AT369265B - Verfahren zur herstellung eines antiserums gegen ein leucinreiches 3,1s-alpha2-glykoprotein - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen ein leucinreiches   3,       2 -Glykoprotein   besteht in seinem Wesen darin, dass man Tiere nach bekannten Methoden mit einem leucinreichen   3, 1S-a2 -Glykoprotein   mit folgenden Parametern : a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge   3, 1S 0, 2 ;   b) Molekulargewicht von   49000 : ! : 4000 ;   
 EMI1.2 
 f) Gehalt von etwa 77   2% a-Aminosäuren   mit einem Anteil von 17 2% Leucin, 23 2% an
Kohlenhydraten ; g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern, immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewinnt. 



   Das erfindungsgemäss zur Immunisierung von Tieren eingesetzte neue Glykoprotein unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Proteinen aus menschlichem Serum in seinen physikalischen und immunochemischen Eigenschaften. 



   Für die Bestimmung der Parameter wurden folgende analytische Verfahren angewendet :
Die Ultrazentrifugationsanalysen wurden mit einer Ultrazentrifuge der Firma Beckman, Modell E, durchgeführt. Das Protein wurde 0, 2% ig (gew. /vol.) in   0, 9%iger Kochsalzlösung   in die Ultrazentrifugenanalyse eingesetzt. Die Sedimentation erfolgte bei 60000 Umdr/min und   20 C   in einer Überschichtungszelle. Die Registrierung erfolgte unter Einsatz der UV-Scanner-Technik bei 280 mm. 



  Eine daraus abzuleitende Molekulargewichtsbestimmung wurde nach der Gleichgewichtsmethode nach Yphantis vorgenommen. 



   Die isoelektrische Fokussierung wurde mit Hilfe einer von der Firma LKB, Stockholm, Schweden, vertriebenen Apparatur und den von dort bezogenen Reagenzien durchgeführt. Verwendet wurde eine 440   ml-Säule   mit speziellen Puffersubstanzen hiefür im Bereich der PH-Werte 3 bis 6. 



   Die Kohlenhydratanalyse wurde durchgeführt nach Schultze, Schmidtberger, Haupt (1958), Biochem. Z., Band 329, Seiten 490 bis 507. 



   Die Aminosäureanalyse erfolgte nach Spackman, Stein und Moore   (1958),   Anal. Chem. 30, Seite 1190. Es wurde verwendet ein Aminosäureanalysator Multichrom B der Firma Beckman. 



   Für die immunologische Bestimmung des neuen Glykoproteins wurde ein Antiserum verwendet, welches durch Immunisierung von Kaninchen über einen Zeitraum von 6 Wochen mit dem isolierten Protein unter Verwendung von komplettem Freudlschen Adjuvans erhalten worden war. Die quantitative Bestimmung des Proteins mit Hilfe dieses Antiserums ist durchführbar nach der Methode von Laurell (1966), Analyt. Biochem., Band 15, Seiten 45 bis 52. 



   Wegen der auffallendsten Parameter des neuen Proteins, nämlich der relativ niedrigen Sedi- 
 EMI1.3 
 den, die dieses Protein enthalten, insbesondere von menschlichem Blutserum ; das Protein wird dabei durch mehrere Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung angereichert. Ziel der Anreicherungen ist es jeweils, entweder das Protein möglichst frei von weiteren Serumbestandteilen oder begleitende Serumbestandteile auszufällen und das leucinreiche   3,      2 -Glykoprotein   in Lösung zu behalten.

   Zur Herstellung des leucinreichen   3, IS-a 2 -Glykoproteins   kann demnach mindestens einer der folgenden Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung des Proteins Anwendung finden : a) Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten Neutral- salzes bis zur Ausfällung des leucinreichen   3,     IS-o-Glykoproteins,   vorzugsweise von
Ammoniumsulfat in einer Menge von 2, 4 bis 2, 8 Mol/1 bei neutralem   PH-Wert ;

     b) Durch Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten organischen Lösungsmittels bis zu einer Konzentration, bei welcher das leucinreiche 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
3,   -Glykoprotein   gerade noch in Lösung verbleibt und begleitende Proteine ausgefällt werden, vorzugsweise Zugabe von 40%   (Vol./Vol.)   Äthanol zu einer in schwach saurem
PH-Bereich gepufferten Lösung bei einer Temperatur von-8 bis   0 C,   vorzugsweise   - 5 C.    



   Dieses Fällungsverhalten des Glykoproteins bedeutet, dass es bei den bekannten Plasma- - Fraktionierungsverfahren mit Hilfe von Äthanol nach der Methode VI von Cohn (E. J. Cohn et. al. J. Am. Chem. Soc. 68 [1946], Seite 459) in Lösung verbleibt. Der verbleibende alkoholische Überstand dieses Fällungsverfahrens enthält nur noch 1 bis 26 gesamte Plas- maproteine. Dies besagt dem Fachmann weiter, dass das Fraktionierungsverfahren nach
Cohn besonders geeignet ist, um das neue Glykoprotein gegenüber andern Plasmaproteinen anzureichern. c) Zugabe von wasserlöslichen Salzen der Akridinbasen, vorzugsweise das 2-Äthoxy-6, 9-Di- aminoakridinlactat bis zu einer Konzentration von 0, 01 Mol/1 im neutralen bis schwach alkalischen PH-Bereich.

   Dabei fällt das neue   3, lS-a -Glykoprotein   nicht aus, wohingegen die meisten Plasmaproteine mit Ausnahme der Gammaglobuline durch diese Massnahme gefällt werden. 



   Demnach erweist sich eine fraktionierte Fällung einer Proteinlösung, welche neben leucin-   reichem     3,      2 -Glykoprotein   noch andere Plasmaproteine enthält, mit Akridinbasen als vorteilhafter Reinigungsschritt für das neue Protein, da hiebei ein grosser Teil der Begleit- proteine ausgefällt wird. d) Zugabe von in der Proteinchemie zur Fällung von Proteinen verwendeten organischen Säu- ren, vorzugsweise von Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/l, wobei das leucinreiche   3, IS-a 2-Glykoprotein   in Lösung verbleibt. 



   Von dieser Massnahme ist bekannt, dass sie den Globulinteil der Plasmaproteine auszufällen vermag. Demnach erweist sie sich ebenfalls als geeignet, um das neue Glykoprotein in
Lösung anzureichern. 



   Statt Trichloressigsäure können auch andere Säuren zur Anreicherung des neuen Glyko- proteins eingesetzt werden, wie   z. B.   Perchlorsäure oder Sulfosalizylsäure. Bei Perchlorsäure liegt die üblicherweise für die Fraktionierung verwendete Endkonzentration zwischen 0,4 bis 0, 6 Mol/l. Bei diesen Konzentrationen verbleibt das neue Glykoprotein in Lösung. 
 EMI2.1 
 bleiben unter den gleichen Bedingungen in Lösung. Die meisten fallen unter Koagulation aus der Lösung aus. f) Entfernung von Elektrolyten aus der das leucinreiche   S.   -Glykoproteins enthaltenden
Lösung. Die Verringerung des Elektrolytengehaltes einer Proteinlösung führt zur Ausfällung der sogenannten Euglobuline. Dazu gehören ein Teil der Lipoproteine, die Makroglobulin, ein Teil der Immunglobuline und Ceruloplasmin um einige als Beispiel zu nennen.

   Bei dieser als sogenannte Euglobulin-Fällung bezeichneten Massnahme bleibt leucinreiche   3, IS-a 2-Glykoprotein   in Lösung. 



   Die Verringerung der Elektrolyte einer Proteinlösung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden,   z. B.   mit Hilfe der Dialyse gegen ein wässeriges Medium mit verrin- gerter Leitfähigkeit, gegebenenfalls gegen destilliertes Wasser. Auch Elektrodialysever- fahren oder die Verringerung der Elektrolyten in Lösung durch Verwendung von Ionen- austauschern sind hiefür geeignet. g) Molekularsiebfraktionierung der das neue Glykoprotein enthaltenden Lösung mit dem Ziel auf einer Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht zwischen 45000 und 55000 bzw. ein Ausschluss von Proteinen höheren oder niedrigeren Molekulargewichts. Hiefür wird zweckmässig eine Säulenfraktionierung durchgeführt unter Verwendung von Molekular- siebgelen, vorzugsweise von mit Epichlorhydrin quervernetztem Dextran.

   Auch andere Gelfil- 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 trationsmedien mit vergleichbaren   Ausschluss- bzw.   Fraktionierungsgrenzen sind im Sinne der Erfindung geeignet. h) Behandlung der Proteinlösung, die das leucinreiche   3, IS-a ; ;-Glykoprotein   enthält mit einem
Anionenaustauscher, vorzugsweise einem solchen, der Aminoäthyl, Diäthylaminoäthyl oder
Triäthylaminoäthyl als funktionelle Gruppen und Cellulose als Matrix enthält. Das leucin- reiche   3, lS-cx2 -Glykoprotein   wird aus einer Lösung mit der Ionenstärke 2 = 0, 05 derartiger
Ionenaustauscher gebunden. Es kann danach mit dem Ionenaustauscher zusammen von den übrigen Proteinen, die in Lösung verbleiben, abgetrennt werden.

   Das neue Protein lässt sich durch Erhöhung der Leitfähigkeit von Pufferlösungen mit Hilfe von beispielsweise
Neutralsalzen wie Kochsalz eluieren und somit gegenüber begleitenden Proteinen anreichern. i) Elektrophorese in geeigneten Trägermedien und Gewinnung der Zone des    2 -Bereiches   der
Plasmaproteine. k) Behandlung der das leucinreiche 3,   -Glykoprotein   enthaltenden Lösung mit wasserun- löslichem Calciumphosphat-Hydrat, vorzugsweise mit Hydroxylapatit. Selbst bei niedriger
Ionenstärke der Proteinlösung,   z. B.   solche von 1/1000 Mol/1 Ionen wird das neue Glyko- protein an das unlösliche Phosphat nicht adsorbiert.

   Bei entsprechender Vorreinigung der das neue Protein enthaltenden Eiweisslösungen stellt der Adsorptionsüberstand bzw. im Säulenchromatographieverfahren der Säulendurchfluss die Lösung eines gereinigten   S. lS-a -Glykoproteins   dar. 



   Als letzter von mehreren der vorgenannten Schritte eingesetzt, liefert der Säulendurch- fluss das reine Glykoprotein. 



   Durch eine beliebige Kombination von vorstehend dargestellten, in der Proteinchemie üblichen Verfahrensschritten lässt sich das neue leucinreiche   3,1S-  2 -Glykoprotein   aus dieses enthaltenden Proteinlösungen, wie   z. B.   menschlichem Serum oder einer Fraktion daraus, beliebig anreichern und rein darstellen. Die schliesslich anfallenden, nur mehr das leucinreiche   3,     lS- CX2 -Glykoprotein,   gegebenenfalls noch Salze enthaltende Lösung kann von Elektrolyten befreit und gefriergetrocknet werden. 
 EMI3.1 
 
9-Diaminoakridinlactatstellt in Schutze, Hermann ; Molecular Biology of Human Proteins ; Elsevier Publishing Company (1966) Seite 265.

   Bei diesen Verfahren ist das leucinreiche   3, IS-a ; :-Glykoprotein   zusammen mit einer Reihe anderer Glykoproteine in einem Abguss angereichert, der als Nebenfraktion bei der Gewinnung von Albumin und Gammaglobulin aus Humanserum anfällt. Daraus werden in einem ersten Trennungsgang mit Hilfe von   2-Äthoxy-6, 9-diaminoakridinlactat   in einer Konzentration von 0, 03 bis 0, 06 Mol/1 eine Reihe begleitender Proteine ausgefällt. Das Fällungsmittel wird durch Zugabe von Chloridionen, vorzugsweise Natriumchlorid, präzipitiert. Zu der Proteinlösung wird ein Ionenaustauscher gegeben, welcher das leucinreiche   3,1S-  2-Glykoprotein   zu binden vermag. Vorteilhaft wird hiefür ein Anionenaustauscher mit funktionellen Aminoäthyl-,   Diäthylamino- oder   Triäthylaminoäthyl-Gruppen verwendet. 



   Der Ionenaustauscher wird sodann mit einer Pufferlösung steigender Salzkonzentration behandelt. Durch diese Massnahme wird das neue Protein vom Ionenaustauscher wieder abgelöst. Die Lösung wird einem Molekularsiebverfahren, bei welchem Proteine mit einem Molekulargewicht von 100000 bis 150000 ausgeschlossen werden, unterworfen. In der niedrig-molekularen Fraktion befindet sich das leucinreiche   3. lS-CC2-Glykoprotein   neben andern, niedrig-molekularen Glykoproteinen. 



   Es erweist sich als zweckmässig und nützlich, die Ionenaustausch-Chromatographie unter etwas variierenden Bedingungen zu wiederholen. Dies kann einerseits durch Änderung der Adsorptionsbzw. Elutionsverhältnisse oder auch durch die Auswahl von Ionenaustauschern unterschiedlicher Basizität erfolgen. Von restlichen Verunreinigungen wird das Glykoprotein durch Behandlung mit 
 EMI3.2 
 protein anfällt. 



   Das leucinreiche   3,   lS-a,-Glykoprotein ist immunogen. Seine parenterale Applikation an Wirbel- 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 tiere, vorzugsweise an gebräuchliche Laboratoriumstiere wie Kaninchen, führt zur Ausbildung von Antikörpern im Blut dieser Tiere. Danach kann deren Blut gewonnen und das Serum abgetrennt und gegebenenfalls hinsichtlich vorhandener Antikörper angereichert werden. Hiezu stehen geläufige Methoden der Plasmaproteinfraktionierung dem Fachmann zur Verfügung. Durch Immunisierung der Versuchstiere mit dem isolierten   S.      2 -Glykoprotein   wurde ein Antiserum erhalten, das streng spezifisch mit dem Immunisierungsantigen reagiert. Kreuzreaktionen mit andern bisher isolierten Serumproteinen wurden nicht beobachtet. 



   Das neue leucinreiche   3, 1S- a 2 -Glykoprotein   erweist sich demnach als wertvolles immunisierendes Agens bei der erfindungsgemässen Herstellung von Antiseren. Diese sind wertvolle diagnostische Reagenzien. 



   Die quantitativen immunologischen Bestimmungen des Proteins mit Hilfe der Elektro-Immunoassay nach Laurell in einer Serummischung von zirka 1000 Spendern ergab einen Durchschnittsgehalt an   3, lS-a2-Glykoprotein   von 2, 1 mg/100 ml Serum. 



   Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des leucinreichen 3,   lS-a-Glykoproteins   in Einzelseren von Erwachsenen zwischen 1,5 und 3,2 mg/100 ml Serum schwankt. 



   Die Herstellung des beim erfindungsgemässen Verfahren zur Immunisierung von Tieren eingesetzten   S. lS-a -Glykoproteins   wird nachstehend näher erläutert :
Ausgangsmaterial für die Herstellung des leucinreichen 3,  2-Glykoprotein ist eine Fraktion ausgehend von 25   l   Humanplasma. Dieses wird mit   0, 84% 2-Äthoxy-6, 9-Diaminoakridinlactat   bei PH = 8, 0 behandelt. Aus dem Überstand wird das Fällungsmittel als Chlorid ausgefällt, und entfernt, sodann wird bei PH = 7, 0 mit 2, 0 Mol Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird als gammaglobulinreiche Fraktion abgetrennt und der Überstand folgendem Verfahren unterworfen. 



   Der Überstand wird durch Ultrafiltration auf 5   l   eingeengt. Der Eiweissgehalt der Lösung beträgt dann 3%. Die Lösung wird mit einer   0,85%gen   Kochsalzlösung am Ultrafilter gewaschen und danach mit 7,5 g 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridin-lactat versetzt. Das dabei entstandene Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung wird Kochsalz bis zu einer Endkonzentration von 5% (Gew./Vol.) zugegeben. Dabei fällt die Akridinbase als Chlorid aus. Es wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird durch Waschen auf dem Ultrafilter vom 
 EMI4.1 
 
02Proteinlösung dar. Dazu werden 300 g Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Ionenaustauscher zugegeben, 1 h gerührt, am Filter abgenutscht und der Filterrückstand mit 0,02 Mol/1 Phosphat-Puffer, PH = 7, 0, gewaschen.

   Darauf wird der Ionenaustauscher mit einer 1 M   NaCl-Lösung   gewaschen. 



  Der Durchfluss wird zum Teil entfernt. Eine Fraktion, welche das leucinreiche Glykoprotein enthält wird weiter verarbeitet. Man führt mit dieser eine Gelfiltration an SEPHADEX G 150 (Pharmacia, Uppsala) durch ; die Gelfiltration wird in einer Säule vom Durchmesser 20 cm und einer Höhe von 
 EMI4.2 
    G3, 1S-a 2 -Glykoprotein   enthält, gewonnen. 



   Anschliessend wird eine Säule (zirka 500 ml, 5 x 45 cm) mit Diäthylaminoäthyl-SEPHADEX (Pharmacia, Uppsala) Ionenaustauscher gefüllt, die das leucinreiche   3,      2 -Glykoprotein   enthaltende Fraktion auf die Säule aufgetragen und die Elution der Substanzen mit einem linearen Salzgradienten von 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer vom PH -Wert 8,6 ohne Salzzusatz 
 EMI4.3 
 angelegt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Es werden diejenigen Fraktionen weiterverarbeitet, welche durch eine Kontroll-Elektrophorese eine elektrische Beweglichkeit im   a2 -Bereich   der Proteine aufweisen. Zur Anreicherung des Proteins werden die Fraktionen mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% versetzt.

   Der dabei entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der für die folgende QAE-Chromatographie verwendet wird. 



   Anschliessend wird eine weitere Chromatographie an QAE-SEPHADEX in einer vergleichbaren Versuchsanordnung durchgeführt. Zur Elution wird ein linearer Salzgradient von 0, 08 Mol Natrium- 
 EMI4.4 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



   Zunächst erfolgt eine Dialyse gegen 0, 001 Mol Natriumphosphat-Puffer vom PH   H = 7, 0.   Das gegen diesen Puffer äquilibrierte Produkt wird schliesslich auf eine mit Hydroxylpatit gefüllte Säule aufgetragen (Säulengrösse 4 x 12 cm). Der Säuleninhalt wird eluiert mit 0, 001 Mol Phosphatpuffer 
 EMI5.1 
 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> 0.Aminosäuren <SEP> Mol <SEP> % <SEP> des <SEP> Aminosäure-Variationskoeffizient
<tb> anteils <SEP> %
<tb> Lysin <SEP> 3, <SEP> 87 <SEP> 5, <SEP> 90 <SEP> 
<tb> Histidin <SEP> 2, <SEP> 23 <SEP> 11, <SEP> 28 <SEP> 
<tb> Arginin <SEP> 4, <SEP> 65 <SEP> 7, <SEP> 68 <SEP> 
<tb> Asparaginsäure <SEP> 11, <SEP> 45 <SEP> 1, <SEP> 49 <SEP> 
<tb> Threonin <SEP> 3, <SEP> 87 <SEP> 6, <SEP> 26 <SEP> 
<tb> Serin <SEP> 6, <SEP> 43 <SEP> 2, <SEP> 36 <SEP> 
<tb> Glutaminsäure <SEP> 10, <SEP> 72 <SEP> 2, <SEP> 51 <SEP> 
<tb> Prolin <SEP> 7,

   <SEP> 04 <SEP> 4, <SEP> 43 <SEP> 
<tb> Glycin <SEP> 7, <SEP> 32 <SEP> 2, <SEP> 31 <SEP> 
<tb> Alanin <SEP> 6, <SEP> 65 <SEP> 1, <SEP> 97 <SEP> 
<tb> 1/2 <SEP> Cystin <SEP> 1, <SEP> 21 <SEP> 9, <SEP> 83 <SEP> 
<tb> Valin <SEP> 4, <SEP> 48 <SEP> 3, <SEP> 78 <SEP> 
<tb> Methionin <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 5, <SEP> 81 <SEP> 
<tb> Isoleucin <SEP> 1, <SEP> 29 <SEP> 3, <SEP> 16 <SEP> 
<tb> Leucin <SEP> 22, <SEP> 05 <SEP> 5, <SEP> 79 <SEP> 
<tb> Tyrosin <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 19, <SEP> 53 <SEP> 
<tb> Phenylalanin <SEP> 3, <SEP> 23 <SEP> 1, <SEP> 39 <SEP> 
<tb> Tryptophan <SEP> 1, <SEP> 60 <SEP> 11, <SEP> 69 <SEP> 
<tb> Kohlenhydrat <SEP> Gew.-%
<tb> Galaktose <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Mannose <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 0
<tb> Fucose <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> : <SEP> ! <SEP> :

   <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Xylose <SEP> 0
<tb> N-Acetylhexosamin <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> N-Acetylneuraminsäure <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Summe <SEP> (Kohlenhydratanteil) <SEP> 22, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI5.3 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 



   Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert. 



   Beispiel : Herstellung eines Antiserums
Zur Herstellung eines spezifischen Antiserums werden Kaninchen mit dem gereinigten leucinreichen   3,     a2 -Glykoprotein   unter Verwendung von Aluminiumhydroxyd als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert. 



   Das leucinreiche   3, IS-a 2-Glykoprotein   wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0, 06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxyd zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg Protein in 3 ml Suspension/Tier i. v. injiziert. Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere   entblutet.   



  Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen ein leucinreiches 3, 2-Glykoprotein, dadurch gekennzeichnet, dass man Tiere nach bekannten Methoden mit einem leucinreichen EMI6.1 f) Gehalt von etwa 77 2% -Aminosäuren mit einem Anteil von 17 2% Leucin, 23 2% an Kohlenhydraten ; g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern, immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewinnt.