DE2718325A1 - Leucinreiches 3,1-s-alpha tief 2 -glykoprotein, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung - Google Patents

Leucinreiches 3,1-s-alpha tief 2 -glykoprotein, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung

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DE2718325A1 DE19772718325 DE2718325A DE2718325A1 DE 2718325 A1 DE2718325 A1 DE 2718325A1 DE 19772718325 DE19772718325 DE 19772718325 DE 2718325 A DE2718325 A DE 2718325A DE 2718325 A1 DE2718325 A1 DE 2718325A1
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg/Lahn
Aktenzeichen: Ma 292
HOE 77/B 007
Datum: 22. April 1977 12. April 1977
Leucinreiches 3 ,1 -S-Oj-.-Glykoprotein,
Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung
Die Erfindung betrifft ein neues Glykoprotein, dessen Herstellung aus menschlichen Seren sowie dessen Verwendung für die Gewinnung von gegen das Glykoprotein gerichteten Antiseren, mit welchen der Gehalt des Glykoproteins in Körperflüssigkeiten nachgewiesen und bestimmt werden kann.
Das neue Glykoprotein unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Proteinen aus menschlichem Serum in seinen physikalischen und immunochemisehen Eigenschaften.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Glykoprotein, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S - 0,2
b) Molekulargewicht von 49.600 - 4.000;
c) elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich
der06--GlObUline des Humanserums;
d) isoelektrischer Bereich pH 3,8 - 4,1;
e) Extinktionskoeffizient E 1 cm, 280 mm = 1 % 7,0'i 0,2;
f) Gehalt von etwa 77 - 2 % oi-Aminosäuren mit einem Anteil
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von 17-2 % Leucin und etwa 22 % an Kohlenhydraten
g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das GIy koprotein gerichteten Antikörpern.
Für die Bestimmung der Parameter wurden folgende analytischen Verfahren angewendet:
Die Ultrazentrifugationsanalysen wurden mit einer Ultrazentrifuge der Firma Beckman, Modell E, durchgeführt. Das Protein wurde 0,2%ig (g/v) in 0,9 %iger Kochsalzlösung in die Ultrazentrifugenanalyse eingesetzt. Die Sedimentation erfolgte bei 60 000 U/min und 200C in einer Uberschichtungszelle. Die Registrierung erfolgte unter Einsatz der UV-Scanner-Technik bei 280 mm. Eine daraus abzuleitende Molekulargewichtsbestimmung wurde nach der Gleichgewichtsmethode nach Yphantis vorgenommen.
Die isoelektrische Fokussierung wurde mit Hilfe einer von der Firma LKB, Stockholm, Schweden, vertriebenen Apparatur und den von dort bezogenen Reagenzien durchgeführt. Verwendet wurde eine 440 ml-Säule mit speziellen Puffersubstanzen hierfür im Bereich der pH-Werte 3-6.
Die Kohlenhydratanalyse wurde durchgeführt nach Schultze, Schmidtberger, Haupt (1958) Biochem. Z., Band 329, Seiten 490 - 507.
Die Aminosäureanalyse erfolgte nach Spackman, Stein und Moore (1958), Anal. Chem. _3_0' Seite 1190. Es wurde verwendet ein Aminosäureanalysator Multichrom B der Firma Beckman.
Für die immunologische Bestimmung des neuen Glykoproteins wurde ein Antiserum verwendet, welches durch Immunisierung von Kaninchen über einen Zeitraum von sechs Wochen mit dem isolierten Protein unter Verwendung von komplettem Freund'sehen Adjuvans erhalten worden war. Die quantitative Bestimmung des Proteins mit Hilfe dieses Antiserums ist durchführbar nach der Methode von Laurell (1966), Analyt. Biochem., Band ^5, Seiten 45 - 52.
