DE2640387C3 - Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number
DE2640387C3
DE2640387C3 DE2640387A DE2640387A DE2640387C3 DE 2640387 C3 DE2640387 C3 DE 2640387C3 DE 2640387 A DE2640387 A DE 2640387A DE 2640387 A DE2640387 A DE 2640387A DE 2640387 C3 DE2640387 C3 DE 2640387C3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
tissue
tissue protein
solution
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2640387A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2640387B2 (de
DE2640387A1 (de
Inventor
Hans Dr. 3550 Marburg Bohn
Wilhelm 3551 Wenkbach Winckler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Priority to DE2640387A priority Critical patent/DE2640387C3/de
Priority to ES462069A priority patent/ES462069A1/es
Priority to NL7709740A priority patent/NL7709740A/xx
Priority to IT27296/77A priority patent/IT1084741B/it
Priority to FI772641A priority patent/FI61192C/fi
Priority to LU78084A priority patent/LU78084A1/xx
Priority to NZ185106A priority patent/NZ185106A/xx
Priority to IL52899A priority patent/IL52899A/xx
Priority to CA286,249A priority patent/CA1092971A/en
Priority to NO773093A priority patent/NO773093L/no
Priority to IE1855/77A priority patent/IE45678B1/en
Priority to AU28621/77A priority patent/AU517607B2/en
Priority to AT0643777A priority patent/AT365929B/de
Priority to DK397677A priority patent/DK397677A/da
Priority to BE180770A priority patent/BE858521A/xx
Priority to GB37521/77A priority patent/GB1586240A/en
Priority to FR7727245A priority patent/FR2364225A1/fr
Priority to JP10870577A priority patent/JPS5334913A/ja
Priority to SE7710085A priority patent/SE7710085L/xx
Publication of DE2640387A1 publication Critical patent/DE2640387A1/de
Priority to US06/068,459 priority patent/US4254021A/en
Publication of DE2640387B2 publication Critical patent/DE2640387B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2640387C3 publication Critical patent/DE2640387C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
    • Y10S530/851—Placenta; amniotic fluid

Description

erhältlich durch Anreichern des Gewebeproteins aus Organextrakten oder daraus gewonnenen Lösungen, mittels mindestens einer der folgenden Maßnahmen und Isolieren der das Gewebeprotein enthaltenden Fraktion:
a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase im Bereich vom nH-Wert von 5- 10 bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8%;
b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins;
c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher und EIutton davon;
d) Molekularsiebfraktionierung und Gewinnung der Fraktionen die einem Molekulargewicht von etwa 50 000 entsprechen;
e) Adsorption an Hydroxylapatu unter Vermeidung der Bindung des Gewebeproteins:
präparative Zonenelektrophorese und Gewinnung der *r und /?t -Zwischenzone.
2. Verfahren zum Herstellen des Gewebeproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Organextrakt ein Extrakt aus menschlichen Placenten verwendet wird.
3. Verwendung des Gewebeproteins nach Anspruch I /um Herstellen von Antiseren.
Die Erfindung betrifft ein gewebespezifisches Protein, d. h. einen Stoff, der Bestandteil von Organgeweben ist. und ein Verfahren zu dessen Herstellung
Aus aufgeschlossenen Organen von Säugern lassen sich mehrere, bereits beschriebene Stoffe in relativ feiner Form isolieren Bekannt Ist z. B, das eisenhaltige Pröleiri Ferritiri, welches aus PläceriteflgeWebe hergestellt werderi kann, aber auch in Magen, Milz, Leber, Niere, Utef Us Und Lunge nächgeWieserf worden ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues öewebepfö/ (ein, welches gekennzeichnet ist durch die im Anspruch 1 enthaltenen Parameter und Verfahrensmaßnahmen. Es besitzt
einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus «-Aminosäuren, von 94 ± 3%;
einen Kohlenhydratanteil von 5,4 ± 2,2%, davon
Hexosen 3,0 ± 1 %,
Hexosamin 1,2 ± 0,5%,
Fucose 0,2 ± 0,2%,
ίο Neuraminsäure 1,0 ± 0,5%,
einen Sedimentationskoeffizienten SW"1 von 3,5 5 ± 0,5 S,
einen isoelektrischen Punkt von 43 ± 0,3
eine elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen den αϊ- und /Jj-GIobuünen,
einen Extinktionskoeffizienten Ε','Χ, (278 nm) von 11,9 ± 1,0 und
eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Protein gerichteten 'o Antikörper.
