konzentrierte Proteinlösung wies eine Proteinkonzentration von 73 mg/ml auf. Bestimmt wurde diese Konzentration mittels der Lowry Folim-Methode. 3 ml dieser konzentrierten Lösung wurden hierauf der Gel-Filtration unterworfen. Die Filtration ging in einer Pufferlösung von Barbital vor sich, welche einen pH von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,05 aufwies. Die Kolonnenmasse waren 2,6 cm Durchmesser und 70 cm Länge (Kapazität 460 ml). Die Kolonne war im voraus mit Sephadex G-200 gefüllt. Das Eluat wurde fraktioniert.
Beim Eluieren zeigten sich vier Pieks bei der Wellenlänge von 280 mp, im Spektrophotometer. Der erste der vier Pieks weist auf eine Fraktion mit Proteinen von mehr als 19S hin. Er umfasst u.a. a2-Makroglobulin, Immunoglobulin M, ß-Lipoprotein und ähnliche Verbindungen. Der zweite Piek umfasst die Fraktion mit 7S-Globulinen. Diese enthält u.a. das Immunoglobulin. Der dritte Piek ist die Fraktion mit 4,5S und umfasst das Albumin. Der vierte Piek ist eine Fraktion von Verbindungen mit noch kleineren Molmassen.
Das NEA wurde aus der Zwischenfraktion zwischen der zweiten und der dritten eluiert. Mit diesem Vorgehen wurden ungefähr um 90% vom NEA mit der Fraktion der Molmassen zwischen 120'000 und 80'000 eluiert. Die Eluäte zwischen den zweiten und den dritten Pieks wurden gesammelt und bildeten die NEA-Rohfraktion. Die gesammelten Roh-NEA-Fraktionen wurden mittels Membranultrafiltration auf ungefähr den 10. Teil des ursprünglichen Gewebevolumens konzentriert. Die dabei verwendeten Ultra-filtrationsmembranen filtrierten Verbindungen mit Molmassen bis unter lO'OOO aus. Zur Elektrophorese der so filtrierten NEA-Lösung wurde ein Tank von 33 cm Länge, 8 cm Breite und 2 cm Tiefe mit Pebicon C-870 als Trägersubstanz gefüllt. Unter Verwendung einer Barbitalpuffer-lösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 wurden 5 ml der konzentrierten Roh-NEA-Fraktion in den Mustergraben der Trägersubstanz injiziert. Diese Öffnung befand sich 10 cm von der Kathode des genannten Elektrophoresetanks entfernt. Die Lösung wurde hierauf 16 Stunden lang der Elektrophorese bei 80 m A Stromstärke unterworfen. Nach Ablauf dieser Zeit befindet sich das NEA zwischen 3 und 7 cm von der Mustergrube entfernt gegen die Kathode. Das Trägersubstanzband, welches das NEA hält, wurde hierauf herausgeschnitten und zu 100 ml einer Pufferlösung gegeben. Diese Lösung enthielt eine wässrige, physiologische Salzlösung mit 0,05 m Phosphat und wies einen pH von 7,5 auf. Das ganze wurde gerührt. Nach dem Rühren wurde das Gemisch 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert und die über dem abgeschiedenen Feststoff liegende Flüssigkeit gesammelt. Nachdem noch einmal 100 ml der genannten Pufferlösung zur entnommenen, gereinigten Lösung gegeben worden war, wurde wiederum zentrifugiert und auf die gleiche Art und Weise getrennt. Um aus der so erhaltenen Lösung das Pebicon C-870 zu entfernen, wur-5 den die gesammelten Lösungen über Glasfilter filtriert. Ungefähr 200 ml des Filtrâtes wurden mittels eines Proteinfilters (Karl Schleicher GmbH, Ultrahülsen No. 100, filterbare Molmasse 25'000) auf 5 ml konzentriert. Das gleiche Vorgehen wurde 5mal wiederholt, und die resultierendé io konzentrierte und reine Lösung wurde bei 4°C gelagert. Die Elektromobilität des erhaltenen NEA war beinahe dieselbe wie diejenige von Immunoglobulin G. In den so erhaltenen Konzentraten befinden sich Immunoglobuline G und A als unreine Proteine, wie durch die Ouchterlony-Testmethode 15 und durch die Immunoelektrophorese-Methode nachgewiesen werden kann.
Gemäss der beschriebenen Methode können ungefähr 50% des ursprünglich im ersten Extrakt vorliegenden NEA gewonnen werden. Der Reinigungsgrad entspricht ungefähr 20 einem Faktor von 100.
Die Teilreinigung von NEA aus Ascites von Tumor-Patienten geschieht folgendermassen:
Mittels einer Ultrafiltrationmembrane (filtrierbare Molmasse ungefähr 15'000) wurden 2 Liter von Ascites eines 25 Patienten, welcher an Magenkrebs litt, auf 500 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde 30 Minuten lang bei 20'000 g zentrifugiert. Anschliessend wurde die über dem abgesetzten Feststoff liegende Flüssigkeit gewonnen. Zu dieser Flüssigkeit wurde soviel physiologische Salzpufferlösung mit einem 30 pH von 7,5 und 0,05 m Phosphat gegeben, bis das gesamte Volumen der Lösungen ein Liter betrug. Der Proteinanteil an den gemischten Lösungen war ungefähr 3 %. Nun wurde der Lösung festes Ammoniumsulfat zugegeben, bis eine totale Ammoniumsulfatkonzentration von 1,5 m erreicht 35 wurde. Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Anschliessend liess man diese Lösung 60 Minuten stehen, worauf sie 30 Minuten lang bei lO'OOO U/min zentrifugiert wurde. Die Flüssigkeit über dem abgesetzten Feststoff wurde wiederum gewonnen. 40 Zu dieser Lösung wurde eine andere Ammoniumsulfatlösung gegeben, so dass eine 2,6 m Ammoniumsulfatlösung erhalten wurde. Nach 60 Minuten Stehenlassen wurde die Lösung 30 Minuten lang bei lO'OOO U/min zentrifugiert. Über 60% des NEA wurden im ausgefallenen Feststoff gewonnen. 45 Der ausgefallene Feststoff wurde in einer Barbitalpuffer-lösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 gelöst. Das totale Volumen dieser Lösung betrug 200 ml.
Diese Lösung wurde nun der Gel-Filtration über Sephadex G-50 (Handelsmarke der Firma Pharmacia AB) un-50 terworfen. Dazu wurde die gleiche Pufferlösung gebraucht wie oben beschrieben. Aus der zuerst eluierten Proteinfraktion wurde vorerst das Ammoniumsulfat entfernt, worauf das Barbital gepuffert wurde. Die Ammoniumsulfatfraktion wurde so eingestellt, dass sie ungefähr 70 mg/ml Protein 55 enthielt. 5 ml dieser Lösung wurden hierauf der Elektrophorese unterworfen. Das Vorgehen bei dieser Elektrophorese war folgende:
In einen Elektrophoresetank von 33 cm Länge, 8 cm Breite und 2 cm Tiefe wurde Pepicon C-870 (Handelsmarke) 60 als Trägersubstanz eingefüllt. In die Probeöffnung der genannten Trägersubstanz wurde hierauf die Ammoniumsulfatfraktion, welche oben beschrieben worden ist, injiziert. Diese Ammoniumsulfatfraktion war vorher mittels Barbitalpuffer-lösung auf pH 8,6 und auf eine lonenstärke von 0,05 ein-65 gestellt worden. 5 ml der erwähnten Lösung wurden in die Probeöffnung gegeben, welche ungefähr 10 cm von der Tankkathode entfernt war. Hierauf wurde die Elektrophorese durchgeführt mittels elektrischem Gleichstrom von 80 mA.
