FI61192C - Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein Download PDFInfo
- Publication number
- FI61192C FI61192C FI772641A FI772641A FI61192C FI 61192 C FI61192 C FI 61192C FI 772641 A FI772641 A FI 772641A FI 772641 A FI772641 A FI 772641A FI 61192 C FI61192 C FI 61192C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- tissue
- solution
- tissue protein
- precipitated
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
- Y10S530/851—Placenta; amniotic fluid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
RSrTI Γβί ku ulutusjulkaisu ^11Q9 LBJ (11) UTLÄGGN I NOSSKRIFT & I l 7 1 C ..Patentti myönnetty 10 06 1902 patent meddelat ^ ^ ^ (51) Kv.ik.3/im.ci.3 C 07 G 7/00 SUOM I — Fl N LAN D (21) P»Mntt»MAumu» — PatuntamMuiinf 7726Ul (22) H«k«mtopUvl — Anieknlnfatf«f 06.09.77 (23) Alkupllv· —Glitlfhatadtf 06.09.77 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offuntllf 09.03.78
Fttmtl· j. »UNvIbUlltu. «λν·*·*— |.l-U-l-»~p~-
PatWlt- och r*fi«toratyr«la«n Anekin uthfd och utl.»krtftun publkurtd 2o.02.o2 (32)(33)(31) Pyydttty atuoikuui —Bugird prlorltut 08.09.76
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) P 261+0387.2 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg/Lahn, Saksein Liittotasa- valta-Forbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Hans Bohn, Marburg/Lahn, Wilhelm Winckler, Wenkbach, Saksan Liittotasa-valta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7I+) Oy Kolster Ab (5I+) Menetelmä diagnostisena aineena käytettävän kudosproteiinin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett säsom diagnostiskt medel användbart vävnadsprotein
Keksintö koskee menetelmää diagnostisena aineena käytettävän kudosproteiinin valmistamiseksi nisäkkään sikiön, sydämen, maksan, munuaisten, keuhkojen, vatsan tai aivojen kudos-uutteesta, tai aikuisen nisäkkään sydämen, keuhkojen, ihon, vatsan, munuaisten, istukan, maksan, pernan, lisämunuaisten, paksusuolen, peräsuolen tai virtsarakon kudosuutteesta, jossa menetelmässä a) kudosuutteesta saostetaan ei—halutut aineet lisäämällä noin 0,8 % akridiini- tai kinoliiniemäksen vesiliukoista johdannaista pH-alueella 5 - 10, b) suodokseen lisätään neutraalisuolaa, kuten ammonium-sulfaattia, kudosproteiinin saostamiseksi, c) saostettu kudosproteiini liuotetaan veteen ja se adsorboidaan heikosti emäksiseen ioninvaihtimeen ja eluoidaan siitä, d) eluaatti fraktioidaan käyttäen molekyyliseulaa, 2 61192 e) proteiini saostetaan käyttämällä neutraalisuolaa, f) adsorboidaan epäpuhtaudet uudelleen liuotetusta proteiinista hydroksyyliapatiitille ja lopuksi g) kromatografoidaan kudosproteiinia sisältävä liuos di-etyyliaminoetyyli-Sephadex ®:lla.
Imettäväisten liuotetuista elimistä voidaan eristää useita sinänsä tunnettuja aineita suhteellisen puhtaina; tunnettu on esim. rautapitoinen proteiini ferritiini, jota voidaan valmistaa istukkakudoksesta, mutta joka on todettavissa myös mahassa, pernassa, maksassa, munuaisissa, kohdussa ja keuhkoissa. On myös tunnettua, että istukkauutteesta voidaan fraktioida mm. kudosspesifisiä proteiineja (Arch. Qynäk 215 (1973) 263, ibid 218 (1975) 131, ibid 221 (1976) 73, ibid 222 (1977) 5 - 13, ja Protides of the Biol. Fluids, Proc. 24th Colloquium, Brtigge 1976, 117 - 124). Uutta erikoista, diagnostisesti käytettävää proteiinia ei ole aiemmin eristetty.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kudospro-teiini sisältää 94 - 3 % lähinnä Oi-aminohapoista muodostuvia proteiineja ja 5,4 - 0,5 % hiilihydraatteja, joista 3,0 t 1 % on heksooseja, 1,2 - 0,5 % heksoosiamiinia, 0,2 - 0,2 fukoosia ja 1,0 - 0,5 % neuramiinihappoa, sen sedimentoitumiskerroin . on 3,5 S - 0,5 S, isoelektrinen piste on 4,9 - 0,3 h v 0 V 6 S X ^ mitattuna polyakryyliamidigeelilevyillä ja 4,5 - 0,3 mitattuna elektrofokusoimispylväässä, elektroforeettinen liikkuvuus on
Oi2- 3a /i|-globuliinien välissä, ekstinktiokerroin (278 nm) on 11,9 - 1,0, ja molekyylipaino on 37100 - 1400 määritettynä ultrasentrifugin avulla,ja se koostuu kahdesta alayksiköstä, joiden molekyylipaino on 22000 - 2000 määritettynä nat-riumdodekyylisulfaattia sisältävän polyakryyliamidigeelin avulla. Uuden kudosproteiinin erityispiirteenä on, että se voidaan todeta imettäväisillä sekä sikiöasteen elimissä että täysikasvuisten elimissä. Kädellisten lahkossa ja erityisesti ihmisessä proteiini voidaan todeta sikiöasteella sydämessä, maksassa, munuaisissa, keuhkoissa, mahassa ja aivoissa ja täysikasvuisilla sydämessä, keuhkoissa, ihossa, mahassa, munuaisissa, kohdussa, maksassa, pernassa, lisämunuaisissa, paksusuolessa, peräsuolessa ja virtsarakossa. Tällöin voidaan yleensä kvantitatiivisin immunologisin menetelmin osoittaa vähintään 10 mg proteiinia 100 gsssa kudosta. Myös istukassa tuotetta on n. 10 mg/100 g kudosta. Istukka onkin erityisen sopiva ko. proteiinin eristämiskohde. Punasoluissa voidaan osoittaa 1 mg tätä proteiinia/100 ml punasoluja, mutta ter- 3 61192 veiden henkilöiden plasmassa tai seerumissa proteiinia ei voida osoittaa.