Als besonderes Merkmal des neuen Gewebeproteins kann festgehalten werden, daß es sich sowohl in fetalen Organen als auch in adulten Organen von Säugern nachweisen läßt. Bei Primaten, insbesondere dem Menschen, ist das Protein in folgenden fetalen Organen nachgewiesen: Herz. Leber. Niere, Lunge, Magen. Gehirn, ferner in folgenden adulten Organen: Herz, Lunge. Haut. Magen, Niere, Uterus, Leber. Milz.
jo Nebenniere. Colon, Rektum. Blase. Mit quantitativen immunologischen Methoden lassen sich dabei in der Regel mindestens 10 mg des Proteins in 100 g Gewebe nachweisen. Auch in der Placenta ist das Produkt in der Größenordnung von 10 mg/100 g Gewebe vorhanden.
j-, Die Placenta bietet sich jedoch für die Isolierung des Proteins besonders an. In Erythrozyten kann ein Gehall von 1 mg des Proteins/100 ml Erythrozyten nachgewiesen werden, wohingegen im Plasma oder Serum von Gesunden das Protein nicht nachzuweisen ist.
Zur Erläuterung der kennzeichnenden Parameter des Proteins sei folgendes ausgeführt.
Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten erfolgte in einer analytischen Ultrazentrifuge bei 60 000 Umdrehungen/Minute in Doppelsektorzellen mit Hilfe
•r, der im Ultravioletten bei der Wellenlänge von 280 nm wandernden Banden der Substanz unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel und einer Proteinkon/en tration von 1 mg/ml in einer Überschichtungszelle einer analytischen Ultrazentrifuge in Anlehnung an Vinograd.
-,n Proc. Acad. Sei. USA.49.902 (1963).
Das Molekulargewicht wurde einerseits in der Ultrazentrifuge über die Krmittlung des Sedimcntationsgleichgewichtes nach Yphaniis errechnet. Ks ergab sich ein Wert von 37 100 ± I 400.
γ, Andererseits wurde bei der Untersuchung des Proteins in einem 0.1% Natriumdode/ylsulfathaltigen Trägergel, bestehend aus Polyacrylamid, der größte Teil des Proteins in 2 Untereinheiten mit einem Molekular gewicht von 22 000 t 2 000/erlegt. Daraus läßt sich fur
mi das native Protein ein Molekulargewicht von 44 000 ± 4 000 ableiten.
Zur Bestimmung des Isöeiektrischen-Punkies wurde das Verfahren der isoeiektrischeri Focussieriing angewandt Unter Einsatz der hierfür von der Firma LKB,
μ Stockholm, vertriebenen Geräte Und Reagenzien.
Die elektrophoretische Beweglichkeit Wurde üfitef Verwendung von Zelluloseacetat als Trägeffolie ermittelt.
9fi ACi q
Kohlenhydrate wurden bestimmt nach Schultze, H. E.; Schmidtberger, R.; Haupt, H,: Untersuchungen Ober die gebundenen Kohlenhydrate in isolierten Plasmaproteinen. Biochem. TL, 329.490, (1958).
Eine Aminosäureanalyse wurde nach Moore, S.; Spackman, D. H.; Stein, W. H.: Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resis. Anal. Chem, 30,1185 (1958). durchgeführt unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographeo. Dabei zeigte sich, daß die am häufigsten in der Peptidkette vertretenen Aminosäuren Leucin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Glycerin sind.
Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten nach einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchem Antigen, d.h. das Protein, und ein gegen das Protein gerichteter Antikörper bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antiserum, gegeneinander in einem Trägermedium, wie z. B. Agar, diffundieren. Treffen die beiden Reaktionskomponenten :r einem günstigen Verhältnis aufeinan- der, bildet sich cm sichtbares Präzipitat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den Fachmann einleuchtend, daß alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung sowohl des neuen Gewebeproteins als tuch der gegen das Gewebeprotein gerichteten 2r> Antikörper möglich sind.
Das Protein ist erfindungsgemäß erhältlich aus Organextrakten, in der Regel wäßrigen Extrakten von Organen, die dieses Protein enthalten und die nach folgenden Kriterien fraktioniert werden: jo
Das Protein ist mit Neulralsalzen fällbar. Mit dem üblicherweise fur derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsulfat wird das Proteii bei einer Sättigungskonzentration des Salzes ion 30 bis 60% in einem pH-Bereich in der Nähe des Neutral unktes gefällt. j<->
Entsprechend seinem Molekulargewicht kann das Protein durch Maßnahmen, die zur Abtrennung von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 35 und 50 000 geeignet sind, gewonnen werden. Vorteilhaft werden hierfür die Methoden der Gelfiltration oder der Ultrafiltration eingesetzt
Das (»ewebeproiein wird bei neutralem oder schwach «Ikalischem pH-Wert an schwach-basische Ionenaustauscher adsorbiert, vorteilhaft wird dabei eine vergleichsweise wenig konzentrierte Pufferlösung verwen- .r, det. denn durch Erhöhung der Salzkonzcntration oder auch durch Erniedrigung des pH-Wertes kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhallens die Möglichkeit an, das Gewebeprotein zu adsorbieren und unter Verwendung ^) von höher konzentrierten Salzlösungen bzw. von Pufferlösungen mit erniedrigten pH-Werten, wieder zu eluieren.