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Wegen der auffelndsten Parameter des neuen Proteins, nämlich der relativ niedrigen Sedimentationskonstante von 3,1S - 0,2, dem auffallend hohen Gehalt an Leucin und der leichten Charakterisierbarkeit durch die Wanderung bis pH 8,6 im c£-2~Bereich der Proteine wird das neue Protein als das Leucinreiche 3,i-SCt^-Glykoprotein bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Leucinreichen 3,1S-C62~Glykoproteins. Ausgehend von Lösungen, die dieses Protein enthalten, insbesondere von menschlichem Blutserum, wird das Protein durch mehrere Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung angereichert. Ziel der Anreicherungen ist es jeweils, entweder das Protein möglichst frei von weiteren Serumbestandteilen oder begleitende Serumbestandteile auszufällen und das Leucinreiche 3,1S<X2~Glykopritein in Lösung zu behalten. Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung des Leucinreichen 3,i-S-CXj-Glykoprotein, worin mindestens einer der folgenden Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung des Proteins Anwendung findet:
a) Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten Neutralsalzes bis zur Ausfällung des Leucin-reichen 3,1-S-Q^-Glykoproteins, vorzugsweise von Ammoniumsulfat in einer Menge von 2,4 bis 2,8 M/l bei neutralem pH-Wert;
b) Durch Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten organischen Lösungsmittels bis zu einer Konzentration, bei welcher das Leucin-reiche 3,1-S-ü62~Glykoprotein gerade noch in Lösung verbleibt und begleitende Proteine ausgefüllt werden, vorzugsweise Zugabe von 40 % (v/v) Äthanol zu einer in schwach saurem pH-Bereich gepufferten Lösung bei einer Temperatur von -8 bis 00C, vorzugsweise -5°C.
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- 4"-G
Dieses Fällungsverhalten des Glykoproteins bedeutet, daß es bei den bekannten Plasma-Fraktionierungsverfahren mit Hilfe von Äthanol nach der Methode VI von Cohn (E.J. Cohn et al. J.Am.Chem.Soc. 6Q (1946), Seite 459) in Lösung verbleibt. Der verbleibende alkoholische überstand dieses Fällungsverfahrens enthält nur noch 1 - 26 gesamte Plasmaproteine. Dies besagt dem Fahcmann weiter, daß das Fraktionierungsverfahren nach Cohn besonders geeignet ist, um das neue Glykoprotein gegenüber anderen Plasmaproteinen anzureichern.
c) Zugabe von wasserlöslichen Salzen der Akridinbasen, Vorzugs, weise das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlactat bis zu einer Konzentration von 0,01 Mol/l in neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich. Dabei fällt das neue 3, 1Sc£--Glykoprotein nicht aus, wohingegen die meisten Plasmaproteine mit Ausnahme der Gammaglobuline durch diese Maßnahme gefällt werden.
Demnach erweist sich eine fraktionierte Fällung einer Proteinlösung, welche neben Leucin-reichen 3,1So62-Glykoprotein noch andere Plasmaproteine enthält, mit Akridinbasen als vorteilhafter Reinigungsschritt für das neue Protein, da hierbei ein großer Teil der Begleitproteine ausgefällt wird.
d) Zugabe von in der Proteinchemie zur Fällung von Proteinen verwendeten organischen Säuren, vorzugsweise von Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/l, wobei das Leucin-reiche3,1-S-o62-Glykoprotein in Lösung verbleibt.
Von dieser Maßnahme ist bekannt, daß sie den Globulinteil der Plasmaproteine auszufällen vermag. Demnach erweist sie sich ebenfalls als geeignet, um das neue Glykoprotein in Lösung anzureichern.
Statt Trichloressigsäure können auch andere Säuren zur Anreicherung des neuen Glykoproteins eingesetzt werden, wie z.B.
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Perchlorsäure oder Sulfosalizylsäure. Bei Perchlorsäure liegt die üblicherweise für die Fraktionierung verwendete Endkonzentration zwischen 0,4 - 0,6 Mol/l. Bei diesen Konzentrationen verbleibt das neue Glykoprotein in Lösung.
e) Erhitzung der das Leucin-reiche 3,1-S-O^ -Glykoprotein enthaltenden Proteinlösung kurzzeitig auf eine Temperatur nahe 1000C bei neutralem bis schwach saurem pH-Wert. Vorzugsweise wird die sogenannte Hitzekoagulation von Proteinlsöungen bei einem pH-Wert von eta 5 während 5-15 Minuten bei 95 - 980C vorgenommen. Dabei zeigt sich, daß nach einer Operation das Leucin-reiche 3,1-S-O^-Glykoprotein in Lösung verbleibt. Nur wenige Proteine bleiben unter den gleichen Bedingungen in Lösung. Die meisten fallen unter Koagulation aus der Lösung aus.