Sedimentoitumiskerroin määritettiin analyyttisessä ultra-sentrifugissa kierrosnopeudella 60 000 kierr/min kaksoissektori-kyveteissä aineen UV-alueella aallonpituudella 280 nm esiintyvän huipun avulla liuottimen ollessa vettä ja proteiinikonsentraa-tion ollessa 1 mg/ml analyyttisen ultrasentri£ugin kerroskyvetis-sä Vinogradin mukaan, Proc. Acad. Sei. USA, 49 (1963) 902.
Molekyylipaino laskettiin toisaalta määrittämällä ultraa sentrifugilla sedimentoitumistasapaino Yphantis'in mukaan, Ann.
New York Acad, Sei., 88 (1960) 586. Toisaalta tutkittaessa proteiinia 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia sisältävässä polyakryy-liamidikantajageeIissä proteiini voitiin suurimmaksi osaksi hajottaa kahdeksi alayksiköksi, joiden molekyylipaino oli 22 000 - 2000. Siitä saadaan alkuperäisen proteiinin molekyylipainoksi 44 000 - 4000.
Isoelektrinen piste määritettiin isoelektrisen fokusoimis-menetelmän avulla, mihin käytettiin ruotsalaisen toiminimen LKB toimittamia laitteita ja reagensseja. Pylvään tilavuus oli 440 ml.
(S)
Niinsanotun Ampholin -seoksen pH-alue oli glykoproteiinitutki-muksessa 4, 0 - 6,0.
Käytettäessä toiminimen LKB polyakryyliamidigeelilevyjä •f isoelektriseksi pisteeksi saadaan 4,9 - 0,3, mutta käytettäessä saman toiminimen elektrofokusoimispylvästä ja tähän suositeltavia reagensseja saadaan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun kudosproteiinin isoelektriseksi pisteeksi 4,5 - 0,3.
Elektroforeettinen liikkuvuus määritettiin käyttäen sellu-loosa-asetaattia kantajakaIvona. Käytettiin Backman Instrumentsin laitetta Microzone R 200 selluloosa-asetaattikalvojen (Fa. Sarto-rius) päällä käyttäen natriumdietyylibarbituraattipuskuria, pH 8,6.
Hiilihydraatit määritettiin Schultze, H.E., Schmidtberger, R., Haupt, H., Untersuchungen iiber die gebundenen Kohlenhydrate in isolierten Plasmaproteinen, Biochem. Z., 329 (1958) 490 mukaan.
Aminohappoanalyysi suoritettiin Moore, S., Spackman, D.H., Stein, W.H., Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins, Anal. Chem., 30 (1958) 1185 mukaan käyttäen neste-kromatografiaa. Tällöin osoittautui, että peptidiketjun tavallisimmat aminohapot ovat leusiini, glutamiinihappo, aspargiinihappo ja glysiini.
Aineen immunologinen tunnistaminen tapahtuu yksinkertaisem- 4 61192 min tunnetun diffuusiomenetelmän avulla, jossa antigeeni (vasta-aineen synnyttäjä), so. proteiini, ja proteiinin vasta-aine tai vastaseerumi, johon vasta-aineet eivät ole rikastuneet, diffun-doituvat vastakkaisiin suuntiin kantaja-aineessa, esim. agarissa. Jos molemmat reaktiokomponentit kohtaavat edullisissa olosuhteissa, muodostuu näkyvä sakka. Tämän perusteella asiantuntijalle on selvää, että kaikkia immunologisia menetelmiä voidaan köyttää sekä uuden kudosproteiinin että sen vasta-aineiden osoittamiseksi ja määrittämiseksi.
Kudosproteiini voidaan saostaa neutraalisuoloilla. Tällaisissa saostuksissa tavallisesti käytetyllä ammoniumsulfaatilla kudosproteiini saostetaan kyllästymiskonsentraatiossa 30 - 60 % olevalla suolalla lähellä neutraalia olevalla pH-alueella.