Es hat sich gezeigt, daß das Gewebeprotein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Acridin- und γ, Chinolinreihc. die für Proteinfällungsvcrfahren üblicher weise Verwendung finden, nicht prä/ipitiert wird, hs bleibt in der bei diesen Verfahren üblichen Konzentration im wäßrigen Überstand. Danach kann beispielswei je cmc Acridinbase. wie das 2-Äthoxy 6.9-Diaminoacn- to din-lactat oder eine Chinolinbase wie Bis-(2methyI4-aminöchinoiyl-öj-carbarjiid-hydrochlgrid, zur Fällung von begleitenden Proteinen verwendet werden, wobei das erfindungsgemäße Gewebeprotein im Überstand Verbleibt,
Ähnliche Überlegungen können gelten bei Verwendung von Hydröxylapatif als Adsorbens für Proteine, Das GeWebcprölein zeigt keine besonderen Affinität zum Hydroxylapatit, wohingegen eine Reihe von Begleitproteinen von Hydroxylapatit festgehalten wird.
Aufgrund der Kenntnis der elektrophonischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung, bzw. Isolierung, des Gewebeproteins die präparative Zonen-Elektrophorese eingesetzt werden.
Die Affinität des Gewebeproteins aufgrund seines immunologischen Verhaltens kann dafür eingesetzt werden, das Protein mit Hilfe von sog. Immun-Adsorptionsverfahren anzureichern. Hierfür kann in an sich bekannter Weise ein Immunadsorbens, d. h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das Gewebeprotein hergestellt werden, welcher das Gewebeproiein spezifisch zu binden vermag. Das Protein kann danach durch \nderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden.
Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Gewebeproteins andererseits zu seiner Abtrennung von den übrigen begleitenden Proteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanz erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das Gewebeprotein und in den durch Kombination der Maßnahme zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zu dessen Reinigung zu sehen.
Es ergibt sich somU erfindungsgemäß die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Organextrakte oder daraus gewonnenen Lösungen, die das Gewebeprotein enthalten und die anschließende Gewinnung der bezüglich des Gewebeproteins angereicherten Fraktion:
a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase, vorzugsweise des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactat, im Bereich vom pH-Wert von 5-10, vorzugsweise bei etwa pH 8. bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8% (Gewicht zu Volumen), wobei ö^s Gewebeprotein im wesentlichen im Überstand verbleibt.
b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins, vorzugsweise vom Ammoniumsulfat bei etwa neutralem pH-Wert bis zu 30-60% der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats.
c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose, bei einer Leitfähigkeit der Lösung von 0-2 mS uiid neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert, beispielsweise unter Verwendung eines etwa 0,01 M Puffers vom pH-Wert von etwa 8. Ein bevorzugt zu verwendender Puffer ist Tris-Hydroxymethylaminomethan-HCl. Die EIution des Gewebeproteins kann durch Verschiebung des pH-Wertes auf < pH 7,0 oder durch Erhöhung der Leitfähigkeit auf > 5 mS erreicht werden.
d) Trennung aufgrund der Molekulargröße (Moleku larsiebfraktionierung). Besonders geeignet ist die Gelfiltration in einer Säule, gefüllt mit einem Polymeren entsprechender Porengröße, beispielsweise mit Epiehlörhydrin-vernetzlem Dextran, das als SElPHADEX® von der Firma Pharmacia, Uppsala, hergestellt wird, mit dem Ziel der Anreicherung Von Proteinen mit einem Molekulargewicht voti etwa 50 000, Aber auch Produkte wie ULTRO'GEL® von LKB, Bromma oder BfÖGEL P® von Βίο-Rad Laboratories, Richmond, Calif,, können eingesetzt werden,
e) Durchführung einer Adsorption mil Hydroxylapatit. Da das Gewebeprotein bei Bedingungen, die üblicherweise in der präpativen Biochemie eingehalten werden, von Hydroxylapatit nicht gebunden wird, ist Hydroxylapatit ein geeignetes Agens, um Begleitproteine des Gewebeproteins aus der Lösung zu entfernen. Die Gewebeproteinlösung wird hierfür zweckmäßig auf einen pH-Wert um den N'eutralpunkt eingestellt und die Leitfähigkeit der Lösung auf etwa 1 mS gehalten.
f) Präparative Zonenelektrophorese.
