CH643860A5

CH643860A5 - Leucinreiches 3,1-s-alpha-2-glykoprotein, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung.

Info

Publication number: CH643860A5
Application number: CH427378A
Authority: CH
Inventors: Heinz Haupt; Siegfried Dr Baudner
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1977-04-25
Filing date: 1978-04-20
Publication date: 1984-06-29
Also published as: SE7804714L; IE46735B1; JPS53133619A; NZ187055A; FR2388824B1; IE780801L; AU519645B2; AU3540578A; BE866365A; AT364857B; LU79490A1; ES472053A1; GB1599435A; ZA782329B; DE2718325A1; DK176578A; IT7822620A0; FR2388824A1; ATA292478A; DE2718325C2

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Glykoprotein, dessen Isolierung aus menschlichen Seren sowie dessen Verwendung für die Gewinnung von gegen dieses neue Glykoprotein gerichteten Antiseren, mit welchen der Gehalt an diesem Glykoprotein in Körperflüssigkeiten nachgewiesen und bestimmt werden kann.

Das neue Glykoprotein unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Proteinen aus menschlichem Serum in seinen physikalischen und immunochemischen Eigenschaften.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Glykoprotein, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S ± 0,^

b) Molekulargewicht von 49.600 ± 4.000;

c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der ct2-Globuline des Humanserums;

d) isoelektrischer Bereich pH 3,8-4,1;

s e) Extinktionskoeffizient E 1 cm, 280 nm = 1% 7,0 ± 0,2;

0 Gehalt von etwa 77 ± 2% a-Aminosäuren mit einem Anteil von 17 ± 2% Leucin und etwa 22% an Kohlenhydraten g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.

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Für die Bestimmung der Parameter wurden folgende analytische Verfahren angewendet:

Die Ultrazentrifugationsanalysen wurden mit einer Ultra-15 Zentrifuge der Firma Beckman, Modell E, durchgeführt. Das Protein wurde 0,2%ig (g/v) in 0,9%iger Kochsalzlösung in die Ultrazentrifugenanalyse eingesetzt. Die Sedimentation erfolgte bei 60 000 U/min und 20°C in einer Überschichtungszelle. Die Registrierung erfolgte unter Einsatz der UV-20 Scanner-Technik bei 280 mm. Eine daraus abzuleitende Molekulargewichtsbestimmung wurde nach der Gleichgewichtsmethode nach Yphantis vorgenommen.

Die isoelektrische Fokussierung wurde mit Hilfe einer von der Firma LKB, Stockholm, Schweden, vertriebenen Appa-25 ratur und den von dort bezogenen Reagenzien durchgeführt. Verwendet wurde eine 440 ml-Säule mit speziellen Puffersubstanzen hierfür im Bereich der pH-Werte 3-6.

Die Kohlenhydratanalyse wurde durchgeführt nach Schultze, Schmidtberger, Haupt (1958) Biochem. Z., Band 30 329, Seiten 490-507.

Die Aminosäureanalyse erfolgte nach Spackman, Stein und Moore (1958), Anal. Chem. 30, Seite 1190. Es wurde verwendet ein Aminosäureanalysator Multichrom B der Firma Beckman.

35 Für die immunologische Bestimmung des neuen Glykoproteins wurde ein Antiserum verwendet, welches durch Immunisierung von Kaninchen über einen Zeitraum von sechs Wochen mit dem isolierten Protein unter Verwendung von komplettem Freund'schen Adjuvans erhalten worden 40 war. Die quantitative Bestimmung des Proteins mit Hilfe dieses Antiserums ist durchführbar nach der Methode von Laurell (1966), Analyt. Biochem., Band 15, Seiten 45-52. Wegen der auffallendsten Parameter des neuen Proteins, nämlich der relativ niedrigen Sedimentationskonstante von 45 3,1S ± 0,2, dem auffallend hohen Gehalt an Leucin und der leichten Charakterisierbarkeit durch die Wanderung bis pH 8,6 im a-2-Bereich der Proteine wird das neue Protein als das Leucin-reiche 3,l-Sa2-Glykoprotein bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur so Herstellung des Leucin-reichen 3,1 S-a:-Glykoproteins. Ausgehend von Lösungen, die dieses Protein enthalten, insbesondere von menschlichem Blutserum, wird das Protein durch mehrere Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung angereichert. Ziel der Anreicherungen ist es jeweils, entweder das 55 Protein möglichst frei von weiteren Serumbestandteilen oder begleitende Serumbestandteile auszufällen und das Leucin-reiche 3,l-S-ot2-Glykoprotein in Lösung zu behalten. Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung des Leucin-reichen 3,1 -S-ci2-Glykoproteins, worin min-60 destens einer der folgenden Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung des Proteins Anwendung findet:

a) Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten Neutralsalzes bis zur Ausfäl-65 lung des Leucin-reichen 3,l-S-a2-Glykoproteins, vorzugsweise von Ammoniumsulfat in einer Menge von 2,4 bis 2,8 M/1 bei neutralem pH-Wert;

; b) Durch Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise

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zur Fraktionierung verwendeten organischen Lösungsmittels bis zu einer Konzentration, bei welcher das Leucin-reiche 3,l-S-rx:-Glykoprotein gerade noch in Lösung verbleibt und begleitende Proteine ausgefällt werden, vorzugsweise Zugabe von 40% (v/v) Äthanol zu einer in schwach saurem pH-Bereich gepufferten Lösung bei einer Temperatur von —8 bis 0°C, vorzugsweise —5°C.

Dieses Fällungsverhalten des Glykoproteins bedeutet, dass es bei den bekannten Plasma-Fraktionierungsverfahren mit Hilfe von Äthanol nach der Methode VI von Cohn (E.J.

Cohn et al. J. Am. Chem. Soc. 68 (1946), Seite 459) in Lösung verbleibt. Der verbleibende alkoholische Überstand dieses Fällungsverfahrens enthält nur noch 1-26 gesamte Plasmaproteine. Dies besagt dem Fachmann weiter, dass das Frak-tionierungsverfahren nach Cohn besonders geeignet ist, um das neue Glykoprotein gegenüber anderen Plasmaproteinen anzureichern.

c) Zugabe von wasserlöslichen Salzen der Akridinbasen, vorzugsweise das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlactat bis zu einer Konzentration von 0,01 Mol/1 in neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich. Dabei fällt das neue 3,l-S-a2-Glyko-protein nicht aus, wohingegen die meisten Plasmaproteine mit Ausnahme der Gammaglobuline durch diese Massnahme gefällt werden.

Demnach erweist sich eine fraktionierte Fällung einer Proteinlösung, welche neben Leucin-reichen 3,l-S-a2-Glykopro-tein noch andere Plasmaproteine enthält, mit Akridinbasen als vorteilhafter Reinigungsschritt für das neue Protein, da hierbei ein grosser Teil der Begleitproteine ausgefällt wird.

d) Zugabe von in der Proteinchemie zur Fällung von Proteinen verwendeten organischen Säuren, vorzugsweise von Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/1, wobei das Leucin-reiche 3,l-S-a>Glykoprotein in Lösung verbleibt.

Von dieser Massnahme ist bekannt, dass sie den Globulin-teil der Plasmaproteine auszufällen vermag. Demnach erweist sie sich ebenfalls als geeignet, um das neue Glykoprotein in Lösung anzureichern.

Statt Trichloressigsäure können auch andere Säuren zur Anreicherung des neuen Glykoproteins eingesetzt werden, wie z.B. Perchlorsäure oder Sulfosalizylsäure. Bei Perchlorsäure liegt die üblicherweise für die Fraktionierung verwendete Endkonzentration zwischen 0,4-0,6 Mol/1. Bei diesen Konzentrationen verbleibt das neue Glykoprotein in Lösung.

