DE2616984C3 - Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins - Google Patents

Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines in der menschlichen Plazenta vorkommenden, von H. Bohn 1972 im wäßrigen Plazentenextrakt gefundenen, als PPs bezeichneten Plazentaproteins sowie damit antigenverwandter Proteine.
Wie von H. Bohn in Archiv für Gynäkologie, Bd. 212, Seite 165 bis 175,1972, beschrieben, kann mit Hilfe von Antiseren, die durch Immunisierung von Plazentenfraktionen gewonnen worden waren, im Extrakt von Plazenta eine Reihe löslicher Antigene immunologisch nachgewiesen werden. Für das mit PPs bezeichnete Protein konnte gezeigt werden, daß es offensichtlich plazentaspezifisch ist, denn die Nachweisversuche dieses Proteins mit immunologischen Standardtechniken in einer Reihe von embryonalen und adulten menschlichen Organen oder auch im Humanplasma sowie Erythrozytenlysaten führten zu keiner positiven Reaktion.
In der elektrophoretischen Wanderung in Agar zeigt sich PPs als j3pGlobulin. In einem Polyacrylamidgel wandert es im Vergleich zu Albumin = 100 mit einer relativen Beweglichkeit von 75. Aufgrund seines Verhaltens bei der Gelfiltration auf quervernetztem Dextran wurde ein Molekulargewicht für PP5 von etwa 000 abgeleitet. Das PP5 ist selbst im Plazentenextrakt in relativ niedriger Konzentration vorhanden, so daß seine Reindarstellung trotz aufwendiger Verfahren der biochemisch präparativen Techniken bisher nicht möglich war, insbesondere weil diese Verfahren nicht hinreichend selektiv sind. In der Plazentafraktion V ist PPs angereichert und diese Fraktion kann vorteilhaft als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren dienen.
Es wui de nämlich überraschend gefunden, daß PP5 aus Lösungen, in denen es enthalten ist, vorzugsweise aus der Plazentafraktion V (Archiv der Gynäkologie (1972), 212, 165) mittels Immunadsorption isoliert und
Ό durch anschließende Reinigung nach konventionellen Fraktionierungsmethoden oder auch in einem weiteren Immunadsorptionsverfahren, in welchem die restlichen Serumproteine und Plazentenproteine entfernt weiden können, rein erhalten werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Isolierung und weiteren Reinigung des Proteins PP5 aus dessen Lösungen, insbesondere aus der Plazentafraktion V.
Die Plazentafraktion V wird auf folgende Weise erhalten:
Plazenten werden mit einer wäßrigen Salzlösung extrahiert Der Extrakt wird mit einer Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat versetzt und der Niederschlag abgetrennt Aus dem Überstand wird noch darin enthaltenes Diaminoäthoxyacridinlactat mit Natriumchlorid gefällt und abgetrennt Zum Überstand wird Ammoniumsulfat gegeben, der Niederschlag, der das PP5 enthält abgetrennt, in Wasser gelöst und gegen einen Puffer von etwa pH 7, beispielsweise 0,01 M Trisoxymethylaminomethan, dialysiert und zentrifugiert. Diese Lösung stellt die Plazentafraktion V dar.
Es liegt im Sinne der Erfindung, daß mittels der Immunadsorption nicht nur PP5 sondern auch mit dem PPs antigenverwandte Proteine isoliert bzw. angereichert werden können. LImgekehrt sind serologisch mit PP5 verwandte Antikörper zur adsorptiven Gewinnung sowohl von PP5 als auch von damit antigenverwandten Proteinen einsetzbar.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine PP5 enthaltende Proteinlösung, insbesondere den wäßrigen Extrakt von Plazenten — im besonderen menschlichen Plazenten —, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PP5 gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PP5 mit einem wäßrigen Medium vom pH-Wert 2—4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von 4—9, insbesondere etwa pH 7, behandelt
Als Ausgangsmaterial dient insbesondere die menschliche Plazenta, aus der man etwa 1—2 mg PP5 pro Plazenta durchschnittlicher Größe (ca. 500-60Og) extrahieren kann. Zur Herstellung des wäßrigen Extraktes werden zerkleinerte Plazenten mit Wasser oder einer geeigneten Salzlösung behandelt und die flüssige Phase gewonnen.
Geeignete Salze für die Salzlösung sind möglichst inerte Salze, wie sie als Bestandteile von Lösungen für die Extraktion von Geweben bekannt sind. Verwendet werden dazu Neutralsalze und Puffersubstanzen, insbesondere Kochsalz oder Tris-hydroxy-methylaminomethan, ferner Alkalisalze der Phosphor- oder Citronensäure. Zweckmäßig liegen die Salzkonzentrationen bei 0,1 bis 5%.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das PP5 aus üblicherweise verwendeten Plazentenextrakten, in denen es in einer Konzentration von etwa 0,1—0,4 mg
pro 100 ml vorliegt bis zu einer Konzentration von etwa 100—1000 mg/100 ml angereichert werden. Die spezifische Anreicherung liegt bei etwa 25 000—50 000.
Der für die Anreicherung des PPs benötigte Antikörper, der in bekannter Weise an einen festen Träger gebunden werden kann, wird durch Immunisierung von Tieren mit PP5 erhalten. Solange das Reinprotein nicht zur Verfügung steht, wird der für die Immunisierung von Wirbeltieren, insbesondere Kaninchen, mit einer aus Fällungsverfahren in bezug auf PPs angereicherten Plazentenfraktion hergestellt: beispielsweise nach der von H. Bohn 1972 beschriebenen Methode.
Bei der Immunisierung mit derartigen Rohfraktionen werden Antiseren mit multispezifischen Antikörpern erhalten. Die nicht spezifisch gegen PPs gerichteten Antikörper werden mit geeigneten Antigenen aus Blutserum und Plazsntenfraktionen behandelt, wonach mit Hilfe der resultierenden Antigen-Antikörperreaktionen die unspezifischen Antikörper entfernt werden können.
Die Gewinnung der Immunglobulinfraktion in der sich PPs-Antikörper befinden, erfolgt in an sich bekannter Weise. Das danach erhaltene Anti-PPs wird entsprechend bekannten Verfahren an geeignete Träger gebunden. Solche Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, Seite 259, Naturwissenschaften 58 (1971), Seite 389 oder Nature 314 (1967), Seite 1302. Besonders geeignete Träger sind hochpolymere Kohlenhydrate, wie Cellulose oder Agar, so synthetische Harze, wie Polyacrylamid oder Co-PoIy-TT,ere aus Äthylen/Maleinsäure-Anhydrid; auch Glaspartikel können als Träger verwendet werden.
Besonders geeignet als Trägermaterial ist eine gereinigte Agarose in Form von kleinen Kügelchen mit einem Durchmesser von 20—200 μΐη an die nach der oben zuletzt genannten Methode die Antikörper gegen PP5 kovalent gebunden werden können.
Für die Isolierung des PPs aus Lösungen, im Besonderen aus Plazentaextrakten, die außerdem -to andere Proteine und Kohlehydrate enthalten, wird die PP5-Lösung mit dem den Antikörper tragenden Adsorbens in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert auf >4 eingestellt wird. Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, empfiehlt es sich, den pH-Wert nicht höher als 9 zu wählen. Die Salzkonzentration der Lösung ist nicht kritisch. Jedoch sollten Bedingungen vermieden werden, die geeignet sind, die Bindung von Antigenen an Antikörper zu lösen. Vorteilhaft enthält die wäßrige Lösung neutrale Salze und/oder Puffersub- so stanzen, wie sie allg. in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere Natriumchlorid, Phosphatpuffer, Tris-Hydroxymethylaminomethan oder andere bekannte Puffersubstanzen, wie sie beispielsweise in Biochem. 5. 472, (1966) beschrieben sind. Die Konzentrationen dieser Substanzen liegt zweckmäßig im Bereich zwischen 0,01 und 2 Mol/l. Das Verhältnis Proteinlösung : Adsorbens ist zweckmäßig im Bereich 1 :1 — 10:1, insbesondere 2:1. Das Adsorbens sollte mit der Proteinlösung 0,1 bis 5 Stunden in Berührung &o bleiben, damit genügend Zeit zur Verfügung steht, die Antigen-Antikörper-Bindung zu knüpfen.
Die Adsorption und die Elution des PP5 kann sowohl im sogenannten batch-Verfahren als auch in einer Chromatografie-Säule durchgeführt werden. Hierzu wird das Adsorbens von der Lösung abgetrennt, im batch-Verfahren durch Zentrifugierung oder Filtration mehrfach mit einer neutralen Salzlösung gewaschen, um überschüssige Salze und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen zu eliminieren. In dem Säulenverfahren wird die Lösung durch gründliches Spülen mit Pufferlösung aus der Säule entfernt
Die Elution des PP5 vom Antikörper-haltigen Träger kann auf bekannte Weise durch Maßnahmen erfolgen, die die Auflösung von Antigen-Antikörper-Bindungen bewirken. Beispielsweise kann die Elution durch Behandlung des Trägers mit einem wäßrigen Medium vom pH-Wert <4, insbesondere zwischen 2 und 4 erfolgen. Die entsprechende Lösung sollte Salze und geeignete Puffersubstanzen in geeigneter Konzentration, zweckmäßig 0,2—8 Mol/l enthalten.
Im batch-Verfahren empfiehlt es sich, die Dispersion des Adsorbens in dieser Lösung 0,1 —2 Stunden lang zu belassen, wobei das PP5 vom Immunadsorbens desorbiert wird. Im Säulenverfahren läßt man die Elutionslösung durch die Säule hindurchfließen. Nach Abtrennung des Adsorbens wird der pH-Wert der das PPs enthaltenden Lösung auf etwa neutral (pH 6—8) gestellt Die angereicherte PPs-Lösung kann gewünschtenfalls einer weiteren Reinigung unterworfen werden.
Die Elution des PPs vom Antikörper-haltigen Träger kann auch mit Hilfe von Proteinbindungen dissoziierenden Stoffen, beispielsweise Harnstoff- oder Guanidinlösungen oder Lösungen von sogenannten chaotropen Salzen wie NaNO3, N'aBr, NaClO4, CF3COONa, NaSCN oder CCl3COONa erfolgen. Die Konzentration dieser Salze im Elutionsmedium beträgt zweckmäßig 2 bis 8 Mol/l. Zur Entfernung der chaotropen Salze aus der Lösung nach der Desorption des PPs und zur Abtrennung des Adsorbens kann die Lösung gegen eine Neutralsalzlösung oder Pufferlösung der Konzentration 0,1 bis 1 Mol/l dialysiert werden.
Das nach diesem Verfahren erhaltene PP5 besitzt einen Reinheitsgrad von 50 bis 80%. Durch weitere Reinigungsverfahren kann es auf über 99% angereichert werden.
Falls eine Weiterreinigung des durch Immunadsorption angereicherten PP5 gewünscht wird, kann diese mit gängigen Fraktionierungsverfahren vorgenommen werden. Bevorzugt werden dabei Fraktionieningsverfahren mit Hilfe eines Molekularsiebs mit dem Ziel, die PP5-Anteile in den Fraktionierungsbereichen von Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 anzureichern. Ein weiteres gängiges anwendbares Verfahren ist die Ionenaustausch-Chromatographie. Dabei werden die Ladungseigenschaften des PP5 verwertet, das sich bekanntlich wie ein ßi-Globulin verhält. Eine weitere Möglichkeit zur Rein-Darstellung des PP5 ist in Immunadsorptionsverfahren gegeben, bei denen nicht die Antikörper gegen PP5 sondern gegen die zu entfernenden Verunreinigungen als trägergebundene Adsorbentien Verwendung finden. Das PP5 befindet sich nach Anwendung dieses Verfahrens in den nicht gebundenen Anteilen.
Der Fortschritt der Reinigungsverfahren ist in jedem Falle am einfachsten mit Hilfe entsprechender Antiseren überprüfbar. Bei den jeweiligen Fraktionierungsverfahren werden diejenigen Fraktionen gewonnen, die mit dem spezifisch gegen PP5 reagierenden Antiseren eine immunologische Reaktion, insbesondere eine Immunpräzipitation, zeigen.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche PP5 ist besonders geeignet, spezifisch dagegen gerichtete Antiseren herzustellen. Gegenstand der Erfii uung ist deshalb auch die Verwendung des erfindungsgemäß erhältlichen PP5 zur Herstellung eines
Anti-PPs-Serums. Dabei werden Tiere nach bekannten Methoden mit PP5 immunisiert und aus dem B'ut der Tiere das Antiserum gewonnen. Mit Hilfe dieser neuen Antiseren läßt sich PP5 durch immunologische Methoden, wie beispielsweise dem Hämiigglutinationshemmungstest, der Komplimentbindungsreaktion, dem Radioimmunoassay, der Latexagglutination und ähnlichen empfindlichen Methoden, in Körperflüssigkeiten nachweisen.
So läßt sich zeigen, daß PP5 während der Schwangerschaf· in geringen Konzentrationen im Blut der Schwangeren erscheint Ferner ist PP5 in der Tumordiagnostik von Bedeutung. Es kann im Blut von Kranken mit trophoblasteschen Tumoren nachgewiesen werden. In der Regel bestehen die entsprechenden diagnostischen Mittel im Wesentlichen aus Anti-PPs und bei bestimmten Verfahren, beispielsweise in radioimmunologischen Testsystemen, wird PP5 selbst als Standardsubstanz mitgeführt In diagnostischen Mitteln zum Nachweis von gegen PP5 gerichteten Antikörpern ist PP5 der wesentliche Bestandteil des Reagens.
Das nachfolgende Beispiel erläutert das Verfahren.
1. Herstellung des Immunadsorberns
150 ml eines Anti-PPs-Serums vom Kaninchen werden gegen 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobuline an DEAE-Zellulose Chromatographien. Die Immunglobulinfraktion (1,3 g Protein) wird dann mit 258 g besonders gereinigter Agarose in Kugelform (Sepharose ® 4B der Pharmacia Uppsala, Schweden), di? "Mt 16,1 g Bromcyan aktiviert worden war, umgesetzt und so kovalent an diesen Träger gebunden.
Das Verfahren ist beschrieben von Axen R, Porath J., Ernbach S, Nature 214,1302,(1967).
Mit Hilfe eines auf diese Weise hergestellten Immunadsorbens kann das Plazentaprotein PP5 aus dessen Lösungen, insbesondere aus PPs-angereicherten Plazentaextraktfraktionen isoliert werden.
2. Anreicherung des PP5 aus Plazentaextrakt
(Gewinnung von Plazentafraktion V)
2.1. Anreicherung der PP5 Eiweißfraktion
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3%igen wäßrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol®) versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand, der das PP5 zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gev/icht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfältriert
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit »Tris« abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die clialysierte Lösung wird zentrifugiert (Plazentafraktiori V).
Der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt
Sodann wird die DEAE-Celiulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriun.azid enthält, eluiert Den vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze verrührt Der Niederschlag, der das PP5 enthält, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen einen 0,1 molaren Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter und 0,1% Natriumazid enthält, dialysiert Man erhält 200 ml einer Lösung mit ca. 6% Eiweiß und etwa 30 mg PP5. Aus dieser Fraktion kann PP5 durch Immunadsorption isoliert werden.
Das unter 2.1 vorgestellte Anreicherungsverfahren ist nicht erfindungswesentlich. Die Immunadsorption kann auch mit Plazentenextrakt direkt durchgeführt werden.
2.2. Isolierung des PP5 durch Immunadsorption
Das Immunadsorbens wird in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 1,0 Mol/l NaCl und 0,1% NaN3 enthält (nachstehend Pufferlösung I) suspendiert, dann in eine Chromatografiesäule gefüllt (3 χ 20 cm) und mit Pufferlösung I nachgespült Dann läßt man langsam 100 ml einer PP5-haltigen Lösung durch die Säule wandern, wobei PP5 immunadsorptiv gebunden wird. Man wäscht die Säule gründlich mit Puffer I nach und eluiert dann das adsorbierte Protein mit 0,5 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5). Die PP5-haltigen Eluate werden mit 1 η NaOH auf pH 7,0 eingestellt und im Ultrafilter auf ca. 10 ml eingeengt Ausbeute pro Adsorption ~ 2 mg PP5.
Das Adsorbens in der Säule wird unmittelbar nach der Elution von PP5 wieder mit Pufferlösung I neutralisiert und gründlich gewaschen; es kann dann erneut zu immunadsorptiven Bindung von PP5 eingesetzt werden. Das durch Immunadsorption gewonnene Protein ist häufig durch unspezifisch gebundene Serumproteine (hauptsächlich IgG und daneben etwas IgA) verunreinigt Die Abtrennung dieser Begleitproteine gelingt,
z. B. durch Gelfiltration, Molekularsiebfraktionierung z. B. bevorzugt mit Hilfe von quervernetztem Dextran wie Sephadex*G-100; die Serumproteine können aber auch durch Immunadsorption, d.h. mit Hilfe von trägergebundenen Antikörpern gegen Serumproteine, entfernt werden.
Das im Rahmen der Erfindung verwendete Anti-PPs-Serum wurde wie folgt erhalten:
Es wurden Kaninchen mit dem gereinigten PP5 unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.
Das PP5 wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter bo Zusatz von Aluminiumhydroxid zu einer Suspension verrührt Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i. v. injiziert. Anschließend läßt man die Tiere 9 Tage ruhen. h" Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, läßt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schließlich nochmals an 5 aufeinander-
folgenden Tagen je 0,06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blules wird das Serum vom Biutkuchen abgeschleudert und gewonnen.

Claims (3)

  1. Patentansprüche:
    ?. Verfahren zur Isolierung und weiteren Reinigung des plazentaspezifischen Proteins PPs, das angereichert werden ka;un, indem Plazenten mit einer wäßrigen Salzlösung extrahiert, der Extrakt mit einer Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat versetzt, vom Niederschlag abgetrennt, das im Überstand verbliebene Diaminoäthoxyacridinlactat mit Natriumchlorid ausgefällt der Überstand mit Ammoniumsulfat versetzt, der Niederschlag abgetrennt, in Wasser gelöst, gegen einen Puffer von pH 7 dialysiert und die dialysierte Lösung zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man eine PPs enthaltende Proteinlösung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 9 mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Antikörper gegen das PP5 in Berührung bringt, den Träger, der das PPs gebunden enthält, von der flüssigen Phase abtrennt und zur Ablösung des PPs mit einem wäßrigen Medium vom pH-Wert 2—4 oder mit einer Lösung eines Proteinbindungen dissoziierenden Stoffes bei einem pH-Wert von 4—9 behandelt und mit an sich bekannten Isolierungsverfahren nach der Immunadsorption bis zu einer Reinheit von über 99% reinigt.
  2. 2. Verwendung des nach Anspruch 1 erhältlichen plazentaspezifischen Proteins PPs zur Herstellung eines gegen das plazentaspezifische Protein PPs gerichteten Antiserums.
  3. 3. Verwendung des nach Anspruch 1 erhältlichen plazentaspezifischen Proteins PPs in einem diagnostischen Mittel zum Nachweis des PPs und von gegen PPs gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten.
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