Die das Protein enthaltende Lösung, die für die Durchführung einer Elektrophorese von Proteinen geeignet ist, vorzugsweise eine alkalische Pufferlösung, beispielsweise ein Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH 8,6, Ionensiärke = 0,1, wird hierzu in einer Apparatur zur präparativen Elektrophorese, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen. Heft 43, Seite 83 ff, insbesondere auf Seite 119 !2O, beschrieben wird, eingetragen. Bei dem Gerät handelt es sich um die hor'^ontale Anordnung einer Trägerlektrophorese in einem offenen Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joule'schen Wärme auf unter !0'C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate in Form eines feinen Granulats.
Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pi i 8.6. bei einer lonenstärke von 0,08-0,12 und bei einer Feldstärke von 4-6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituralpuffer vom pH-Wert 3,6 wandert das Gt-webeprotein im elektrischen Feld indem als(x>- undßi-Zone klassifizierbaren Bereich der Plasmaproteine.
Für die Gewinnung des hochmolekularen ic-Globuli-s wird diese Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wäßrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis l%igen Kochsalzlösung, eluiert. In einem letzten Reinigungsschritt kann das Eluat vorteilhaft nach einer vorherigen Konzentrierung, beispielsweise r»uf einem Ultrafilter, eine Gelfiltration unterworfen werden.
Zur Herstellung des neuen Gewebeproteins werden mehrere der angeführten Maßnahmen miteinander kombiniert und dabei jeweils diejenige Fraktion weiter verarbeitet, die das Gewebeprotein enthält, während die übrigen Fraktionen verworfen werden.
Vorteilhaft setzt man dabei als Organextrakt Human-Plactnte-Extrakt ein. Ohne das daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, soll im folgenden eine Möglichkeit beispielhaft aufgezeigt werden, wie das Gewebeprotein aus einem Organgewebe gewonnen werden kann.
Dazu werden beispielsweise menschliche Placente zerkleinert und mit Wasser oder einer verdünnten, zweckmäßig einer weniger als IO°/oigen Salzlösung, vorteilhaft mit einer 0,5%igen Neulralsalzlösung, wie beispielsweise Natriumchlorid, extrahiert. Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Placenten etwa I —5 Liter der ExtraktionslöEUngen. Die nicht gelösten Anteile wevden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Arbeiten bei der Herstellung des Gewebeproleins unterhalb der Zimmertemperatur, beispielsweise bei 10°C, durchzuführen. Der neutrale bis schwach alkalische, vorzugswei-■i se auf etwa pH 8 eingestellte Placentenextrakt wird sodann mit einem wasserlöslichen Derivat einer Acridinbase, beispielsweise dem 2-Äthoxy-6.9-Diamino acridin-lactat, bis zu einer Konzentration von 0,8 ± 0,4% versetzt oder mit einem wasserlöslichen ίο Derivat einer Chinoünbase, vorteilhaft mit Sis-(2methyW-aminochinolyl-öJ-carbamid-hydrochlorid bis zu einer Konzentration von OJ + 0,15%. Die dabei entstehende Fällung wird verworfen. Der Überstand enthält den Hauptanteil des anzureichernden Gewebeis proteins. Danach ist es zweckmäßig, überschüssiges Fällungsmittel durch Zusatz von Verbindungen abzuscheiden, welche mit dem Fälluiigsmittel einen Niederschlag zu bilden vermögen. Die Acridinbasen bilden beispielsweise mit Halogeniden schwer lösliche Verbin düngen, so daß es sich anbief, zur Abscheidung der Δ r*nHinhücp MalnnmrhlnnH 711 t>·-'* ry^ρπΗρπ Fm*» ΚοΓπρ
digende Abscheidung wird erreicht bei einer Konzentration von etwa 3-7% (G : V) Natriumchlorid. Der überstehenden Proteinlösung wird im folgenden so viel
2Ί eines für die Fällung von Eiweißkörpern verwendbaren Salzes zugesetzt, daß das Gewebeprotein aus der Lösung verdrängt wird Vorteilhaft wird als SaI/ Ammoniumsulfat verwendet: Zweckmäßig wird hierfür eine Sättigungskonzentration des Ammomurnsulfdis
jo von 30 - 60%, vorzugsweise 40 - 50%, eingehalten. Der sich nach Zugabe des Ammoniumsulfats bildende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen und in Wasser wieder aufgelöst. Da derartige durch Salzfällung erhaltene Niederschläge in der Regel
r, noch Fällungsmittel selbst einschließen, empfiehlt es sich, danach eine Dialyse anzuschließen. Die Lösung gegen die die Proteinlösung dialysiert wird ist zweckmäßig eine wenig konzentrierte Pufferlösung. Sinnvoll ist hier der Einsatz von Pufferlösungen, die bei der Ionenaustauschchromatographie üblich sind und die eine Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher ermöglichen.
Die dialysierte Lösung des Gewebeproteins wird danach in einem wenig konzentrierten Puffermilieu mit
4-; dem schwachbasischen Ionenaustauscher. /.. B. Diäthylaminoäthylzellulose gemischt und nach erfolgter Ad sorption des Gewebeproteins an den Ionenaustauscher dieser von der restlichen Lösung abgetrennt, z. B. abfiltriert. Wurde die Adsorption beispielsweise in einem schwach alkalischen Milieu (etwa pH 8.0) und einem Puffer der Konzentration von etwa 0.01 Mol/Liter durchgeführt, läßt sich ein Wasche;) des Ionenaustauschers mit einem 0,02 molaren Puffer bei etwas erniedrigtem pH-Wert (etwa 6-7) vornehmen.
Die Salzkonzentration des Elutionsnuffers kann bei insgesamt etwa 02 Mol/Liter liegen.
Es ist vorteilhaft, das Eluat ähnlich wie oben beschrieben mit so viel Neutralsalz zu versetzen, daß das Protein ans der verdünnten Lösung als Niederschlag
bo und danach wieder aufgelöst in konzentrierter Form erhalten werden kann. Zur weiteren Reinigung kann das wieder aufgelöste Protein einer Gelfiltration unterworfen werden. Besonders gut angereicherte Fraktionen hinsichtlich des gesuchten Gewebeproleins werden
(,5 erhalten, wenn hierfür das quervernetzte Dextran der Firme Pharmacia, SEPHADEX® vom Typ G 150. verwendet wird, zweckmäßig in Form von Maßnahmen einer Säulenchromatographie. Zur Elution können in
der Biochemie gebräuchliche Pufferlösungen, denen zur Erhöhung des Fraklionicrungscffcktcs Neutralsalze zugesetzt werden können, beispielsweise 0,01 -0.1 m Tris-hydroxymethyl-aminomethan Salzsäurcpuffer mil Zusatz von 0 — 5 in NaCI von annähernd neutralem bis basischem pH-Wert dienen. Bei diesem Elutionsverfahfeii wird das Gewebeprotein in den eluierien Fraktionen, zweckmäßig mit immunologischen Verfahren, gesucht, wonach diejenigen Fraktionen ausgesondert und gesammelt werden, die das erfindungsgemäßc Protein enthalten.
Da auch die Gclfiltrationseluate das Gewebeprotein in verdünnter Form enthalten, ist auch hier eine Anreicherung durch Fällung mit NeutraKal/en. wie beschrieben, ange/eigt.
Die durch Wiederauflösung des Sal/niederschlages gewonnene Lösung des Gewebeproteins wird durch Dialyse gegen eine sehr stark verdünnte Pufferlösung auf die Bedingungen eingestellt, die geeignet sind, möglichst viele der noch vorhandenen Verunreinigun· gen an Hydroxydapatit zu adsorbieren. Geeignet sind hier insbesondere schwach-konzentrierie Phosphatpuffer, beispielsweise ein etwa 0.005molarcr Natriumphosphalpuffer, dessen pH-Wert etwa zwischen 6,5 und 7.0 liegt. Beim Kontakt des Hydroxylapatits mit der vorliegenden Proteinlösung wird das erfindungsgemäße Gewcbeprotein weitgehend in Lösung belassen, so daß das Hxdroxylapatit. das zweckmäßig in eine Säule eingefüllt ist, für das folgende Verfahren nicht mehr berücksichtigt werden muß. Der Durchlauf durch die Hydroxylapatitsäule enthält das gesuchte Gewebeprotein in abermals angereicherter und gereinigter Form.
Eine Wiederholung der lonenaustauschchroniatographie, wobei — abweichend zum vorher beschriebenen Schritt — der Ionenaustauscher in eine Säule gefüllt, die das Gewebeprotein enthallende Lösung auf die Säule aufgetragen und mit einer Salzlösung steigender konzentration (gradient) eluiert wird führt zu weiteren Anreicherungen des Gewebeproteins. Das nach diesen beispielhaft aufgezeigten Schritten durchgeführte Reinigungsverfahren führt zu dem Gewebeprotein in einer
Das Gewebeprotein läßt sich selbstverständlich nach dem vorher Gesagten in der gleichen Reinheit auch durch Kombination anderer Schritte, beispielsweise a; auch unter Einfügimg eines Schrittes der präparativen Elektrophorese oder der Immunadsorption, erhalten.
Das erfindungsgemäß hergestellte Gewebeprotein hat antigene Eigenschaften. Eine damit durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden 5η führte zur Bildung von spezifischen Antikörpern im Blut der immunisierten Tiere. Deren Seren können nach üblichen Verfahren gewonnen und die darin enthaltenen Antikörper angereichert werden.
Die nachgewiesene Gewebespezifität des erfindungsgemäßen Stoffes legt eine diagnostische Bedeutung nahe. Gewebeerkrankungen lassen sich durch den Austritt des Proteins aus dem Gewebe in die Blutbahn im Blut nachweisen. Hierfür kommen im wesentlichen die bekannten immunologischen N achweis verfahren t,n unter Verwendung der spezifischen gegen das Gewebeprotein gerichteten Antikörper in Frage.
Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert:
lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natfiumhydroxyd auf pH 8 eingestellt und mit 50 I einer 3%igen Wäßrigen Lösung voll Diamihoäthoxyücridin-Iactat versetzt. Nach diner Wartezeit von 1 Stunde wird der > Überstand, der das Gewebspfotein enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (I I kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacri* din-lactals versetzt, filtriert und mit 30% — bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeif — festem Ammonsulfat
in versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymcthyl)-aminomeih<in-Salz
Π säure-Pufferlösung vom pH-Wert 7.0. die 0.05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0.1 η Natriumhydroxydlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit
21) 500 g feuchter Diäthylaminoäthylcellulose (Firma Serva. Heidelberg) 1 Stunde verrührt.
Dann wird die Diäthylaminoäthylcellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je 1 1 0,01 molarem Tris-(oxymethyl)-ammomethan-Salzsäu-
_'·> repuffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02molarem Tris-(oxymeth>l)-aminomethan-Salzsäurepuffer. pH 6.5. der 0.85% Natriumchlorid und 0.05% Natriumazid enthält, eluiert. Den vereinigten Eluatcn werden 30% Amnion
«ι sulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das Ganze wird verrührt. Der Niederschlag, der das Gewebeprotein enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und der Gelfiltration mittels SEPHADEX®G-150 unter Verwendung von O.lmola-
Π fern Tris-ioxymcthylJ-aminomethan-Salzsäurepuffer vom pH 8.0. der 1.0 Mol Natriumchlorid/Liter enthält, unterzogen (100:20 cm-Säule). Hierbei dient der Tris-Puffer zunächst als Suspensionsmedium, in dem der Träger für die Gelfiltration — nämlich das SEPHADEX^G-ISO vorliegt. Das in destilliertem Wasser gelöste Gewebeprotein wird auf die mit CCDLIAr^CYiS «ταΓΓιΙΙ*«» QHnIo atifcrotracr^n iinrl mit /"!pm ~ — — " - ο ■ c- "o-
besagten Tris-Puffer eluiert.
Anschließend werden die Eluate mit spezifischem Gewebeprotein-Antiserum getestet, die Gewebeprotein-haltigen Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30% festem Ammonsulfat ausgefallt.
Die Weiterreinigung erfolgt an Hydroxylapatit (Säule 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines 0.005m Phosphatpuffers, pH 6,8. und anschließend durch Chromatographie an Diäthylaminoäthylen-SEPHADEX® (Pharmacia) (Säule 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines Tris-HCI-Puffers, pH 7,0. Zur Elütiön wird ein Salzgradient mit 0 — 2% NaCl angelegt Es werden 40 mg des neuen Gewebeproteins in einer Reinheit von 99,5% erhalten.
Die Aminosäureanalyse ergab folgende Werte (Mol-Prozent):
Beispiel
150 kg tiefgefrorene Placemen werden zerkleinert und mit 150 1 einer 0.5%igen wäßrigen Natriumchlorid-
65 Lysin
Histidin
Arginin
Asparaginsäure
Threonin
Serin
Glutaminsäure
Prolin
5.64
1.05
3.83
9,84
4,33
4,78
11,29
6.41
Jf..■„-x.s.^m as-ft s_._... -. S«Li.., i
IO
Glycin Alanin Cystin/2
Valin Methionin
8,65 7,51 2,11 6,68 0,98
Isoleucin
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin
Tryptophan
3,32 14,43 5,10 3,08 1,14

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Gewebeprotein mit
a) einem Proteinanteil von 94 ± 3%
einem Geh&k an Kohlenhydraten
5,4 ± 2,2% und davon
Hexosen3,0± 1%,
Hexosamin 1,2 ± 0,5%,
Fucose 0,2 ± 0,2%,
Neuraminsäure 1,0 ± 0,5%;
b) einem Sedimentationskoeffizienten S:
von 3,5 S ± 0,5 S;
c) einem isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 03;
d) einer elektrophoretischen Beweglichkeit im Bereich zwischen den «r und /?rGIobulinen;
e) einen Extinktionskoeffizienten £ül (278 nm) von 11.9 ± 1.0,
DE2640387A 1976-09-08 1976-09-08 Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE2640387C3 (de)

Priority Applications (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2640387A DE2640387C3 (de) 1976-09-08 1976-09-08 Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
ES462069A ES462069A1 (es) 1976-09-08 1977-09-02 Procedimiento para el enriquecimiento de proteina de teji- dos.