Kudosproteiini voidaan eristää menetelmillä, jotka sopi-r vat molekyylipainoltaan 35 000 - 50 000 olevien aineiden eristämiseksi. Edullisia menetelmiä ovat geelisuodatus ja ultrasuoda- tus.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kudosproteiini adsorboidaan neutraaleissa tai heikosti emäksisissä olosuhteissa heikosti emäksiseen ioninvaihtimeen. On edullista käyttää suhteellisen laimeaa puskuriliuosta, koska suolakonsentraation kohottaminen tai pH-arvon alentaminen voi estää adsorptiota. Toisaalta on mahdollista adsorboida kudosproteiini ja eluoida se uudelleen käyttäen väkevämpiä suolaliuoksia tai puskuriliuoksia, joilla on alhaisempi pH.
On osoittautunut, että kudosproteiinia ei voida saostaa akridiini- ja kinoliinisarjän vesiliukoisilla orgaanisilla emäksillä, joita tavallisesti käytetään proteiinien saostukseen. Näissä menetelmissä käytetyissä tavanomaisissa konsentraatioissa proteiini jää liuokseen. Täten esim. akridiiniemästä, kuten 2-etoksi-r 6,9-diaminoakridiinilaktaattia, tai kinoliiniemästä, kuten bis-(2-metyyli-4-aminokinolyyli-6)-karbamidihydrokloridia, voidaan käyttää muiden proteiinien saostamiseen, jolloin keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kudosproteiini jää liuokseen.
Hydroksyyliapatiittia voidaan käyttää proteiini-adsorbent-tina puhdistusprosessissa, koska kudosproteiini ei siihen sitoudu, mutta sensijaan useat muut proteiinit adsorboituvat siihen.
Elektroforeettisten liikkuvuusarvojen perusteella voidaan kudosproteiinin rikastamiseksi tai eristämiseksi käyttää prepara- 5 61192 tiivistä vyöhyke-elektroforeesia.
Kudosproteiinin immunologisen affiniteetin perusteella voidaan rikastaa ns. immunoadsorptiomenetelmän avulla. Tunnettuun tapaan voidaan käyttää immunoadsorbenttia, so. kantajaan sidottua kudosproteiinin vasta-ainetta, joka pystyy sitomaan kudosproteiinin spesifisesti. Muuttamalla ympäristöolosuhteita proteiini voidaan eluoida erilleen.
Yhdistämällä tietyllä tavalla menetelmiä, joilla toisaalta rikastetaan kudosproteiinia ja toisaalta poistetaan muut proteiinit, uusi kudosproteiini voidaan eristää.
Seuraavassa selitetään keksinnön mukaista menetelmää yksityiskohtaisesti .
a) Lisätään akridiini- tai kinoliiniemäksen vesiliukoista johdannaista, edullisesti 2-etoksi-6,9-diaminoakridiinilaktaattia, pH-alueella 5 - 10, edullisesti pH-arvossa n. 8, lopullisen kon-sentraation ollessa n. 0,8 % (p/t), jolloin ei-halutut aineet saostuvat ja kudosproteiini jää suurimmaksi osaksi liuokseen.
b) Suodokseen lisätään, neutraalisuoloja, edullisesti am-moniumsulfaattia, kudosproteiinin saostamiseksi liuoksen pH:n ollessa noin. 7, lopullisen neutraalisuolan konsentraatio on 30 - 60 % kyllästyskonsentraatiosta.
c) Saostettu kudosproteiini liuotetaan veteen ja se adsorboidaan heikosti emäksiseen ioninvaihtimeen, esim. dietyyli-aminoetyyliselluloosaan, liuoksen johtokykyarvon ollessa 0 2 mS neutraaleissa tai heikosti emäksisissä olosuhteissa käyttäen esim. n. 0,01-m puskuria, pH n. 8. Suositeltava puskuri on tris-hydroksimetyyliaminometaani-HCl. Kudosproteiinin eluointi voidaan suorittaa alentamalla pH arvoon alle 7,0, tai nostamalla johtokykyä yli 5 mS:een.
d) Suoritetaan erotus molekyylikoon perusteella (mole-kyyliseulafraktiointi). Erityisen sopiva on geelisuodatus pylväässä, jossa on polymeeriä, jonka huokoskoko vastaa erotettavan molekyylikokoa, esim. epikloorihydriinillä verkkoutettua dekst-
C1D
raania, valmistaja Pharmacia, Uppsala nimellä Sephadex Väfc. Tällöin rikastetaan proteiineja, joiden molekyylipaino on n. 50 000.
e) Saostetaan kudosproteiini lisäämällä neutraalisuolaa, kuten edellä on esitetty.
, 61192 f) Adsorboidaan hydroksyyliapatiitille. Koska hydroksyy- liapatiitti preparatiivisen biokemian tavanomaisissa olosuhteissa ei sido kudosproteiinia, hydroksyyliapatiitti sopii poistamaan muut proteiinit liuoksesta. Kudosproteiiniliuoksen pH säädetään sopivimmin suunnilleen neutraaliksi, ja liuoksen johtokyky pidetään arvossa n. 1 mS. __ (g) g) Kromatografoidaan dietyyliaminoetyyli-Sephadex llä käyttäen tris-HCl-puskuria, pH = 7,0; eluoinnissa käytetään suola-gradienttina 0 - 2 % suolaliuosta.