e) Erhitzung der das Leucin-reiche 3,1 -S-cc2-Glykoprotein enthaltenden Proteinlösung kurzzeitig auf eine Temperatur nahe 100°C bei neutralem bis schwach saurem pH-Wert. Vorzugsweise wird die sogenannte Hitzekoagulation von Proteinlösungen bei einem pH-Wert von etwa 5 während 5-15 Minuten bei 95-98°C vorgenommen. Dabei zeigt sich, dass nach einer Operation das Leucin-reiche 3,l-S-<X2-Glykopro-tein in Lösung verbleibt. Nur wenige Proteine bleiben unter den gleichen Bedingungen in Lösung. Die meisten fallen unter Koagulation aus der Lösung aus.

f) Entfernung von Elektrolyten aus der das Leucin-reiche 3.1-S-«:-Glykoprotein enthaltenden Lösung. Die Verringerung des Elektrolytengehaltes einer Proteinlösung führt zur Ausfällung der sogenannten Euglobuline. Dazu gehört ein Teil der Lipoproteine, die Makroglobuline, ein Teil der Immunglobuline und Ceruloplasmin um einige als Beispiel zu nennen. Bei dieser als sogenannte Euglobulin-Fällung bezeichneten Massnahme bleibt Leucin-reiche 3,1-S-aj-Gly-koprotein in Lösung.

Die Verringerung der Elektrolyte einer Proteinlösung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe der Dialyse gegen ein wässriges Medium mit verringerter Leitfähigkeit, ggf. gegen destilliertes Wasser. Auch Elektrodialyseverfahren oder die Verringerung der Elektrolyten in Lösung durch Verwendung von Ionenaustauschern sind hierfür geeignet.

g) Molekularsiebfraktionierung der das neue Glykoprotein enthaltenden Lösung mit dem Ziel auf einer Anreiche-

s rung von Proteinen mit einem Molekulargewicht zwischen 45 000 und 55 000 bzw. ein Ausschluss von Proteinen höheren oder niedrigeren Molekulargewichts. Hierfür wird zweckmässig eine Säulenfraktionierung durchgeführt unter Verwendung von Molekularsiebgelen, vorzugsweise von mit io Epichlorhydrin quervernetztem Dextran. Auch andere Gelfiltrationsmedien mit vergleichbaren Ausschluss- bzw. Frak-tionierungsgrenzen sind im Sinne der Erfindung geeignet.

h) Behandlung der Proteinlösung, die das Leucin-reiche 3,l-S-<X2-Glykoprotein enthält mit einem Anionenaustau-

15 scher, vorzugsweise einem solchen, der Aminoäthyl, Diäthyl-aminoäthyl oder Triäthylaminoäthyl als funktionelle Gruppen und Cellulose als Matrix enthält. Das Leucin-reiche 3, l-S-a2-Glykoprotein wird aus einer Lösung mit der Ionenstärke 2 = 0,05 derartige Ionenaustauscher gebunden. Es 20 kann danach mit dem Ionenaustauscher zusammen von den übrigen Proteinen, die in Lösung verbleiben, abgetrennt werden. Das neue Protein lässt sich durch Erhöhung der Leitfähigkeit von Pufferlösungen mit Hilfe von beispielsweise Neutralsalzen wie Kochsalz eluieren und somit gegenüber 25 begleitenden Proteinen anreichern.

i) Elektrophorese in geeigneten Trägermedien und Gewinnung der Zone des ca-Bereiches der Plasmaproteine.

k) Behandlung der das Leucin-reiche 3,1 -S-ci2-Glykopro-tein enthaltenden Lösung mit wasserunlöslichem Calcium-30 phosphat-Hydrat, vorzugsweise mit Hydroxylapatit. Selbst bei niedriger Ionenstärke der Proteinlösung, z.B. solcher von '/iooo Mol/1 Ionen wird das neue Glykoprotein an das unlösliche Phosphat nicht adsorbiert. Bei entsprechender Vorreinigung der das neue Protein enthaltenden Eiweisslösungen 35 stellt der Adsorptionsüberstand bzw. im Säulenchromatogra-phieverfahren der Säulendurchfluss die Lösung eines gereinigten 3,l-S-a2-Glykoproteins dar.

Als letzter von mehreren der vorgenannten Schritte eingesetzt, liefert der Säulendurchfluss das reine Glykoprotein. 40 Durch eine beliebige Kombination von vorstehend dargestellten, in der Proteinchemie üblichen Verfahrensschritten lässt sich das neue Leucin-reiche 3,l-S-oi2-Glykoprotein aus dieses enthaltenden Proteinlösungen, wie z.B. menschlichem Serum oder einer Fraktion daraus, beliebig anreichern und 45 rein darstellen. Die schliesslich anfallenden, nurmehr das Leucin-reiche 3,l-S-a2-Glykoprotein, ggf. noch Salze enthaltende Lösung kann von Elektrolyten befreit und gefriergetrocknet werden.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Leucin-50 reichen 3,l-S-a2-Glykoproteins geht von der bekannten Serumfraktionierung mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-Diamino-akridinlactat und Ammoniumsulfat aus, allgemein bekannt unter der Bezeichnung «Rivanol-Ammoniumsulfat-Ver-fahren», dargestellt in Schultze, Hermanns; Molecular Bio-55 logy of Human Proteins; Elsevier Publishing Company (1966) Seite 265. Bei diesen Verfahren ist das Leucin-reiche 3,1 -S-ct2-Glykoprotein zusammen mit einer Reihe anderer Glykoproteine in einem Abguss angereichert, der als Nebenfraktion bei der Gewinnung von Albumin und Gammaglo-60 bulin aus Humanserum anfällt. Daraus werden in einem ersten Trennungsgang mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-diamino-akridinlactat in einer Konzentration von 0,03 bis 0,06 M/1 eine Reihe begleitender Proteine ausgefällt. Das Fällungsmittel wird durch Zugabe von Chloridionen, vorzugsweise 65 Natriumchlorid, präzipitiert. Zu der Proteinlösung wird ein Ionenaustauscher gegeben, welcher das Leucin-reiche 3,1-S-<X2-Glykoprotein zu binden vermag. Vorteilhaft wird hierfür ein Anionenaustauscher mit funktionellen Aminoäthyl-,

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Diäthylamino- oder Triäthylaminoäthyl-Gruppen verwendet.

Der Ionenaustauscher wird sodann mit einer Pufferlösung steigender Salzkonzentration behandelt. Durch diese Massnahme wird das neue Protein vom Ionenaustauscher wieder abgelöst. Die Lösung wird einem Molekularsiebverfahren, bei welchem Proteine mit einem Molekulargewicht von 100 000-150 000 ausgeschlossen werden, unterworfen. In der niedrig-molekularen Fraktion befindet sich das Leucin-reiche 3,l-S-ct2-Glykoprotein neben anderen, niedrig-mole-kularen Glykoproteinen.

Es erweist sich zweckmässig und nützlich, die lonenaus-tausch-Chromatographie unter etwas variierenden Bedingungen zu wiederholen. Dies kann einerseits durch Änderung der Adsorptions- bzw. Elutionsverhältnisse oder auch durch die Auswahl von Ionenaustauschern unterschiedlicher Basi-zität erfolgen. Von restlichen Verunreinigungen wird das Glykoprotein durch Behandlung mit einem mineralischen Adsorbens, z.B. Hydroxylapatit abgetrennt. Dabei bleiben die begleitenden Proteine an dem Adsorbens gebunden, wonach eine Lösung mit reinem, Leucin-reichen 3,l-S-cc2-Glykoprotein anfällt.

Das Leucin-reiche 3,l-S-ct2-Glykoprotein ist immunogen. Seine parenterale Applikation an Wirbeltiere, vorzugsweise an gebräuchliche Laboratoriumstiere, wie Kaninchen, führt zur Ausbildung von Antikörpern im Blut dieser Tiere.

Danach kann deren Blut gewonnen und das Serum abgetrennt und ggf. hinsichtlich vorhandener Antikörper angereichert werden. Hierzu stehen geläufige Methoden der Plasma-proteinfraktionierung dem Fachmann zur Verfügung. Durch Immunisierung der Versuchstiere mit dem isolierten 3,1-S-CC2-Glykoprotein wurde ein Antiserum erhalten, das streng spezifisch mit dem Immunisierungsantigen reagiert. Kreuzreaktionen mit anderen bisher isolierten Serumproteinen wurden nicht beobachtet.

Das neue Leucin-reiche 3,1 -S-cc2-Glykoprotein erweist sich demnach als wertvolles immunisierendes Agens bei der Herstellung von Antiseren. Diese sind wertvolle diagnostische Reagenzien.

Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung des neuen Glykoproteins für die Herstellung von Antiseren.

Die quantitativen immunologischen Bestimmungen des Proteins mit Hilfe des Elektro-Immunoassay nach Laureil in einer Serummischung von ca. 1000 Spendern ergab einen Durchschnittsgehalt an 3,l-S-cc2-Glykoprotein von 2,1 mg/100 ml Serum.

Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des Leucin-reichen 3,l-S-a2-Glykoproteins in Einzelseren von Erwachsenen zwischen 1,5 und 3,2 mg/100 ml Serum schwankt.

Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert

Beispiel

Ausgangsmaterial für die Herstellung des Leucin-reichen 3,1 -S-cc2-Glykoprotein ist eine Fraktion ausgehend von 25 Liter Humanplasma. Dieses wird mit 0,84% 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlactat bei pH 8,0 behandelt. Aus dem Überstand wird das Fällungsmittel als Chlorid ausgefällt, und entfernt, sodann wird bei pH 7,0 mit 2,0 Mol Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird als gammaglobulinreiche Fraktion abgetrennt und der Überstand folgendem Verfahren unterworfen.

Der Überstand wird durch Ultrafiltration auf 51 eingeengt. Der Eiweissgehalt der Lösung beträgt dann 3%. Die Lösung wird mit einer 0,85%igen Kochsalzlösung am Ultrafilter gewaschen und danach mit 7,5 g 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridin-lactat versetzt. Das dabei entstandene Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zu der überstehenden

Lösung wird Kochsalz bis zu einer Endkonzentration von 5% (g/v) zugegeben. Dabei fällt die Akridinbase als Chlorid aus. Es wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird durch Waschen auf dem Ultrafilter vom Kochsalz befreit und mit 0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0 äquilibriert. Er stellt 3 Liter einer 2,5%igen Proteinlösung dar. Dazu werden 300 g Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Ionenaustau-scher zugegeben, 1 Stunde gerührt, am Filter abgenutscht und der Filterrückstand mit 0,02 M/1 Phosphat-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Darauf wird der Ionenaustauscher mit einer 1M NaCl-Lösung gewaschen. Der Durchfluss wird zum Teil entfernt. Eine Fraktion, welche das Leucin-reiche Glykoprotein enthält, wird weiter verarbeitet. Man führt mit dieser eine Gelfiltration an SEPHADEX G 150 durch; die Gelfiltration wird in einer Säule vom Durchmesser 20 cm und einer Höhe von 1 m, welche mit SEPHADEX|R| G 150 gefüllt ist, durchgeführt. Als Elutionsmittel dient Trishydroxymethylamino-ethan-HCl-Puffer, 0,1 molar, vom pH 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl. Dabei wird eine hochmolekulare Fraktion abgetrennt und eine niedermolekulare Fraktion, welche das Leucin-reiche 3,l-S-a2-Glykoprotein enthält, gewonnen.

Anschliessend wird eine Säule (ca. 500 ml, 5 x45 cm) mit Diäthylaminoäthyl-SEPHADEX Ionenaustauscher gefüllt, die das Leucin-reiche 3,l-S-a2-Glykoprotein enthaltende Fraktion auf die Säule aufgetragen und die Eluation der Substanzen mit einem linearen Salzgradienten von 0,006 M Tris-hydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,6 ohne Salzzusatz bis 0,006 M Trishydroxymethylaminome-than-Puffer HCl vom pH-Wert 8,6, enthaltend 0,2 M NaCl/1, angelegt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Es werden diejenigen Fraktionen weiterverarbeitet, welche durch eine Kontroll-Elektrophorese eine elektrische Beweglichkeit im ca-Bereich der Proteine aufweisen. Zur Anreicherung des Proteins werden die Fraktionen mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70 % versetzt. Der dabei entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der für die folgenden QAE-Chromatographie verwendet wird.

Anschliessend wird eine weitere Chromatographie an QAE-SEPHADEX in einer vergleichbaren Versuchsanordnung durchgeführt. Zur Elution wird ein linearer Salzgradient von 0,08 Mol Natriumacetat-Puffer pH 5,5 bis 0,35 Mol NatriumacetatpufferpH 5,5 angelegt. Die durch Elektrophorese charakterisierten Fraktionen werden gewonnen und weiterverarb eitet.

Zunächst erfolgt eine Dialyse gegen 0,001 Mol Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,0. Das gegen diesen Puffer äquilibrierte Produkt wird schliesslich auf eine mit Hydroxylpatit gefüllte Säule aufgetragen (Säulengrösse 4x 12 cm). Der Säuleninhalt wird eluiert mit 0,001 Mol Phosphatpuffer pH 7,0. Der Durchfluss stellt reines Leucin-reiches 3,l-S-a2-Glyko-protein dar.

Ausgehend von 25 Litern Humanplasma werden 100 mg des erfindungsgemässen Proteins erhalten.

Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzungen:

Aminosäuren Mol % des Variationskoeffizient

Aminosäureanteils %

Lysin 3,87 5,90

Histidin 2,23 11,28

Arginin 4,65 7,68

Asparaginsäure 11,45 1,49

Threonin 3,87 6,26

Serin 6,43 2,36

Glutaminsäure 10,72 2,51

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Aminosäuren

Mol % des Aminosäureanteils

Variationskoeffizient

%

Prolin

7,04

4,43

Glycin

7,32

2,31

Alanin

6,65

1,97

Vi Cystin

1,21

9,83

Valin

4,48

3,78

Methionin

0,75

5,81

Isoleucin

1,29

3,16

Leucin

22,05

5,79

Tyrosin

0,81

19,53

Phenylalanin

3,23

1,39

Tryptophan

1,60

11,69

5 643 860

Kohlenhydrat

Gew.%

Galaktose

4,1

±0,3

Mannose

3,8

±0,3

Glucose

0

Fucose

0,3

±0,1

Xylose

0

N-Acetylhexosamin

8,1

±0,5

N-Acetylneuraminsäure

6,6

±0,4

Summe (Kohlenhydratanteil)

22,9

±1,6

Die Streubreiten sind methodisch bedingte Fehlergrenzen. .

B

Claims

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1. Glykoprotein aus menschlichem Serum, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S ±0,2;

b) Molekulargewicht von 49 000 ± 4000;

c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der cc-Globuline des Humanserums;

d) isoelektrischer Bereich pH 3,8-4,1;

e) Extinktionskoeffizient E2somm = 7,0 + 2,0;

f) Gehalt von etwa 77 ± 2% a-Aminosäuren mit einem Anteil von 17% ± 2% Leucin 23 + 2% an Kohlenhydraten;

g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.

2. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine das Protein enthaltende Lösung mindestens einer der folgenden Massnahmen zur Reindarstellung des Proteins unterworfen wird;

a) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Proteins;

b) Zugabe von organischen Lösungsmitteln bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;

c) Zugabe eines wasserlöslichen Salzes einer Akridinbase bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;

d) Zugabe von organischen Säuren bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;

e) Erhitzung auf eine Temperatur zwischen 95 und 100°C bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;

f) Verringerung des Elektrolytgehaltes bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;

g) Molekularsiebfraktionierung und Gewinnung der Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 45 000 und

55 000;

h) Adsorption des Proteins an einen Anionenaustauscher und Elution davon;

i) Elektrophorese und Gewinnung der cu-Zone des Humanserums;

k) Adsorption von Begleitprotein mit wasserunlöslichem Calciumphosphat-Hydrat;

wonach jeweils die das Protein enthaltende Fraktion gewonnen wird.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Antiseren des Glykoproteins nach Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass man Wirbeltiere mit dem Glykoprotein nach Anspruch 1 immunisiert und aus deren Blut das Anti-serum gewinnt.

5. Verwendung des Antiserums gemäss Anspruch 3 als diagnostisches Reagenz.