f) Entfernung von Elektrolyten aus der^ das Leucin-reiche 3,1-S-Oi2-Glykoprotein enthaltenden Lösung. Die Verringerung des Elektrolytengehaltes eine Proteinlösung führt zur Ausfällung der sogenannten Euglobuline. Dazu gehört ein Teil der Lipoproteine, die Makroglobuline, ein Teil der Immunglobuline und Ceruloplasmin um einige als Beispiel zu nennen. Bei dieser als sogenannte Euglobulin-Fällung bezeichneten Maßnahme bleibt Leucin-reiche 3,1-S-OiL-Glykoprotein in Lösung.
Die Verringerung der Elektrolyte einer Proteinlösung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe der Dialyse gegen ein wässriges Medium mit verringerter Leitfähigkeit, ggf. gegen destilliertes Wasser. Auch Elektrodialyseverfahren oder die Verringerung der Elektrolyten in Lösung durch Verwendung von Ionenaustauschern sind hierfür geeignet.
g) Molekularsiebfraktionierung der das neue Glykoprotein enthaltenden Lösung mit dem Ziel auf einer Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht zwischen 45.000 und 55.000 bzw. ein Ausschluß von Proteinen höheren oder niedrigeren Molekulargewichts. Hierfür wird zweckmäßig eine Säulenfraktionierung durchgeführt unter Verwendung von Molekularsiebgelen, vor-
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zugsweise von mit Epichlorhydrin quervernetztem Dextran. Auch andere Gelfiltrationsmedien mit vergleichbaren Ausschluß- bzw. Fraktionierungsgrenzen sind im Sinne der Erfindung geeignet.
h) Behandlung der Proteinlösung, die das Leucin-reiche 3,1-S-Ou--Glykoprotein enthält mit einem Anionenaustauscher, vorzugsweise einem solchen, der Aminoäthyl, Diäthylaminoäthyl oder Triäthylaminoäthyl als funktioneile Gruppen und Cellulose als Matrix enthält. Das Leucin-reiche 3,1-S-<X~~Glykoprotein wird aus einer Lösung mit der Ionenstärke 2 = 0,05 derartige Ionenaustauscher gebunden. Es kan danach mit dem Ionenaustauscher zusammen von den übrigen Proteinen, die in Lösung verbleiben, abgetrennt werden. Das neue Protein läßt sich durch Erhöhung der Leitfähigkeit von Pufferlösungen mit Hilfe von beispielsweise Neutralsalzen wie Kochsalz eluieren und somit gegenüber begleitenden Proteinen anreichern.
i) Elektrophorese in geeigneten Trägermedien und Gewinnung der Zone
Plasmaproteine.
k) Behandlung der das Leucin-reiche"3,1-S-<X2~Glykoprotein enthaltenden Lösung mit wasserunlöslichen Calciumphosphat-Hydrat, vorzugsweise mit Hydroxylapatit. Selbst bei niedriger Ionenstärke der Proteinlösung, z.B. solche von 1/1000 Mol/l Ionen wird das neue Glykoprotein an das unlösliche Phosphat nicht ad sorbiert. Bei entsprechender Vorreinigung der das neue Protein enthaltenden Eiweißlösungen stellt der Adsorptionsüberstand bzw. im Säulenchormatographieverfahren der Säulendurchfluß die Lösung eines gereinigten 3,1-S-06 -Glykoprotein dar.
Als letzter von mehreren der vorgenannten Schritte eingesetzt, liefert der Säulendurchfluß das reine Glykoprotein.
Durch eine beliebige Kombination von vorstehend dargestellten, in der Proteinchemie üblichen Verfahrensschritten läßt sich das neue Leucin-reiche 3,i-S-OC^-Glykoprotein aus dieses enthaltenden Prote-
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inlösungen, wie z.B. meschlichem Serum oder einer Fraktion daraus, beliebig anreichern und rein darstellen. Die schließlich anfallenden, nurmehr das Leucin-reiche 3,1-S- 2~G1ykoProtein' 99f· noch Salze enthaltende Lösung kann von Elektrolyten befreit und gefriergetrocknet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Leucin-reichen 3,1-S-Ct_-Glykoproteins gehr von der bekannten Serumfraktionierung mit Hilfe von 2-A'thoxy-6,9-Diaminoakridinlactat und Ammoniumsulfat aus, allgemein beaknnt unter der Bezeichnung "Rivanol-Ammoniumsulfat-Verfahren", dargestellt in Schultze, Hermanns; Molecular Biology of Human Proteins; Elsevier Publishing Company (1966) Seite 265. Bei diesen Verfahren ist das Leucin-reiche 3,1-S-OC2-Glykoprotein zusammen mit einer Reihe anderer Glykoproteine in einem Abguß angereichert, der als Nebenfraktion bei der Gewinnung von Albumin und Gammaglobulin aus Humanserum anfällt. Daraus werden in einem ersten Trennungsgang mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-diaminoakridinlactat in einer Konzentration von 0,03 bis 0,06 M/l eine Reihe begleitender Proteine ausfällt. Das Fällungsmittel wird durch Zugabe von Chloridionen, vorzugsweise Natriumchlorid, präzipitiert. Zu der Proteinlösung wird ein Ionenaustauscher gegeben, welcher das Leucinreiche 3,1-S-<X2-Glykoprotein zu binden vermag. Vorteilhaft wird hierfür ein Anionenaustauscher mit funktionellen Aminoäthyl-, Diäthylamino- oder Triäthylaminoäthyl-Gruppen verwendet.
Der Ionenaustauscher wird sodann mit einer Pufferlösung steigender Salzkonzentration behandelt. Durch diese Maßnahme wird das neue Protein vom Ionenaustauscher wieder abgelöst. Die Lösung wird einem Molekularsiebverfahren, bei welchem Proteine mit einem Molekulargewicht von 100 000 - 150 000 ausgeschlossen werden, unterworfen. In der niedrig-molekularen Fraktion befindet sich das Leucinreiche 3,1-S-o^2~G^yk°Protein ne^en anderen, niedrig-molekularen Glykoproteinen.
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AO
Es erweist sich zweckmäßig und nützlich, die Ionenaustausch-Chromatographie unter etwas variierenden Bedingungen zu wiederholen. Dies kann einerseits durch Änderung der Adosrptions- bzw. Elutionsverhältnisse oder auch durch die Auswahl von Ionenaustauschern unterschiedlicher Basizität erfolgen. Von restlichen Verunreinigungen wird das Glykoprotein durch Behandlung mit einem mineralischen Adsorbens, z.B. Hydroxylapatit abgetrennt. Dabei bleiben doe begleitenden Proteine an dem Adsorbens gebunden, wonach eine Lösung mit reinem, Leucin-reichen 3,1-S-ctA-Glykoprotein anfällt.
Das Leucin-reiche 3,1-S-Cl2-Glykoprotein ist immunogen. Seine parenterale Applikation an Wirbeltiere, vorzugsweise an gebräuchliche Laboratoriumstiere wie Kaninchen, führt zur Ausbildung von Antikörpern im Blut dieser Tiere. Danach kann deren Blut gewonnen und das Serum abgetrennt und ggf. hinsichtlich vorhandener Antikörper angereichert werden. Hierzu stehen geläufige Methoden der Plasmaproteinfraktionierung dem Fachmann zur Verfügung. Durch Immunisierung der Versuchstiere mit dem isolierten 3,1-S-cx^-Glykoprotein wurde ein Antiserum erhalten, das streng spezifisch mit dem Immunisierungsantigen reagiert. Kreuzreaktionen mit anderen bisher isolierten Serumproteinen wurden nicht beobachtet.
Das neue Leucin-reiche 3,1-S-O*-Glykoprotein erweist sich demnach als wertvolles immunisierendes Agens bei der Herstellung von Antiseren. Diese sind wertvolle diagnostische Reagenzien.
Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung des neuen GIykoproteins für die Herstellung von Antiseren.
Die quantitativen immunologischen Bestimmungen des Proteins mit Hilfe des Elektro-Immunoassay nach Laurell in einer Serummischung von ca. 1.000 Spendern ergab einen Durchschnittsgehalt an 3,1-Glykoprotein von 2,1 mg/100 ml Serum. ,
Es wurde festgestellt, daß die Konzentration des Leucin-reichen
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- sr-M
3,1-S-ok-Glykoproteins in Einzelseren von Erwachsenen zwischen 1,5 und 3,2 mg/100 ml Serum schwankt.
Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert.
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Beispiel
Ausgangsmaterial für die Herstellung des Leucin-reichen 3,1-S-, Glykoprotein ist eine Fraktion ausgehend von 25 Liter Humanplasma Dieses wird mit 0,84 % 2-Ä'thoxy-6,9-Diaminoakridinlactat bei pH 8,0 behandelt. Aus dem Überstand wird das Fällungsmittel als Chlorid ausgefällt, und entfernt, sodann wird bei pH 7,0 mit 2,0 Mol Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird als Gammaglobulinreiche Fraktion abgetrennt und der überstand folgendem Verfahren unterworfen.
Der überstand wird durch Ultrafiltration auf 5 1 eingeengt. Der Eiweißgehalt der Lösung beträgt dann 3 %. Die Lösung wird mit einer 0,85 %igen Kochsalzlösung am Ultrafilter gewaschen und danach mit 7,5 g 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridon-lactat vorsetzt. Das dabei entstandene Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung wird Kochsalz bis zu einer Endkonzentration von 5 % (g/v) zugegeben. Dabei fällt die Akridinbase als Chlorid aus. Es wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der überstand wird durch Waschen auf dem Ultrafilter vom Kochsalz befreit und mit 0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0 äquilibriert. Er stellt 3 Liter einer 2,5 %igen Proteinlsöung dar. Dazu werden 300 g Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Ionenaustauscher zugegeben, 1 Stunde gerührt, am Filter abgenutscht und der Filterrückstand mit 0,02 M/l Phosphat-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Darauf wird der Ionenaustauscher mit einer 1M NaCl-Lösung gewaschen. Der Durchfluß wird zum Teil entfernt. Eine Fraktion, welche das Leucin-reiche Glykoprotein enthält wird weiter verarbeitet. Man führt mit dieser eine Gelfiltration an SEPHADEX G 150 durch die Gelfiltration wird in einer Säule vom Durchmesser 20 cm und einer Höhe von 1 m, welche mit SEPHADEX* ' G 150 gefüllt ist, durchgeführt. Als Elutionsmittel dient Trishydroxymethylaminoethan-HCl-Puffer, 0,1 molar, vom pH 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl. Dabei wird eine hochmolekulare Fraktion abgetrennt und eine niedermolekulare Fraktion, welche das Leucinreiche 3,1-S-o6_-Glykoprotein enthält, gewonnen.
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Anschließend wird eine Säule (ca. 500 ml, 5x45 cm) mit Diäthylaminoäthyl-SEPHADEX Ionenaustauscher gefüllt, die das Leucin-reiche 3,1-S-06?-Glykoprotein enthaltende Fraktion auf die Säule aufgetragen und die Elution der Substanzen mit einem linearen Salzgradienten von 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,6 ohne Salzzusatz bis 0,006 M Trishydroxymethylamin-omethan-Puffer HCl vom pH-Wert 8,6, enthaltend 0,2 M NaCl/1, angelegt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Es werden diejenigen Fraktionen weiterverarbeitet, welche durch eine Kontroll-Elektrophorese eine elektrische Beweglichkeit im 2~"Berei-cn der Proteine aufweisen. Zur Anreicherung des Proteins werden die Fraktionen mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70 % versetzt. Der dabei entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der für die folgenden QAE-Chromatographie verwendet wird.
Anschließend wird eine weitere Chromatographie an QAE-SEPHADEX in einer vergleichbaren Versuchsanordnung durchgeführt. Zur Elution wird ein linearer Salzgradient von 0,08 Mol Natriumacetat-Puffer pH 5,5 bis 0,35 Mol Matriumacetatpuffer pH 5,5 angelegt. Die durch Elektrophorese charakterisierten Fraktionen werden gewonnen und weiterverarbeitet.
Zunächst erfolgt eine Dialyse gegen 0,001 Mol Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,0. Das gegen diesen Puffer äquilibrierte Produkt wird schließlich auf eine mit Hydroxylpatit gefüllte Säule aufgetragen (Säulengröße 4 χ 12 cm). Der Säuleninhalt wird eluiert mit 0,001 Mol Phosphatpuffer pH 7,0. Der Durchfluß stellt reines Leucinreiches 3,1-S-<X2~Glykoprotein dar.
Ausgehend von 25 Litern Humanplasma werden 100 mg des erfindungsgemäßen Proteins erhalten.
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Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzungen:
AMINOSÄUREN Mol % des
Aminosäure
anteils		 0, 3 Variations-
koeffizien %
Lysin 3,87 0, 3 5,90
Histidin 2,23 11,28
Arginin 4,65 0, 1 7,68
Asparaginsäure 11,45 1,49
Threonin 3,87 0, 5 6,26
Serin 6,43 0, 4 2,36
Glutaminsäure 10,72 2,51
Prolin 7,04 4,43
Glycin 7,32 2,31
Alanin 6,65 1,97
1/2 Cystin 1,21 9,83
Valin 4,48 3,78
Methionin 0,75 5,81
Isoleucin 1,29 3,16
Leucin 22,05 5,79
Tyrosin 0,81 19,53
Phenylalanin 3,23 1,39
Tryptophan 1,60 11,69
KOHLENHYDRAT Gew. %
Galaktose 4,1 -
Mannose 3,8 -
Glucose O
Fucose 0,3 -
Xylose 0
N-Acetylhexosamin 8,1 -
N-Acetylneuraminsäure 6,6 -
Summe (Kohlenhydratanteil)22,9
- 1,6
809843/0513
Die Streubreiten sind methodisch bedingte Fehlergrenzen.
809843/0513

Claims (6)

  1. HOE 77/B 007
    Patentansprüche
    Glykoprotein aus menschlichem Serum, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
    a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S - 0,2;
    b) Molekulargewicht von 49 000 - 4 000;
    c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der C£~~Globuline des Humanserums;
    d) isoelektrischer Bereich pH 3,8 - 4,1;
    e) Extinktionskoeffizient E 1 cm^ 280 ^n = 7,0 - 2,0;
    f) Gehalt von etwa 77 - 2 % oc--Aminosäuren mit einem Anteil
    von 17 % - 2 % Leucin 23 - 2 % an .Kohlenhydraten;
    g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine das Protein enthaltende Lösung mindestens einer der folgenden Maßnahmen zur Reindarstellung des Prtoeins unterworfen wird;
    a) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Proteins;
    b) Zugabe von organischen Lösungsmitteln bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;
    c) Zugabe eines wasserlöslichen Salzes einer A. ridinbase bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;
    d) Zugabe von organischen Säuren bis zur Ausfällung von Begleitproteinen ;
    e) Erhitzung auf eine Temperatur zwischen 95 und 1000C bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;
    f) Verringerung des Elektrolytgehaltes bis zur Ausfällung von Begleitproteinen;
    g) Moleklularsiebfraktionierung und Gewinnung der Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 45 000 und 55 000;
    809843/0513 original inspected
    HOE 77/B 007
    h) Adsorption des Proteins an einen Anionenaustauscher und Elution davon;
    i) Elektrophorese und Gewinnung der O^-Zone des Humanserums;
    k) Adsorption von Belgeitprotein mit wasserunslöslichem CaI-ciumphosphat-Hydrat;
    wonach jeweils die das Puctein enthaltende Fraktion gewonnen wird.
  3. 3. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antiseren.
  4. 4. Antiseren des Glykoproteins gemäß Anspruch 1.
  5. 5. Verwendung des Antiserums gemäß Anspruch 4 als diagnostisches Reagenz.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Wirbeltiere mit dem Glykoprotein gemäß Anspruch 1 immunisiert und aus deren Blut das Atinserum gewinnt.
    8098 A3 /0513
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