Seuraavassa kuvataan kudosproteiinin eristämistä elin-kudoksesta.
Hienonnetaan esim. ihmisistukolta, ja ne uutetaan vedellä tai laimealla, sopivimmin alle 10-% suolaliuoksella, edullisesti 0,5-% neutraalisuolaliuoksella, esim. natriumkloridiliuoksella. Sopivimmin käytetään n. 1 - 5 1 uuttoliuoksia 1 kg:a kohti istu-koita. Liukenematon aines erotetaan uutteesta linkoamalla tai suodattamalla.
On osoittautunut edulliseksi valmistaa kudosproteiini alle huoneen lämpötilan olevassa lämpötilassa, esim. 10°C:ssa. Neutraaliksi tai heikosti emäksiseksi, edullisesti pH-arvoon n. 8 säädettyyn istukkauutteeseen lisätään akridiiniemäksen vesiliukoista johdannaista, esim. 2-etoksi-6,9-diaminoakridiinilaktaattia, lopullisen konsentraation ollessa 0,8 - 0,4 %, tai kinoliiniemäksen vesiliukoista johdannaista, edullisesti bis-(2-metyyli-4-amino-kinolyyli-6)-karbamidihydrokloridia, konsentraatioon 0,3 - 0,15 %. Muodostunut sakka erotetaan ja heitetään pois. Liuos sisältää rikastettavan kudosproteiinin pääosan. Sen jälkeen on edullista poistaa saostukseen käytetty aine liuoksesta lisäämällä yhdisteitä, jotka saostavat tämän. Akridiiniemäkset muodostavat esim. haloge-nidien kanssa niukkaliukoisia yhdisteitä, joten akridiiniemäksen poistamiseksi voidaan käyttää natriumkloridia.
Tyydyttävä erotus saavutetaan konsentraatiolla n. 3 - 7 % (p/t) natriumkloridia. Jäljelle jääneeseen proteiiniliuokseen lisätään niin paljon proteiineja saostavaa suolaa, että se syrjäyttää kudosproteiinin liuoksesta. Suolana on edullista käyttää ammonium-sulfaattia, ja sopiva pitoisuus on 30 - 60 %, erityisesti 40 - 50 % kyllästyskonsentraatiosta.Ammoniumsulfaattilisäyksen johdosta muodostunut sakka eristetään linkoamalla tai suodattamalla ja liuote- 61192 7 taan uudelleen veteen. Koska tällaiset suolasaostuksella saadut sakat sisältävät yleensä saostintakin, on suositeltavaa suorittaa dialyysi. Liuos, jonka avulla proteiiniliuos dialysoidaan, on sopivimmin laimea puskuriliuos. Tällöin on edullista käyttää ioninvaihtokromatografiässä tavanomaisia puskuriliuoksia, joiden avulla on mahdollista adsorboida kudosproteiini heikosti emäksiseen ioninvaihtimeen.
Sitten kudosproteiinin dialysoitu liuos sekoitetaan lai-? meassa puskurissa heikosti emäksiseen ioninvaihtimeen, esim. di-etyyliaminoetyyliselluloosaan, ja kun kudosproteiini on adsorboitunut ioninvaihtimeen, tämä erotetaan liuoksesta esim. suodattamalla. Suoritettaessa adsorptio heikosti emäksisissä olosuhteissa (pH n. 8,0) puskurikonsentraation ollessa n. 0,01 moolia/1,ioninvaihdin voidaan pestä 0,02-m puskuriliuoksella hieman alemmassa pH-arvossa (n. 6 - 7). Eluointipuskuriliuoksen kokonaissuolakonsentraatio on n. 0,2 moolia/1.
On edullista lisätä eluaattiin niin paljon neutraalisuolaa,' että proteiini saadaan laimeasta liuoksesta saostuneena ja sen jälkeen uudelleenliuotettuna konsentroidussa muodossa. Liuotetun proteiinin puhdistusta voidaan jatkaa geelisuodattamalla. Fraktioita, joihin haluttu kudosproteiini on erittäin suuresti rikastunut, saadaan käyttämällä Pharmacian verkkoutettua dekstraa-nia, Sephadex® tyyppi G-150, sopivimmin pylväskromatografioimalla. Eluointi-voidaan suorittaa tavanomaisella puskuriliuoksella, johon fraktioimistehon lisäämiseksi voidaan lisätä neutraalisuoloja, jollainen on esimerkiksi 0,01 - 0,1-m tris-hydroksimetyyliamino-metaanisuolahappopuskuri, johon on lisätty 0-5 moolia natrium-kloridia lähes neutraaleissa tai emäksisissä olosuhteissa. Tässä eluointimenetelmässä kudosproteiini todetaan eluoiduista fraktioista sopivimmin immunologisin menetelmin, minkä jälkeen uutta kudosproteiinia sisältävät fraktiot eristetään ja yhdistetään.