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Die Dauer der Elektrophorese betrug 16 Stunden. Nachher wurde der Streifen von 3 - 7 cm Abstand von der Probeöffnung aus der Trägersubstanz herausgeschnitten. Dieser wurde zerkleinert und in 100 ml einer physiologischen Salzpufferlösung mit 0,05 m Phosphat und einem pH von 7,5 gegeben. Die Mischung wurde gerührt und hierauf 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Die über dem Feststoff liegende Flüssigkeit wurde abgeschieden und zu 100 ml der gleichen Pufferlösung zugesetzt, wie sie oben beschrieben ist. Die Mischung wurde gerührt und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Die daraus gewonnene flüssige Phase wurde über ein Glasfilter filtriert. Das Filtrat wurde anschliessend über eine Proteinmembrane auf 2,5 ml konzentriert. Diese 2,5 ml Konzentrat wurden hierauf der Gel-Filtration unterworfen. Die Kolonne hatte einen Durchmesser von 2,6 cm und eine Höhe von 90 cm, was einer Austauschkapazität von 460 ml entspricht. Die Kolonne war mit Sephadex G-200 gefüllt. Die aufgegebene Lösung war eine Pufferlösung von pH 7,5 und 0,05 m Phosphatgehalt. Das Eluat wurde fraktioniert in verschiedene Reagenzgläser aufgefangen. Bei der Eluation wurden zwei Pieks bei der Wellenlänge 280 m(x im Spektrometer bemerkt. Der erste Piek entspricht der Fraktion mit 19S, welche das Immunoglobulin M umfasst. Der zweite Piek entspricht der Fraktion mit 7S und umfasst das Immunoglobulin G. Das NEA wurde ein wenig nach dem zweiten Piek eluiert. Mit andern Worten, ungefähr 90% des NEA oder mehr lagen in der Fraktion vor, welche die Molmassen 80'000 - 120'000 umfasst. Diese Fraktion wurde aufgefangen und mittels Proteinmembrane konzentriert. Das Konzentrat wurde hierauf bei 4°C aufbewahrt. Bei der anschliessenden Arbeit mit dem Konzentrat wurde festgestellt, dass es als Verunreinigungen, vor allem Immunoglobulin G und A, enthielt. Diese Feststellungen wurden mittels der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrophorese-Methode gemacht. Der Reinigungsgrad des erhaltenen NEA entspricht ungefähr einem Faktor von 50.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1 Herstellung des NEA-Antikörpers
Teilweise gereinigtes NEA wurde so eingestellt, dass eine wässrige Lösung mit physiologischem Salzgehalt und einem Proteingehalt von 1 mg/ml erhalten wurde. Zu 0,5 ml dieser Lösung wurde eine äquivalente Menge von Freund-Perfekt-Zusatz («adjuvant») gegeben. Die Mischung wurde in Emulsionsform gebracht. Teile dieser Emulsion wurden hierauf intracutan, subcutan und intramuskulär im Hinterbein und im Bauch eines Kaninchens injiziert. Das Kaninchen hatte ein Gewicht von ungefähr 2 kg. 2 Wochen später wurden entsprechende Injektionen gemacht, wobei diesmal von einer Emulsion ausgegangen wurde, die 1 ml der ursprünglichen NEA-Lösung enthielt. Nach weiteren zwei Wochen wurde noch einmal immunisiert, dies wiederum mit einer Emulsion, die 1 ml NEA-Lösung enthielt. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde das Blut des Tieres gewonnen. Das Blutserum wurde abgetrennt und 30 Minuten lang bei 56°C inkubiert. Dadurch wurde erreicht, dass das Serum in einen statischen Zustand übergeführt wurde. Zum Zwek-ke der Antisepsis wurde zum Serum so viel Natriumnitrid zugegeben, dass sein Anteil darin 0,05 % betrag. Zu diesem Serum wurde ein Drittel seines Volumens menschliches Serum gegeben sowie 5 mg gereinigtes y-Globulin aus Colostrum pro ml Antiserum. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert und hierauf 48 Stunden lang bei 4°C aufbewahrt. Anschliessend wurde sie bei 4°C 30 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Die Flüssigkeit
über dem abgeschiedenen Feststoff wurde gewonnen. Mittels der Outcherlony-Methode und der Immunoelektro-phorese-Methode, wobei Extrakte aus Brustkrebsgewebe als Antigene benutzt wurden, wurde nachgewiesen, dass das oben beschriebene Antiserum keine Antikörper enthielt ausser den NEA-Antikörpern. Es zeigten sich nämlich monospezifische Eigenschaften des NEA-Antikörpers. Die Zugabe von gereinigtem y-Globulin aus dem Colostrum dient zur Neutralisierung des Antiserums. Da dieses Antiserum nämlich aus Brustkrebsgewebe gewonnen wird, besteht die Möglichkeit, dass es ein Antigen des Immunoglobulin A enthält und dieses in die Probe mit dem NEA-Antikörper einbringt. Da es dann aber wahrscheinlich ist, dass im Antiserum ein Antikörper für das genannte Antigen gebildet wird, wird eben das gereinigte Y-Globulin aus dem Colostrum zugegeben, welches das Sekretionsantigen des Immunoglobulin A enthält und den genannten Antikörper absorbiert und entfernt.
Beispiel 2 Herstellung des NEA-Antikörpers
Teilweise gereinigtes NEA wurde derart eingestellt, dass es in einer physiologischen Salzlösung im Wasser einen Gehalt an Protein von ungefähr 1 mg/ml aufwies. Zu 0,5 ml der genannten Lösung wurde die äquivalente Menge von Freund-Zusatz gegeben. Nach Vermischung der beiden Komponenten wurde die Mischung in eine Emulsionsform gebracht. Teile dieser Emulsion wurden hierauf intracutan, subcutan und intramuskulär im Hinterbein und im Bauch eines Kaninchens injiziert, welches ungefähr 2 kg wog. Nach 2 Wochen wurden entsprechende Emulsionsinjizierungen verabreicht, wobei diesmal die Emulsion 1 ml NEA-Lösung enthielt, sonst aber gleich hergestellt worden war, wie oben beschrieben. Nach weiteren zwei Wochen wurde noch einmal immunisiert mit 1 ml NEA in der Emulsion. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde das Blut des Tieres gewonnen. Das Serum wurde vom Blut getrennt. Es wurde anschliessend 30 Minuten lang bei 56°C inkubiert, um es so in einen statischen Zustand zu bringen. Dem Serum wurde Natriumnitrid zugegeben, bis dessen Anteil im Serum 0,05 % betrug. Diese Zugabe war nötig zum Zwecke der Antisepsis. Diesem Antiserum wurde anschliessend ein Drittel seines Volumens normales menschliches Serum und ein Drittel seines Volumens konzentriertes Ascites eines Patienten, welcher an Lebercirrhose litt, zugegeben. Die Menge Protein in der Lösung betrug 80 mg/ml. Die Mischung wurde anschliessend eine Stunde lang bei 37°C inkubiert und dann 48 Stunden lang bei 4°C aufbewahrt. Darauf wurde sie bei 4°C 30 Min. lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Die über den abgeschiedenen Feststoffen liegende Flüssigkeit wurde gewonnen. Mittels der Ouchterlony-Methode mit der ursprünglichen konzentrierten Ascites als Antigen und mit der Immunoelektrophorese-Methode wurde festgestellt, dass das oben beschriebene Antiserum keine Antikörper ausser dem NEA-Antikörper enthielt.
Die Isolierung und Reinigung des NEA mittels Affinitätschromatographie geschah folgendermassen:
Das NEA wurde von einem monospezifischen Antikörper des NEA mittels Affinitätschromatographie isoliert und gereinigt.
Zu 50 ml des monospezifischen Kaninchen-Antiserums zum NEA — dessen Herstellung im Beispiel 1 beschrieben ist — wurde eine äquivalente Menge einer physiologischen Salzpufferlösung mit 0,05 m Phosphat und einem pH 7,5 gegeben. Zur so erhaltenen Mischung wurde eine äquivalente Menge von gesättigter Ammoniumsulfatlösung mit einem pH von 7,8 gegeben. Nach 60 Minuten wurde die
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Lösung bei 5000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene, abgeschiedene Feststoff wurde in der gleichen, oben beschriebenen Pufferlösung wieder gelöst. Die so erhaltene Lösung hatte nun also die gleiche Zusammensetzung wie das ursprüngliche Antiserum. Zur Lösung wurde hierauf ein Viertel des Volumens an gesättigter Ammoniumsulfatlösung mit pH 7,8 gegeben. Nach 60 Minuten wurde die Lösung bei 5000 U/min zentrifugiert. Noch einmal wurde zur Lösung ein Viertel ihres Volumens an gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Nach Abscheidung der Feststoffe wurde die darüberliegende Lösung gewonnen; sie wies somit ein Gehalt von 33 % Ammoniumsulfat auf. 60 Minuten später wurde die Lösung bei 5000 U/min zentrifugiert, um die y-Globulinfraktion als ausgefallenen Feststoff zu gewinnen. Der ausgefallene Feststoff wurde in ungefähr 15 ml einer Pufferlösung bei einem pH von 8,0 und einem Gehalt von 0,01 m Phosphat gelöst. Die Entsalzung und die Pufferung der genannten Lösung wurden mittels Fraktionierung von 15 ml Lösung über Gel-Filtration bewerkstelligt. Die Filtration geschah über eine Kolonne mit 2,6 cm Innendurchmesser und 40 cm Länge, welche mit Sephadex G-50 gefüllt war. Als Pufferlösung wurde die gleiche Phosphatlösung verwendet, wie es weiter oben beschrieben worden ist. Es wurde die Proteinfraktion gewonnen, welche als erste eluiert wurde. Mittels einer Proteinmembrane wurde die Lösung konzentriert und eingestellt, so dass eine Lösung erhalten wurde, welche ungefähr 70 mg Protein pro ml enthielt.
Anschliessend wurde die gleiche Kolonne mit DEAE-Zellulose gefüllt, wiederum unter Verwendung des genannten Phosphatpuffers. Die oben angegebene konzentrierte Lösung wurde auf die Kolonne aufgegeben, so dass sie im Kolonnenfüllmaterial absorbiert wurde. Über der beladenen Kolonnenfüllung wurde der beschriebene Phosphatpuffer gegeben und nun kontinuierlich durch die Kolonne abflies-sen gelassen. Der grösste Teil des Immunoglobulin G wird nicht auf der DEAE-Zellulose absorbiert, alle andern Proteine werden absorbiert. Das anschliessende Eluat wird in Fraktionen gewonnen. Kontrolliert wurden die Eluate mittels optischer Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm. So wurde die Proteinfraktion erhalten. Das Immunoglobulin G wurde anschliessend getrennt von den andern Proteinen gewonnen. Die gewonnene Fraktion wurde mittels der Proteinmembrane weiter konzentriert und so eingestellt, dass eine Lösung erhalten wurde, welche das Protein in einem Gehalt von 10 mg/ml enthielt. Die genannte Lösung des Immunoglobulin G, welche den NEA-Antikörper enthielt, wurde anschliessend auf 50 ml Bromcyanid-aktivierte Ce-phalose 4B-Gel gegeben. Das Mischungsverhältnis wurde so gewählt, dass 5 mg NEA-Antikörperaktivität auf 1 ml Gel kam. Die Mischung wurde hierauf bei Raumtemperatur (20 - 25°C) 6 Stunden lang reagiert, um das Immunoglobulin zu fixieren. Unreagiertes Immunoglobulin wurde hierauf mittels genügender Waschungen mit einer physiologischen, gepufferten Salzlösung, welche Phosphat enthielt, entfernt. Das beladene Cephalose 4B-Gel wurde anschliessend in eine Kolonne von 2,6 cm Durchmesser und 20 cm Länge gefüllt, wobei dazu die genannte, physiologische Phosphatsalzpufferlösung verwendet wurde. In 10 ml einer physiologischen, wässrigen Salzlösung wurden hierauf so viel Teile gereinigtes NEA aus dem Beispiel 1 gegeben, dass nach dem Rühren die Lösung 20 mg Protein gelöst enthielt. Die erhaltene Lösung wurde auf die Kolonne gegeben, um die Reaktion zwischen dem NEA und dem an der Cephalose 4B-Gel fixierten NEA-Antikörper zu erlauben. Im Gel geschah nun also die Reaktion von NEA und dessen Antikörper zum gesuchten Komplex. Nach Auswaschen von nichtreagiertem Protein mit der genannten, phosphathaltigen
Lösung wurde 0,2 m Natriumcarbonatlösung (pH 11,5) auf die Kolonne gegeben, um den oben erhaltenen Komplex aufzuspalten und das NEA herauszulösen. Die erhaltene NEA-Lösung wurde anschliessend dialysiert und so konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt. Das resultierende NEA zeigte eine einzelne Sedimentationslinie in der Ouchterlony-Methode und auch in der Immunoelektrophorese-Methode. In den genannten Untersuchungen wurde normales menschliches Serum und Anti-NEA-Serum verwendet, wobei das letztere ein Serum ist, welches vorgängig mit dem gereinigten Colostrum-Y-Globulin neutralisiert worden ist. Weiter zeigte das isolierte NEA ein einzelnes Reaktionsband in der Plattenelektrolyse, welche als Gel 10%iges Natriumdodecylsulphit-polyacrylamid von hoher Reinheit enthielt.
Die Reinigung von NEA mittels basischem Anionen-austauscherharz geschah folgendermassen:
500 ml Ascites eines Patienten, welcher an primärem Leberzellentumor litt, wurden auf 150 ml konzentriert. Die Konzentration an Protein in der so erhaltenen Lösung lag bei ungefähr 7%. Die Konzentration wurde mittels Osmose gegen eine 30% ige Phosphatpufferlösung von pH 7,0 und Ionenstärke 0,05 von Polyäthylenglycol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 15'000 ausgeführt. Die konzentrierte Lösung wurde anschliessend 30 Minuten lang bei 5000 g zentrifugiert. Die über dem abgeschiedenen Feststoff liegende Flüssigkeit wurde bei 4°C 3 Tage lang dialysiert gegen eine phosphathaltige Pufferlösung der Ionenstärke von 0,05 und von einem pH von 7,0. Zur Dialyse wurden Zellu-loseröhrchen verwendet. Getrennt davon wurde QAE-Se-phadex A-50 vorerst angefeuchtet und hierauf mittels der Phosphatpufferlösung der Ionenstärke 0,05 und dem pH von 7,0 ins Gleichgewicht gebracht. Die so vorbehandelte QAE-Sephadex A-50 wurde hierauf in eine Kolonne von 5 cm Innendurchmesser und 40 cm Länge gegeben. Auf die Kolonne wurden anschliessend 500 ml der obengenannten Testlösung für die Dialyse gegeben. Nachdem die Lösung in der Kolonne absorbiert worden war, wurde auf die Kolonne die oben beschriebene Phosphatpufferlösung aufgeschichtet und anschliessend kontinuierlich durchlaufen gelassen. Praktisch kein NEA und kein Immunoglobulin G wurden im Ionentauscher absorbiert. Sie wurden alle ausgewaschen, währenddem die anderen Proteine praktisch alle absorbiert wurden. Die ausgewaschene Lösung wurde hierauf fraktioniert und die Absorption bei 280 m fi in der Lösung gemessen. Dadurch konnte die Proteinfraktion gewonnen werden. Diese Proteine zeigten eine einzelne Sedimentationslinie in der Ouchterlony-Methode, bei welcher als Antikörper das Kaninchen-Antiserum verwendet wurde. Das gesuchte Protein erwies sich als menschliches Immunoglobulin G gleich wie wenn Antikörper zu menschlichem Immunoglobulin G verwendet wird.
Weiter wurde gezeigt, dass die obige Proteinfraktion NEA umfasst. Auch dieser Nachweis wurde mittels der Ouchterlony-Methode und Anti-NEA-Kaninchen-Antiserum geführt.
Die konzentrierte Lösung der Proteinfraktion wurde anschliessend einer Identifikationsprüfung mittels Elektrophorese in Zelluloseacetatmembranen unterworfen. Gemäss dem so erhaltenen Resultat konnte nachgewiesen werden, dass das Proteinband allein auf das y-Globulin zurückzuführen ist. Die proteinhaltigen Bänder in anderen Globulin-regionen und Albuminregionen konnten nicht charakterisiert werden. Auf diese Art und Weise wurden ungefähr 5 % NEA gewonnen, wobei der Reinigungsgrad des Proteinanteils ungefähr dem Faktor 6 entspricht.
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Beispiel 3
Reinigung des monospezifischen NEA-Antikörpers
Teilgereinigtes NEA wurde in einer gepufferten, physiologischen Salzlösung mit 0,05 m Phosphat gelöst. Es wurde so eine Lösung erhalten, die 10 mg Protein pro ml enthielt. Diese Lösung wurde zu ungefähr ihrem halben Volumen an Cephalose 4B-Gel gegeben, welches vorgängig mit Brom-cyanid aktiviert worden war. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4°C reagieren gelassen, wobei das Protein der teilgereinigten NEA auf dem Gel fixiert wurde. Unreagier-tes Protein wurde anschliessend mittels genügend Waschungen derselben Pufferlösung entfernt. Das beladene Gel wurde anschliessend in eine Kolonne von 1,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge eingefüllt. Auf die Kolonne wurde die Lösung des gereinigten Kaninchen-Immunoglobulin G mit einem Proteingehalt von 10 mg/ml gegeben. Die genannte Lösung enthielt den NEA-Antikörper, der gemäss dem Verfahren des Beispiels 2 hergestellt und gereinigt worden war. Der NEA-Antikörper in der Lösung reagierte mit dem NEA, welches auf das Cephalose B fixiert worden war, und ergab so zusammen den NEA-Antigen-Antikörperkomplex auf dem Gel. Nach der Entfernung von nichtreagiertem Immunoglobulin G-Protein durch Waschen mit genügend Phosphatlösung wurde auf die Kolonne eine 0,2 m Natriumcarbonat-lösung mit pH 11,5 aufgegeben. Durch Einwirkung dieser Lösung wurde der Komplex aufgelöst und der NEA-Antikörper ausgewaschen. Die Fraktion mit dem NEA-Antikörper wurde gewonnen und durch Zugabe eines Fünftels ihres Volumens 1 m Glycin-Salzsäurepufferlösung von 2,5 neutralisiert. Die resultierende Lösung wurde auf Sephadex G-25-Trägersubstanz gegeben. Eluiert wurde sie anschliessend mit 0,05 m physiologischer, gepufferter und pliosphat-haltiger Salzlösung. Dadurch wurde das Glycin aus dem Gemisch entfernt.
Das anschliessend erhaltene reine NEA zeigte eine einzelne Fällungslinie in der Ouchterlony-Methode und auch in der Immunoelektrophorese-Methode, in denen beide sowohl Serum von Kaninchen wie auch Serum von Schaf als Antiserum eingesetzt wurden. Die gereinigte NEA-Lösung zeigte auch eine einzelne Fällungslinie mit Kaninchen-y--Globulinserum wie auch solches von Schafen. Die genannte Fällungs- oder Sedimentationslinie zeigte sich nicht — weder in der Ouchterlony- noch In der Immunoelektrophorese-Methode —, wenn menschliches Antiserumprotein und Anti-colostrumserumprotein verwendet wurde. Aufgrund dieser Resultate zeigt sich, dass der NEA-Antikörper das Kanin-chen-Immunoglobulin G ist und nur aus NEA-Antikörpern von hoher Reinheit besteht. Dieser NEA-Antikörper zeigte Antikörper-Aktivitäten, die bis zu lOOmal stärker waren als das ursprüngliche Antiserum im Verhältnis der Proteinmengen.
Zur Herstellung von-NEA, ausgehend vom isolierten und gereinigten NEA wurden 100 [xg des gereinigten NEA in 0,5 ml wässriger, physiologischer Salzlösung aufgelöst. Zur Lösung wurde die äquivalente Menge Freund-Perfekt-Zusatz gegeben und die Mischung in Emulsionsform überführt.
Teile eines Milliliters dieser Emulsion wurden getrennt intracutan, subcutan und intramuskulär im Hinterbein und im Bauch eines Kaninchens injiziert. Das Tier hatte ein Lebendgewicht von 2 kg. Je zwei Wochen später wurden nochmals zwei gleiche Injektionen mit gleichen Mengen Antigen ausgeführt. 10 Tage nach der letzten Injektion wurde das Blut des Tieres gewonnen. Das Blut wurde aufgetrennt und das Serum zurückbehalten. Vorerst wurde das Serum 30 Minuten lang bei 56°C gehalten, um es so zu passivieren. Dem Serum wurde soviel Sodiumnitrid zugegeben, dass dessen Anteil 0,05% war; dies zum Zwecke der Antisepsis. Mit der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrophorese-Methode und unter Verwendung eines Gewebeextraktes von Brustkrebs als Antigen wurde nachgewiesen, dass das 5 oben erhaltene Antiserum nur NEA-Antikörper enthielt.
Dieses Antiserum wurde nun weiter gereinigt. Dazu wurde eine äquivalente Menge von gepufferter Salzlösung mit physiologischem Salzgehalt und 0,05 m Phosphat bei einem pH von 7,5 zu 50 ml des Anfiserums gegeben. Zu io dieser Lösung wurde nochmals die gleiche Menge von gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei pH 7,8 gegeben. 60 Minuten später wurde die Lösung bei 5000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in der gleichen phosphathaltigen, physiologischen Salzpufferlösung gelöst, 15 so dass der Gehalt an NEA in dieser Lösung der gleiche war wie derjenige des Originalantiserums. Zu dieser Lösung wurde ein Viertel ihres Volumens an gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Nach 60 Minuten wurde die Lösung wiederum bei 5000 U/min zentrifugiert. Zur klaren Lösung 20 wurde noch einmal ein Viertel ihres Volumens an gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben, so dass schliesslich eine Lösung erhalten wurde, die 33 % Ammoniumsulfat enthielt. Diese Lösung wurde wiederum 60 Minuten stehengelassen und darauf noch einmal bei 5000 U/min zentrifugiert. Das 25 ausgefallene y-Globulin wurde gewonnen. Das Präzipitat wurde hierauf in ungefähr 15 ml einer 0,01 m Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0 gelöst. Die Lösung wurde entsalzen und gepuffert über eine Gel-Filtrationsanlage in eine Kolonne von 2,6 cm Innendurchmesser und 40 cm Länge 30 gegeben. Die Kolonne war gefüllt mit Sephadex G-50, und es wurde die gleiche Phosphatpufferlösung verwendet, um die Proteinfraktionen zu eluieren. Die Proteinfraktion wurde mittels einer Proteinmembrane auf 70 mg/ml Protein konzentriert.
35 Hierauf wurde in eine Kolonne von 2,6 cm Innendurchmesser und 40 cm Länge aktivierte DEAE-Zellulose eingefüllt. Die Einfüllung geschah wiederum mit der gleichen Phosphatpufferlösung. Auf diese Kolonne wurde die konzentrierte Proteinlösung gegeben. Die Lösung wurde vom 40 Zellulosebett vollständig aufgenommen. Hierauf wurde die gleiche phosphathaltige Pufferlösung über die Kolonne gegeben und kontinuierlich durchlaufen gelassen.
Der Hauptanteil an Immunoglobulin G wird nicht auf DEAE-Zellulose absorbiert, alle anderen Proteine werden 45 praktisch absorbiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen und mittels optischer Absorption bei 280 mm auf optimale Proteingehalte untersucht. So wurde das Immunoglobulin G mit dem NEA-Antikörper isoliert und gewonnen. Die fraktionierte Lösung wurde konzentriert — wiederum 50 mittels der Proteinmembrane — und auf eine Konzentration von 10 mg Protein pro ml Lösung gebracht.
Zur Herstellung des NEA-Antikörpers, ausgehend von NEA-NEA-Antikörperkomplex wurde ein Liter von Ascites eines Patienten mit primärem Leberzellentumor, welches 55 NEA enthielt, mittels einer Ultrafiltrationsmembrane auf ungefähr 300 ml eingedickt. Die filtrierbare Molmasse der verwendeten Membrane betrug lO'OOO. Die Lösung wurde hierauf bei 4°C 30 Minuten lang bei 40'000 g zentrifugiert. Die klare Flüssigkeit über dem Niederschlag wurde als NEA-60 Antigen-Lösung weiter verwendet. Daneben wurden 50 ml des NEA-monospezifischen Kaninchenantiserums aus dem Beispiel 1 bei 4°C ebenfalls 30 Minuten und bei 40'000 g zentrifugiert. Auch hier wurde die überstehende klare Flüssigkeit als NEA-Antikörperlösung verwendet. 65 Die beiden gesamten Lösungen des NEA-Antigens und des NEA-Antikörpers wurden zueinander gegeben, gemischt und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Hierauf wurden sie 24 Stunden lang bei 4°C aufbewahrt. Die gemischten
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Lösungen wurden anschliessend bei 4°C 20 Minuten lang bei lO'OOO g zentrifugiert und die überstehende klare Flüssigkeit verworfen. Der als Feststoff ausgefallene NEA-Anti-gen-Antikörperkomplex wurde gewonnen. Zu diesem Niederschlag wurden 50 ml eisgekühlte, wässrige, physiologische Salzlösung gegeben, und der Niederschlag wurde in dieser Lösung suspendiert. Die Suspension wurde wiederum bei 4°C 20 Minuten lang bei lO'OOO g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, und der ausgefällte Feststoff wiederum weiter verwendet. Wiederum wurde zum Niederschlag die gleiche Menge eisgekühlte, physiologische, wässrige Salzlösung gegeben, und das Verfahren wurde zweimal wiederholt, um einen vollständig gereinigten, mittels Zentrifugierung ausgefällten Feststoff zu erhalten. Zie diesem reinen NEA-Antigen-Antikörperkomplex wurden hierauf 20 ml einer Pufferlösung aus Glycin und Salzsäure mit einem pH von 1,8 gegeben. Der Komplex wurde in dieser Lösung 30 Minuten belassen und zerfiel dabei in seine Einzelkomponenten. Die Reaktionstemperatur betrug 4°C. Diese Lösung wurde anschliessend wiederum bei 4°C 20 Minuten lang bei 30'000 g zentrifugiert und die überstehende, klare Lösung vom Bodenkörper abgetrennt. Zur Lösung wurde eine zweite Lösung von 0,4 m Dinatriumhydrogenphosphat gegeben, um so die erste Lösung zu neutralisieren und den pH auf 7,0 zu bringen. Der NEA-Antigen-Antikörperkom-plex wurde durch die Neutralisation wieder ausgefällt. Das gleiche Reinigungsverfahren wurde zweimal wiederholt, und die zuletzt erhaltene, neutrale Lösung eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die anschliessend 24 Stunden lang bei 4°C gehaltene Lösung wurde immer noch bei 4°C während 20 Minuten bei lO'OOO g zentrifugiert.
Die überstehende, klare Lösung wurde verworfen und der als Feststoff abgeschiedene NEA-Antigen-Antikörperkomplex gewonnen. Es wurde vorerst in einer wässrigen, physiologischen Salzlösung suspendiert und der Gehalt an Protein wurde auf 2 mg/1 Flüssigkeit eingestellt. Eine Emulsion aus dieser Dispersion aus 0,5 ml dieser Suspension mit 0,5 ml Freund-Perfekt-Zusatz wurde anschliessend hergestellt. Teile dieser Emulsion wurden intrakutan, subkutan und intramuskulär in das Hinterbein und in den Bauch eines Kaninchens injiziert. Das Tier hat ein Lebendgewicht von 2 kg. Zwei Wochen später wurde eine zusätzliche Immunisierung ausgeführt, wobei jedoch 1 ml der NEA Antigen-Antikörperkomplex-Suspension verwendet wurde. Wiederum nach zwei Wochen wurde noch einmal 1 ml der Suspension immunisiert. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurde das Blut des Tiers gewonnen und daraus das Serum abgetrennt. Das Serum wurde vorerst 30 Minuten lang bei 56°C inkubiert, um es zu passivieren. Zur passivierten Lösung wurde soviel Natriumnitrit gegeben, dass dessen Gehalt 0,5 % betrug. Die Zugabe des genannten Salzes geschah aus Zwecken der Antisepsis. Als Resultat der Bestimmungen mittels der Ouchterlony-Methode und der Immuno-Elektrophorese-Methode, bei denen in beiden als entsprechende Afttikörper konzentrierte Lösungen aus dem Origi-nalaszites für die Herstellung des NEA-Antigen-Antikörper-komplexes verwendet worden sind, konnte nachgewiesen werden, dass dieses Antiserum keine Antikörper ausser dem NEA-Antikörper enthält.
Das NEA im Serum von Patienten, welche verschiedene Krankheiten hatten, wurde mittels der Ouchterlony-Methode untersucht.
Vorerst wurden dazu Probeplättchen aus l,2%iger Aga-rcse und einer wässrigen, physiologischen, salzhaltigen Pufferlösung mit 0,05 M Phosphat und einem pH von 7,5 hergestellt. Die Trägersubstanz enthielt zudem 0,05 % Natriumnitrit. Die Probeplättchen wiesen eine Schichtdicke von 1,2 mm auf. Die Öffnungen zum Eingeben des zu untersuchenden Serums und auch diejenigen des entsprechenden Antikörpers hatten je einen Durchmesser von 4 mm und die Distanz zwischen den Mittelpunkten der beiden runden Öffnungen betrug 7 mm. Die eigentliche Prüfung auf NEA wurde folgendermassen ausgeführt: Vorerst wurden 10 [tl des Anti-NEA-Kaninchen-Antiserums gemäss dem Beispiel 3 in die Antikörperöffnung gegeben. Hierauf wurden 40 p.1 des zu untersuchenden Serums in die Antigenöffnung auf der anderen Seite injiziert. In den folgenden Prüfungen wurde das NEA von hoher Reinheit gemäss dem Beispiel 3 verwendet. Als Bewertungskriterium wurde der Umstand genommen, dass die beiden Fällungslinien genau übereinstimmten. Eine der beiden Fällungslinien ist dabei auf die Reaktion zwischen dem authentischen NEA und dem Anti-NEA-Kaninchen-Antiserum zurückzuführen, die andere Fällungslinie erfolgt durch die Reaktion zwischen dem zu untersuchenden Test und dem Anti-NEA-Kaninchen-Anti-serum. Durch das Zusammenfallen der beiden Fällungslinien wird bestätigt, dass die zweite Fällungslinie vom zu untersuchenden Serum auf NEA zurückzuführen ist. Die Resultate der Prüfungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
TABELLE 1
Anzahl Positives Negatives Zu untersuchendes Serum Prüf- Prüfungs- Prüfungs fälle résultat résultat
Serum
Magen-Tumor
25
8
17
von Neo-
plasma-
patienten
Colon-Tumor und
Rectum-Tumor
12
2
10
Pancreas-Tumor
8
2
6
Primärer Leber-
Tumor
12
4
8
Unterus-Tumor
und
Eierstock-T umor
10
3
7
Brust-Tumor
9
5
4
Leukämie
6
2
4
Lymphosarcoma
2
1
1
Serum
Gesunde
von
Menschen
31
0
31
Nicht-Neoplas-mapa-tienten
Gastritis, Gastrische Ulcer, Duodenal-Ulcer
32
0
32
Colitis
6
0
6
Hepatitis und
Cirrhose der
Leber
18
0
18
Mastitis
3
0
3
Chronische
Pancreatitis
3
0
3
Pancreatitis
3
0
3
Rheumatisches
Fieber
3
0
3
Chronischer arti
kularer Rheuma
tismus
5
0
5
Andere Nicht-
Tumor-Krank
heiten
7
0
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
627187
Mittels der «Single Radial» Immunodiffusions-Methode wurde im Serum von verschiedenen Patienten auf NEA geprüft. Da feststeht, dass die Menge NEA im Serum von Patienten mit bösartigen Neoplasmen über einen weiten Bereich variieren kann, wurde versucht, die Prüfung auf Anwesenheit von NEA zu verbessern, indem mit zwei Un-tersuchungsplättchen von verschiedenen Konzentrationen an Antikörpern gearbeitet wurde. Das zu untersuchende Serum wurde dabei von beiden Untersuchungsplättchen geprüft, um so die Möglichkeiten des Nichtvorhandenseins des Fällungsrings wegen zuviel oder zuwenig Antikörper aus-zuschliessen.
Da im Falle des Prüfungsplättchens mit tiefer Antikörperkonzentration der Fällungsring von Auge fast nicht auszumachen ist, wurde gemäss folgender Methode vorgegangen. Nach genügend langer Reaktionszeit zwischen dem Antigen und dem Antikörper wurde das Prüfungsplättchen in die Pufferlösung gegeben, um so den nicht-reagierten Antikörper aus dem Agar in die Pufferlösung zu überführen. Andererseits wurde ein Antiserum vorbereitet, in dem man das Serum Immunoglobulin des gleichen Tieres verwendete, welches für die Herstellung des genannten Antikörpers verwendet worden war. Das andere Tier wurde mit dem genannten Globulin immunisiert. Das Antiserum wurde in die entsprechenden Öffnungen der Prüfungsplättchen injiziert und dort eine bestimmte Zeit lang inkubiert.
Wenn der NEA-Antigen-Antikörperkomplex gebildet wird, kann dann auch bei der Probe mit schwacher Antikörperkonzentration der Fällungsring beobachtet werden. Dieser ist jetzt aber auf die Reaktion zwischen dem NEA-Antigen und dem NEA-Antikörper zurückzuführen, welcher anschliessend dazugegeben worden ist. Mit andern Worten, diese Methode hat nun den Namen «single radial» Immunodiffusions-Methode mit zwei Antikörpern.
1. In einer physiologischen, gepufferten Salzlösung von pH 8,0, welche zudem 0,1 M Tris-Salzsäure enthielt, wurde unter Erwärmen soviel Agarose gelöst, dass deren Anteil an der Mischung 1,2% betrug. Die dazu verwendete Lösung enthielt zudem noch 0,1 Gew.-% Natriumnitrit für Antisepsis. Beim Abkühlen dieser Mischung wurde eine Gelatine erhalten. Dieses Agarosegel wurde anschliessend auf 50°C erwärmt. Auch das NEA-Kaninchen-Antiserum aus dem Beispiel 3 wurde auf die gleiche Temperatur erwärmt. Die beiden Stoffe wurden hierauf miteinander so gemischt, dass zwei verschiedene Mischungen erhalten wurden. Eine dieser Mischungen wies einen Gehalt von 2% Antiserum (hohe Konzentration), die andere Mischung 0,4% Antiserum (tiefe Konzentration) auf. Die Mischungen wurden jeweils auf Glasplatten oder in Plastikbehälter geleert, so dass eine Agarosegelplatte, die Antiserum enthielt, von ungefähr
1,2 mm Schichtdicke erhalten wurde. In die einzelnen Probeplättchen wurden wie oben spezifiziert Öffnungen ge-gohrt, die 4 mm Durchmesser hatten. Die Öffnungen wurden in genügendem Abstand zueinander angebracht.
2. Je 10 (il des zu untersuchenden Serums wurden gleichzeitig in ein Probeplättchen mit hohem Antiserum-gehalt und in ein Probeplättchen mit tiefem Antiserum-gehalt injiziert. Nachdem alles Serum in den Gelplättchen absorbiert worden war, liess man die Plättchen 48 Stunden lang in einer Feuchthaltekammer bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend wurde vorerst in der Platte mit der hohen Konzentration auf den Fällungsring geprüft, mittels dem angezeigt wird, ob im zu untersuchenden Serum NEA vorhanden ist oder nicht.
Die Platte mit der tiefen Antikörperkonzentration wurde statt dessen 3 Tage lang in die gleiche Pufferlösung getaucht, welche zur Herstellung der Gelplatte verwendet worden war. Dies geschah, um nichtreagierten NEA-Anti-
körper aus dem Gel zu eliminieren. Die Pufferlösungen wurden zweimal am Tag, d.h. am morgen und am abend erneuert. Nach drei Tagen wurden die Plättchen aus der Pufferlösung entnommen und die Pufferlösung in den An-s tigenöffnungen entfernt. In die gleichen Öffnungen wurden je 10 p-1 des Antiimmunoglobulin des Kaninchens und Antiserum der Ziege injiziert. Nachdem das gesamte Antiserum im Gel absorbiert worden war, liess man die Platte wiederum in einer Feuchthaltekammer bei Raumtemperatur 24 Stun-io den lang stehen. Dann erst geschah die Prüfung auf Vorhandensein des Zählungsringes. Die so erhaltenen Prüfungsresultate sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.
TABELLE 2
15
Zu untersuchendes Serum
Anzahl Prüffälle
Positives Prüfungsresultat
Negatives Prüfungsresultat
20 Serum
Magen-Tumor
27
10
17
von
Neoplas-
mapatien-
ten
Colon-Tumor und
Rectum-Tumor
14
3
11
25
Pancreas-Tumor Primärer Leber-
8
2
6
Tumor
19
9
10
30
Unterus-Tumor und
Eierstock-Tumor
10
3
7
Brust-Tumor
12
8
4
35
Leukämie
6
2
4
Lymphosarcoma
2
1
1
Serum
Gesunde
40 von
Menschen
31
0
31
Nicht-Neoplas-mapatien-ten
Gastritis, Gastrische Ulcer, Duodenal-Ulcer
32
0
32
45
Colitis
Hepatitis und Cirrhose der
6
0
6
Leber
45
1
44
50
Mastitis Chronische
3
0
3
Pancreatitis
3
0
3
Pancreatitis
4
0
4
55
Rheumatisches
Fieber
5
0
5
Chronischer
artikularer
60
Rheumatismus
Andere NichtTumor-Krank
5
0
5
heiten
7
0
7
65
a) Schafsblut, welches in Aiserverlösung aufbewahrt worden war, wurde bei 4°C 10 Minuten lang bei 2000 U/ min zentrifugiert. Anschliessend wurde das Plasma des
627187
12
Blutes gewonnen, fünfmal mit physiologischer, wässriger Salzlösung gewaschen und anschliessend noch einmal während 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Die Schafserythrocyten wurden hierauf zu 5%iger Lösung aufgearbeitet, indem man physiologische, gepufferte und Phosphat-haltige Salzlösung dazugab. Zu dieser Emulsion wurde anschliessend tropfenweise und langsam 1/5 des Volumens an 2,5 %igem Glutaraldehyd in eisgekühlter, Phosphat-halti-ger physiologischer und gepufferter Salzlösung gegeben.
Die neue Emulsion wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde sie fünfmal mit physiologischer, wässriger Salzlösung gewaschen und dann 5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert. Zum abgetrennten Niederschlag wurde hierauf eine eisgekühlte, physiologische, gepufferte Salzlösung gegeben, welche zusätzlich Thymerosal enthielt. Durch die Zugabe erhielt man eine 5%ige mit Glutalaldehyd behandelte Schafserythrocytlö-sung. Zu dieser Erythrocytlösung wurde anschliessend eine Äquivalentmenge von 0,0025 %iger Tanninsäurelösung gegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt und anschliessend zentrifugiert. Die überstehende, klare Lösung wurde verworfen. Der ausgefallene Feststoff wurde fünfmal mit physiologischer, wässriger Salzlösung gewaschen und anschliessend noch einmal zentrifugiert. Zum erhaltenen, niedergeschlagenen Feststoff wurde Phosphat-haltige, physiologische, gepufferte Salzlösung gegeben. Schliesslich erhielt man so die 5 %ige, mittels Glutaraldehyd und Tanninsäure behandelte Schafserythrocytlösung.
Zu diesen Erythrocyten wurde eine äquivalente Menge (10 (ig/ml) des NEA-Antikörpers gegeben, welcher gemäss dem Verfahren des Beispiels 7 hergestellt worden war. Die gesamte Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend zentrifugiert. Der erhaltene, abgesetzte Feststoff wurde zweimal mit physiologischer, wässriger Salzlösung gewaschen und anschliessend mit der Phosphat-haltigen, physiologischen, gepufferten Salzlösung verdünnt. Das somit erhaltene Produkt ist also eine 10%ige Erythrocytlösung, in der die Erythrocyten mit Glutaraldehyd und Tanninsäure behandelt und mit NEA-Antikörper sensibilisiert worden sind.
Die Erfassungsgrenze für die Feststellung auf Anwesenheit von NEA der oben genannten Erythrocytlösung betrug 150 ng/ml, wenn die RPHA-Methode verwendet wurde. Das bedeutet, dass mit dieser Methode und den oben beschriebenen Untersuchungsflüssigkeiten sehr kleine Mengen von NEA in den zu untersuchenden Sera festgestellt werden können.
b) Zur unter a) erhaltenen Erythrocytlösung, mit Erythrocyten, die mittels Glutaraldehyd und Tanninsäure behandelt worden waren, wurde eine äquivalente Menge (10 Hg/ml) von NEA gemäss dem Beispiel 5 gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend 10 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert. Der abgesetzte Feststoff wurde zweimal mit physiologischer, wässriger Salzlösung gewaschen und anschliessend mit Phosphat-haltiger, physiologischer, gepufferter Salzlösung verdünnt. Es wurde so ein Produkt hergestellt, welches 10% mit Glutaraldehyd und Tanninsäure behandelte und mit NEA sensibilisierte Schafserythrocyten enthielt. Die Erfassungsgrenze dieser Testflüssigkeit auf NEA betrug 200 ng/ml, wenn die PHA-Methode angewendet wurde.
a) Der Anti-NEA-Kaninchen-Immunoglobulin-Antikör-per aus Beispiel 8 wurde so eingestellt, dass der Proteingehalt in der Lösung 7 mg/ml betrug. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 70 ml einer gepufferten Borsäurelösung bei pH 8,0 gegeben. (Die Pufferlösung wurde hergestellt, indem Wasser zu 9,03 g H3B03, 2,13 g NaCI und 5,18 g Na2B407 • 10 H20 gegeben wurde.) Zugleich wurden der Mischung
20 ml 1,0 M Kaliumcyanatlösung gegeben. Das Gemisch wurde 120 Minuten lang bei 45°C inkubiert und anschliessend auf 4°C abgekühlt, um die Reaktion zu stoppen. Die erhaltene Lösung wurde mittels Dialyse durch ein Zellulose-5 rohr auf ungefähr 10 ml konzentriert. Das Zelluloserohr befand sich dabei in einer 30%igen Polyäthylenglycollösung mit einem Phosphatpuffer von 0,05 M bei pH 7,5. Das mittlere Molekulargewicht des Polyäthylenglycols betrug ungefähr 15'000. Ungefähr 10 ml der konzentrierten Lösung io wurden hierauf entsalzt und gepuffert. Dies geschah mittels Kolonnenchromatographie in einer Kolonne von 2,6 cm Innendurchmesser und 40 cm Länge. Die Kolonne war mit Sephadex G-25 gefüllt, welche vorgängig mit 0,05 M Phosphatpulverlösung bei pH 7,5 gewässert und in Gleichgewichts-15 zustand übergeführt worden war. Der so erhaltene Antikörper wurde mittels einer Proteinmembrane auf eine Konzentration von ungefähr 70 mg Protein/ml Lösung gebracht.
Die resultierende Lösung von carbamyliertem NEA-Antikörper wurde hierauf der Elektrophorese in Agar-Agar-20 Gel unterworfen. Das NEA wurde dabei in die normalerweise für den Antikörper vorgesehene Öffnung gegeben. Bei der a2-Globulinfraktion konnte anschliessend eindeutig eine Fällungslinie festgestellt werden. Im Falle der NEA-Antikörperlösung vor der Carbamylierung als Vergleich 25 zeigte sich die Fällungslinie bei der y-Globulinfraktion.
Als Resultat der Carbamylierung des NEA-Antikörpers zeigte sich eindeutig seine Umkehrung der Elektromobilität. Die Fällungslinie lag jetzt also auf der anodischen Seite der Aufgabeöffnung. Trotzdem behielt jedoch der Antikörper 30 seine ursprüngliche Aktivität bei.
b) Die Feststellung auf Anwesenheit von NEA im zu untersuchenden Serum wurde gemäss der folgenden Methode ausgeführt: Vorerst wurden wiederum Agar-Agar-Prüf-plättchen (mit 1,2% Agar-Agar) von 1,2 mm Schichtdicke 35 erstellt. Die dazu verwendete Lösung enthielt einen Veronal-puffer und hatte einen pH von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,025. In die einzelnen Prüfplättchen wurden je zwei Öffnungen gebohrt, welche einen Durchmesser von 4 mm aufwiesen und einen Abstand zwischen den Mittelpunkten 40 der Öffnungen von 7 mm. In die Probeöffnungen, d.h. in diejenigen Öffnungen aus der anodischen Seite des Probe-plättchens wurden jeweils 10 [il des zu untersuchenden Serums injiziert. In die andere Öffnung injizierte man jeweils 10 [il der carbamylierten NEA-Antikörperlösung des Bei-45 spiels 1. Die Antikörperlösung befand sich also auf der kathodischen Seite des Prüfplättchens. Nun wurde die Elektrophorese ausgeführt. Diese dauerte normalerweise 40 Minuten und der elektrische Gleichstrom durch die Platte hatte eine Stärke von 2,5 mA/cm Plattenseite. Geprüft wurde 50 anschliessend auf Anwesenheit einer Fällungslinie.
Die Resultate der Prüfung sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.
13
627187
TABELLE 3
Anzahl Positives Negatives Zu untersuchendes Serum Prüf- Prüfungs- Prüfungs fälle résultat résultat
Serum
Magen-Tumor
25
8
17
von
Neoplas-
mapa-
tienten
Colon-Tumor und
Rectum-Tumor
12
2
10
Pancreas-Tumor
8
2
6
Primärer
Leber-Tumor
19
8
11
Unterus-Tumor
und
Eierstock-T umor
10
3
7
Brust-Tumor
12
7
5
Leukämie
6
2
4
Lymphosarcoma
2
1
1
Serum
Gesunde
von
Menschen
31
0
31
Nicht-Neoplas-mapa-tienten
Gastritis, Gastrische Ulcer, Duodenal-Ulcer
32
0
32
Colitis
6
0
6
Hepatitis und
Cirrhose der
Leber
41
1
40
Mastitis
3
0
3
Chronische
Pancreatitis
3
0
3
Pancreatitis
3
0
3
Rheumatisches
Fieber
5
0
5
Chronischer arti
kularer Rheu
matismus
5
0
5
Andere Nicht-
Tumor-Krank
heiten
7
0
7
Wie aus den Angaben aus Tabelle 3 ersichtlich ist, wurde das NEA in 33 von 94 möglichen Beispielen nachgewiesen. Der Erfassungsgrad liegt also bei 35,1%. Andererseits wurde das NEA in 136 von nicht-Neoplasmapatienten nur einmal entdeckt, wobei noch zu sagen ist, dass der eine positive Fall einen Patienten betrifft, welcher an Lebercirrhose litt und von den Ärzten in bezug auf Komplikationen wegen Primärtumor in Leberzellen untersucht wurde.
a) Die Markierung des NEA wurde gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 ausgeführt. Es wurden die folgenden drei Lösungen miteinander gemischt:
— NEA-Lösung (1,25 mg/ml) 20
— 125I-Na (0,1 Millicurie/ jxl) 10
— 0,4 M Phosphat-haltige Pufferlösung (pH 7,4) 50
Zu der so erhaltenen Mischung wurden zusätzlich 50 {xl einer Lösung Chloramin T (1,2 mg/ml) gegeben und das Ganze wurde anschliessend 30 Sekunden lang gerührt. Zur gerührten Mischung wurden anschliessend 50 jjlI einer Lö-5 sung von Natriummetabisulfit (3,0 mg/ml) gegeben und das Ganze wiederum 2 Minuten gerührt. Anschliessend wurden der neuen Mischung 100 [il einer Lösung von nicht-radio-aktivem Natriumjodid (10 mg/ml) gegeben. Diese Reaktionslösung wurde anschliessend der Kolonnenchromatographie io über Sephadex G-75 unterworfen. Eluiert wurde mit einer 0,05 M Phosphat-haltigen, physiologischen Salzlösung bei pH 7,4. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen und zwar in Reagenzgläser, in die im voraus jeweils 1 ml einer 0,05 M Phosphat-haltigen gepufferten physiologischen Salz-15 lösung, welche zudem 1 % Kuhserum-Albumin enthielt, eingefüllt worden war.
Die markierte NEA-Fraktion wurde so eingestellt, dass sie eine Radioaktivität von 10 Millicurie/mg aufwies. Diese markierte NEA-Lösung wurde für Diagnosen im Serum auf 20 Neoplasma verwendet.
b) Vorerst wurde eine Standardkurve aufgesetzt, indem Lösungen mit bekanntem NEA-Gehalt mit der markierten NEA-Prüfungslösung von oben gemessen wurden. Speziell wurden jeweils 0,1 ml der Standard-NEA-Lösung mit 0,1 ml 25 der 125I-NEA-Lösung gemischt. Zu dieser Mischung wurden dann jeweils noch 0,5 ml einer 0,05 M Phosphat-haltigen, gepufferten physiologischen Salzlösung mit 1 % Kuhserumalbumin gegeben. Weiter wurde der Mischung 0,1 ml einer solchen Lösung zugegeben, die aus einer 20'000 bis 40'000-30 Verdünnung des Anti-NEA-Kaninchen-Antiserums aus dem Beispiel 3 erhalten wurde. Diese Reaktionsmischung wurde 24 Stunden lang bei 4°C aufbewahrt. Anschliessend wurden ihr 0,1 ml des normalen Kaninchenserums zugegeben, welches lOOmal verdünnt worden war und 0,1 ml des Anti-35 Kaninchen-y-Globulin-Geiss-Antiserurns, welches zehnmal verdünnt worden war, zugegeben. Die letztere Lösung diente als zweiter Antikörper. Wiederum wurde das ganze 24 Stunden lang bei 4°C belassen. Die Lösung wurde nun 30 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert und die überstehende, 40 klare Lösung verworfen. Die Radioaktivität des ausgefällten Feststoffes wurde bestimmt. Durch dieses Vorgehen wurde eine sehr genaue Standardkurve erhalten. Der Bereich der Standardkurve lag zwischen 5-320 ng NEA pro ml.
Die RIA-Messmethode wurde in der gleichen Art und 45 Weise wie weiter oben beschrieben ausgeführt. Es wurden im ganzen 381 Serumbeispiele, bestehend aus 55 Serum von gesunden Menschen, 129 Beispielen von nicht-Neoplasmapatienten und 197 Beispielen von Neoplasmapatien-ten untersucht. Die Resultate der Untersuchungen sind in 50 der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt.
(il 65
(il
[il
627187
14
TABELLE 4
Fall
Anzahl Prüffälle
NEA-Gehalt 200 ng/ml
Serum von
Neoplas-
mapatien-
ten
Serum von gesunden Menschen und Nicht-Neoplas-mapa-tienten
Anzahl Fälle
Prozente (%i)
Magen-Tumor
68
21
30,9
Tumor von grossen inneren Organen
29
10
34,5
Pancreas-Tumor
10
6
60,0
Leber-Tumor
21
9
42,9
Tumor der Galle, Blase sowie des Gallentraktes
10
3
30,0
Lungen-Tumor
3
1
33,3
Brust-Tumor
17
7
41,2
Uterus-Tumor und
Eierstöcke-Tumor
11
3
27,3
Leukämie
24
12
50,0
Andere bösartigen Tumoren
4
2
50,0
Total
197
74
37,6'
Gesunder Mensch
55
0
0
Akute Hepatitis
6
1
16,7
Chronische Hepatitis
23
4
17,4
Cirrhosis der Leber
21
1
4,8
Andere gutartige Krankheiten
79
3
3,8
Total
184
9
4,9:
Wie aus den Angaben aus Tabelle 4 zu ersehen ist, ist die Bestimmung NEA im Serum mittels der RIA-Methode nützlich für die Diagnose von Neoplasma bei Menschen.
c) Die Markierung des NEA-Antikörpers, welcher gemäss dem Beispiel 7 hergestellt worden war, geschah durch Mischen der folgenden drei Lösungen:
10
— NEA-Antikörper-Lösung (1,0 mg/ml)
— 125I-Na (0,1 Millicurie/nl)
— 0,4 M Phosphat-haltige Pufferlösung (pH 7,4)
20 nl 10 nl 15 nl
Für diese Mischung wurden vorerst 100 [1,1 einer Chlor-amin T-Lösung (1,0 mg/ml) und nach Rühren der Mischung 15 während einer Minute nochmals 100 jil einer Lösung von Natriummetabisulphit (2,4 mg/ml) gegeben. Die neuerliche Mischung wurde wiederum 2 Minuten lang gerührt und noch einmal mit 100 [il einer nichtradioaktiven Natriumjodid-lösung (10 mg/ml) versetzt. Die Reaktionslösung wurde 20 über eine Kolonne chromatographiert. Als Füllmittel der Kolonne diente Sephadex G-75. Eluiert wurde mit einer 0,05 M Phosphat-haltigen, gepufferten, physiologischen Salzlösung mit dem pH 7,4. Die Eluate wurden als Fraktionen gewonnen und zwar in Reagenzgläsern, welche zuvor mit 25 1 ml 0,05 M Phosphat-haltiger, gepufferter physiologischer Salzlösung mit 1 % Kuhserum-Albuminlösung gefüllt worden war. Die markierte NEA-Antikörper-Fraktion wurde getrennt aufgefangen. Anschliessend wurde daraus eine Lösung hergestellt, welche den 125I-NEA-Antikörper mit 30 einer spezifischen Radioaktivität von 100 Millicurie/mg enthielt. Diese 125I-NEA-Antikörperlösung wurde ebenfalls als Diagnosereagenz auf Neoplasma bei Menschen verwendet.
35
74
* prozentualer Anteil: x 100 = 37,6%
197
9
** prozentualer Anteil: X 100 = 4,9%
184
v
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