NL7709740A NL7709740A (nl) 1976-09-08 1977-09-05 Weefselspecifiek proteine en de bereiding daarvan.
FI772641A FI61192C (fi) 1976-09-08 1977-09-06 Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein
LU78084A LU78084A1 (de) 1976-09-08 1977-09-06
NZ185106A NZ185106A (en) 1976-09-08 1977-09-06 Tissue protein and preparation of antisera
IL52899A IL52899A (en) 1976-09-08 1977-09-06 Tissue specific protein and process for preparing same
IT27296/77A IT1084741B (it) 1976-09-08 1977-09-06 Proteina specifica dei tessuti e processo per la sua preparazione
AU28621/77A AU517607B2 (en) 1976-09-08 1977-09-07 Tissue specific protein
IE1855/77A IE45678B1 (en) 1976-09-08 1977-09-07 Tissue specific protein and process for preparing same
CA286,249A CA1092971A (en) 1976-09-08 1977-09-07 Tissue specific protein and process for preparing same
AT0643777A AT365929B (de) 1976-09-08 1977-09-07 Verfahren zur gewinnung eines neuen gewebespezifi-schen proteins
DK397677A DK397677A (da) 1976-09-08 1977-09-07 Vaevprotein dets berigelse og anvendelse
NO773093A NO773093L (no) 1976-09-08 1977-09-07 Vevspesifikt protein og fremgangsmaate til dets fremstilling
GB37521/77A GB1586240A (en) 1976-09-08 1977-09-08 Tissue specific protein and process for preparing same
FR7727245A FR2364225A1 (fr) 1976-09-08 1977-09-08 Proteine specifique de tissus organiques et leur procede de preparation
BE180770A BE858521A (fr) 1976-09-08 1977-09-08 Proteine specifique de tissus organiques et leur procede de preparation
JP10870577A JPS5334913A (en) 1976-09-08 1977-09-08 Tissueepeculiar protein and itspreparation
SE7710085A SE7710085L (sv) 1976-09-08 1977-09-08 Vevnadsspecifikt protein och forfarande for dess framstellning
US06/068,459 US4254021A (en) 1976-09-08 1979-08-21 Tissue specific protein and process for preparing same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2640387A DE2640387C3 (de) 1976-09-08 1976-09-08 Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2640387A1 DE2640387A1 (de) 1978-03-16
DE2640387B2 DE2640387B2 (de) 1980-05-22
DE2640387C3 true DE2640387C3 (de) 1981-01-22

Family

ID=5987430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2640387A Expired DE2640387C3 (de) 1976-09-08 1976-09-08 Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4254021A (de)
JP (1) JPS5334913A (de)
AT (1) AT365929B (de)
AU (1) AU517607B2 (de)
BE (1) BE858521A (de)
CA (1) CA1092971A (de)
DE (1) DE2640387C3 (de)
DK (1) DK397677A (de)
ES (1) ES462069A1 (de)
FI (1) FI61192C (de)
FR (1) FR2364225A1 (de)
GB (1) GB1586240A (de)
IE (1) IE45678B1 (de)
IL (1) IL52899A (de)
IT (1) IT1084741B (de)
LU (1) LU78084A1 (de)
NL (1) NL7709740A (de)
NO (1) NO773093L (de)
NZ (1) NZ185106A (de)
SE (1) SE7710085L (de)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2718325C2 (de) * 1977-04-25 1986-09-25 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Leucinreiches 3,1-S-&alpha;&darr;2&darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung
DE2720704C2 (de) * 1977-05-07 1986-09-25 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
DE2842467A1 (de) * 1978-09-29 1980-04-10 Behringwerke Ag Neues ubiquitaeres gewebsprotein pp tief 8
DE2854759A1 (de) * 1978-12-19 1980-07-10 Behringwerke Ag Neues plazentaspezifisches gewebsprotein pp tief 10
DE2952792A1 (de) * 1979-12-31 1981-07-02 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues protein (pp(pfeil abwaerts)15(pfeil abwaerts)) mit immunsuppressiver wirkung
DE3013724A1 (de) * 1980-04-10 1981-10-15 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung
DE3109629A1 (de) * 1981-03-13 1982-09-23 Behringwerke Ag, 3550 Marburg "neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)6(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung"
DE3228503A1 (de) * 1982-07-30 1984-02-02 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)7(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung
DE3230996A1 (de) * 1982-08-20 1984-02-23 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung
DE3315000A1 (de) * 1983-04-26 1984-10-31 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)4(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
DE3334405A1 (de) * 1983-09-23 1985-04-04 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Membranassoziierte proteine (mp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)), verfahren zu ihrer gewinnung sowie ihre verwendung
DE3404563A1 (de) * 1984-02-09 1985-08-14 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
DE3418888A1 (de) * 1984-05-21 1985-11-21 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
CA1265446A (en) * 1985-09-30 1990-02-06 Masahiro Maki Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component
JPH0689014B2 (ja) * 1986-01-21 1994-11-09 興和株式会社 トロンビン結合性物質およびその製法
RU94022543A (ru) * 1994-06-10 1996-05-20 АОЗТ "Научно-практический центр медикобиологических проблем" Основа лекарственного средства и способ ее изготовления

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3409605A (en) * 1965-06-15 1968-11-05 American Cyanamid Co Concentration and purification of growth factor-placental origin (human)
US3497492A (en) * 1968-04-02 1970-02-24 American Cyanamid Co Preparation of placental albumin
US3931399A (en) * 1970-12-22 1976-01-06 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for isolating a fibrin-stabilizing factor
US3904751A (en) * 1970-12-22 1975-09-09 Behringwerke Ag Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta
US4191533A (en) * 1971-09-29 1980-03-04 Behringwerke Aktiengesellschaft Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it
DE2221261A1 (de) * 1972-04-29 1973-11-15 Behringwerke Ag Ap-glykoproteine und verfahren zu ihrer isolierung
FR2215944A1 (en) * 1973-02-01 1974-08-30 Bellon Labor Sa Roger Extracts of human placenta - free of proteases, and contg. histaminase, kininases and monoamine-oxidases for treating allergies
DE2353973C3 (de) * 1973-10-27 1979-10-04 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung
FR2261755A1 (en) * 1974-02-25 1975-09-19 Thomas Andre Glyco protein and mucopolysaccharides extraction - from naturally occuring materials fr use in cosmetics
US3910822A (en) * 1974-03-14 1975-10-07 Us Health Isolation of glucocerebrosidase from human placental tissue
DE2616984C3 (de) * 1976-04-17 1981-10-29 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins

Also Published As

Publication number Publication date
CA1092971A (en) 1981-01-06
AU2862177A (en) 1979-03-15
GB1586240A (en) 1981-03-18
ATA643777A (de) 1981-07-15
AU517607B2 (en) 1981-08-13
IT1084741B (it) 1985-05-28
AT365929B (de) 1982-02-25
DE2640387B2 (de) 1980-05-22
DK397677A (da) 1978-03-09
DE2640387A1 (de) 1978-03-16
BE858521A (fr) 1978-03-08
FR2364225B1 (de) 1982-11-19
IL52899A0 (en) 1977-11-30
NL7709740A (nl) 1978-03-10
IE45678L (en) 1978-03-08
IE45678B1 (en) 1982-10-20
FI772641A (fi) 1978-03-09
FI61192C (fi) 1982-06-10
NZ185106A (en) 1980-05-27
NO773093L (no) 1978-03-09
FR2364225A1 (fr) 1978-04-07
JPS5334913A (en) 1978-03-31
LU78084A1 (de) 1978-06-01
IL52899A (en) 1980-09-16
FI61192B (fi) 1982-02-26
SE7710085L (sv) 1978-03-09
ES462069A1 (es) 1978-06-01
US4254021A (en) 1981-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2720704C2 (de) Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
DE2640387C3 (de) Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
EP0000134B1 (de) Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum
DE3315000A1 (de) Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)4(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
EP0060491B1 (de) Protein (PP16), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung
EP0009715B1 (de) Neues ubiquitäres Gewebsprotein PP8 und Verfahren zu seiner Anreicherung
EP0033000B1 (de) Neues Protein PP15, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung
EP0101603B1 (de) Neues Protein (PP13), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung
EP0100522B1 (de) Neues Protein (PP17), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung
EP0014756A1 (de) Plazentaspezifisches Gewebsprotein PP10 und Verfahren zu seiner Anreicherung
EP0037963B1 (de) Neues Protein PP9, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung
DE2616984C3 (de) Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins
DE3418888A1 (de) Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
EP0141326B1 (de) Neues Protein PP20, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung
EP0029191B1 (de) Neues Protein PP11, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung
DE3410694C2 (de)
DE2718325C2 (de) Leucinreiches 3,1-S-&amp;alpha;&amp;darr;2&amp;darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung
EP0137345B1 (de) Membranassoziierte Proteine (MP2), Verfahren zu ihrer Gewinnung sowie ihre Verwendung
DE3404563A1 (de) Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
AT369265B (de) Verfahren zur herstellung eines antiserums gegen ein leucinreiches 3,1s-alpha2-glykoprotein

Legal Events

Date Code Title Description
OAP Request for examination filed
OD Request for examination
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
8339 Ceased/non-payment of the annual fee