Koska myös geelisuodatuksessa saadut eluaatit sisältävät vain vähän kudosproteiinia, on tässäkin tapauksessa paikallaan suorittaa rikastus neutraalisuolasaostuksen avulla.
Kudosproteiiniliuos, joka on saatu liuottamalla neutraali-suolasaostuma, säädetään dialysoimalla erittäin laimean puskuri-liuoksen avulla sellaiseksi, että hydroksyyliapatiitti pystyy adsorboimaan mahdollisimman paljon vielä jäljellä olevia epäpuhtauk- 8 611 92 siä. Sopivia ovat erityisesti laimeat fosfaattipuskuriliuokset, esim. n. 0,005-m natriumfosfaattipuskuriliuos, jonka pH on n.
6,5 - 7,0.Hydroksyyliapatiitin joutuessa kosketukseen käsiteltävänä olevan proteiiniliuoksen kanssa uusi kudosproteiini jää suurimmaksi osaksi liuokseen, joten edullisesti pylväässä olevaa hydroksyyliapatiittla ei tarvitse jatkokäsittelyssä ottaa huomioon. Hydroksyyliapatiittipylvään läpi valunut liuos sisältää haluttua kudosproteiinia hyvin rikastuneessa ja puhtaassa muodossa.
Toistamalla ioninvaihtokromatografia, jolloin poiketen aikaisemmin kuvatusta vaiheesta ioninvaihdin on pylväässä, johon kudosproteiinia sisältävä liuos kaadetaan, ja eluointi suoritetaan konsentraatioltaan kasvavalla suolaliuoksella(gradientilla), kudos-proteiini rikastuu edelleen. Näiden esimerkkien mukaan suoritetussa puhdistusmenetelmässä saadun kudcrsproteiinin puhtausaste on yli 99 %.
Keksinnön mukaisesti valmistetulla kudosproteiinilla on anti-geeniominaisuuksia. Sillä suoritettu eläinimmunisointi tunnetuin menetelmin johti spesifisten vasta-aineiden muodostumiseen immunisoitujen eläimien veressä. Niistä seerumit voidaan eristää ja seerumeissa olevat vasta-aineet rikastaa tavalliseen tapaan. Spesifisten vastaseerumien avulla voidaan veressä oleva kudosproteiini määrittää herkkien immunologisten menetelmien, kuten esim. radio-immuunimäärityksen, avulla. Sairaustiloissa seerumin kudosproteiini-pitoisuus nousee usein moninkertaiseksi. Seerumissa olevan proteiinin määrittämistä voidaan siis sen vuoksi käyttää sairauksien toteamiseen sekä sairauden kulun ja tietyn hoitomenetelmän valvomiseen.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun kudospro-teiinin osoitetulla kudosspesifisyydellä on diagnostinen merkitys. Kudossairauksia voidaan osoittaa verestä proteiinin joutuessa verenkiertoon. Tällöin tulevat lähinnä kysymykseen tunnetut immunologiset toteamismenetelmät, joissa käytetään spesifisiä kudos-proteiinin vasta-aineita.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä
Esimerkki 1
Hienonnettiin 150 kg syväjäädytettyjä istukoita ja uutettiin 150 litralla 0,5-% natriumkloridiliuosta. Uutteen pH säädettiin arvoon 8 2-n natriumhydroksidiliuoksella, ja lisättiin 50 1 diaminoetoksiakridiinilaktaatin 3-% vesiliuosta. Tunnin kuluttua pintaan noussut kudosproteiinia sisältävä neste poistettiin dekan- 3 61192 toimalla, lisättiin 5 % (11 kg) kiinteätä natriumkloridia liuokseen jääneen diaminoetoksiakridiinilaktaatin poistamiseksi, suodatettiin, lisättiin 30 % kiinteätä ammoniumsulfaattia (nesteen painosta laskettuna), ja sekoitettiin hyvin. Tunnin kuluttua sakka poistettiin suodattamalla.
Liuotettiin 500 g suodattimelle jäänyttä sakkaa 500 ml:aan tislattua vettä, ja dialysoitiin 0,01 -m tris-(oksimetyyli)-amino-metaanisuolahappopuskuriliuoksen avulla, pH 7,0, jossa oli 0,05 % natriumatsidia. Dialysoitu liuos lingottiin, päällä oleva neste-kerros erotettiin ja laimennettiin samalla puskuriliuoksella 2000 ml:ksi, liuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 0,1-n natriumhydrok- sidiliuoksella, lisättiin 500 g kosteaa dietyyliaminoetyylisellu-loosaa (toiminimi Serva, Heidelberg), ja sekoitettiin tunnin ajan.
Sitten dietyyliaminoetyyliselluloosa erotettiin suodattamalla liuoksesta, pestiin kahdesti 1 litran annoksilla 0,01-m tris-(oksimetyyli)-aminometaanisuolahappopuskuria, pH 8,0, ja eluoitiin kolmasti 500 ml:n annoksilla 0,02-m tris-(oksimetyyli)-aminometaanisuolahappopuskuria, pH 6,5, jossa oli 0,85 % natriumkloridia ja 0,Q5 % natriumatsidia.
Yhdistettyihin eluaatteihin lisättiin 30 % ammoniumsulfaattia (nesteen painosta laskettuna) ja sekoitettiin. Kudosproteiinia sisältävä sakka liuotettiin 300 ml:aan tislattua vettä ja geeli-suodatettiin Sephadex G-150:llä käyttäen 0,1-m tris-(oksimetyyli) -aminometaanisuolahappopuskuria , pH 8,0, johon oli lisätty 1,0 moolia natriumkloridia/1 (pylväs 100 x 20 cm). Tris-puskuri toimii lähinnä suspendoimisväliaineena, joka sisälsi geelisuodatuksen kantajan eli Sephadex^ G-150:n. Tislattuun veteen liuotettu ku- (S) dosproteiini kaadettiin Sephadex llä täytettyyn pylvääseen ja eluoitiin tris-puskurilla.
Tämän jälkeen eluaatteja testattiin spesifisellä kudospro-teiinivastaseerumilla, kudosproteiinipitoiset fraktiot otettiin talteen ja proteiinit saostettiin niistä uudelleen yllä kuvatulla tavalla 30 %:lla kiinteätä ammoniumsulfaattia.
Puhdistusta jatkettiin hydroksyyliapatiitilla (pylväs 3 x 23 cm) käyttäen 0,005-m fosfaattipuskuria, pH 6,8, ja tämän jälkeen
Ciö kromatografoimalla dietyyli-aminoetyyli-Sephadex :11a (Pharmacia) (pylväs 3 x 23 cm) käyttäen tris-HCl-puskuria, pH 7,0. Eluoinnissa 10 61192 käytettiin suolagradienttina 0 - 2 % natriumkloridiliuosta.
Tämän jälkeen dialysoitiin, ja lopuksi kylmäkuivatuin proteiinin sisältävä liuos. Saatiin 40 mg uutta kudosproteiinia, puhtaus 99/5 %.
Aminohappoanalyysi antoi seuraavat arvot (mooli-%): lysiiniä 5,64 alaniinia 7/51 histidiinia 1/05 kystiiniä/2 2,11 arginiinia 3,83 valiinia 6,68 aspargiinihappoa 9,84 metioniinia 0,98 treoniinia 4,33 isoleusiinia 3,32 seriinia 4,78 leusiinia 14,43 glutamiinihappoa 11,29 tyrosiinia 5,10 proliinia 6,41 fenyylialaniinia 3,08 glysiiniä 8,65 tryptofaania 1,14
Esimerkki 2
Meneteltiin kuten esimerkissä 1 on selitetty, mutta käy-!· tettiin istukan sijasta ihmisen maksa-, keuhko- tai munuaiskudosta, joka murskattiin, käsiteltiin 0,5-% natriumkloridiliuok-sella, ja erotettiin uuteliuos; jatkokäsittely oli sama kuin esimerkissä 1.
Claims (1)
11 61192 Patenttivaatimus: Menetelmä diagnostisena aineena käytettävän kudosproteii-nin valmistamiseksi nisäkkään sikiön sydämen, maksan, munuaisten, keuhkojen, vatsan tai aivojen kudosuutteesta, tai aikuisen nisäkkään sydämen, keuhkojen, ihon, vatsan, munuaisten, istukan, maksan, pernan, lisämunuaisten, paksusuolen, peräsuolen tai virtsarakon kudosuutteesta, jossa menetelmässä a) kudosuutteesta saostetaan ei-halutut aineet lisäämällä noin 0,8 % akridiini- tai kinoliiniemäksen vesiliukoista joh-r dannaista pH-alueella 5 - 10, b) suodokseen lisätään neutraalisuolaa, kuten ammonium-sulfaattia, kudosproteiinin saostamiseksi, c) saostettu kudosproteiini liuotetaan veteen ja adsorboidaan heikosti emäksiseenioninvaihtimeen ja eluoidaan siitä, d) eluaatti fraktioidaan käyttäen molekyyliseulaa, e) proteiini saostetaan lisäämällä neutraalisuolaa, f) adsorboidaan epäpuhtaudet uudelleen liuotetusta proteiinista hydroksyyliapatiitille ja lopuksi g) kromatografoidaan kudosproteiinia sisältävä liuos di-etyyliaminoetyyli-Sephadej^: 11a, tunnettu siitä, että lopputuotteena saadaan kudosproteiini, jolla on seuraavat tunnusmerkit: h) se sisältää 94- 3 % proteiinia ja 5,4 - 2,2 % hiilihydraatteja, joista 3,0 - 1 % heksooseja, 1,2 - 0,5 % heksoosiamiinia, 0,2 - 0,2 % fukoosia ja 1,0 - 0,5 % neuramiinihappoa, i) sen sedimentoitumiskerroin . on 3,5 S - 0,5 S, 2 0/ _^vesi j) sen isoelektrinen piste on 4,9 - 0,3 mitattuna poly» akryyliamidigeelilevyillä, ja 4,5 - 0,3 mitattuna elektrofokusoimis-pylväässä, k) sen elektroforeettinen liikkuvuus on ja /3^-giobu-liinien välissä, 1 | + l) sen ekstinktiokerroin E* _ (278 nm) on 11,9 - 1,0, ja icra + m) sen molekyylipaino on 37 100 - 1400 määritettynä ultra-sentrifugin avulla, ja n) se koostuu kahdesta alayksiköstä, joiden molekyyli-paino on 22 000 - 2000 määritettynä natriumdodekyylisulfaattia sisältävän polyakryyliamidigeelin avulla.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2640387A DE2640387C3 (de) | 1976-09-08 | 1976-09-08 | Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung |
| DE2640387 | 1976-09-08 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI772641A7 FI772641A7 (fi) | 1978-03-09 |
| FI61192B FI61192B (fi) | 1982-02-26 |
| FI61192C true FI61192C (fi) | 1982-06-10 |
Family
ID=5987430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI772641A FI61192C (fi) | 1976-09-08 | 1977-09-06 | Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4254021A (fi) |
| JP (1) | JPS5334913A (fi) |
| AT (1) | AT365929B (fi) |
| AU (1) | AU517607B2 (fi) |
| BE (1) | BE858521A (fi) |
| CA (1) | CA1092971A (fi) |
| DE (1) | DE2640387C3 (fi) |
| DK (1) | DK397677A (fi) |
| ES (1) | ES462069A1 (fi) |
| FI (1) | FI61192C (fi) |
| FR (1) | FR2364225A1 (fi) |
| GB (1) | GB1586240A (fi) |
| IE (1) | IE45678B1 (fi) |
| IL (1) | IL52899A (fi) |
| IT (1) | IT1084741B (fi) |
| LU (1) | LU78084A1 (fi) |
| NL (1) | NL7709740A (fi) |
| NO (1) | NO773093L (fi) |
| NZ (1) | NZ185106A (fi) |
| SE (1) | SE7710085L (fi) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2718325C2 (de) * | 1977-04-25 | 1986-09-25 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Leucinreiches 3,1-S-α↓2↓-Glykoprotein sowie dessen Verwendung |
| DE2720704C2 (de) * | 1977-05-07 | 1986-09-25 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
| DE2842467A1 (de) * | 1978-09-29 | 1980-04-10 | Behringwerke Ag | Neues ubiquitaeres gewebsprotein pp tief 8 |
| DE2854759A1 (de) * | 1978-12-19 | 1980-07-10 | Behringwerke Ag | Neues plazentaspezifisches gewebsprotein pp tief 10 |
| DE2952792A1 (de) * | 1979-12-31 | 1981-07-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)15(pfeil abwaerts)) mit immunsuppressiver wirkung |
| DE3013724A1 (de) * | 1980-04-10 | 1981-10-15 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung |
| DE3109629A1 (de) * | 1981-03-13 | 1982-09-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | "neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)6(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung" |
| DE3228503A1 (de) * | 1982-07-30 | 1984-02-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)7(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3230996A1 (de) * | 1982-08-20 | 1984-02-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3315000A1 (de) * | 1983-04-26 | 1984-10-31 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)4(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3334405A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Membranassoziierte proteine (mp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)), verfahren zu ihrer gewinnung sowie ihre verwendung |
| DE3404563A1 (de) * | 1984-02-09 | 1985-08-14 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3418888A1 (de) * | 1984-05-21 | 1985-11-21 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
| CA1265446A (en) * | 1985-09-30 | 1990-02-06 | Masahiro Maki | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
| JPH0689014B2 (ja) * | 1986-01-21 | 1994-11-09 | 興和株式会社 | トロンビン結合性物質およびその製法 |
| RU94022543A (ru) * | 1994-06-10 | 1996-05-20 | АОЗТ "Научно-практический центр медикобиологических проблем" | Основа лекарственного средства и способ ее изготовления |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3409605A (en) * | 1965-06-15 | 1968-11-05 | American Cyanamid Co | Concentration and purification of growth factor-placental origin (human) |
| US3497492A (en) * | 1968-04-02 | 1970-02-24 | American Cyanamid Co | Preparation of placental albumin |
| US3931399A (en) * | 1970-12-22 | 1976-01-06 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for isolating a fibrin-stabilizing factor |
| US3904751A (en) * | 1970-12-22 | 1975-09-09 | Behringwerke Ag | Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta |
| US4191533A (en) * | 1971-09-29 | 1980-03-04 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it |
| DE2221261A1 (de) * | 1972-04-29 | 1973-11-15 | Behringwerke Ag | Ap-glykoproteine und verfahren zu ihrer isolierung |
| FR2215944A1 (en) * | 1973-02-01 | 1974-08-30 | Bellon Labor Sa Roger | Extracts of human placenta - free of proteases, and contg. histaminase, kininases and monoamine-oxidases for treating allergies |
| DE2353973C3 (de) * | 1973-10-27 | 1979-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Steroid-bindendes Globulin und Verfahren zu dessen Herstellung |
| FR2261755A1 (en) * | 1974-02-25 | 1975-09-19 | Thomas Andre | Glyco protein and mucopolysaccharides extraction - from naturally occuring materials fr use in cosmetics |
| US3910822A (en) * | 1974-03-14 | 1975-10-07 | Us Health | Isolation of glucocerebrosidase from human placental tissue |
| DE2616984C3 (de) * | 1976-04-17 | 1981-10-29 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins |
-
1976
- 1976-09-08 DE DE2640387A patent/DE2640387C3/de not_active Expired
-
1977
- 1977-09-02 ES ES462069A patent/ES462069A1/es not_active Expired
- 1977-09-05 NL NL7709740A patent/NL7709740A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-09-06 NZ NZ185106A patent/NZ185106A/xx unknown
- 1977-09-06 IT IT27296/77A patent/IT1084741B/it active
- 1977-09-06 LU LU78084A patent/LU78084A1/xx unknown
- 1977-09-06 IL IL52899A patent/IL52899A/xx unknown
- 1977-09-06 FI FI772641A patent/FI61192C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-09-07 AT AT0643777A patent/AT365929B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-09-07 AU AU28621/77A patent/AU517607B2/en not_active Expired
- 1977-09-07 NO NO773093A patent/NO773093L/no unknown
- 1977-09-07 DK DK397677A patent/DK397677A/da not_active Application Discontinuation
- 1977-09-07 CA CA286,249A patent/CA1092971A/en not_active Expired
- 1977-09-07 IE IE1855/77A patent/IE45678B1/en unknown
- 1977-09-08 SE SE7710085A patent/SE7710085L/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-09-08 GB GB37521/77A patent/GB1586240A/en not_active Expired
- 1977-09-08 JP JP10870577A patent/JPS5334913A/ja active Pending
- 1977-09-08 BE BE180770A patent/BE858521A/xx unknown
- 1977-09-08 FR FR7727245A patent/FR2364225A1/fr active Granted
-
1979
- 1979-08-21 US US06/068,459 patent/US4254021A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO773093L (no) | 1978-03-09 |
| SE7710085L (sv) | 1978-03-09 |
| JPS5334913A (en) | 1978-03-31 |
| FR2364225A1 (fr) | 1978-04-07 |
| GB1586240A (en) | 1981-03-18 |
| ATA643777A (de) | 1981-07-15 |
| DE2640387A1 (de) | 1978-03-16 |
| LU78084A1 (fi) | 1978-06-01 |
| DE2640387C3 (de) | 1981-01-22 |
| AU2862177A (en) | 1979-03-15 |
| IL52899A0 (en) | 1977-11-30 |
| NZ185106A (en) | 1980-05-27 |
| US4254021A (en) | 1981-03-03 |
| DK397677A (da) | 1978-03-09 |
| ES462069A1 (es) | 1978-06-01 |
| CA1092971A (en) | 1981-01-06 |
| FI61192B (fi) | 1982-02-26 |
| AU517607B2 (en) | 1981-08-13 |
| DE2640387B2 (de) | 1980-05-22 |
| IL52899A (en) | 1980-09-16 |
| IE45678B1 (en) | 1982-10-20 |
| IE45678L (en) | 1978-03-08 |
| FR2364225B1 (fi) | 1982-11-19 |
| BE858521A (fr) | 1978-03-08 |
| FI772641A7 (fi) | 1978-03-09 |
| AT365929B (de) | 1982-02-25 |
| IT1084741B (it) | 1985-05-28 |
| NL7709740A (nl) | 1978-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI61192C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett saosom diagnostiskt medel anvaendbart vaevnadsprotein | |
| US4217339A (en) | Glycoprotein and process for isolating it | |
| US4507229A (en) | Tissue protein PP4, a process for isolating it and its use | |
| McConathy et al. | Isolation and partial characterization of apolipoprotein D: a new protein moiety of the human plasma lipoprotein system | |
| US4269825A (en) | New glycoprotein and process for isolating it | |
| CA1134352A (en) | Ubiquitary tissue protein pp.sub.8 | |
| US4402872A (en) | Protein and process for isolating it | |
| US4468345A (en) | Protein (PP17), a process for concentrating and isolating it and its use | |
| US4500451A (en) | New protein PP13 extracted from human placental tissues and use thereof | |
| US4302385A (en) | Placenta-specific tissue protein PP10 | |
| US4746731A (en) | Isolated tissue protein PP18 | |
| CA1187076A (en) | Protein pp.sub.9, process for its enrichment and its isolation and its use | |
| US4592863A (en) | Protein PP20, a process for obtaining it, and its use | |
| CA1154437A (en) | Protein, pp in11 xx, a process for its preparation and its use | |
| Harvey et al. | Demonstration of two molecular variants of carcinoembryonic antigen by concanavalin A sepharose affinity chromatography | |
| US4594328A (en) | Tissue protein PP21, a process for obtaining it and its use | |
| US4599318A (en) | Tissue protein PP19, a process for obtaining it, and its use | |
| US4309339A (en) | Leucine-rich 3,1-S-α2 -glycoprotein, process for isolating it and its use | |
| Zinneman et al. | Cryoglobulinemia in a patient with Sjögren's syndrome, and factors of cryoprecipitation | |
| Robey et al. | Isolation and characterization of a thymic factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT |